Tugas Akhir Mikrobiologi

Mita Nurhayati 2 An 2 SMK Negeri 7 Bandung
Makalah Mikrobiologi
Kata Pengantar
Puji dan syukur marilah kita panjatkan atas kehadirat Allah Subhanahu Wa Taala, karena atas limpahan rahmat-Nya lah kami dapat menyelesaikan tugas Makalah Tugas Akhir Mikrobiologi. Shalawat serta salam semoga tercurahkan kapada junjungan kita Nabiullah Muhammad Salallahu Alaihi Wassalam, karena dengan mengikuti akhlakul karimah beliau lah saya dapat menyelesaikan tugas ini dengan maksimal. Ilmu mikrobiologi dewasa ini sangat dibutuhkan demi kelancaran ilmu pengetahuan dan teknologi yang semakin canggih dan berkembang. Adanya ilmu mikrobiologi merupakan titik awal lahirnya ilmu pengetahuan yang lain. Tidak ada mikrobiologi, maka kehidupan tidak akan terjadi. Ilmu mikrobiologi mencangkup semua hal mengenai bakteri, medianya, cara mensterilkan tempat dari berbagai bakteri, dan penganalisaan berbagai bahan, seperti makana, suhu, air, dll dari bakteri yang bersifat aman dan membahayakan. Maka atas dasar diatas, siswa-siswi perlu mempelajari dan memahami ilmu mikrobiologi dengan baik dan benar untuk di aplikasikan. Dalam penulisan laporan ini penulis manyadari sepenuhnya bahwa masih terdapat kekurangan baik dari segi materi, susunan bahasa, maupun cara penyajiaannya. Hal ini dikarenakan keterbatasan pengetahuan yang dimiliki penulis. Untuk semua itu, dengan kerendahan hati dan keterbatasan, penulis sangat mengharapkan kritik, dan penyempurnaan yang sifatnya membangun serta saran yang dapat memberikan manfaat dan dorongan bagi peningkatan kemampuan penulis di masa yang akan datang. Meskipun demikian laporan ini dapat terwujud tiada lain karena perhatian, ketulusan hati, bantuan dan jasa, serta bimbingan dan dorongan dari berbagai pihak kepada penulis. Untuk itu, perkenankanlah pada kesempatan ini penulis menyampaikan penghargaan dan terima kasih yang sedalam-dalamnya kepada pihak-pihak yang telah membantu dalam kelancaran pembuatan makalah ini.
Akhir kata, besar harapan penulis agar semua yang penulis lakukan dalam makalah ini dapat bermanfaat bagi penulis khususnya dan bagi pembaca pada umumnya. Bandung, Juni 2011
Penyusun
Abstrak
Ilmu mikrobiologi dewasa ini sangat dibutuhkan demi kelancaran ilmu pengetahuan dan teknologi yang semakin canggih dan berkembang. Adanya ilmu mikrobiologi merupakan titik awal lahirnya ilmu pengetahuan yang lain. Tidak ada mikrobiologi, maka kehidupan tidak akan terjadi. Ilmu mikrobiologi mencangkup semua hal mengenai bakteri, medianya, cara mensterilkan tempat dari berbagai bakteri, dan penganalisaan berbagai bahan, seperti makana, suhu, air, dll dari bakteri yang bersifat aman dan membahayakan. Maka atas dasar diatas, siswa-siswi perlu mempelajari dan memahami ilmu mikrobiologi dengan baik dan benar untuk di aplikasikan. Dalam penyusunan makalah ini, saya ingin sedikit membuka wawasan para pembaca mengenai mikrobiologi. Untuk menghindari kebimbangan pembaca, saya lebih membuat spesifik bahasan mikrobiologi yang akan dibahas pada makalah ini. Bahasannya mencangkup : Pengertian mikrobiologi, sterilisasi dan disinfeksi , mikroskop, persiapan smear, pewarnaan sederhana dan penempelan zat basah, pewarnaan diferensial, pewarnaan diferensial tambahan demonstarasi pembelahan sel , media selektif dan diferensial, teknik isolasi, perhitungan populasi mikroba dengan metoda perhitungan mikroskop, karakteristik fisiologis bakteri pada metabolisme karbohidrat, karakteristik fisiologi bakteri pada reaksi metabolism nitrogen, pemeriksaan susu secara mikrobiologi, pengujian agen anti mikroba secara metode difusi disk, analisa mikroba pada bahan makanan, pemeriksaan air secara mikrobi, karakteristik fisiologi bakteri pada reaksi serbaneka. Semua bahasan yang akan di bahas sesuai bab di atas akan di tulis secara rapih dan memudahkan pembaca untuk membacanya. Mencangkup Makalah Mikrobiologi 3
pengertian/definisi, prisip dasar pembelajaran, prosedur praktikum dan teoriteori yang mendukung analisa MIKROBIOLOGI.
Abstract
Microbiology science is very necessary for the smooth running of science and technology is increasingly sophisticated and growing. The existence of the science of microbiology is the starting point for the birth of other sciences. Without microbiology, life would not have happened. Science of microbiology covering all things about bacteria, the media, how to sterilize a variety of bacteria, and analyzing various materials, such as food, temperature, water, etc from pathogenic and apathogenic bacteria. Because of it, students need to learn and understand the science of microbiology with a good and right to apply. In preparing this essay, I want a little to open the reader insights into microbiology. For the avoidance of doubt the reader, I prefer to make a specific microbiological topics to be discussed in this paper. Include: Definition of microbiology, sterilization and disinfection, microscopy, smear preparation, differential dye and wet paste, simple staining, differential staining additional demonstration of cell division, selective and differential media, isolation techniques, the method of calculation of microbial population counts by microscopy, physiological characteristics of bacteria in the metabolism of carbohydrates, the characteristics of bacterial physiology on the reaction of nitrogen metabolism, milk inspection microbiology, agent disk diffusion method of testing anti-microbial, microbial analysis in food, water microbial inspection, Makalah Mikrobiologi 4
the characteristics of bacterial physiology on the reaction Miscellaneous All topics will be discussed in Chapter accordance with the above will be written neatly and allows readers to read it. include definitions, basic principles of learning, lab procedures and theories that support the analysis MICROBIOLOGY.
BAB I PENDAHULUAN
1.1Latar Belakang Masalah Mikrobiologi merupakan sesuatu yang secara tidak kita sadari pasti ada disekeliling kita. Setiap jengkal dari kehidupan kita tidak akan pernah lepas dari keberadaaan mikroba. Disekitar kita terdapat bermilyar-milyar mikroba yang siap untuk kita teliti. Mikroba sangat penting dalam proses kehidupan kita, dalam proses penguraian zat-zat organic mikroba sangat berperan aktif, akan tetapi mikroba ada yang merupakan mikroba baik untuk tubuh atau buruk untuk tubuh kita. Mikroba dapat dibedakan menjadi beberapa jenis sesuai dengan karakteristik, fisiologi dan keberadaannya. Keberagaman mikroba inilah yang mendorong penulis untuk membuat sebuah laporan akhir yang berjudul Makalah Mikrobiologi . 1.2Identifikasi Masalah Dalam karya ilmiah ini, kita memerlukan arti-arti penting dari sebuah kata yang berasal dari judul yang penulis ambil. Di bawah akan dijelaskan mengenai istilah-istilah yang muncul pada judul, diantaranya : 1. Mikrobiologi adalah sebuah cabang darii lmu biologi yang mempelajari mikroorganisme. Objek kajiannya biasanya adalah semua makhluk (hidup) yang perlu dilihat dengan mikroskop, khususnya bakteri, fungi, Makalah Mikrobiologi 5
alga mikroskopik , protozoa, dan Archaea. Virus sering juga dimasukkan walaupun sebenarnya tidak sepenuhnya dapat dianggap sebagai makhluk hidup 2. Bakteri merupakan mikrobia prokariotik uniselular, termasuk klas Schizomycetes, berkembang biak secara aseksual dengan pembelahan sel. Bakteri tidak berklorofil kecuali beberapa yang bersifat fotosintetik. 3. Prinsip adalah dasar dari segala sesuatu. 4. Aplikasi adalah praktik yang terjadi, kenyataan di lingkungan. 5. Mikroba adalah Jasad hidup yang ukurannya kecil sering disebut sebagai mikroba atau mikroorganisme atau jasad renik. Jasad renik disebut sebagai mikroba bukan hanya karena ukurannya yang kecil, sehingga sukar dilihat dengan mata biasa, tetapi juga pengaturan kehidupannya yang lebih sederhana dibandingkan dengan jasad tingkat tinggi. Mata biasa tidak dapat melihat jasad yang ukurannya kurang dari 0,1 mm. Ukuran mikroba biasanya dinyatakan dalam mikron ( ), 1 mikron adalah 0,001 mm. Sel mikroba umumnya hanya dapat dilihat dengan alat pembesar atau mikroskop, walaupun demikian ada mikroba yang berukuran besar sehingga dapat dilihat tanpa alat pembesar. 6. Sterilisasi adalah proses pembunuhan semua jasad renik yang ada sehingga jika ditumbuhkan didalam suatu medium tidak ada lagi jasad renik yang dapat berkembang biak. 7. Mikroskop adalah alat yang digunakan untuk melihat mikroba. Berupa alat optic yang terdiri dari lensa objektif dan okuler yang disusun sehingga menghasilkan focus. 8. Smear adalah kaca preparasi yang telah diisikan bakteri dan dibuat sedemikian rupa agar sel bakteri tersebut menempel pada kaca preparasi tersebut. 9. Media adalah tempat yang tepat untuk proses pertumbuhan mikroba, yang berisis nutrisi-nutrisi khusus mikroba. 10. Isolasi adalah pemisahan bakteri menjadi jenis yang mempunyai ciri sendiri. 11.Inokulasi adalah proses pemindahan suatu koloni bakteri kedalam suatu media. 1.1Pembatasan Masalah Mikroba didunia sangat kompleks dan sangat banyak. Mikrobiologi mencakup segala makhluk yang berukuran mikro dan nano. Namun penulis menyadari memiliki banyak kekurangan dan keterbatasan moril Makalah Mikrobiologi 6
maupun materil apabila penulis semua yang mencakup semua spesies mikroba. Maka dari itu, penulis membatasi masalah dalam penulisan laporan ini. Yang akan di teliti dan dibahas oleh penulis dalam laporan ini menjadi PRINSIP DASAR DAN APLIKASI MIKROBIOLOGI PADA BAKTERI. 1.2Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang yang telah diuatarakan di atas, dapat diambil beberapa poin mengenai rumusan masalah, diantaranya yaitu : 1. Apa itu mikrobiologi, bakteri dan bagaimana sejarah dan perkembangan mikrobiologi ? 2. Apa dan bagaimana cara sterilisasi dan disinfeksi ? 3. Apakah yang dimaksud mikroskop dan bagaimana penggunaan mikroskop ? 4. Bagaimana cara dan apa yang dimaksud persiapan smear, pewarnaan sederhana dan penempelan zat basah? 5. Apa yang dimaksud pewarnaan diferensial dan bagaimana prosedur praktikumnya ? 6. Apa dan bagaimana pewarnaan diferensial tambahan demonstarasi pembelahan sel ? 7. Apa yang dimaksud media selektif dan diferensial serta bagaimana prosedur pembuatannya ? 8. Bagaimanakah teknik isolasi? 9. Bagaimana cara perhitungan populasi mikroba dengan metoda perhitungan mikroskop? 10. Bagaimana karakteristik fisiologis bakteri pada metabolisme karbohidrat? 11. Bagaimana karakteristik fisiologi bakteri pada reaksi metabolism nitrogen? 12. Bagaimana karakteristik fisiologi bakteri pada reaksi serbaneka? 13. Bagaimana pengujian agen anti mikroba secara metode difusi disk? 14. Bagaimana analisa mikroba pada bahan makanan? 15. Bagaimama pemeriksaan air secara mikrobiologi? 16. Bagaimana pemeriksaan susu secara mikrobiologi? 1.3Tujuan dan Manfaat Penelitian Adapun tujuan dan manfaat dalam pembuatan makalah ini adalah sebagai berikut: Tujuan Penelitian
Dari rumusan yang telah di runtut di atas, penulis dapat mengambil beberapa poin dari tujuan penulisan laporan ini, di antaranya yaitu : 1. Untuk mengetahui arti dari mikrobiologi, bakteri dan sejarah dan perkembangan mikrobiologi. 2. Untuk mengetahui cara sterilisasi dan disinfeksi. 3. Untuk mengetahui dan memahami mikroskop dan penggunaan mikroskop. 4. Untuk mengetahui dan memahami cara dan yang dimaksud persiapan smear, pewarnaan sederhana dan penempelan zat basah. 5. Untuk mengetahui dan memahami yang dimaksud pewarnaan diferensial dan prosedur praktikumnya. 6. Untuk mengetahui dan memahami pewarnaan diferensial tambahan demonstarasi pembelahan sel. 7. Untuk mengetahui dan memahami media selektif dan diferensial serta prosedur pembuatannya. 8. Untuk mengetahui dan memahami teknik isolasi. 9. Untuk mengetahui dan memahami cara perhitungan populasi mikroba dengan metoda perhitungan mikroskop 10.Untuk mengetahui dan memahami karakteristik fisiologis bakteri pada metabolisme karbohidrat. 11. Untuk mengetahui dan memahami karakteristik fisiologi bakteri pada reaksi metabolism nitrogen. 12. Untuk mengetahui dan memahami karakteristik fisiologi bakteri pada reaksi serbaneka. 13.Untuk mengetahui dan memahami pengujian agen anti mikroba secara metode difusi disk. 14.Untuk mengetahui dan memahami analisa mikroba pada bahan makanan? 15. Untuk mengetahui dan memahami pemeriksaan air secara mikrobiologi 16. Untuk mengetahui dan memahami pemeriksaan susus secara mikrobiologi
1.1Metode Penelitian Metode penelitian yang akan penulis gunakan dalam pembuatan laporan ini adalah : Makalah Mikrobiologi 8
1. Metode Kajian Pustaka Metode Pustaka yang digunakan dengan membaca referensi mengenai rasa mikrobiologi dan analisa bakteri baik dari buku atau dari internet. Metode ini digunakan dengan cara mencari referensi dan beberapa artikel mikrobiologi dan analisa bakteri. 2. Metode observasi Observasi atau pengamatan merupakan salah satu teknik pengumpulan data dan faka dengan mempelajarai objek yang akan di analisis. Metode observasi yang penulis gunakan adalah mengamati dan menganalis dan mempraktikan dari teori-teori mengenai mikrobiologi dan analisa bakteri.
BAB II KAJIAN PUSTAKA

2.1Sterilisasi dan Desinfeksi Sterilisasi adalah suatu proses untuk membunuh semua jasad renik yang ada pada suatu tempat sehingga jika ditumbuhkan suatu spesimen di dalam suatu medium tidak ada lagi jasad renik yang dapat berkembangbiak selain dari spesimen yang dimaksudkan untuk ditumbuhkan. Sterilisasi harus dapat membunuh jasad renik yang paling tahan panas sekalipu, yaitu spora bakteri. Dalam pengolahan pangan dikenal istilah sterilisasi komersial, yaitu suatu proses untuk membunuh suatu jasad renik yang dapat menyebabkan kebusukan makanan pada kondisi suhu penyimpanan yang ditetapkan. Makanan yang telah mengalami proses sterilisasi komersialpun masih ada kemungkinan mengandung jasad renik yang tahan proses sterilisasi, tetapi tidak mampu berkembang biak pada suhu penyimpanan normal yang ditetapkan untuk makanan tersebut. Desinfeksi adalah suatu proses untuk membunuh jasad renik yang bersifat patogenik (beracun) dengan cara kimia ataupun fisik. Semua desinfektan pada dasarnya efektif terhadap setiap sel vegetatif tetapi tidak selalu aktif pada sporanya. Antiseptik adalah suatu proses untuk menonaktifkan ataupun membunuh jasad renik dengan cara kimia. Bahan antiseptic bersifat membunuh bakteri atau fungi. 2.1.1Sterilisasi dengan Perlakuan Fisik Untuk membunuh jasad renik, dapat digunakan dengan perlakuan fisik, maksudnya adalah sterilisasi yang dilakukan langsung pada alat yang dimaksud. Jenis-jenisnya akan dibahas di bawah ini. 2.1.1.1 Pemanasan Basah Beberapa cara pemanasan dapat membunuh jasad renik terutama karena panas basah dapat menyebabkan detanurasi protein, termasuk enzim-enzim dalam sel. 1) Perebusan Perebusan adalah pemanasan di dalam air mendidih atau uap air pada suhu 1000C selama beberapa menit. Dengan teknik ini banyak spora yang tidak mati karena banyak spora bakteri Makalah Mikrobiologi 10
yang tahan panas sehingga masih hidup setelah proses perebusan setelah beberapa jam. 2) Pemanasan dengan Tekanan Pemanasan atau pengukusan dengan tekanan dapat dilakukan menggunakan otoklaf, yaitu untuk membunuh spora bakteri yang paling tahan panas. Spora yang paling panas akan mati pada suhu 1210C selama 15 menit. Suhu ini dapat dicapai pada permukaan laut dengan menggunakan uap pada tekanan 15psi dalam tekanan atmosfir berlebih. Kekuatan membunuh uap air panas disebabkan pada waktu kondensasi, pada bahan yang disterilisasi dilepaskan sejumlah besar panas latent. Pengerutan yang disebabkan oleh kondensasi menyebabkan penyerapan uap air baru yang yang berarti lebih banyak panas yang diserap. Autoklaf adalah alat untuk memsterilkan berbagai macam alat & bahan yang menggunakan tekanan 15 psi (2 atm) dan suhu 1210C. Suhu dan tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi memberikan kekuatan yang lebih besar untuk membunuh sel dibanding dengan udara panas. Biasanya untuk 0 mesterilkan media digunakan suhu 121 C dan tekanan 15 lb/in2 (SI = 103,4 Kpa) selama 15 menit. Alasan digunakan suhu 1210C atau 249,8 0F adalah karena air mendidih pada suhu tersebut jika digunakan tekanan 15 psi. Untuk tekanan 0 psi pada ketinggian di permukaan laut (sea level) air mendidih pada suhu 1000C, sedangkan untuk autoklaf yang diletakkan di ketinggian sama, menggunakan tekanan 15 psi maka air akan memdididh pada suhu 1210C. Ingat kejadian ini hanya berlaku untuk sea level, jika dilaboratorium terletak pada ketinggian tertentu, maka pengaturan tekanan perlu disetting ulang. Misalnya autoklaf diletakkan pada ketinggian 2700 kaki dpl, maka tekanan dinaikkan menjadi 20 psi supaya tercapai suhu 1210C untuk mendidihkan air. Semua bentuk kehidupan akan mati jika dididihkan pada suhu 1210C dan tekanan 15 psi selama 15 menit. Makalah Mikrobiologi 11
Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoklaf lama kelamaan akan mendidih dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf. Setelah semua udara dalam autoklaf diganti dengan uap air, katup uap/udara ditutup sehingga tekanan udara dalam autoklaf naik. Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai., maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai menghitung waktu mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan tekanan dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi. Autoklaf tidak boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0 psi. Untuk mendeteksi bahwa autoklaf bekerja dengan sempurna dapat digunakan mikroba pengguji yang bersifat termofilik dan memiliki endospora yaitu Bacillus stearothermophillus, lazimnya mikroba ini tersedia secara komersial dalam bentuk spore strip. Kertas spore strip ini dimasukkan dalam autoklaf dan disterilkan. Setelah proses sterilisai lalu ditumbuhkan pada media. Jika media tetap bening maka menunjukkan autoklaf telah bekerja dengan baik. Beberapa media atau bahan yang tidak disterilkan dengan autoklaf adalah : Bahan tidak tahan panas seperti serum, vitamin, antibiotik, dan enzim Pelarut organik, seperti fenol Buffer engan kandungan detergen, seperti SDS
Untuk mencegah terjadinya presipitasi, pencoklatan (media menjadi coklat) dan hancurnya substrat dapat dilakukan pencegahan sbb : Makalah Mikrobiologi Glukosa disterilkan terpisah (peptone) atau senyawa fosfat dengan asam amino
Senyawa fosfat disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa garam mineral lain. Senyawa garam mineral disterilkan terpisah dengan agar Media yang memiliki pH > 7,5 jangan disterilkan dengan autoklaf 12
Jangan mensterilisasi larutan agar dengan pH < 6,0
Erlenmeyer hanya boleh diisi media maksimum dari total volumenya, sisa ruang dibirkan kosong. Jika mensterilkan media 1L yang ditampung pada erlenmeyer 2L maka sterilisasi diatur dengan waktu 30 menit. Untuk sterilisasi bahan cair seperti susu, dapat dilakukan pada suhu yang relative tinggi dalam waktu yang sangat singkat, yaitu 1350-1500C selama 2-6 detik. Proses ini disebut dengan UHT (Ultra High Temperatur) 1) Tindalisasi Tindalisasi dilakukan dengan pemanasan medium atau larutan menggunakan uap selama 1 jam setiap hati untiuk 3 hari berturut-turut. Waktu inkubasi di antara dua proses pemanasan sengaja diadakan supaya spora dapat bergerminasi menjadi sel vegetatif sehingga mudah dibunuh pada proses berikutnya. Cara kerja : Bahan dimasukkan kedalam erlenmeyer atau botol dan ditutup rapat dengan sumbat atau aluminium foil. Erlenmeyer/botol lalu dimasukkan kedalam alat sterilisasi (alat standar menggunakan Arnold Steam Sterilizen atau dandang). Nyalakan sumber panas dan tunggu hingga termometer menunjukkan suhu 1000C kemudian hitung waktu mundur hingga 30 menit (uap panas yang terbentuk akan mematikan mikroba). Setelah selesai alat sterilisasi dimatikan dan bahan yang steril dikeluarkan. Setelah 24 jam, bahan tersebut di sterilkan lagi dengan cara yang sama, sedang waktu ini dimaksudkan untuk memberi kesempatan spora atau sel vegetatif yang belum mati untuk tumbuh sehingga mudah dibunuh.
1) Pasteurisasi Pateurisasi adalah proses pemanaan pada suhu dan waktu tertentu di mana semua pathogen yang berbahaya bagi manusia akan dibunuh, misalnya bakteri penyebab Makalah Mikrobiologi 13
tuberculosis dan bruselosis. Proses pasteurisasi biasanya dilakukan terhadap susu. Proses ini juga dapat mencegah penyakit yang disebabkan oleh Streptokoki grup A (Streptococcus pyogenes). Pasteurisasi dapat dilakukan pada suhu yang relative rendah dalam waktu yang relative lama yaitu 650C selama 30 menit, atau pada suhu tinggi dalam (750C) selama 15 detik. Beberapa bakteri vegetatif yang tahan panas (thermofil) dan spora bisa masih tahan setelah proses pasteurisasi. Setelah proses pasteurisasi, produk atau sesuatu yang disterilkan harus didinginkan dengan cepat untuk mencegah pertumbuhan bakteri yang masih hidup. 2.1.1.1 Pemanasan Kering Pemanasan kering kurang efektif untuk membunuh jasad renik dibandingkan dengan pemanasan basah. Contoh pemanasan kering adalah proses penyetrikaan dan proses pengovenan. Berbeda demngan pemanasan basah yang menyebabkan denaturasi protein, pemanasan kering menyebabkan terjadinya dehidrasi sel. Pemanasan kering dapat juga menyebabkan oksidasi komponen-komponen dalam sel. Pemanasan kering sering dilakukan dalam proses sterilisasi alat-alat gelas laboratorium, di mana digunakan oven dengan suhu 1600-1800C selama 1,5-2 jam dengan sistem udara statis. Jika digunakan oven yang dilengkapi dengan sirkulasi udara panas, hanya diperlukan waktu setengahnya agar aliran udara panas ke alat-alat gelas akan lebih efisien. Alat gelas yang disterilisasi dengan udara panas tidak akan timbul kondensasi sehingga tidak ada tetes air (embun) didalam alat gelas. Bungkus alat-alat aluminium foil gelas dengan kertas payung dan atau alat
Atur pengatur suhu oven disterilkan selama 2-3 jam.
menjadi
1800C
2.1.1.1 Radiasi Sinar matahari yang dipancarkan langsung terhadap sel vegetatif jasad renik,dapat menyebabkan kematian pada sel tersebut, tetapi biasanya spora dari sel tersebut masih bisa Makalah Mikrobiologi 14
bertahan. Aktifitas bakterisidal dari sinar matahari tersebut disebabkan oleh bagian ultraviolet dari spectrum sinar. Sinar ultraviolet yang dipancarkan dari lampu uap merkuri sering digunakan untuk menyinari ruangan sehingga mengurangi kontaminasi jasad renik di udara, misalnya dalam ruangan inokulasi si laboratorium ataupun di ruangan pengolahan. Radiasi ultraviolet menyebabkan kesalahan pada replikasi DNA, dan mempunyai aktifitas mutagenic pada sel-sel yang masih hidup. Radiasi ioniasi adalah radiasi yang mengandung energy jauh lebih tinggi daripada sinar ultraviolet. Oleh karena itu mempunyai daya desinfektan yang jauh lebih kuat. Salah satu contoh radiasi ionisasi misalnya inar gamma yang dipancarkan dari sinar kobalt-60, digunakan secara komersial untuk mensterilkan alat-alat kedokteran dan laboratorium. Jika digunakan untuk mensterilkan makanan, radiasi ionisasi mungkin dapat mempengaruhi ciarasa makanan. Sedangkan jika digunakan untuk mensterilkan obat-obatan, hormone dan enzim mungkin dapat mempengaruhi potensi dan aktifitasnya. Satian Internasional (SI) yang digunakan dalam radiasi dibedakan atas dua macam, yaitu unit penyerapan (absorpsi) dan unit radio aktif. Disajikan dalam tabel di bawah ini: Unit Penyerapan Unit Radioaktif Lama Baru Lama Baru Nama Curie Bacquer Red Gray Simbol Ci el Rad Gy 10 Unit 3.7x10 di Bq 100erg/g 1j/g Hubung s/s 1dis/s 1 0.01 an 1 3.7x1010 * Ley (1983) dikutip dari Panduan Laboratorium Mokrobiologi Prinsip Dasar dan Aplikasi Stephen A.
Norrel & Karen E. Messley, yang diterjemahkan oleh Dra. Hj. Ani Syafaatin
2.1.1.2 Penyaringan Sterilisasi dengan penyaringan dilakukan untuk mensterilisasi cairan yagn mudah rusak jika terkena panas atu mudah menguap (volatile). Cairan yang disterilisasi dilewatkan ke suatu saringan (ditekan dengan gaya sentrifugasi atau pompa vakum) yang berpori dengan diameter yang cukup kecil untuk menyaring bakteri. Virus tidak akan tersaring dengan metode ini. Makalah Mikrobiologi 15
Sterilisasi dengan penyaringan dapat dilakukan dengan berbagai cara : Non-disposable filtration apparatus Disedot dengan pompa vakum Volume 20-1000 ml Disedot dengan pompa vakum Volume 15-1000 ml Disedot dengan pompa vakum Volume 15-1000 ml Ditekan seperti jarum suntik Volume 1-20 ml Ditekan dengan gaya setrifugasi Volume kurang dari 1 ml
Disposable filter cup unit
Disposable filtration unit dengan botol penyimpan
Syringe filters
. Spin filters
Cara kerja menggunakan Non-disposable filtration apparatus 1) Sterilkan saringan (dapat menggunakan saringan Bekerfeld, Chamberland Zeitz), membran penyaring (kertas saring) dan erlenmeyer penampung. 2) Pasang atau rakit alat-alat tersebut secara aseptis (sesuai gambar), lalu isi corong dengan larutan yang akan disterilkan. 3) Hubungkan katup erlenmeyer dengan pompa vakum kemudian hidupkan pompa. Makalah Mikrobiologi 16
4) Setelah semua larutan melewati membran filter dan tertampung dierlenmeyer, maka larutan dapat dipindahkan kedalam gelas penampung lain yang sudah steril dan tutup dengan kapas atau aluminium foil yang steril. 2.1.1Sterilisasi dengan Bahan Kimia Selain dengan menggunakan perlakuan secara fisik, sterilisasipun dapat dilakukan dengan perlakuan secara kimiawi, maksudnya adalah proses sterilisasi dengan menggunakan bahan kimia sebagai alat sterilisasinya. Bahan kimia menimbulkan pengaruh yang lebih selektif terhadap jasad renik dibandingkan dengan perlakuan fisik seperti panas dan radiasi. Dalam memilih bahan kimia sebagai desinfektan atau antiseptic perlu diperhatikan hal-hal sebagai berikut: 1. Sifat Mikrosidal (membunuh jasad renik) Spora pada umumnya lebih tahan joika dibandingkan dengan bentuk vegetatif dan hanya beberapa desinfektan seperti halogen, merkuri klorida, formalin, dan etilen oksida yang efektif terhadap spora. Mycobacteria merupakan bentuk vegetatif bakteri yang paling tahan dibandingkan dengan kebanyakan sel vegetatif lainnya. Untuk membunuh Mycobacteria sebaiknya digunakan alcohol dan fenol. Virus lebih tahan dibandingkan bakteri vegetatif, dan dapat dibunuh dengan mengunakan halogen, oksidan, dan formalin. Komponen kimia yang dapat membunuh jasad renik mempunyai sifat bakterisidal (membunuh bakteri) atau fungisidal (membunuh fungi) 2. Sifat Mikrostatik (menghambat pertumbuhan jasad renik) Beberapa komponen kimia pada konsentrasi rendah tidak dapat membunuh jasad renik, tetapi hanya menghambat pertumbuhannya. Misalnya senyawa tertentu yang terdapat pada rempah-rempah. Komponen tersebut mempunyai sifat bakteriostatik (menghambat pertumbuhan bakteri) atau fungistatik (menghambat pertumbuhan fungi). Komponen kimia yang bersifat membunuh lebih baik daripada yang hanya bersifat menghambat. 3. Kecepatan Penghambatan Komponen kimia mempunyai kecepatan membunuh atau menghambat yang berbeda terhadap jasad renik. Beberapa komponen kimia bekerja dengan cepat, sedangkan komponen Makalah Mikrobiologi 17
kimia lainnya hanya efektif beberapa menit, bahkan ada yang setelah beberapa jam. Sel yang sedang tumbuh atau berkembangbiak lebih sensitive dan mudah dibunuh dibandingkan dengan sel dalam keadaan istirahat atau statis. 4. Sifat Penunjang Dalam pemilihan desinfektanpun perlu diperhatikan mengenai harga, aktifitasnya dalam jangka lama, mudah larut dalam air, stabil dalam larutan, sifat racunnya, sifat iritasi pada kulit, dan warna yang ditinggalkannya. Beberapa komponen organic dapat menghambat kerja desinfektan, misalnya halogen, garam merkuri dan detergen kationik, sedangkan sabun dan detergen anionic dapat membantu penyerapan. 2.1.1Macam-Macam Desinfektan Desinfektan dapat dikelompokan atas 8 golongan, yaitu: 1. Grup Alkohol Larut Contoh : Etanol, Isopropil alkohol Cara kerja : Koagulasi protein dan melarutkan membran Konsentrasi : 70-90% Keuntungan : Bakterisidal cepat, tuberkulosidal Kelemahan : Tidak membunuh spora, menyebabkan korosi metal kecuali jika ditambahkan komponen pereduksi (2% Na-nitrit), mengeringkan kulit 2. Grup Gas Sterilisasi Contoh : Etilen Oksida Cara kerja : Substitusi grup alkil di dalam sel dengan atom Hydrogen yang labil Waktu reaksi : 1-18 jam Keuntungan : tidak berbahaya untuk kebanyakan bahan yang tidak panas Kelamahan : Membutuhkan peralatan khusus 3. Grup Gas Desinfektan Contoh : Formaldehida Cara kerja : Seperti etilen oksida Konsentrasi : larutan jenuh dalam bentuk gas Makalah Mikrobiologi 18
: Membunuh spora, tidak korosif, digunakan untuk bahan yang tidak panas Kelemahan : membutuhkan peralatan khusus 4. Grup Halogen Contoh : Klorin, Iodium Cara kerja : Oksidasi grup sulfhidril bebas Konsentrasi : Hipoklorit konsentrasi tertinggi HClO (warexin) larutan 1.5% Yodium tinkur - konsentrasi tinggi Keuntungan : Klorin tuberkolosidal Yodium Pencuci dan desinfektan, tidak meninggalkan warna, meninggalkan residu anti bakteri Yodium tinkur bersifat tuberkolosidal Kelemahan : Klorin memutihkan bahan, korosi logam tidak stabil di dalam air sadah, larutan harus segar. Yodium menimbulkan warna dan iritasi kulit Iodofor tidak stabil, aktifitasnya hilang di dalam air sadah, korosif terhadap logam, menyebabkan pengeringan. 5. Grup Fenol Contoh : Kreoso, Fenolsemi sintetis, Lisol Cara kerja : Koagulasi protein, menyebabkan kebocoran membrane sel Konsentrasi : Kreosol 2%, Losol 1% Keuntungan : Aktifitasnya tidak hilang oleh bahan organic, sabun atau air sadah, meninggalkan efek residu jika mongering. Kelemahan : kreosol harus digunakan dalam air lunak 6. Grup Detergen Kationik (Ammonium Quaternar) Cara kerja : Pengerutan membrane dan merusak permeabilitasnya Konsentrasi : Larutan 1/1000-1/5000 Makalah Mikrobiologi 19
Keuntungan
Keuntungan Kelemahan dilarutkan
: Tidak berbau : Tidak bersifat
tuberkolosidal,
harus
dalam air destilat, aktifitasnya hilang oleh protein sabun dan serat selulosa, aktifitas bakterisidalnya lemah sehingga harus dikombinasikan dengan grup fenol 7. Grup Detergen Anionik Contoh : Heksaklorfen Konsentrasi : Heksaklorfen septisol 2%, phisohex 3% Keuntungan : Aktifitas bakteri lama, baik digunakan sebagai pencuci. Kelemahan : Tidak bersifat sporisidal maupun tuberkolusidal, cara kerja lambat, beracun jika digunakan terus-menerus dan akan diserap oleh tubuh. 8. Desinfektan Lainnya Garam : Komponen merkuru organic seperti Merkurokom bersifat kurang beracun, Tetapi aktifitas bakterisidalnya lemah Alkali : Larutan NaOH sering digunakan dalam kedokteran, terkadang untuk desinfeksi Hydrogen peroksida : Dalam konsentrasi 3% digunakan untuk mencuci dan mendisinfeksi luka Sabun : Aktifitas bakterisidalnya lemah, tetapi efektif untuk mencuci/menghilangkan jasad renik
20
2.2. Mikroskop Mikroskop (bahasa Yunani: micros = kecil dan scopein = melihat) adalah sebuah alat untuk melihat objek yang terlalu kecil untuk dilihat dengan mata kasar. Ilmu yang mempelajari benda kecil dengan menggunakan alat ini disebut mikroskopi, dan kata mikroskopik berarti sangat kecil, tidak mudah terlihat oleh mata. Mikroskop cahaya Bagian-bagian dari mikroskop cahaya: 1. lensa okuler, 2. lensa objektif, 3. lensa objektif yang lain, 4. pengatur fokus, 5. pengatur fokus secara halus, 6. papan letak objek/sampel/preparat yang dilihat, 7. sumber cahaya, 8. kondensor cahaya, 9. penjepit sampel Mikroskop cahaya atau dikenal juga dengan nama "Compound light microscope" adalah sebuah mikroskop yang menggunakan cahaya lampu sebagai pengganti cahaya matahari sebagaimana yang digunakan pada mikroskop konvensional. Pada mikroskop konvensional, sumber cahaya masih berasal dari sinar matahari yang dipantulkan dengan suatu cermin datar ataupun cekung yang terdapat dibawah kondensor. Cermin ini akan mengarahkan cahaya dari luar kedalam kondensor. Mikroskop cahaya menggunakan tiga jenis lensa, yaitu lensa obyektif, lensa okuler, dan kondensor.Lensa obyektif dan lensa okuler terletak pada kedua ujung tabung mikroskop sedangkan penggunaan lensa okuler terletak pada mikroskop bisa berbentuk lensa tunggal (monokuler) atau ganda (binokuler). Pada ujung bawah mikroskop terdapat tempat dudukan lensa obyektif yang bisa dipasangi tiga lensa atau lebih. Di bawah tabung mikroskop terdapat meja mikroskop yang merupakan tempat preparat. Makalah Mikrobiologi 21
Sistem lensa yang ketiga adalah kondensor. Kondensor berperan untuk menerangi obyek dan lensa-lensa mikroskop yang lain. Cara kerja: Lensa obyektif berfungsi guna pembentukan bayangan pertama dan menentukan struktur serta bagian renik yang akan terlihat pada bayangan akhir serta berkemampuan untuk memperbesar bayangan obyek sehingga dapat memiliki nilai "apertura" yaitu suatu ukuran daya pisah suatu lensa obyektif yang akan menentukan daya pisah spesimen, sehingga mampu menunjukkan struktur renik yang berdekatan sebagai dua benda yang terpisah. Lensa okuler, adalah lensa mikroskop yang terdapat di bagian ujung atas tabung berdekatan dengan mata pengamat, dan berfungsi untuk memperbesar bayangan yang dihasilkan oleh lensa obyektif berkisar antara 4 hingga 25 kali. Lensa kondensor, adalah lensa yang berfungsi guna mendukung terciptanya pencahayaan pada obyek yang akan dilihat sehingga dengan pengaturan yang tepat maka akan diperoleh daya pisah maksimal.
Jika daya pisah kurang maksimal maka dua benda akan terlihat menjadi satu dan pembesarannyapun akan kurang optimal. Persiapan preparat di dalam mikroskop cahaya terbagi menjadi dua jenis, yaitu : Preparat Non-permanen, yang dapat diperoleh dengan menambahkan air pada sel hidup di atas kaca objek, kemudian diamati di bawah mikroskop. Preparat permanen, yang dapat diperoleh dengan melakukan fiksasi yang bertujuan untuk membuat sel dapat menyerap warna, membuat sel tidak bergerak, mematikan sel, dan mengawetkannya. Tahap selanjutnya, yaitu pembuatan sayatan, yang bertujuan untuk memotong sayatan hingga setipis mungkin agar mudah diamati di bawah mikroskop. preparat dilapisi dengan monomer resin melalui proses pemanasan karena pada umumnya jaringan memiliki tekstur yang lunak dan mudah pecah setelah mengalami fiksasi, kemudian dilanjutkan dengan pemotongan menggunakan mikrotom. Umumnya mata pisau mikrotom terbuat dari berlian karena berlian tersusun dari atom karbon yang padat. Oleh karena itu, sayatan yang terbentuk lebih rapi. Setelah dilakukan penyayatan, dilanjutkan dengan pewarnaan, yang bertujuan untuk memperbesar kontras antara preparat yang akan diamati dengan lingkungan 22
sekitarnya. Setiap pewarna mengikat molekul yang memiliki kespesifikan tertentu, contohnya : Hematoksilin, yang mampu mengikat asam amino basa (lisin dan arginin) pada berbagai protein, dan eosin, yang mampu mengikat molekul asam (DNA dan rantai samping pada aspartat dan glutamat). Data Pengamatan : Lensa Objektif Low Power dengan pembesaran 4x, objek yang dilihat telihat 4x lebih besar dari pada aslinya. Lensa Objektif High Dry dengan pembesarn 100x 400x , objek yang dilihat telihat 100x lebih besar dari pada aslinya. Jika darah manusia yang dilihat akan terliht serat seratnya. Lensa Objektif Oil Immersion, penggunaannya lebih besar 1000x dari aslinya jika yang diamatinya bakteri akan terlihat bentuknya. Tujun dri immsion oil adalah mencegah tejadiny pembiasan cahaya yang meninggalkan kaca preparasi dan memberikan gambar yang lebih jelas dari objek yang tersebar. 2.2.1 Persiapan Smear, Pewarnaan Sederhana, dan Penempelan Zat Basah 2.2.1.1Pewarnaan pada Mikroorganisme Metode pewarnaan pertama kali ditemukan oleh Christian gram pada tahun 1884. Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif dan gram negatif yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pewarnaan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. (Tryana, S.T, 2008). Struktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu: 1. Struktur dasar (dimiliki oleh hampir semua jenis bakteri) Meliputi: dinding sel, membran plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpana. 2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu) Meliputi kapsul, flagelum, pilus, fimbria, klorosom, Vakuola gas dan endospora Staphylococcus adalah bakteri Gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni dan berbentu seperti buah buah anggur. Pada tahun 1884, Rosenbach menjelaskan ada dua jenis 23
warna staphylococci yaitu: Staphylococcus Aureus yang berwarna kuning dan Staphylococcus albus yang berwarna putih. Beberapa karakterististik yang dimiliki Staphylococcus Aureus diantaranya hemolytic pada darah agar, catalase-oxidase-positif dan negatif, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15 sampai 45 derajat dan lingkungan NaCl pada konsentrasi tinggi hingga 15 persen dan menghasilkan enzim coagulase. Selain itu,biasanya S. Aureus merupakan patogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru-paru, radang kelenjar dada, radang urat darah, meningitis, saluran kencing osteomyelitis dan endocarditis serta menyebabkan keracunan makanan yaitu dengan melepakan enterotoxins menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan melepasan superantigens ke dalam aliran darah (Kenneath, 2008). Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara alami sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis tumbuh di berbagai mesophilic suhu berkisar 25-35 derajat Celsius. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol Bakteri ini hanya memilikin satu molekul DNA yang berisi seperangkat set kromosom. DNAnya berukuran BP 4214814 (4,2 Mbp) (TIGR CMR). 4,100 kode gen protein. Beberapa keunggulan dari bakteri ini adalah mampu mensekresikan antibiotik dalam jumlah besar ke luar dari sel (Scetzer, 2006). Menurut Kenneath tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008). Endospore adalah organisme yang Makalah Mikrobiologi 24
dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Ncbi, 2008). Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (Textbook, 2008).
1.2.3 Teknik Pewarnaan pada Spesimen 1.2.3.1Pewarnaan pada Bakteri Gelas objek dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70% kemudian ditetesi dengan aquades steril. Kemudian dibuat apusan dari biakan miring dan disuspensikan sampel sampai homogen, lalu difiksasi di atas api bunsen. Apusan bakteri yang telah jadi ditetesi gram A selama 1 menit, dicuci denan air mengalir, dan dikeringanginkan. Kemudian ditetesi gram B selama 1 menit, dicuci dengan air mengalir, dan dikeringanginkan. Kemudian ditetesi gram D selama 30 detik, dicuci dengan air mengalir, dan dikeringanginkan. Lalu diamati dengan mikroskop dengan perbesaran 1000 x, kemudian dicatat bentuk dan warna sel bakteri 1.2.3.2Pewarnaan pada Endospora Gelas objek dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70% kemudian ditetesi dengan aquades steril. Kemudian dibuat apusan dari biakan miring dan disuspensikan sampel sampai homogen, lalu difiksasi di atas api bunsen. Apusan bakteri digenangi dengan pewarna malakit hijau lalu dipanaskan preparat di atas penangas air mendidih sampai muncul uap air (10 menit) dan dijaga jangan sampai pewarna kering. Kemudian dicuci dengan air mengalir, dikeringanginkan, diwarnai dengan safranin (1-2 menit) lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan lagi. Kemudian diamati ada tidaknya spora dalam sel (bentuk, letak, ukuran terhadap sel vegetatif) menggunakan mikroskop dengan perbesaran. Persiapan smear : Persipan kaca preparasi yang berisi bahan biologis adalah sebuh proses dua tahap : Makalah Mikrobiologi 25
1. Persiapan smear, Smear adalah kaca preparasi yang telah diisikan bakteri dan dibuat sedemikian rupa agar sel bakteri tersebut menempel pada kaca preparasi tersebut. 2. Pewarnaan Smear. Setelah bakteri tertempel pada kaca preparasi, maka harus dilakukan pewarnaan. Hal ini termasuk membuka sel pada bahan pewarnaan membiarkan sel tersebut bereaksi dengan bahan dalam waku tertentu, mencuci pewarna sisa dari kaca preparasi dan mengeringkannya. Data pengamatan : Persiapan smear dilakukan untuk mengamati morfologi bakteri meliputi tampilan, penyusun, pewarna yang digunakan dan daya pembesaran yang diamati. Pewarnaan Sederhana : Bahan kimia yang akan digunakan sebagai pewarnaan biologis setidaknya harus bersifat sangat chromogenic (berwarna) dan bereaksi terhadap beberapa komponen sel. Apabila bahan pewarnaan biologis yang memiliki sifat-sifat tersebut digunakan secaa tepat, maka memungkinkan kita untuk memeriksa sel secara visual dengan tingkat resolusi dan definisi yang besar . Pewarnaan sedehana/Pewarnaan Tunggal adalah pewarnaan yang dapat digunakan secara umum dengan menggunakan satu macam zat warna, untuk tujuan pewarnaan. Biasanya berupa pencelupan dasar yang akan mewarnai hampi seluruh membrane sel bakteri. Zat warna yang dapat digunakan adalah Methylene Blue, Gentian Violet, Basic Fuschia atau Safranin. Umumnya merupakan hal yang untuk membuka sel pada pewarnaan beberapa saat saja, pewarnaan yang dihasilkan lalu dipindahkan dengan cara dicuci sebelum mengamati sel dengan menggunakan mikroskop. Pengamatan : Pewarnaan sedehana digunakan untuk mengamati morfologi bakteri dengan menggunakan zat warna yang telah disebutkan diatas. Kemudian setelah itu diamati menggunakan mikroskop. Pewarnaan Zat Basah Makalah Mikrobiologi : 26
Seringkali merupakan hal yang penting untuk mengamati sel dalam keadaan hidup. Sebagai contoh, salah satu metode unuk menentukan motilitas bakteri mengharuskan kita untuk mengamati bakteri ketika baktei itu berenang. Dengan mengamati secara langsung pergerakan, kita dimungkinkan untuk memisahkan antara organisme yang secara aktif bersifat motile dan mempelihatkan pergerakan dengan maksud tertenttu, dengan organisme yang hany mempelihatkan geakan Bownian, atau pergerakan yang dikarenakan bombarderman molecular. Gerakn Brownian dapat ditentukan dengan adanya gerakan tidak teratur dan tersentak sentak. Terdapat 2 metode yang dapat digunakn untuk mengamatinya secar mikoskopis : 1. Penempelan zat basah. Penempelan zat basah disiapkan secara sederhana dengan meletakkan satu loop penuh air daging pada kaca peparasi dengan kaca penutup. Jika preparasi akan diamati dalam waktu yang lama, gunakan jeli petroleum untuk menamabal tepian kaca agar cairan tidak mengering. 2. Hanging drop. Jika satu tetes biakn diletakkan secaa tept pad kaca penutup, mka tetesan tersebut dapat diletakkan pada kaca prepaasi hingga tejadi tekanan, yang membuat tetesan air daging tersebut menggantung pada ruang tekanan, sehingga dengan hanging dop. Teknik ini sangat berguna ketika kita diharuskanuntuk mengamati sel sel tebal seperti protozoa. Data Pengamatan : Penempelan zat basah digunakan untuk mengamati sifat bakteri dengan mengamati arah gerakannya (apakah berlawanan dengan gerakan Brownian). 2.2 Teknik Isolasi 2.2.1 Pengertian Isolasi Pengertian isolasi telah sedikit disinggung paada bab pendahuluan. Teknik isolasi adalah suatu teknik yang dilakukan Makalah Mikrobiologi 27
untuk memisahkan satu jenis mikroba dari mikroba lainnya yang berasal dari biakan campuran sehingga kita memperoleh suatu biakan murni yang kita inginkan. Sebelum melakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan pengambilan sampel. Berikut merupakan prosedur pengambilan sampel. 1. Sampel Tanah Jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah, maka cara pengambilannya disesuaikan dengan tujuan dan kebutuhan. Misal jika yang diinginkan mikroorganisma rhizosfer maka sampel diambil dari sekitar perakaran dekat permukaan hingga ujung perakaran. 2. Sampel air Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air itu sendiri. Jika beerasal dari air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan bibir botol melawan arus air. Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang, botol dapat dicelupkan dengan tali, jika ingin mengambil sampel dari air keran maka sebelumya keran dialirkan dulu beberapa saat dan mulut kran dibakar.
Tetapi jika suspense sudah tersedia, maka kita tidak perlu mengambil sampel, kita tinggal lanjutkan ke langkah melakukan teknik isolasi. Agar tidak dapat dihidrolisis oleh bakteri yang ditumbuhkan padanya dan tidak mengandung nutrisi apapun bagi bakteri. Sehingga agar dapat digunakan untuk mensolidkan media tanpa mengubah komponen media atau tanpa mencairkan media selama bakteri dibiakan. Agar memiliki beberapa keunggulan lainnya yang juga penting bagi para ahli mikrobiologi, yaitu: 1) Tetap solid pada temperature pembiakan.
28
2)
3)
Agar ditemukan sebagai hasil dari pencarian alat untuk memisahkan bakteri ke dalam pembiakan murni. Gelatin, di lain pihak meleleh ketika temperature berada di atas 250C dan mudah dihidrolisis oleh banyak bakteri. Ketika gelatindigunakan sebagai agen solid, bagitu mencair (baik karena meleleh maupun karena katifitas sendiri), bakteri menjadi tercanpur dan tidak lagi dapat dipelajari sebagai populasi biakan murni. Sedangkan Agar tidak mencair hingga mencapai suhu 1000C, dank arena umumnya tidak akan mencair karena aktifitas bakteri. Agar dapat digunakan untuk mensolidkan media pembiakan tanpa harus cemas terjadi pencampuran biakan murni. Tidak berwarna. Agar yang disolodkan biasanya agak berkabut tetapi tetap transparan. Hal inimerupakan karakteristik yang penting karena kita dimungkinkan untuk melakukan pengamatan terhadap karakteristik koloni bakteri yang tidak akan tampak jika Agar dalam keadaan buram. Dapat berubah wujud. Agar merupakan koloid yang dapat dibolak-balik. Ia dapat berubah dari fase sol (cair) ke gel (padat) pada suhu tertentu. Fase perubahan dari gel ke sol (padat ke cair) terjadi pada suhu >1000C, tetapi bergantian berubah dari sol ke gel (cair ke padat) pada suhu 450C. ini berarti Agar dapat dipanaskan hingga suhu 550C dan disimpan dalam bentuk cair hingga digunakan. Katika agar dalam keadaan cair, komponen tambahan dapat ditambahkan, dan jika perlu, bakteri dapat dicampurkan pada agar untuk pemisahan. Jika sebagian nutrisi atau bakteri yang tidak tahan panas ditambahkan pada Agar cair pada suhu 500C, Agar dapat dituangkan pada tabung atau piring tanpa terjadi denaturasi panas pada nutrisi atau pemanasan yang dapat membunuh bakteri. Hal ini tentu saja tidak akan mungkin jika media disolidkan ada suhu yang tinggi.
2.2.1 Manfaat Agar Ketika agar disolidkan, bentuknya akan tetap hingga dicairkan kembali. Ada beberapa cara penggunaan agar solid.
29
1. Slant, adalah sebuah tabung pembiakan (tabung tes) yang mana medianya disolidkan ketika media dalam keadaan miring. Tabung pembiakan diisikan sepertiganya dengan mediacair yang dapat disolidkan sehingga media memiliki slant yamg substansial.slant menyediakan peetumbuhan yang baik di permukaannya dan merupakan cara yang ideal untuk memelihara pembiakan untuk kepentingan studi. 2. Stab, tidak seperti slant. Dibuat dengan membiakan media menjadi solid ketika tabung dalam keadaan tegak. Tabung diisi antara sepetiga sampai setengah tabung. Stab digunakan ketika pengurangan oksigen diperlukan, atau ketika mengamati efek pertumbuhan bakteri di dalam media dan bukan di atas media. 3. Deep atau pour, biasanya mengandung 18-20mL media agar, dan umumnya digunakan untuk membuat pour plate. Tabung media jauh lebih mudah untuk disimpan daripada plate, sehingga lebih mudah ditamgani dan dimanipulasi. Media dicairkan dan disimpan di dalam wadah air paad suhu 500-550C. komponen dan/atau bakteri dapat ditambahkann seperti yang diperlukan oleh renvana percobaan. 4. Petri plate, adalah segelas atau sepiring plastic yang sesuai. Mesia yang telah dilelehkan dituangkan pada piring dan dibiarkan solid. Hasil permukaan media yang didapat digunakanuntuk membiakan bakteri dan memisahkannya menjadi pembiakan murni melalui prosedur streak plate (streak plate, disebarkan di atas media. Pour plate, diisikan di dalam media). 2.2.1 Teknik Preparasi Suspensi Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril. Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Macammacam preparsi bergantung kepada bentuk sampel : a. Swab (ulas), dilakukan menggunakan cotton bud steril pada sampel yang memiliki permukaan luas dan pada umumnya Makalah Mikrobiologi 30
sulit dipindahkan atau sesuatu pada benda tersebut. Contohnya adalah meja, batu, batang kayu dll. Caranya dengan mengusapkan cotton bud memutar sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton bud kontak dengan permukaan sampel. Swab akan lebih baik jika cotton bud dicelupkan terlebih dahulu ke dalam larutan atraktan semisal pepton water. b. Rinse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel pada permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran kecil, misalnya daun bunga dll. Rinse merupakan prosedur kerja dengan mencelupkan sampel ke dalam akuades dengan perbandingan 1 : 9 (w/v). Contohnya sampel daun diambil dan ditimbang 5 g kemudian dibilas dengan akuades 45 ml yang terdapat dalam beaker glass. c. Maseration (pengancuran), sampel yang berbentuk padat dapat ditumbuk dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam air. Contoh sampelnya antara lain bakso, biji, buah dll. Perbandingan antar berat sampel dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9 (w/v). Untuk sampel dari tanah tak perlu dimaserasi 2.2.1 Prosedur Isolasi Terdapat dua prosedur isolasi yang umum digunakan pada setiap praktikumikrobiologi. Prosedur pertama yaitu streak plate, mungkin merupakan satu-satunya prosedur yang paling umum digunakan dalam laboratotium mikrobiologi. Campuran bakteri disebarkan di atas permukaan media nutrisi solid sehingga koloni yang terisolasi dapat berkembang. Prosedur kedua, pour plate, kurang umum digunakan untuk mengukur jumlah bakteri dalam suatu sampel. Prosedur ini memerlukan satu takar sampel yang dicampurkan dengan media yang dilelehkan, kemudian dituangkan ke dalam petri plate, lalu dilarutkan dengan benar. Koloni yang terisolasi akan berkembang setelah inkubasi. 1) Streak Plate
31
Streak plate yang berhasil akan menghasilkan koloni terisolasi yang dapat dipindahkan pada media baru dengan keyakinan bahwa koloni tersebut adalah murni. Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru. a. Goresan Sinambung Cara kerja : Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai setengah permukaan agar. Jangan pijarkan loop, lalu putar cawan 180oC lanjutkan goresan sampai habis. Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal, melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.
Goresan T Cara kerja : Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan streak zig-zag pada daerah 2 (streak pada gambar). Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna Lakukan hal yang sama pada daerah 3 a.
32
a.
Goresan Kuadran (Streak quadrant) Cara kerja : Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel mikroorganisma.Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal.
1)
Pour Plate Teknik ini memerlukan agar yang belum padat o (>45 C) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan selsel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen. Adapun prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut : Siapkan cawan steril, tabung pengenceran yang akan ditanam dan media padat yang masih cair (>45oC) Teteskan 1 ml secara aseptis.suspensi sel kedalam cawan kosong Tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar cawan untuk
33
menghomogenkan suspensi bakteri dan media, kemudian diinkubasi.
Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0,1 ml untuk spread plate dan 1 ml untuk pour plate karena spread plate ditujukan untuk menumbuhkan dipermukaanya saja, sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate.
2.2.1 Estimasi Kuantitatif Jika kita mengetahuivolume sampel asli yag digunakan untuk membuat larutan pertama pada uor plate, juga larutan terakhir yang digunakan, kita dapat menentukan jumlah bekteri yang terdapat dalam sampel. Kita tinggal mengalikan ketiga variable tersebut untuk mendapatkan jawabannya. Kebanyakan ahli mikrobiologi akan melaporkan hasilnya sebagai jumlah bakteri/mL atau colony-forming units (CFU)/mL. sebagai contoh, hasil dari pembiakan urine dapat dilaporkan sebagai 9.750bakteri/mL atau sebagai > 100.000 bakteri/mL.
34
2.2.2 Morfologi Koloni Morfologi bakteri merujuk penampilan fisik dari koloni terisolir. Perlu kita ingat, ketika koloni dikembangkan pada plate terisolasi, anda akan seringkali mengamati karakteristik fisik dari bakteri yang terisolir sejak pertma kali. Karakteristik fisik ini seringkali bersifat spesifik untuk tipe bakteri yang membentuk koloni dan dapat digunakan sebagai alat pengenalan. Namun demikian, morfologi koloni dari bakteri yang sama bisa berbeda pada kondisi lingkungan yang berbeda. Hal yang perlu kita ingat lagi adalah bahwa morfologi koloni umumnya hanya ditentukan pada koloni yang ditanam dipermukaan. Koloni yang tertanam pada media, sama halnya dengan pour plate, dikelilingi oleh media dan dibatasi oleh karakteristik fisik media. Koloni yang berada di dalam media cenderung lentikular, atau berbentuk seperti bola sepak, karena pertumbuhan koloni cenderung membagimedia, dan memungkinkan pertumbuhan terjadi hanya pada tonjolan yang dihasilkan. Karakteristik apapun yang memungkinkan kita untuk membedakan akan mengenali tipe koloni dapat digunakan. Daftar di bawah ini dimaksudkan untuk menjadi petunjuk atau sebagai contoh pengamatan ketika kita mengamati morfologi suatu bakteri. Karakteristik fisik koloni: 1) Bentuk dan tampilan koloni Conve, Concave, Flat, Center , Plateau, Dimpled, Fried Egg 2) Konsistensi koloni Mulus, Kasar, Kering, Granuar, Berfiber, Mucoid 3) Tepian koloni Menyebar, Mulus, Rhizoid , Lobate 4) Warna koloni 5) Perubahan yang terjadi pada permukaan media Makalah Mikrobiologi 35
Sebagian bakteri dapat melarutkan agar dan terlihat tenggelam ke dalamnya.
2.2 Media Selektif dan Diferensial Mikroorganisme yang berbeda memiliki kebutuhan fisik yang berbeda pula, dan harus dipenuhi jika kita ingin membiakannnya dengan baik.selain itu, setiap mikroorganisme pun memiliki kebutuhan yang spesifik. Untuk sebagian spesies, mereka hanya membutuhkan permukaan untuk tumbuh, garam anorganik yang terbatas, dan udara. Diperlukan juga persediaan molekul organic kompleks untuk kebutuhan nutrisinya. Media adapat juga digunakan untuk menyediakan informasi tambahan tentang organism yang diamati. Dengan menggunkan indikator pH, sumber karbon atau nitrogen, atau agen kimia penghambatan penghambatan mampu memanfaatkan, byproduct metabolism yang dihasilkan, atau kemampuann organism untuk bertahan terhadap agen kimia. Media bakeriologis dapat memenuhi berbagai tujuan dalam laboratorium mikrobiologi. Mulai dari memungkinkan kita untuk mengelompkan spesimen, pemindahan spesimen di Laboratorium, deteksi, isolasi primer, dan identifikasi sifat-sifat fisiolegis mikroorganisme, perbanyakan, dan penentuan kerentaan anti mikroba. Pemilihan media akan bergantung pada sumber mikrorganisme atau organism spesifik yang ditunjukan. Penggunaan beragam media daapt ditemukan paad Difco Manual (Difco Laboratories) dan BBI Manual (Becton Dickinson). 2.2.1 Pengertian Media Media adalah campuran bermacam-macam zat hara atau nutrisi atau makanan untuk tumbuhnya mikroorganisme. Media adalah suatu zat yang dijadikan tempat untuk menanam dan menumbuh kembangkan mikroorganisme yang kita inginkan. Dalam pemilihan media, kita tidak boleh main-main karena setiap mikroorganisme yang berbeda jenis memiliki Makalah Mikrobiologi 36
kebutuhan fisik yang berbeda pula.Selain itu, kita juga harus memperhatikan tujuan kita mempergunakan media tersebut. Berdasarkan wujudnya, media ada yang berbentuk cair, berbentuk padat, media cair yang bis dipadatkan, dan media padat yang bisa dicairkan. Jika dilihat dari susunan kimianya, media dibagi menjadi: 1) Media organic, yaitu media yang terbuat dari bahan organic 2) Media anorganik, yaitu media yang terbuat dari bahan anorganik 3) Media sintesis, yaitu media yang diketahui susunan kimianya dengan pasti 4) Media nonsintesis, yaitu media yang tidak diketahui susunan kimianya secara pasti. Biasanya digunakan untuk mempelajari taksonomi suatu supensi. Untuk menumbuhkan mikroorganisme dengan baik, maka kita harus dapat memilihkan media yang sesuai dengan mikroorganisme yang akan kita tananm dan tumbuhkembangkan. Berikut adalah syarat-syarat dari media yang baik: 1) Media harus mengandung semua zat hara yang mudah digunakan oleh mikroba (tergantung jenis mikroba) 2) Media harus mempunyai tekanan osmotis, pH lingkungan yang sesuai, tegangan permukaan yang tepat, dan suhu yang sesuai 3) Media tidak boleh mengandung zat-zat racun yang dapat menghambat tumbuhnya mikroba 4) Media harus dalam keadaan steril sebelum digunakan Perlu kita ingan juga, bahan yang bisa digunakan untuk media harus merupakan bahan baku supaya hasil yang diperoleh dari pengujian mikroorganisme tidak dipengaruhi zat medianya, sehingga di manapun pengujian dilakukan, akan mendapat hasil yang sama dan akurat tentunya. Berikut adalah bahan yang umun digunakan dalam pembuatan media: 1) Air suling 2) Agar, merupakan Agar khusus untuk keperluan bateriologi, bukan Agar yang sering kita temukan di pasaran. 3) Bahan-bahan kimia (seperti MgSO4, Na2SO4), yang boleh digunakan adalah yang proanalisa bukan teknis. Makalah Mikrobiologi 37
4) Beef Extract, yang sudah distandarisasi (bebas lemak) tentunya. 5) Garam Empedu, merupakan campuran Na-ghikola dan NaTauracholate. 6) Gula murni 7) Gelatin yang tidak mengandung karbohidrat, dan difermentasi oleh mikroorganisme mikroorganisme untuk membedakan mikroorganisme yang bersifat proteolitik 8) Pepton, berasal dari hasil hidrolisa protein 9) Proteose pepton, adalah pepton khusus yang dibuat dari daging sapi segar. Digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme penumbuh racun 10)Empedu sapi jantan (ox-gall), adalah berasal dari empedu segar yang dimurnikan. Digunakan untuk menghambat pertumbuhan mikroorganisme secara selektif 11)Tepung susu skim, adalah susu tanpa lemak 12)Trypticase, merupakan pepton yang diperoleh dari casein (protein susu) 13)Trypton, adalah hasil dari hidrolisa dari casein yang berkualita sangat baik dengan menggunakan cairan pangkreas 14)Ekstrak Khamir (Yeast Extract), hasil hidrolisa ekstrak khamir. Digunakan untuk mempercepat pertumbuhan mikroorganisme Berikut adalah cara dari pembuatan media: 1) Mencampur seluruh bahan dan dilarutkan dalam air suling 2) Panaskan (baik langsung ataupun di penangas) agar bahan larut seluruhnya dan homogen 3) Menyaring, tidak semua media harus disaring. Media yang harus disaring adalah media yang mengandung gelatin/agar dan disaring dalam keadaan panas. Penyaringannyapun dilakukan sebelum penambahan agar arau gelatin. 4) Menentukan dan mengatur pH, karena mikroba hidup dan tumbuh paad ph yang berbeda-beda 5) Memasukannya ke dalam wadah, wadah harus sudah dalam keadaan steril dan sudah diberi label 6) Dibugkus dengan kertas perkamen (jika tidak ada gunakan kertas biasa) sebelum dilakukan inkubasi Makalah Mikrobiologi 38
2.2.1 Tujuan Penggunaan Media 2.2.1.1Media Pemindahan Salah satu faktor yang paling kritis dalam laboratorium mikrobiologi adalah pemeliharaan organism secara layak dari sejak dikoleksikan dari pasien hingga pembiakan di laboratorium. Media pemindahan merupakan media semi solid, non nutrisi yang menghambat reaksi perusakan enzim dengan sendirinya di dalam sel. Media tersebut juga diformulasikan untuk mencegah efek mematikan oksidasi. Contoh media pemindahan termasuk di dalamnya Amies Transport Media dan Stuart Transport Media. 2.2.1.2Media Isolasi Tujuan dari media isolasi adalah untuk menentukan keberadaan mikroorganisme pada materi pembiakan. Hal ini memerlukan eliminasi organism flora normal agar keberadaan pathogen dapat ditentukan. Ketika sampai pada tahap pemilihan media selektif, beberapa criteria harus diperhatikan. Hal ini termasuk spesimen, media pemindahan apa yang digunakan, reaksi gram pembiakan, keberadaan organism komensal, dan sifat agen yang dicurigai. 2.2.1.3Media Tujuan Umum Media tujuan umum merupakan media non selektif. Media ini akan membantu pertumbuhan berbagai macam flora normal tubuh, pathogen, dan mikroba tanah. Untuk merangsang pertumbuhan mikroorganisme, faktor pengaya seperti darah, hemoglobin, dan faktor pertumbuhan, dapat ditambahkan. Contoh media tujuan umum adalah Agar nutrisi (NA), Agar Tryptic Soy, dan Agar darah untuk pertumbuhan bakteri, dan Agar Sabouraud Deztrose untuk fungsi. 2.2.1.4Media Selektif dan Diferensial Media Selektif merupakan media yang ditambahkan zat kimia tertentu yang bertujuan untuk mencegah tumbuhnya mikroba lain. Seringkali kita mencoba untuk mnegisolasi suatu organisme yang membangun flora normal lingkungan, Makalah Mikrobiologi 39
tetapi malah mencarikeberadaan spesies lain yang tidak hadir secara rutin pada media (jarang hadir).hal ini termasuk mencari keberadaan Eshericia coli dalam air (indikator terjadinya kontaminasi air dengan bakteri fecal) atau keberadaan mikrobakteria di dalam sampel sputum. Untuk memfasilitasi deteksi organism tersebut di antara flora normal, media selektif digunakan. Media diformulasikan untuk menekan dan menghambat pertumbuhan satu kelompok mikroorganisme tetapi tetap membiarkann pertumbuhan golongan (tertentu yang diinginkan) lainnya yang ada dalam flora campuran. Hal ini biasanya dapat dicapai melalui suatu penggabungan Agar (agen) bakteriostatik dan penghambat lingkungan fisik atau bahan kimia pada suatu media. Contoh bahan kimia yang digunakan diantaranya adalah antibiotik, natrium klorida, natrium azide, phenylethanol, dan garan empedu, yang di antara mereka hanya sedikit yang sering atau umum digunakan. Contoh media selektif adalah Agar CAN Columbia, Agar Phenylethanol, dan Agar Lowenstein Jensen. Sedangkan media diferensial adalah media yang ditambahkan bahan atau zat kimia tertentu yang menyebabkan mikroba membentuk pertumbuhan sehingga mikroba dapat dibedakan tipe-tipenya setelah dilakukan inkubasi. Sebagai contoh, jika gula yang difermentasi, seperti glukosa, terdapat pada media dan juga indikator pH, hal tersebut akan memberikan pemisahan visual yang cepat antara organism yang berfermentasi dengan nonfermentasi setelah inkubasi. Contoh media selektif dan deferensial: 1. Agar Garam Mannitol Mengandung konsentrasi garam tinggi (7,5% NaCl), yang dapat menghambat pertumbuhan kebanyakan bakteri, kecuali Staphylococcus. Media ini juga mengadakan fungsi differensial karena mengandung karbohidrat mannitol, dimana beberapa Staphylococcus dapat melakukan fermentasi , phenol Makalah Mikrobiologi 40
red (pH indikator) digunakan untuk mendeteksi adanya asam hasil fermentasi manitol. Staphylococcus ini memperlihatkan suatu zona berwarna kuning di sekeliling pertumbuhannya, Staphylococcus yang tidak melakukan fermentasi tidak akan menghasilkan perubahan warna. 2. Agar Darah Darah dimasukkan ke dalam medium untuk memperkaya unsur dalam pembiakan mikroorganisme terpilih seperti Streptococcus sp. Darah juga akan memperlihatkan sifat hemolysis yang dimiliki Streptococcus. a) gamma hemolisis: tidak terjadi liysis sel darah merah, tidak adanya perubahan medium di sekitar koloni b) alpha hemolisis: terjadi lisis sel darah merah dengan reduksi hemoglobin menjadi metahemoglobin menghasilkan lingkaran kehijauan sekitar pertumbuhan bakteri beta hemolisis: terjadi lisis sel darah merah dilengkapi kerusakan dan penggunaan hemoglobin oleh mikroorganisme menghasilkan zona bening sekeliling koloni. 1. Agar McConkey Menghambat pengaruh kristal ungu terhadap pertumbuhan bakteri Grampositif, selanjutnya bakteri Gram-negatif dapat diisolasi. Medium dilengkapi dengan karbohidrat (laktosa), garam empedu, dan neutral red sebagai pH indikator yang mampu membedakan bakteri enterik sebagai dasar kemampuannya untuk memfermentasi laktosa. Pada dasarnya bakteri enterik dipisahkan ke dalam dua kelompok: a) Coliform basil menghasilkan asam dari fermentasi laktosa. Bakteri memperlihatkan warna merah pada permukaannya. Escherichia coli menghasilkan kuantitas asam lebih Makalah Mikrobiologi 41
banyak dibandingkan spesies coliform yang lain. Jika ini terjadi medium di sekitar pertumbuhan juga akan berubah menjadi merah seharusnya pengaruh asam terjadi pengendapan garam empedu yang diikuti penyerapan pewarna neutral red. b) Disentri, tifoid, dan paratifoid batang tidak memfermentasi laktosa, maka tidak menghasilkan asam. Koloni kelihatan tidak berwarna dan seringkali transparan 1. Agar Eosin-Methylene Blue (EMB agar) Laktosa dan zat pewarna eosin serta metilen biru mampu membedakan antara enterik yang memfermentasir laktosa dengan nonfermenter sebaik identifikasi terhadap basilus colon Escherichia coli. Koloni E. coli tersebut kelihatan biru kehitaman dengan kilat hijau logam/metalik yang disebabkan besarnya kuantitas asam yang dihasilkan dan pengendapan zat pewarna di atas permukaan pertumbuhan. Bakteri coliform lain seperti Enterobacter aerogenes terbentuk tebal, mukoid, koloni berwarna pink di atas medium ini. Bakteri enterik nonfermenter laktosa membentuk koloni tidak berwarna maka kelihatan transparan, kelihatan di atas medium yang berwarna ungu (merah lembayung). Medium ini juga dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram-positif, sedangkan bakteri Gram-negatif tumbuh lebih baik. 2. Agar Darah Telurit Untuk menggisolasi Corynebacterium digunakan agar darah telurit (Mc Leod), sebagai medium selektif, setelah inkubasi selama 24 jam koloni bakteriterlihat berwarna abu-abu tua-hitam. Selanjutnya untuk biakan murni Corynebacterium digunakan media perbenihan Loeffler dalam tabung. 3. Agar Tioglikolat/Tarrozi (Perbenihan Anaerob) Perbenihan tioglikolat, mengandung asam tioglikolat yang dapat mengikat oksigen sehingga tercapai suasana anaerob dalam perbenihan. Perbenihan Tarrozi, kaya akan enzim peroksidase sehingga zat toksik (H2O2) yang Makalah Mikrobiologi 42
dihasilkan Clostridium tetani berubah menjadi tidak toksik (H2O dan O2) dan kuman dapat tumbuh terus dalam perbenihan. 4. Agar TCBS dan Agar Monsur Agar TCBS (thiosulfat citrat bile sucrose), Agar Monsur (mengandung telurit gelatin agar atau kaldu agar alkalis yang mengandung Na-tourokolat), digunakan untuk mengisolasi genus Vibrio. Setelah diinkubasi selama 24 jam pada temperatur 37oC di atas media berwarna hijau kehitaman koloni akan terlihat bundar berwarna kuning muda, transculent dan permukaannya rata. 5. Agar Coklat atau Thayer-Martin Medium agar coklat (Thayer-Martin) merupakan media terpilih untuk genus Neisseria. Untuk pertumbuhannya diperlukan suasana anaerob (fakultatif) dengan sedikit gas CO2 dan tidak boleh kekeringan, sehingga pembiakan yang cocok digunakan dalam eksikator yang diberi kapas basah pada bagian bawah Petri yang berisi biakan. 6. Medium Agar Lowenstein-Jensen Medium agar padat tersebut banyak digunakan untuk perbenihan genus Mycobacterium, bakteri ini dapat tumbuh walaupun dalam waktu relatif lama, kecuali jenis atipik golongan rapid growers dapat tumbuh dalam 3-7 hari.
2.2.1.1Media Pengayaan Terkadang keberadaan sejumlah floral normal dapat melebihi dan menghalangi keberadaan pathogen yang ingin diamati. Media pengayaan didesain untuk menekan flora normal yang tumbuh menyaingi pathogen, sehingga memungkinkan pathogen untuk dapat ditumbuhkan dan diisolasi lebih jauh. Contohnya adalah air daging GN untuk kultivasi selektif Shigella-Salmonella dari spesimen limbah dan air daging Selentine Cystine untuk pengayaan Shigella-Salmonella dari makanan dan produk susu. 2.2.1.2Media Isolasi Khusus Makalah Mikrobiologi 43
Media isolasi khusus diformulasikan untuk kebutuhan terhadap mikrooranisme spersifik sehingga memungkinkan isolasi dan identifikasi yang lebih cepat (singkatnya: untuk menumbuhkan satu jenis mikroba saja). Contohnya adalah Agar Mannitol Salt yang bersifat selektif untuk Staphylococcus patogenik. 2.2.1.3Media diperkaya Media yang ditambahi zat-zat tertentu (serum, zat tanaman) yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri heterotrof seperti Shigella-Salmonella
2.2.1.4Media Identifikasi Begitu organism telah diisolasi, penting untuk dengan segera dan secara akurat ditentukan identitasnya. Hal ini untuk keperluan perawatan terhadap infeksi yang mungkin terjadi atau pemusnahan mikroorganisme yang tidak diinginkan ynag masuk ke dalam lingkungan. Media identifikasi seringkali menggunakan pengetahuan tentang sistem enzim untuk memungkinkan pengidentifikasian yang lebih cepat. 2.2.1.5Media Pengujian Media yang terbuat dari zat-zat tertentu untuk melakukan pengujian seperti pengujian antibiotik. 2.3 Perhitungan Mikroba 2.3.1 Penghitungan jumlah bakteri secara keseluruhan (langsung) Penghitungan secara langsung dapat dilakukan secara mikroskopis yaitu dengan menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil. Alat yang digunakan adalah Petroff-Hauser Chamber atau Haemocytometer. Jumlah cairan yang terdapat antara coverglass dan alat ini mempunyai volume tertentu sehingga satuan isi yang terdapat dalam satu bujur sangkar juga tertentu. Ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm. Satu kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,2 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini Makalah Mikrobiologi 44
adalah 0,1 mm. Sel nakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui.
Luas kotak sedang : =pxl = 0,2 x 0,2 = 0,04 mm2 jadi misalnya diperoleh: Volume kotak sedang : 20 sel dalam satu kotak sedang = 0,04 mm2 x 0,1 mm maka jumlah sel keseluruhan : = 0,004 mm3 = 20 x (1/4) x 106 Karena 1 ml = 1cm2 = 5 x 106 sel/ml Maka : = 0,004 mm3 = 0,000004 cm3 = 4x10-6 ml Sel/ml : = jumlah sel/4x10-6 ml = (jumlah sel/4) x 106 = jumlah sel x () x 106 = jumlah sel x 2,5 x 105 Kotak sedang : Makalah Mikrobiologi 45
Re 2.6. aks 1. i Met kar ode bo Eks hid Jumlah sel/ml = jumlah sel x 2,5 x 105 peri rat Dengan perhitungan yang sama maka diperoleh rumus untuk me yan kotak kecil : ntal g Jumlah sel/ml = jumlah sel x 4 x 106 bia uk sa menentu dig kan un karakteri aka stik n biokimia unt suatu uk organism ide e, ntif kita harus iasi menggun ad akan ala media h yang rea membant ksi u kat dan mengem ab bangkan olic karakteri de stik gra tersebut dat dan kita if Ki p harus In yan 4. 5. M sa K menggun di g 6. 7.-akan Phdig 4 2 et ra k 6. 2.4 Karakteristik Fisiologi Bakteri I 7. beberapa Br un 8 9 en 6. hy n at 0 tes o aka kimia Ketika Iodine dan kanji bereaksi, akan menghasilkan warna ol 0 l d or ungu yang pekat. Jika plate agar kanji dituangi dengan larutan ini m n sering 8. m M a iodine, kanji yang ada kan bereaksi dengan iodine, sehingga 7. th 4 melibatk er bak n menyebabkan pembentukan warna ungu pekat. Jika kanji telah 6 y ku an ahteri W dihidrolisasi (digunakan) oleh bakteri yang dibiakan, meskipun ku m penggun ni seb ar dituangi oleh iodine, maka tidak akan menghasilkan warna ungu ni ol aan ngag ku n yang pekat, tetapi tetap tidak ada perubahan. ng birindikator - ai ni a u pH m ba pada ng birmedia er gia u untuk ahn Makalah Mikrobiologi 46 mendete dar ksi i produksi me
Enzim yang disekresikan oleh bakteri yang menghidrolisis kanji disebut enzim amylase, dan pengujiannya biasa disebut tes amylase. 2.6.2 Tes Methyl Red Voges Proskauer (MR-VP) Tes Methyl Red Methyl red merupakan indikator pH yang berubah warna pada pH yang lebih rendah (sekitar 4,5) dari pada phenol merah. Ketika beberapa tetes methyl merah diteteskan pada air daging yang mengandung gula, perubahan warna akan Nampak jika ph turun sekitar 4,5 ke bawah dan berwarna kuning pada pH di atas 4,5. Tidak seperti phenol merah yang digunakan pada fermentasi air daging, warna merah bersifat positif untuk tes methyl merah yang mengindikasikan suatu pH pada sisi asam pada indikator. Tes ini digunakan pada kebanyakan skema identifikasi untuk organisme berbentuk gram negative. Tes Voges Proskauer Tes ini merupakan tes spesifik untuk intermediasi metabolic yang dihasilkan ketika gula difermentasikan untuk menghasilkan butylenes glycol sebagai tambahan untuk asam. Fermentasi butylenes glycol merupakan salah satu pola fermentasi yang dilakukan oleh bakteri gram negative. Ini merupakan pola fermentasi alternative untuk organisme yang hanya menghasilkan asam saja. Tes VP yang positif hampir tidak pernah diamati dengan tes MR positif karena tes MR didasarkan pada produksi asam yang cukup untuk menurunkan pH di bawah 4,5, jika sebagian gula yang difermentasikan digunakan untuk pembuatan butylenes glycol, maka ia tidak bisa digunakan untuk memproduksi asam. Pada tes ini ditambahkan reagen barrit (A dan B) pada media, lalu amati perubahan warna setelah dibiarkan beberapa waktu (kira-kira 10 menit) agar tejadi reaksi. 2.6.3 Penggunaan Sitrat Media Agar Sitrat Simmon digunakan untk menentukan apakah isolasi yang ada mampu menggunakan sitrat sebagai salah satu sumber karbohidrat yang dapat dioksidasi. Media tersebut juga memiliki indikator pH yang berubah warna ketika sitrat digunakan. Indikator tersebut (Brom Thymol Blue) berubah Makalah Mikrobiologi 47
dari kuning menjadi biru ketika sitrat digunakan. Alasan perubahan pH, dari netral (warna ungu hijau) menjadi alkalin, merupakan sesuatu yang rumit yang berhubungan dengan reaksi logam alkalin bumi pada suatu media cair. Ketik sitrat digunakan, reaksi tersebut akan berlangsung dan indikator berubah dari hijau ke biru. 2.5 Karakteristik Fisiologi Bakteri II Bakteri pada umumnya metabolisme karbohidrat sebagai sumber energy, dan memilih untuk menggunakan protein dan asam amino untuk sintesis dan pertumbuhan. Akan tetapi, ketika tidak terdapat karbohidrat yang dapat dioksida pada media, atau ketika bakteri menggunakan karbohidrat, atau ketika bakteri tidak dapat digunakan karbohidrat yang dapat dioksidasi pada media. Maka organisme tersebut harus dapat enggunakan asam amino dan protein yang ada, mengoksidasi rantai karbon, dan akadang mengeluarkan molekul bagian residual yang tidak terpakai, seperti ammonia dan hydrogen sulfide. Media berikut menghambat ketersediaan karbohidrat untuk pertumbuhan bakteri. Hal ini memaksa organisme untuk menggunakan, ketika memungkinkan, protein dan asam amino yang ada. Kita kemudian dapat menguji produk sampingan dekomposisi protein atau mencari bahan bukti lain dan aktifitas proteolitik (hidrolisis atau pemecahan protein). 2.5.1 Hidrolisis Gelatin Gelatin merupakan koloid protein yang menjaga bentuk gelnya pada suhu di bawah 250C. Bentuk gel koloid juga bergantung pada integritas structural protein yang ditemukan pada gelatin, dan hidrolisis pada peptid akan mengakibatkan kerusakan pada koloid. Organisme yang menghasilkan enzim galatinase dapat menghidrolisis gelatin, dengan derajat hidrolisis gelatin yang berfungsi sebagai indikator aktifitas enzim. Hasil produk berupa peptid yang dapat dilarutkan dan asam amino yang adapat berfungsi sebagai sumber karbon dan energy bagi organisme 2.5.2 Indole Indole adalah senyawa yang dihasilkan ketika asam amino tryptophan dihidrolisasi menjadi asam pyruvic (yang digunakan untuk metabolism energy) dan indole yang dikeluarkan melalui Makalah Mikrobiologi 48
aksi tryptophanase. Keberadaan tryptophanase (enzim) merupakan sebuah perbedaan yang segnifikan antara Eschericia coli yang menghasilkannya dan oleh karenanya indole positif dengan organisme enteric lainnya. 2.5.3 Produksi Hidrogen Sulfida Hydrogen sulfide merupakan produk sampingan dari perpecahan cysten oleh bakteri yang manghasilkan enzim cysten desulfurase. Hal ini memungkinkan organisme untuk menggunakan asam amino yang mengandung sulfur untuk metabolism energinya. Hydrogen sulfide dikeluarkan dan adapat diujikan melalui pemanfaatan formasi black precipitate ketika bereaksi dengan perak, besi, atau lead di dalam media. Untuk menguji produksi hydrogen sulfide, kita harus menggunakan media yang mengandung amino bersulfur dan sumber logam yang disebutkan di atas. Besi (seperti ferro sulfat), atau lead seperti lead asetat adalah sumber yang paling umum digunakan.
2.5.4 Hidrolisis Urea Urea dihasilkan sebagai hasil sampingan atau produk sampingan dari dekomposisi protein dan asam nukleit. Jika suatu organisme manghasilkan enzim urease, ia akan dimungkinkan untuk mendetoksifikasi urea, sebuah produk limbah, dan untuk melepaskan energy yang dapat digunakan ketika menghidrolisasinya menjadi ammonia dan karbondiokurease. Ammonia bereaksi dengan air pada media untuk menghasilkan ammonium hidroksida, sehingga menyebabkan pH menjadi naik. Media urea mengandung indikator phenol merah sebagai tambahan urea dan memiliki pH awal sekitar 6,5 6,8. 2.5.5 Reduksi Nitrat Reduksi nitrat merupakan karakteristik yang ditunjukan oleh beberapa organisme dengan frekuensi produksi nitrit yang digunakan dalam diagnose protokoler pada batang gram negative. Nitrat digunakan pada menerima terakhi electron dalam respirasi anaerob, mengurangi nitrat pada nitrit. Makalah Mikrobiologi 49
Senyawa kimia digunakan untuk mendeteksi nitrit sebagaimana sisa nitrat dan produk sisa nitrat lainnya. Setelah nitrit diproduksi, ada kemungkinan dapat direduksi lebih jauh menjadi produk gas termasuk gas nitrogen, atau ammonia. Produk gas dilepaskan ke atmosfer, dan ammonia sering digunakan untuk sintesis protein, meskipun dapat dikeluarkan pada media dalam berbagai kondisi. Jika suatu organisme mendapatkan hasil tes yang negative untuk keberadaan nitrit, ada kemungkinan 3 hal yang mengkin terjadi, yaitu: 1. Organisme tidak mengurangi kadar nitrat 2. Organisme mengurangi kadar nitrat dan langsung mengubahnya menjadi nitrit, tetapi juga memproduksi nitrit reduktasi yang mereduksi nitrit menjadi ammonia Denitrifikasi nitrat telah terjadi, mengakbatkan reduksi nitrit menjadi gas hydrogen. 2.2 Karakteristik Fisiologi Bakteri III Terdapat banyak bakteri yang memproduksi enzim yang lalu dikeluarkan pada media. Sebagai contoh, hidrolisis kanji dan pancairan gelatin terjadi karena beberapa bakteri mengeluarkan enzim hidrolitik yang dapat menyebabkan depolimerisasi (pecah menjadi unit yang lebih kecil) terhadap molekul-molekul tersebut. Sebagian besar dari enzim yang dikeluarkan memiliki signifikansi ekologis atau medis, serta terdapat beberapa yang juga memiliki kepentingan diagnostic. Signifikansi klinis dari berbagai enzim ini terdapat pada kemampuannya untuk melawan substrat di membrane sel, jaringan, atau cairan tubuh sehingga berhubungan dengan mekanisme pertahanan tubuh atau homeostatis. Pada kasus yang lain enzim bersifat antigenic dan dapat diujikan melalui reaksi serologis yang memberikan bukti pengungkapan bakteri yang memproduksi enzim. Ketika bakteri memproduksi flagella, maka mereka dimungkinkan untuk dapat berenang di dalam cairan dan media lunak. Bakteri ini bersifat motile. Motilitas adalah hasil dari aktifitas flagella oleh spesies bakteri yang menghasilkannya. Biasanya untuk menguji enzimatik dengan cara menambahkan substrat enzim pada pembiakan bakteri lalu menguji tampilan produk atau hilangnya substrat. Sebagai contoh adalah ketika kita melakukan hidrolisis kanji lalu menambahkan iodine untuk menguji hidrolisis pada kanji. Makalah Mikrobiologi 50
2.8.1 Enzimatik Spesifik Tes Katalase Katalase adalah enzim yang dihasilkan oleh banyak organisme, termasuk manusia. Katalase begitu umum ditemukan sehingga organisme yang tidak dapat menghasilkan katalase sangat sulit ditemukan, dan ketiadaan katalase menjadi suatu arakteristik diagnostic yang signifikan. Enzim ini mengubah hydrogen peroksida menjadi air dan oksigen dan melakukannya secara giat sehingga menimbulkan busa. Hydrogen peroksida dihasilkan ketika beberapa molekul organic oksida secara langsung. Hydrogen peroksida ini harus segera dipindahkan karena sangat beracun bagi sebagian besar sel-sel. Oleh karena itu kebanyakan sel aerob atau fakultatif menghasilkan hal tersebut adalah sel anaerob atau mikroaeroflilik. Beberapa bakteri yang memiliki flavoprotein dapat mereduksi O2 dengan menghasilkan hydrogen peroksida (H2O2) atau superoksida (O2-). Kedua bahan ini merupakan bahan yang toksik dan menghancurkan komponen sel dengan sangat cepat. Bakteri harus dapat mempertahankan diri dengan memproduksi O2 atau akan terbunuh. Beberapa bakteri dapat memproduksi enzim yang dapat mengkatalisis superoksids yaitu peroksida dismutase, dan juga katalase atau peroksidase yang dapat mendekstruksi hidrogen peroksida.Katalase adalah enzim yang mengkatalisasikan penguraian hydrogen peroksida (H2O2) menjadi air dan O2. Hidrogen peroksida terbentuk sewaktu metabolisme aerob, sehingga mikroorganisme yang tumbuh dalam lingkungan aerob dapat menguarikan zat toksik tersebut.Uji katalase ini dilakukan untuk mengidentifikasi kelompok bakteri bentuk kokkus, dalam membedakan Staphylococcus dan Streptococcus. Dimana kelompok streptococcus bersifat katalase negative dan Staphylococcus bersifat katalase positif. Penentuan adanya katalase ini terlihat dari pembentukan gelembung udara di sekitar koloni setelah ditambahkan larutan H2O23%. Reaksi kimiawi yang dikatalisasikan oleh enzim terlihat sebagai berikut : Makalah Mikrobiologi 51
superoksida 2 O2+ 2H+ O2+ H2O2 desmutase katalase H2O2 H2O + O2 (gelembung udara) Peroksidase Tes Oksidase Terdapat banyak bakteri yang memproduksi enzim yang lalu dikeluarkan pada media. Sebagai contoh, hidrolisis kanji dan pancairan gelatin terjadi karena beberapa bakteri mengeluarkan enzim hidrolitik yang dapat menyebabkan depolimerisasi (pecah menjadi unit yang lebih kecil) terhadap molekul-molekul tersebut. Sebagian besar dari enzim yang dikeluarkan memiliki signifikansi ekologis atau medis, serta terdapat beberapa yang juga memiliki kepentingan diagnostic. Signifikansi klinis dari berbagai enzim ini terdapat pada kemampuannya untuk melawan substrat di membrane sel, jaringan, atau cairan tubuh sehingga berhubungan dengan mekanisme pertahanan tubuh atau homeostatis. Pada kasus yang lain enzim bersifat antigenic dan dapat diujikan melalui reaksi serologis yang memberikan bukti pengungkapan bakteri yang memproduksi enzim. Ketika bakteri memproduksi flagella, maka mereka dimungkinkan untuk dapat berenang di dalam cairan dan media lunak. Bakteri ini bersifat motile. Motilitas adalah hasil dari aktifitas flagella oleh spesies bakteri yang menghasilkannya. Biasanya untuk menguji enzimatik dengan cara menambahkan substrat enzim pada pembiakan bakteri lalu menguji tampilan produk atau hilangnya substrat. Sebagai contoh adalah ketika kita melakukan hidrolisis kanji lalu menambahkan iodine untuk menguji hidrolisis pada kanji. Fermentasi dan oksidasi adalah dua proses penting dalam metabolisme mikroorganisme. Dimana tujuan akhirnya adalah akumulasi energi, baik untuk aktivitas mikroorganisme maupun untuk proses-proses biologis lain. Oksidasi umumnya dilakukan pada respirasi aerobic menghasilkan CO2dan H2O, sedangkan fermentasi menghasilkan etanol dan gas.Adapun uji ini dilakukan
52
untuk mengetahu kemampuan mikroorganisme untuk menggunakan karbohidrat dengan cara fermentasi atau oksidasi Tes Koagulase Koagulase,suatu protein mirip enzim yang dapat menggumpalkan plasma yang telah diberi oksalat atau sitrat dengan bantuan suatu faktor yang terdapat dalam banyak serum. Bakteri yang membentuk koagulase dianggap mempunyai potensi menjadi patogen invasive. 2.8.2 Motilitas Dimanapun motilitas bukan merujuk pada reaksi kimia, tetapi lebih pada karakteristik organisme yang dapat dengan mudah diamati melalui penggunaan media yang benar. Bakteri yang memiliki flagella mempu berenang dalam cairan dan media lunak (kurang dari setengah jumlah agar yang biasanya ditemukan pada media plate atau slant). Kemampuan ini dapat langsung melalui kaca preparasi zat basah, atau secara tidak langsung dengan menggunakan deep agar lunak. Motilitas adalah salah satu dari ciri mahluk hidup, begitu pula dengan mikroorganisme, namun alat geraknya masih sederhana berupa flagella atau cilia. Bakteri melakukan motilitas dengan menggunakan energi yang diperoleh dari ATP yang diuraikan oleh koenzim ATP-ase membentuk fosfo anorganik.Beberapa protein kaya akan asam amino yang mengandung gugus sulfur seperti sistein. Jika protein ini dihidrolisis oleh bakteri, asam amino akan dilepaskan. Sistein dengan adanya sistein desulfurase, ahan melepaskan atom sulfur yang dengan adanya hydrogen dari air akan membentuk gas hydrogen sulfide. gas ini juga dapat diproduksi dengan reduksisenyawa anorganik yang mengandung sulfur seperti tiosulfat, sulfat atau sulfit. Sebagai petunjuk adanya aktivitas motilitas ini dapat diamati daerah bekas tusukan dari medium yang telah diinokulasikan oleh biakan dan diinkubasikan. Medium ini ditambahkan senyawa anorganik yang mengandung sulfur, yaitu natrium tiosulfat. Natrium tiosulfat ini akan bereaksi dengan ion hidrogen dari air, dan dengan adanya enzim tiosulfat reduktase, maka akan dihasilkan ion sulfit dan gas H2S. Gas ini akanbereaksi dengan feri ammonium sulfat yang datambahkan Makalah Mikrobiologi 53
(sebagai indicator untuk H2S) ke dalam media sehingga terbentuk FeS yang berwarna hitam. Pembentukan FeS inilah yang diamati sebagai penunjuk adanya aktivitas motil dari bakteri uji pada tabung yang berisi medium motility setelah diinkubasikan 2.3 Analisa Makanan Banyak bakteri, virus, dan jamur menyerang makanan yang masih berupa bahan makanan mentah seperti sayuran, buah, susu, daging. Banyak pula yang menyerang makanan yang sudah dimasak, seperti nasi, roti, kue, lauk-pauk, dan lain sebagainya. Bakteri yang tumbuh di dalam makanan kita mengubah makanan tersebut manjadi zat-zat organic yang berkurang energinya. Hasil metabolism spesies-spesies tertentu digemari oleh manusia, misalnya alcohol sebagai hasil metabolisme Saccharomycetes sereviciae, cuka sebagai hasil metebolisme Acetobacter sp. Ada beberapa spesies yang hasil metabolismenya merupakan eksotoksin yang berbahaya bagi kesehatan manusia. Faktor yang menyebabkan spesies dari bakteri saprobe dan dari bakteri pathogen, jika makanan yang dihinnapinya memiliki pH, kelembaban, dan temperature yang menguntungkan bagi mereka. Toksin yang mereka hasilkan dapat berupa: 1.Enterotoksin, yaitu toksin yang dapat menggangu alat pencernaan 2.Neurotoksin, yaitu toksin yang dapat menyerang dan mengganggu urat saraf Makanan yang telah dipasteurisasi, kemudian disimpan terusmenerus di dalam kaleng pada tempertur kamar, dapat mangandung Clostridium botulinum. Spora-spora dari bakteri ini tidak akna mati dalam proses pasteurisasi. Makanan merupakan media alami bagi mikroba. Dengan sendirinya makanan pasti mengandung mikroorganisme dengan jenis barmacam-macam bahkan dapt mengandung pathogen penghasil racun atau pencemar. Kehadiran mikroba ini karena adanya kontaminasi baik dari bahan dasar, alat pengolahan makanan, air pencuci, pekerja, udara, dan lainnya. Makanan yang layak konsumsi oleh manusia adalah yang bebas dari mikroba dan pathogen, penghasil
54
racun maupun pencemar. Makanan sebagai media alami mikroba dapat berupa makanan segar ataupun makanan awetan. 2.2 Analisa Air Pemeriksaan air secara mikrobiologi sangat penting dilakukan mengingat air merupakan sumber kehidupan utama bagi semua makhluk hidup. Segala macam air perlu mendapat perhatian untuk diperiksa baik secara mikrobiologi, fisik, maupun kimia untuk menghindari mengkonsumsi air yang tercemar. Syarat bakteriologi air ditetapan sebagai berikut: 1. Tidak boleh mengandung mikroba pathogen 2. Tidak boleh mengandung mikroba apathogen terlalu banyak Pemeriksaan air secara mikrobiologi baik kualitatif maupun kuantitatif dapat dijadikan sebagai pengukur derajat pencemaran. Selain andungan mikroba, pencemaran air karena adanya kandungan senyawa organicpun perlu diperhatian. Senyawa organic dalam air merupakan bahan pencemar apabila kadarnya melebihi ambang batas, juga merupakan nutrsi bagi mikroorganisme sehingga pertumbuhan mikroorganisme sangat subur dan banyak. Kandungan mikroba yang terlalu tinggi dalam air dapat menurunkan kualitas air. Pemeriksaan air secara mikrobiologi meliputi: 1. Pemeriksaan jumlah total mikroorganisme 2. Deteksi dan enumerasi terhadap bakteri pathogen Shigella dan Salmonella juga terutama Eschericia coli 3. Jumlah perkiraan terdekat jumlah terdekat bakteri coli, baik coli umum maupun coli fekal Bakteri golongan coli merupakan indikator terhadap intra bacteriaceae. Bakteri coli dapat dipakai sebagai indikator adanya pencemaran baik oleh manusia ataupun hewan. Adanya bakteri coli dalam air, identik dengan adanya bakteri pathogen. Analisa bakteri golongan coli dilakukan dengan tahap-tahap sebagai berikut: 1. Presumtif test 2. Confimed test 3. Complited test Cara pengambilan sampel air: Makalah Mikrobiologi 55
1. 2. 3. 4. 5.
Buka kran, biarkan mengalir 2-3 menit lalu tutup lagi. Panaskan mulut kran dengan api sampai uap air keluar Buka kran dan biarkan beberapa saat Siapkan botol steril dan lewatkan mulut botol pada nyala api kemudian isi dengan air kran tersebut. Lewatkan lagi mulut botol di atas api. Kemudan tutup dengan penutup steril yang telah dilewatkan di atas nyala api juga sebelumnya.
Berita mengenai keamanan air minum isi ulang banyak mewarnai media masa, misal ditemukannya bakteri Escherichia coli, Coliform dan bahkan Salmonella dalam air minum isi ulang yang diambil dari beberapa depo. Nama-nama bakteri tersebut tentunya cukup membingungkan masyarakat awam, khususnya tentang signifikansi dan konsekuensi keberadaan bakteri-bakteri tersebut dalam air. Tulisan ini akan membahas tentang mengapa bakteribakteri tersebut diuji sebagai indikator air minum dan apa arti keberadaan bakteri-bakteri tersebut di dalam air minum maupun makanan. Bakteri Indikator Sanitasi, Escherichia coli dan Coliform Dalam bidang mikrobiologi pangan, dikenal istilah bakteri indikator sanitasi. Dalam hal ini pengertian pangan adalah pangan seperti yang tercantum pada Undang-Undang Pangan No. 7 tahun 1996 yang mencakup makanan dan minuman (termasuk air minum). Bakteri indikator sanitasi adalah bakteri yang keberadaannya dalam pangan menunjukkan bahwa air atau makanan tersebut pernah tercemar oleh kotoran manusia. Mengapa demikian? Karena bakteribakteri indikator sanitasi tersebut pada umumnya adalah bakteri yang lazim terdapat dan hidup pada usus manusia. Jadi adanya bakteri tersebut pada air atau makanan menunjukkan bahwa dalam satu atau lebih tahap pengolahan air atau makanan tersebut pernah mengalami kontak dengan kotoran yang berasal dari usus manusia dan oleh karenanya mungkin mengandung bakteri patogen lainnya yang berbahaya. Apa sajakah bakteri indikator sanitasi? Sampai saat ini ada 3 jenis bakteri yang dapat digunakan untuk menunjukkan adanya masalah sanitasi yaitu Escherichia coli , kelompok Streptococcus Makalah Mikrobiologi 56
( Enterococcus ) fekal dan Clostridium perfringens . Clostridium perfringens adalah bakteri Gram positif pembentuk spora yang sering ditemukan dalam usus manusia. Meskipun demikian, bakteri ini jarang digunakan sebagai indikator sanitasi karena metode pengujiannya kurang spesifik, kadang-kadang ditemukan di luar usus manusia (tanah, debu, lingkungan dan sebagainya) dan karena bakteri ini termasuk patogen asal pangan ( foodborne pathogens ) penyebab keracunan maka pengujiannya membahayakan. Kelompok Streptococci fekal merupakan bakteri Gram positif bukan pembentuk spora yang ditemukan dalam usus manusia. Akan tetapi Streptococci fekal relatif tidak banyak diujikan sebagai indikator sanitasi karena beberapa spesiesnya ditemukan di luar usus manusia (S. equinus pada usus kuda, S. bovis pada sapi) dan korelasinya dengan terdapatnya patogen tidak dianggap bagus. Meskipun demikian bakteri ini baik digunakan sebagai indikator sanitasi apabila jarak pengambilan sampel dan laboratorium pengujian cukup jauh karena relatif lebih tahan berada di dalam air ketimbang Escherichia coli . Bakteri yang paling banyak digunakan sebagai indikator sanitasi adalah E. coli , karena bakteri ini adalah bakteri komensal pada usus manusia, umumnya bukan patogen penyebab penyakit sehingga pengujiannya tidak membahayakan dan relatif tahan hidup di air sehingga dapat dianalisis keberadaannya di dalam air yang notabene bukan merupakan medium yang ideal untuk pertumbuhan bakteri. Keberadaan E. coli dalam air atau makanan juga dianggap memiliki korelasi tinggi dengan ditemukannya patogen pada pangan. E. coli adalah bakteri Gram negatif berbentuk batang yang tidak membentuk spora yang merupakan flora normal di usus. Meskipun demikian, beberapa jenis E. coli dapat bersifat patogen, yaitu serotipeserotipe yang masuk dalam golongan E. coli Enteropatogenik, E.coli Enteroinvasif, E. coli Enterotoksigenik dan E.coli Enterohemoragik . Jadi adanya E. coli dalam air minum menunjukkan bahwa air minum tersebut pernah terkontaminasi kotoran manusia dan mungkin dapat mengandung patogen usus. Oleh karenanya standar air minum mensyaratkan E. coli harus absen dalam 100 ml. Berbagai cara pengujian E. coli telah dikembangkan, tetapi analisis konvensional yang masih banyak dipraktekkan adalah dengan 4 tahap analisis yang memerlukan waktu 5-7 hari. Empat tahap analisis Makalah Mikrobiologi 57
tersebut adalah Uji Pendugaan dengan metode MPN ( most probable number ), Uji penguat pada medium selektif, Uji lengkap dengan medium lactose broth, serta Uji Identifikasi dengan melakukan reaksi IMViC (indol, methyl red, Vogues-Praskauer, dan citrate). Jadi untuk dapat menyimpulkan E. coli berada pada air atau makanan diperlukan seluruh tahapan pengujian di atas. Apabila dikehendaki untuk mengetahui serotipe dari E. coli yang diperoleh untuk memastikan apakah E.coli tersebut patogen atau bukan maka dapat dilakukan uji serologi. Meskipun demikian, beberapa serotipe patogen tertentu seperti O157:H7 yang ganas tidak dapat diuji langsung dengan pengujian 4 tahap ini dan memerlukan pendekatan analisis khusus sejak awal. Karena uji E. coli yang kompleks, maka beberapa standar, misalnya Standar Nasional Indonesia (SNI), mensyaratkan tidak adanya coliform dalam 100 ml air minum. Apakah yang dimaksud dengan Coliform ? Coliform adalah kelompok bakteri Gram negatif berbentuk batang yang pada umumnya menghasilkan gas jika ditumbuhkan dalam medium laktosa. Salah satu anggota kelompok coliform adalah E. coli dan karena E. coli adalah bakteri coliform yang ada pada kotoran manusia maka E. coli sering disebut sebagai coliform fekal. Pengujian koliform jauh lebih cepat jika dibandingkan dengan uji E. coli , karena hanya memerlukan Uji penduga yang merupakan tahap pertama uji E coli 4 tahap di atas. Apa artinya jika terdapat coliform dalam air minum atau makanan? Artinya ada kemungkinan air atau makanan itu mengandung E. coli , tetapi mungkin juga tidak mengandung E. coli karena bakteri-bakteri bukan patogen dan bukan asal usus dari genus Enterobacter dan beberapa Klebsiella juga menghasilkan uji koliform positif. Jika ingin diketahui apakah coliform tersebut merupakan coliform fekal atau E. coli maka uji tersebut dapat dilanjutkan dengan uji 4 tahap di atas. Akan tetapi jika uji penduga tidak menunjukkan adanya coliform, maka tidak perlu dilakukan uji 4 tahap di atas. Pada air bukan untuk minum umumnya terdapat perbedaan persyaratan coliform dani E. coli . Air untuk kolam renang misalnya mensyaratkan kandungan coliform <2.4 x 10 3 , tetapi syarat E. coli tentunya lebih ketat yaitu < 1 x 10 3 dalam 100 ml. Salmonella dalam air minum atau makanan : Salmonella adalah bakteri Gram negatif berbentuk batang bukan pembentuk spora yang terdiri dari sekitar 2500 serotipe Makalah Mikrobiologi 58
yang kesemuanya diketahui bersifat patogen baik pada manusia atau hewan. Bakteri ini bukan indikator sanitasi , melainkan bakteri indikator keamanan pangan . Artinya, karena semua serotipe Salmonella yang diketahui di dunia ini bersifat patogen maka adanya bakteri ini dalam air atau makanan dianggap membahayakan kesehatan. Oleh karena itu berbagai standar air minum maupun makanan siap santap mensyaratkan tidak ada Salmonella dalam 100 ml air minum atau 25 gram sampel makanan. Pengujian Salmonella juga memerlukan tahapan yang cukup panjang dan hanya dengan pengujian lengkap maka seseorang bisa menyimpulkan keberadaan Salmonella . Uji Salmonella umumnya didahului dengan tahap pre-enrichment pada medium kaya untuk meyembuhkan sel Salmonella yang luka ( injured ) , selective-enrichment (pengkayaan selektif) pada media selektif untuk menghalau bakteri-bakteri non Salmonella , tahap isolasi pada beberapa media selektif dan tahap identifikasi berdasarkan reaksi-reaksi biokimia pada media identifikasi dan konfirmasi serologi atau biokimiawi yang menetapkan apakah bakteri tersebut benar-benar Salmonella atau bukan. 2.2 Analisa Susu Susu merupakan tempat persemaian atau media yang baik bagi pertumbuhan bakteri. Berkembang biaknya bakteri tidaklah terjadi bersamaan waktunya namun berganti-ganti. Mula-mula terjadi perubahan zat-zat protein kasein dari susu yang dipeptonisasi oleh bakteri kasease seperti Staphylococcus, Basil proteus, Basil subtilis, dan Basil mesentericus, yang dapat berbahaya karena toksalbumin dan ptomaine. Karena perubahan tersebut susu menjadi tempat yang subur bagi Bacillus acidi/lactici seperti macam-macam Coli dan Bacillus aerogenes yang menyebabkan susu menjadi asam, pecah, berbau asam, dan pahit-asin rasanya. Selanjutnya asam yang telah terbentuk dinetralisasi oleh bakteri Bacillus faecalis alcaligenes yang memecah albumosa dan kasein susu dengan mengeluarkan amoniak. Akhirnya susu menjadi busuk sama sekali dan penuh dengan berbagai cendawan seperti Penicillium, Aspergillus, dan Iodium lactis. Sebagai pengaruh dari bakteri susu dapat menjadi mengalami perubahan antara lain, susu berasa pahit karena pengaruh bakteri Makalah Mikrobiologi 59
kasease, atau mempunyai rasa lobak akibat Coli, atau rasa seperti sabun karena Bacillus lactis saponacei, atau tengik karena bakteri acid boric. Air susu normal mengandung bakteri yang berperan dalam menghasilkan enzim yang dalam keadaan normal sangat bermanfaat dalam air susu. Enzim tersebut antar lain fosfatase, katalase, lipase, peroksidase, dsb. Menurut SNI, batasan jumlah koloni bakteri adalah 1 juta/ml. Apabila melebihi batas tersebut maka susu memiliki kualitas yang kurang baik. Syarat penghitungan jumlah koloni bakteri : 1. Koloni yang dihitung adalah yang tumbuh antara 30-300 koloni bakteri. 2. Bila jumlah koloni kurang dari 30 koloni, pilih koloni pada pengenceran terendah. 3. Bila jumlah koloni lebih dari 300 koloni, pilih koloni pada pengenceran tertinggi. 4. Jika jumlah koloni di antar 30-300 maka cari rasio dengan membagi hasil tertinggi dengan hasil terendah 5. Jika rasio < 2 maka ambil rata-rata, sedangkan jika rasio > 2 ambil dari pengenceran terendah. Dari hasil pemeriksaan susu UP2KH UGM didapatkan jumlah koloni yaitu 8 koloni pada pengenceran dan 22 pada pengenceran. Karena jumlah koloni kurang dari 300 maka ambil dari pengenceran terendah yaitu 8 koloni pada pengenceran. Jumlah koloni bakteri adalah 8x104 CFU/ml. Berdasarkan SNI maka susu yang diperiksa layak untuk dikonsumsi Susu merupakan makanan yang sangat tinggi kadar nutrisinya . karbohidrat,lemak, protein,dan vitamin serta mineral semuanya terkandung di dalam susu sehingga dengan demikian susu juga merupakan makanan yang baik bagi mikroorganisme. Berbagai jenis mikroorganisme dapat tumbuh didalam susu dan dapat menyebabkan berbagai macam perubahan pada susu. Pemecahan senyawa-senyawa dari susu dapat menimbulkan berbagai jenis produk dengan segala sifatnya seperti asam, bau , dll. Susu merupakan habitat kuman yang ideal terdiri atas tetesan lemak yang teremulsi dan melarutkan, konsentrasi fisiologik garamgaram ,gula-gula, dan protein dalam air. Susu juga mengandung enzim-enzim yang berasal dari binatang.Gula terbentuk dalam bentuk laktosa suatu disakharida tempat glukosa terikat pada salah satu Makalah Mikrobiologi 60
stereoisomernya, galaktosa. Susu segar memiliki pH kira-kira 6,8 yang berada dalam jajaran optimal untuk kebanyakan kuman-kuman.Pada penanganan normal (dalam tempat penyimpanan terisi),susu cenderung anaerob. Susu merupakan suatu perbenihan yang diperkaya dan karena itu, hanya jenis-jenis yang paling cocok yang dapat bertahan hidup.Kuman pertama yang dapat hidup subur diantaranya Sterptococcus lactis meragikan laktosa menjadi asam laktat.Dengan menurunnya pH pada susu maka, spesies lain dapat tumbuh seperti Lactobacillus casei dan Lactobacillus acidophilus, bila disimpan pada suhu tubuh, maka mungkin yang akan tumbuh adalah bakteri Enterobacter (Aerobacter)aerogenes da Eschericia coli, dll. Pengamatan Pemeriksaan JPT/MPN susu: Perhitungan JPT/MPN susu: Karena,jumlah koloni yang tumbuh pada media adalah sebanyak 2400, maka tidak memenuhi standar syarat perhitungan koloni.sehingga, jumlah pasti mikroorganisme yang ada dinyatakan Too Numeric To Count (TNTC). Perhitungan Mikroorganisme Secara Langsung dengan Mikroskop: Setelah diamati dan dihitung secara matematis, jumlah bakteri yang terdapat dalam susu dapat ditentukan @ 1 mL adalah sebanyak 1,49 . 10-2 sel/mL sedangkan jumlah bakteri keseluruhan adalah 8.92 . 10 2 sel/mL. Pengaruh Bakteri Terhadap Susu: Setelah melihat pengaruh bakteri tehadap susu, maka dapat disimpulkan bahwa pada susu yang tidak ditambahkan biakkan bakteri juga terdapat mikroba yang menyebabkan terjadinya koagulasi,peptonisasi,dan fermentasi.Sedangkan bakteri E.coli, L.bulgaricus, P.aeruginosa, dan B.subtilis juga menyebabkan terjadinya proses koagulasi,peptonisasi, dan fermentasi. Test Reduksi Methylene Blue: Warna Methylene Blue pudar setelah 13 jam, dan tereduksi sepenuhnya setelah 26 jam. Hal ini terjadi karena setiap mikroba dalam susu mengahasilkan enzim dehidrogenese dan jumlah mikroba yang terkandung hanya sedikit sehingga proses reduksi lebih lama berlangsung. Makalah Mikrobiologi 61
Berdasarkan waktu yang diperlukan oleh susu untuk mengalami reduksi, dapat diketahui bahwa jumlah mikroorganisma yang mungkin terkandung dalam susu adalah sebanyak: koloni = 200.000 koloni. Uji Coliform: 1. Presumetive Test: Pada uji ini, dapat ditentukan bahwa kemungkinan jumlah mikroorganisme yang terkandung didalam sample susu adalah sebanyak 1100 koloni per 100 mL . 2. Confirmed Test: Pada uji ini, dapat dilihat bahwa berdasarkan cirri-ciri koloni yang tumbuh pada media EMB maka koloni yang tumbuh dapat dipastikan adalah bakteri Eschericia coli . 3. Completed Test: Pada uji ini, dapat dipastikan bahwa jenis bakteri coli yang terkandung dalam sample susu adalah jenis coli fekal dan umum. Akan tetapi, sebenarnya bakteri jenis coli fekal tidak ada, hasil pada percobaan menunjukkan positif karena mungkin alat yang digunakan tidak steril.
2.2 Uji Agen Anti Mikroba Agen anti mikroba meliputi semua agen baik secara fisik maupun kimia yang menghancurkan atau menghambat pertumbuhan mikroorganismee. Kita meneliti keefektifan beberapa agen pengendali fisik dalam. Untuk kali ini kita akan fokus kepada agen mikroba kimia. Istilah gemircide sering digunakan untuk menunjukan kemampuan suatu bahan kimia untuk menghancurkan atau menghambat pertumbuhan mikroorganismee. Tindakan yang lebih spesifi dapat dilihat dari penggunaan istilah yang lebih tepat, misalnya bactericide (agen yang membunuh sel bakteri), sporicide (agen yang membunuh endospora atau spora jamur), rirucide (agen yang membunuh virus), atau fungicide (agen yang membunuh jamur). Perbedaan penamaan terebut penting digunakan untuk penggunaannya. Bahan kimia lain tidak membunuh mikroorganismee, tetapi hanya menghambat pertumbuhannya. Agen ini disebut microbastatic. Sama halnya dengan germicide, istilah microbisatic dapat menunjukan tindakan spesifik yang dapat digunakan. Makalah Mikrobiologi 62
Agen pengendali kimia juga diklasifikasikan oleh kemampuannya untuk digunakan dalam jaringan hidup dibandingkan dengan kemampuannya yang hanya dipakai dalam permukaan tak bernyawa. Bahan kimia ini tidak beracun, sehingga dapat digunakan dengan aman untuk kulit atau membrane selaput lendir dan biasanya tetapi tidak selalu bacteriostatik. D sisi lain, desinfektan digunakan untuk bahan yang tidak bernyawa. Desinfektan mungkin hampir sama dengan antiseptic, namun biasanya digunakan dalam konsentrasi yang lebih tinggi. Apakah obat pemutih untuk keperluan rumah tangga dapat digunakan untuk antiseptic atau desinfektan? Bagaimana dengan hydrogen peroksida? Klasifikasi Agen Anti Mikroba Agen anti mikroba diklasifikasikan oleh komposisi dan metode tindakannya. Biasanya saat kita menerima suntikan atau pengambilan darah, kulit kita dibersihkan dengan alcohol. Karena penguapan yang cepat, efektifitasnya hanya sedikit karena hanya membunuh sel vegetatif yang berada pada permukaan kulit. Endospora, bakteri resistan, dan organisme dalam pori-pori kulit tidak terpengaruh. Alcohol berperan dalam pelarutan lipid yang melarutkan membrane sel. Saat digabungkan dengan air, maka akan mengurangi sifat protein. Oleh karena itu ethyl atau isoprophyl alcohol biasanya digunakan dalam konsentrasi 70%-80%. Antiseptic kulit dan agen antiseptic kulit lainnya yang banyak digunakan adalah halogen terutama iodine dan klorin. Larutan iodine merupakan salah satu agen antiseptic yang digunakan pertamak kali. Penggunaan iodine dalam aplikasi klinis telah diganti oleh iodophors yang mengkombinasikan iodine dengan organic surfavant. Hal ini memberikan antiseptis dalam waktu penggosokan pembedahan dan penyiapan kulit sebelum pengirisan. Klorin digunakan sebagai hypoclorous acid dalam obat pemutih, perawatan air, dan berbagai agen sabitasi komersial. Namun, salah satu keterbatasan pemakaiannya adalah bisa dinonaktifkan dengan adanya bahan organic. Logam berat seperti merkuri, tembaga, perak, seng, dan selenium bekerja dengan tindakan oligodynamik (sedikit kekuatan), yaitu bergabung dengan molekul protein dan mengubah sifatnya. Bentuk merkuri yang biasa digunakan adalah merthiolate dan mercurochrome, trimerosal untuk antiseptis kulit, desinfeksi instrument dan pengawetan vaksin. Tembaga lazim digunakan untuk Makalah Mikrobiologi 63
pengendalian pertunbuhan alga dalam air. Nitrat perak telah digunakan untuk mencegah pertumbuhan organisme gonococcal pada mata yang baru lahir, dan baik perak nitrat maupun sufadiazine perak digunakan untuk luka bakar parah. Seng dan selenium termasuk agen anti jamur dalam minyak obat kulit dan shampoo. Awalnya Lister menggunakan phenol sebagai agen anti mikroba. Kemudian phenol diganti dengan sejumlah turunannya atau phenolic karena kadar racun pada phenol. Agen tersebut mengubah sifat protein dan menganggu membrane sel. Efektifitasnya tidak tidak dipengaruhi oleh keberadaan bahan organic. Banyak jenis phenolic seperti hexachlorophene dan chlorhexidine gluconate yang merupakan kombinasi phenolic dan halogen untuk meningkatkan efektifitasnya. Banyak desinfektan laboratorium yang biasa digunakan merupakan senyawa quartenary ammonium. Termasukdiantaranya Zephiran dan Roccal. Namun penggunaannya agak terbatas karena telah terbukti tidak hanya gagal menggunakan organisme Pseudomonas, justru membantu pertumbuhannya. Pengujian Difusi Disk Tekinik difusi disk biasanya digunakan untuk menguji aktifitas antiseptic, desinfenktan, dan agen kemoterapi. Pengujian ini berdasarkan kepada difusi molekul (agen yang diuji) dari bagian konsentrasi tinggi (disk) ke bagian yang rendah (media). Efektifitas agen akan berkurang seiring dengan berkurangnya konsentrasi agen sehingga menghasilkan berbagai zona penghambatan. Kecepatan dilusi molekul tergantung pada beberapa faktor meliputi berat molekul, bentuk bahan yang diuji, konsentrasi, media yang digunakan, keberadaan bahan organic, dan suhu inkubasi. Oleh karena itu, kita tidak dapat mengasumsikan bahwa semakin besar zona penghambatan, maka agen akan semakin efektif. Tetapi, kita harus berasumsi apakah sebuah agen kimia dapat menghambat atau tidak organisme yang ditentukan.
64
BAB III PROSEDUR KERJA

3.1 Sterilisasi Alat dan Bahan : 1. Pengendalian mikroorganisme dengan cara fisik a. Media agar deeps b. Media agar slaud c. Media agar plate d. Media nutrisi cair e. Media alat-alat gelas,pipet,ose, dll f. Media autoklaf 1. Pengendalian mikroorganisme dengan bahan kimia a. Daya kerja b. Disinfektan : c. Fenol 5% d. Lisol e. Axi f. Alcohol 70% g. Hipoklorit 5-25% h. Biakan : i. Staphylococcus aureus j. Salmonella sp k. Koefisien fenol : l. Biakan staphylococcus aureus (24 jam) m. Fenol (asam karbonat) A. Pengendalian Secara fisik 1. Sebelum melakukan sterilisasi terlebih dahuluperiksa banyaknya air dalam otoklaf. 2. Masukkan media atau alat-alatlaboratorium yang akan disterilkan, kemudian tutup dengan sekrup pengaman. 3. Nyalakan api dan biarkan katu uap/udara tetap terbuka sehingga semua udara didalam otoklaf di ganti oleh uap, kemudian tutup katup uap/udara. Makalah Mikrobiologi 65
4. Pergantian udara dengan uap ini diikuti oleh peningkatan tekanan dalam suhu. Pada saat tekanan mencapai 15 lbs dan suhu meningkat sehingga 121c, proses sterilisasi dimulai.waktu yang di perlukan untuk mensterilkan media atau alat-alat laboratorium sekitar 15-20 menit. 5. Setelah proses sterilisasi api di matikan dan tekanan dibiarkan turun sehingga mencapai 0, otoklaf tidak boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0, karena cairan dalam tabung atau labu dapat tumpah keluar disebabkan penurunan suhu yang mendadak. 6. Buka tutup otoklaf kemudian ambil peralatan atau media yang disterilkan dengan sarung tangan tahan panas, perhatikan bahwa peralatan dan cairan yang baru dikeluarkan dari otoklaf bersuhu tinggi sehingga dapat menyebabkan luka bakar. 7. Untuk melihat bahwa otoklaf bekerja dengan sempurna dapat digunakan mikroba penguji yang bersifat thermofilis(b.stearothermophilus) dalam bentuk spore strip. 8. Spore strip di masukan ke dalam dextrose tripone broth dan di inkubasi pada suhu 55-66 C bila kaldu tetap setelah masa inkubasi hal ini menunjukan bahwa otoklap telah bekerja sempurna. A. Sterilisasi dengan bahan kimia A. Daya kerja desinfektan Ambil 2 tabung agar yang telah di cairkan. Inokulasi masing masing tabung dengan biakan yang telah di sediakan. Tulis nam desinfektan dan nama bakteri pada cawan petris. Kocok tabung di antar dua telapak tangan ,kemudian tuang ke dalam cawan perti ,biarkan agar membeku. Ambil cakram kertas dengan pinset kemudian dalam larutan desinfektan yang di sediakan. celupkan ke
Letakan cakram kertas pada permukaan lempengan agar,jarak antar cakramkertas harus cukup jauh. 66
Inkubasi pada suhu 37c selama 48 jam. Ukur luas daerah jernih. Bandingkan daya kerja berbagai desinfektan terhadap kedua bakteri.
A. Koefesien fenol Hari ke 1 1. Encerkan fenol dalam aqua destilate steril sehingga di peroleh pengenceran 1:80 1:90 1:100. 2. Masukan 5ml dari tiap pengenceran dalam tabung, beri tanda pengenceran dalam tiap tabung. 3. Inokulasi setiap pengenceran dengan 05 ml nutrient broth organisme penguji (24 jam). 4. Encerkan bahan antimikrobial (desinfektan) uji dengan aqua destilata steril sehingga di peroleh pengenceran 1:10, 1:150, 1:200, 1:250, 1:30, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500. 5. Masukan 5ml dari tiap pengenceran ke dalam tabung,beri tanda pengenceran. 6. Inokulasi tiap tabung pengenceran dengan 0,5 ml nutrient broth mikroorganisme Staphylococcus aureus 24 jam. 7. Inokulasi pada suhu 20c 8. Dalam rentang waktu 5,10 dan 15 menit pindahkan satu mata ose dan tabung pengenceran ke dalam tsb yang steril. 9. Kocok baik baik tabung berisi biakan dan inokulasi selama 24 -48 jam pada suhu 35c. Hari ke 2 dan ke 3 1. Kocok tabung baik baik . Tentukan tabung pengenceran yang menunjukan pertumbuhan dan tabung pengenceran yang tidak menunjukan pertumbuhan. Hasil di sajikan dalam bentuk tabel. Makalah Mikrobiologi 67
2. Tentukan nilai koefesien fenolnya. 3.2 Analisis Mikroskopis Alat dan Bahan : 1. Mikroskop cahaya dan mikroskop stereo 2. Pipet dan silet* 3. Pinset 4. Gelas obyek dan kaca penutup* 5. Cawan petri 6. Bunsen 7. Jarum/loup inokulasi 8. Rak dan rak pencuci 9. Botol semprot 10. Kertas isap 11. Potongan kertas berhuruf "A", "d". 12. Tissue 13. Organisme berukuran kecil (semut, bunga rumput, dan lainnya) 14. Butir-butir pati kentang 15. Air dan larutan iodine 16. Biakan bakteri 24-48 jam 17. Metilen biru 18. Kertas lensa 19. Minyak imersi 20. Xilal 21. Aquades 22. Aquades steril 23. Pewarna dasar : kristal violet 24. Larutan pengikat warna dasar : Larutan Iodin 25. Larutan pencuci warna dasar : Alkohol 70 % 26. Pewarna pembanding : Lar. Safranin Prosedur Kerja : A. PENGGUNAAN LENSA OBJEKTIF LOW POWER 1. Ambil mikroskop, siapkan, dan bersihkan semua lensa. 2. Letakkan kaca preparasi letter e pada stage mikroskop dengan benar. 3. Ikuti langkah 1-9 pada bagian Penggunaan Mikroskop. Setelah lensa berada pada fokus yang jelas, sambil melihat melalui lensa okular, sesuaikan berbagai kontrol cahaya (kontrol voltase, Makalah Mikrobiologi 68
diafragma iris, dan kondensor seperti yang tersedia pada mikroskop). Efek apa yang diberikan oleh bagian kontrol cahaya tersebut pada gambar yang diamati? 4. Pindahkan kaca preparasi pada stage dengan menggunakan kontrol stage mekanis jika tersedia. Jika tidak, pindahkan hati-hati dengan tangan. Apa yang terjadi jika anda memindahkan kaca preparasi dari arah depan ke belakang. 5. Pindahkan kaca tempatnya preparasi dari stage dan kembalikan pada
A. PENGGUNAAN LENSA OBJEKTIF HIGH DRY 1. Ambil contoh darah manusia. Dengan menggunakan prosedur di atas. Fokuskan dengan menggunakan lensa objektiflow power. 2. Setelah mengamati dengan lensa low power, putar bagian hidung mikroskop hingga lensa high dry berada di atas kaca preparasi. Ikuti langkah 1-11 pada Penggunaan Mikroskop untuk membantu anda memfokuskan kaca preparasi. 3. Gunakan tombol penyesuai halus untuk memfokuskan sel darah. Pastikan untuk menyesuaikan cahaya pada resolusi maksimum. Selain itu catat besar penyesuaian yang dilakukan dengan menggunakan tombolpenyesuai halus dan ke arah mana anda akan memutarnya. Anda akan menemukan bahwa penyesuaian dengan cara yang sama akan diperlukan pada mikroskop yang sama akan diperlukan pada mikroskop yang sama secara efisien 4. Gerakkan kaca preparasi hingga anda melihat berbagai bentuk sel darah manusia. Gunakan gambar 1.2 untuk membantu anda mengidentifikasi sel-sel yang anda amati. Gambarlah beberapa sel yang terlihat pada formulir laporan laboratorium 5. Pindahkan kaca preparasi dari stage dan letakkan kembali pada tempatnya. A. PENGGUNAAN LENSA OBJEKTIF OIL IMMERSION 1. Ambil kaca preparasi yang sudah ditetesi cairan berisi tiga bentuk bakteri. Makalah Mikrobiologi 69
2. Dengan menggunakan prosedur diatas, fokuskan lensa lowpower. Setelah itu naikkan mikroskop pada lensa high dry. Pastikan anda menyesuaikan cahaya, dan tombol penyesuai halus ketika mengganti lensa. 3. Dengan seksama ikuti langkah 11-14 pada Penggunaan Mikroskop ketika beralih dari lensa highdry ke lensa oil emmersion. Pastikan anda menyesuaikan kembali pencahayaan ketika mengganti lensa. 4. Pada kaca preparasi, tentukan tiap bentuk bakteri dasar (bulat, batang, dan spiral). Gambar beberapa sel yang terlihat dari tiap jenis bakteri pada formulir laporan laboratorium. 5. Setelah selesai mengamati kaca preparasi. Jauhkan stage dari lensa dan pindahkan kaca preparasi. Bersihkan kaca dari minyak secara hati-hati lalu kembalikan ke tempatnya. 6. Bersihkan lensa-lensa pada mikroskop dengan kertas pembersih lensa secara hati-hati, terlebih saat membersihkan minyak pada lensa oil immersion. Ikuti langkah-langkah pada setelah selesai dengan mikroskop. A. PENGGUNAAN LENSA OBJEKTIF LOW POWER 1. Ambil mikroskop, siapkan, dan bersihkan semua lensa. 2. Letakkan kaca preparasi letter e pada stage mikroskop dengan benar. 3. Ikuti langkah 1-9 pada bagian Penggunaan Mikroskop. Setelah lensa berada pada fokus yang jelas, sambil melihat melalui lensa okular, sesuaikan berbagai kontrol cahaya (kontrol voltase, diafragma iris, dan kondensor seperti yang tersedia pada mikroskop). Efek apa yang diberikan oleh bagian kontrol cahaya tersebut pada gambar yang diamati? 4. Pindahkan kaca preparasi pada stage dengan menggunakan kontrol stage mekanis jika tersedia. Jika tidak, pindahkan hati-hati dengan tangan. Apa yang terjadi jika anda memindahkan kaca preparasi dari arah depan ke belakang. 5. Pindahkan kaca tempatnya Makalah Mikrobiologi preparasi dari stage dan kembalikan pada 70
A. PENGGUNAAN LENSA OBJEKTIF HIGH DRY 1. Ambil contoh darah manusia. Dengan menggunakan prosedur di atas. Fokuskan dengan menggunakan lensa objektiflow power. 2. Setelah mengamati dengan lensa low power, putar bagian hidung mikroskop hingga lensa high dry berada di atas kaca preparasi. Ikuti langkah 1-11 pada Penggunaan Mikroskop untuk membantu anda memfokuskan kaca preparasi. 3. Gunakan tombol penyesuai halus untuk memfokuskan sel darah. Pastikan untuk menyesuaikan cahaya pada resolusi maksimum. Selain itu catat besar penyesuaian yang dilakukan dengan menggunakan tombolpenyesuai halus dan ke arah mana anda akan memutarnya. Anda akan menemukan bahwa penyesuaian dengan cara yang sama akan diperlukan pada mikroskop yang sama akan diperlukan pada mikroskop yang sama secara efisien 4. Gerakkan kaca preparasi hingga anda melihat berbagai bentuk sel darah manusia. Gunakan gambar 1.2 untuk membantu anda mengidentifikasi sel-sel yang anda amati. Gambarlah beberapa sel yang terlihat pada formulir laporan laboratorium 5. Pindahkan kaca preparasi dari stage dan letakkan kembali pada tempatnya. A. PENGGUNAAN LENSA OBJEKTIF OIL IMMERSION 1. Ambil kaca preparasi yang sudah ditetesi cairan berisi tiga bentuk bakteri. 2. Dengan menggunakan prosedur diatas, fokuskan lensa lowpower. Setelah itu naikkan mikroskop pada lensa high dry. Pastikan anda menyesuaikan cahaya, dan tombol penyesuai halus ketika mengganti lensa. 3. Dengan seksama ikuti langkah 11-14 pada Penggunaan Mikroskop ketika beralih dari lensa highdry ke lensa oil emmersion. Pastikan anda menyesuaikan kembali pencahayaan ketika mengganti lensa. 4. Pada kaca preparasi, tentukan tiap bentuk bakteri dasar (bulat, batang, dan spiral). Gambar beberapa sel yang terlihat dari tiap jenis bakteri pada formulir laporan laboratorium. Makalah Mikrobiologi 71
5. Setelah selesai mengamati kaca preparasi. Jauhkan stage dari lensa dan pindahkan kaca preparasi. Bersihkan kaca dari minyak secara hati-hati lalu kembalikan ke tempatnya. 6. Bersihkan lensa-lensa pada mikroskop dengan kertas pembersih lensa secara hati-hati, terlebih saat membersihkan minyak pada lensa oil immersion. Ikuti langkah-langkah pada setelah selesai dengan mikroskop. A. PREPARASI SMEAR 1. persiapkan kaca preparasi. Anda akan memerlukan tiga lempeng kaca untuk di warnai. Dua diantaranya akan digunakan untuk penempelan basah. a. Lempeng kaca harus dalam keadaan bersih. Jika terdapat lemak residu pada kaca, smear akan menyebar secara tidak tentu pada lempeng kaca dan akan menyulitkan anda dalam mengamati morfologi bakteri. Cuci semua lempeng kaca dengan sabun dan air. Lanjutkan dengan bilasan air dan bilasan air etil alkohol 95%. Ketika akn digunakan, kaca harus dalam keadaan kering. b. Jika nada menggunakan lempeng kaca yang beku diujungnya, anda dapat menggunakaan pensil untuk memberi label pada lempeng kaca. Ujung yang beku dapat berguna sebagai masker untuk menjaga agar kaca terarah dengan benar (sisi kanan ke atas dan kanan ke kiri). Jika kaca beku tidak tersedia, gunakan pena marker atau pene marker lilin untuk memberi label pada kaca preparsi anda. c. Dengan menggunakan pena marker, gambar dua lingkaran berdiameter sekitar setengah inci pada masing-masing lempeng kaca seperti yang ditunjukkan pada gambar. 1. Preparasi smear dari biakkan agar. Anda akan memerlukan satu set smear untuk masing-masing pewarnaan yang akan di gunakan. a. Letakkan satu tetes kecil air pada tiap lingkaran di atas lempeng kaca. Loop penyuntik adalah alat yang berguna untuk menentukan jumlah air yang sesuai.
72
b. Dengan menggunakan loop. Pindahkan sedikit pembiakkan pada tetesan air. Emulsikan pembiakkan pada tetesan tersebut, campurkan secara menyeluruh dengan air tetesan tersebut. Hal ini akan menghasilkan hasil smear yang cukup keruh (kabur), tetapu tidak buram. Sebarkan secara merata ke seluruh lingkaran. Pastikan anda memegang loop anda di atas api sebelum dan sesudah menggunakannya. c. Ulangi hingga tiap-tiap pembiakan slant disiapkan pada kaca preparasi. d. Biarkan kaca preparasi mengering oleh udara. e. Panaskan bakteri pada lempeng kaca dengan melewatkannya menembus bara pemanas burner beberapa kali. Jika anda kurang memanaskannya, sel bakteri akan tercuci pada proses pewarnaan. Jika terlalu panas, sel-sel bakteri tersebut akan terkarbonasi. 1. Preparasi smear dari biakkan air daging. Anda akan memerlukan satu set smear untuk setiap pewarnaan yang akan digunakan. a. Gunakan loop untuk memindahkan satu loop penuh biakkan air daging pada kaca preparasi anda. Pastikan anda mencampurkan air daging tersebut sebelum pemindahan atau inokulasi. Gunakan teknik asepti ini dan jangan lupa untuk memegang loop di atas api sebelum dan sesudah digunakan. b. Sebarkan tetesan pada area yang ditandai. c. Jika pembiakkan air daging tersebut kurang keruh, anda mungkin perlu untuk menambahkan satu atau dua loop penuh tetesan pada kaca preparasi. d. Ulangi hingga setiap pembiakkan air daging telah disiapkan pada kaca preparasi. e. Biarkan kaca preparasi untuk mengering sendiri. f. Panaskan kaca preparasi seperti yang dilakukan di atas. A. PEWARNAAN
73
1. Setelah kaca preparasi benar-benar dingin, letakkan pada rak pewarnaan yang terletak di atas tempat mencuci atau tempat pewarnaan. 2. Warnai kaca preparasi. Pastikan setiap smear tertutupi sepenuhnya, jangan biarkan smear mengering, tambahkan pewarna tambahan bila perlu dan biarkan smear terwarnai dalam jangka waktu berikut: Crystal violet selama 30 detik Metylen blue 1 menit Safranin 1 menit 3. Bilas warna kaca preparasi dan pegang di bawah aliran air yang perlahan. Jangan biarkan aliran air jatuh langsung pada smear, tetapi biarkan air mengalir diatasnya. 4. Bersihkan air sisa dari kaca dengan cara menepuk perlahan tepian kaca dengan menggunakan kertas pembersih. 5. Biarkan kaca preparasi mwngwring dengan sendirinya. Sebagian orang memilih untuk mengeringkan dengan kertas hisap. Jika instruktur anda mengijinkannya letakkan kaca pembersih pada kertas pembersih dengan posisi yang di warnai berada di atas, lalu keringkan secara hati-hati. Jangan menggosok kaca preparasi dengan kertas. Catatan : prosedur pewarnaan, terutama pewarnaan sederhana, tidak selalu membunuh bakteri, terutama yang membentuk spora. Mengeringkan dengan kertas hisap dapat memindahkan bakteri yang masih aktif pada kertas. Mengeringkan dengan udara merupakan salah satu prosedur untuk menghindari hal tersebut. 6. Amati semua smear dengan lensa objektif oil immersion. Catat pengamatan anda pada formulir laporan laboratorium.
A. PENEMPELAN ZAT BASAH 1. Siapkan zat basah dari tiap-tiap pembiakkan air daging. Pindahkan satu loop penuh pembiakkan pada pusat kaca preparasi yang bersih secara hati-hati. Letakkan kaca penutup di atas pusat kaca.
74
2. Pindahkan salah satu bagian kaca penutup pada kaca preparasi hingga salah satu bagian menyentuh kaca terlebih dahulu kemudian kaca penutup dapat diturunkan seluruhnya. Prosedur ini dapat meminimalisasi formasi dan jumlah gelembung pada tetesan air daging. 3. Jika anda berniat untuk mengamati zat basah tersebut lebih dari beberapa menit, anda harus menambal tepian kaca dengan jeli petroleum. Dengan menggunakan tusuk gigi, letakkan sedikit jeli dengan hati-hati (kira-kira 1,0 mm) pada keempat sisi kaca penutup sebelum meletakkan satu loop penuh air daging pada kaca preparasi. 4. Telungkupkan kaca penutup dan posisikan seperti dijelaskan di atas. Jeli harus membentuk tambalan saat anda menurunkan kaca penutup pada kaca preparasi. Sedikit gerakan menekan mungkin perlu dilakukan agar benar-benar menutup tepian kaca. 5. Amati zat basah tersebut dengan lensa oil immersion pada mikroskop. Tentukan apakah bakteri tersebut bersifat motile dengan cara mengamati arah gerakan (apakah berlawanan dengan gerakan brownian). Ingatlah bahwa bakteri tersebut masih hidup. Buang zat basah tersebut dengan cara aman. 6. Lengkapi formulir laporan laboratorium A. PEWARNAAN GRAM 1. Persiapkan smear pembiakkan bakteri seperti yang diindikasikan instruktur anda. Panaskan yang sudah jadi. 2. Lengkapi pewarnaan gram a. Bubuhi smear dengan crystal violet gram b. Setelah 30 detik, bersihkan crystal violet dengan cara di bilas dengan lembut oleh larutan iodin. c. Bubuhi smear dengan iodine gram dan biarkan bereaksi selam beberapa 1 menit d. Sambil memegangi kaca preparasi di dekat tempat membilas atau wadah pewarnaan, biarkan ethanol atau acetone/ethanol mengalir melalui smear. Saat warna berhenti mengalir dari Makalah Mikrobiologi 75
smear, bilas kaca preparasi dengan air. Langkah ini, yang disebut sebagai dekolorisasi, adalah langkah yang paling penting. Pada langkah ini terlalu banyak menggunakan alkohol biasanya terjadi sehingga menghasilkan sel gram-positif yang terwarnai dengan kurang baik. e. Tutupi smear dengan safranin selama 1 menit. f. Bilas pewarna dari kaca preparasi, keringkan air yang tersisa, lalu keringkan dengan udara. 1. Amati semua smear dengan lensa objektif oil immersion 2. Amati pewarnaan yang telah di siapkan sesuai arahan 3. Lengkapi formulir laporan laboratorium bagian A A. PEWARNAAN ACID-FAST 1. Siapkan smear pembiakkan bakteri seperti yang diindikasikan instruktur anda. Panaskan. 2. Lengkapi pewarnaan acid-fast dengan penggunaan prosedur yang ditunjukan instruktur anda. A. PROSEDUR ZIEHL-NEELSEN a. Siapkan tempat untuk merebus atau gunakan penopang melingkar untuk menopang kaca preparasi ketika di panaskan. b. Potong atu robek sedikit bagian kertas pembersih berukuran lebih besar dari smear, tetapi sedikit lebih kecil dari kaca preparasi (sekitar inci x 2 inci) c. Letakkan kaca preparasi di dalam tempat rebusan atau penopang melingkar tutupi smear dengan potongan kertas pembersih, dan airi kaca preparasi dengan puchsin karbol Ziehl-Neelsen. d. Panaskan kaca preparasi selama tidak lebih dari lima menit. Jika anda menggunakan api bunsen untk memanaskan kaca, uap harus terlihat di atas pewarna. Jangan sampai cairan mendidih jangan biarkan pewarna mengering saat pewarna menguap, tambahkan lagi pada smear.
76
e. Setelah smear dipanaskan selama sedikitnya 5 menit, biarkan kaca preparasi mendingin, lalu bilas dengan air untuk membersihkan sisa pewarna. Jangan biarkan kertas pembersih jatuh ke dalam bak cuci. Gunakan loop, jarum, atau gunting tang untuk meletakannya di dalam tempat sampah f. Bilas kaca preparasi dengan acid-alkohol hingga pewarna berhenti mengalir pada smear. Pewarnaan acid-fast, meski tidak secepat dekolorisasi seperti pada pewarnaan gram, dapat dilakukan pewarnaan kembali jika alkohol digunakan terlalu lama . bilas perlahan dengan air. g. Lakukan counterstain dengan menggunakan methylene blue selama satu menit bilas, keluarkan airnya, dan keringkan. A. PROSEDUR KINYOUN (PEWARNAAN DINGIN) a. Airi smear dengan fuchsin karbol kinyoun, dan biarkan terwarnai selama lima menit. b. Bilas smear dengan air untuk membersihkan warna yang tersisa. c. Bilas kaca preparasi dengan acid-alkohol hingga pewarna tidak lagi mengalir dari smear. Pewarnaan acid-fast, meski tidak secepat dekolorisasi seperti pada pewarnaan gram, dapat dilakukan pewarnaan kembali jika alkohol digunakan terlalu lama . bilas perlahan dengan air. d. Amati semua smear dengan menggunakan lensa objektif oil immersion. e. Amati kaca preparasi yang telah siap sesuai arahan f. Lengkapi formulir laporan laboratorium, bagian B. A. PEWARNAAN GRANULA METAKROMATIK 1. Siapkan smear berisi pembiakkan bakteri seperti yang ditujukan. Panaskan 2. Lengkapi pewarnaan granula metakromatik dengan menggunakan prosedur yang ditunjukkan instruktur anda. Prosedur albert: a. Airi smear dengan pewarna albert selama tiga sampai lima menit. Makalah Mikrobiologi 77
b. Bilas kaca preparasi dengan air lalu keringkan. c. Airi smear dengan iodine gram dan biarkan bereaksi selama satu menit. d. Bilas, bersihkan air, dan keringkan di udara Prosedur Loeffler: a. Airi smear dengan metylene blue loeffler selama tiga menit b. Bilas, bersihkan air, dan keringkan di udara 1. Amati semua smear dengan lensa objektif oil immersion 2. Amati kaca preparasi yang sudah di persiapkan sesuai arahan 3. Lengkapi formulir laboratorium, bagian C 1.3Media Isolasi Alat dan Bahan : 1. Plate agar tryptic soy 2. Plate agar phenylethanol 3. Plate agar manittol salt 4. Plate Levine EMB 5. Plate agar darah 6. Plate CAN Colombia 7. Pembiakkan air daging a. Escherichia Coli b. Entberobacter aureus c. Streptococcus faecalis d. Media, satu per grup Prosedur Kerja : 1. Labeli setiap plate dengan nama media dan informasi pengidentifikasian. Bagi tiap plate menjadi kuadran. Labeli tiap bagian dengan nama suatu organisme yang di ujikan. 2. Inokulasi tiap bagian dengan organism yang benar. 3. Inkubasi semua plate pada suhu 37 4. Setelah diinkubasi catat hasil yang didapat dari tiap plate pada formulir laporan laboratorium. a. Agar trytic soy : amati pertumbuhannnya pada plate apakah artinya jika pada salah satu bagian tidak terdapat pertumbuhan ? Makalah Mikrobiologi 78
b. Agar phenylethanol : amati pertumbuhannya pada plate. c. Agar manitol salt : amati pertumbuhan pada plate. Catat warna pada media yang mengelilingi (pink atau kuning) untuk organisme yang tumbuh. d. Agar Levine EMB : amati pertumbuhan pada plate untuk organism yang tumbuh catat warna pada koloni (pink, hijau, metalik atu tidak berwarna) e. Agar darah : amati pertumbuhan pada plate. Untuk organisme yang tumbuh, catat hemolysisi yang ada. Agar Colombia CAN : amati pertumbuhan pada plate untuk organisme yang tumbuh, catat tipe hemolysisis yang diamati.
1.3Teknik Isolasi Alat dan Bahan : 1. Gelas kimia 250 ml. 2. Batang pengaduk. 3. kassa asbes dan kaki tiga. 4. pembakar bunsen. 5. aqua dm. 6. Botol semprot. 7. Tabung sentrifugal. 8. Bakteri yang diuji. 9. Cawan petri. 10. Loop Prosedur Kerja : Terdapat dua prosedur isolasi yang umum dilakukan pada mikrobiologi. Prosedur pertama adalah streak plate dan yang kedua adalah prosedur pour plate. Streak Plate 1. Ambil plate agar nutrisi lalu beri label untuk keperluan pembuatan streak plate satu untuk pembiakan murni dan satu untuk pembiakan campuran. 2. Dengan menggunakan teknik aseptik seperti dicontohkan instruktur, buatlah streak plate dari semua pembiakan. Jangan Makalah Mikrobiologi 79
gunakan inokolum yang terlalu banyak dan gunakan seluas mungkin permukaan. Jangan sampai media tergali. Jika terjadi kesalahan, ulangi dengan menggunakan plate baru. 3. Tempatkan semua plate pada incubator dengan suhu 37oC dengan posisi terbalik. Biarkan terinkubasi selama 24-48 jam. 4. Amati inkubasi. Catan penjelasan mengenai tiap tipe koloni dan cobalah mengenali tiap tipe pada pembiakan campuran. 5. Jika anda tidak mendapatkan koloni terisolir periksa plate anda dan cari tahu alasannya. Ulangi percobaan hingga mendapatkan koloni yang terisolir jika diperintahkan. 6. Catan pengamatan anda pada formulir laporan laboraturium. Pour Plate 1. Dapatkan dan labeli enamblank larutan serta lima petri dishyang steril. Ambil pipet yang sudah disterilkan. Jangan buka petri dish. 2. Dapatkan lima buah tabung berisi agar nutrisi deeps. Lelehkan pada bejana air yang mendidih. Biarkan terus pada suhu kira-kira 500C-55oC. Jika ada yang melelehkannya untuk anda, jangan pindahkan dar air hingga anda siap untuk menggunakannya. Jika mmedia anda solid di dalam tabung, anda harus mengulangi lagi. Anda harus menyiapkan segalanya sebelum menggunakan agar deeps, karena begitu dipindahkan dari air maka media akan menjadi solid dengan cepat. 3. Dengan menggunakan teknik aseptik, pindahkan 1,0ml sampel pada blank larutan pertama. Campurkan dengan baik, sekarang anda memiliki larutan 1:10. 4. Pindahkan 1,0 ml larutan dari blank pertama ke blank kedua. Campurkan dengan baik, lalu pindahkan lagi 1,0ml larutan pada blank berikutnya. Teruskan hingga semua blank larutan terinokulasi, memindahkan 1,0ml larutan dari tiap tabung larutan pada tabung larutan berikutnya. 5. Dari sini anda akan membuat pour plate untuk setiap larutan. Sekarang saatnya untuk memastikan bahwa media sudah siap dan petri dish berada pada tempatnya. Blank larutan Agar deep Petri plate nomor nomor nomor Tidak di-plateTidak di-plate1 kan kan 2 1 1 Makalah Mikrobiologi 80
3 4 5 6
2 3 4 5
2 3 4 5
6. Setelah mencampurkan larutan pada tabung 2, pindahkan satu loop penuh bakteri ke tabung 1. Campurka media dan segera tuangkan pada petei dish terganggu ketika anda melanjutkan. 7. Ulangi hingga semua tabung berisi agar yang dilelehkan dan petri dish digunakan semua. Pada saat selesai anda akan mempunyai lima plate. 8. Setelah media menjadi solid, tempatkan semua plate pada inkubator pada suhu 37oC. Biarkan terinkubasi selama 24-48 jam. 9. Catan pengamatan anda pada formulir laporan laboraturium. Tulis deskripsi koloni dan coba kenali tiap tipe pada pembiakan campuran. 10. Bandingkan hasil koloni yang didapat pada pour plate dengan yang didapat pada streak plate. Dan catan pengamatan anda.
1.3Karakteristik Fisiologi Bakteri Bagian I Alat dan Bahan : A. Fermentasi Gula 1. Pembiakkan 24 jam dari organisme yang akan diajukan, termasuk : Staphylococcus epidermides Escberisbia coli Entherobacter aerogenes Proteus vulgaris Basilus subtilis 2. Satu tabung untuk tiap organisme Air daging phenol red glukosa Air daging phenol red sukrosa Air daging phenol red lactose Makalah Mikrobiologi 81
Air daging phenol red mannitol A. Hidrolisis Kanji 1. Pembiakkan 24 jam dari organisme yang akan diajukan, termasuk : Staphylococcus epidermides Escberisbia coli Entherobacter aerogenes Proteus vulgaris Basilus subtilis 2. Satu patriplate agar kanji perorganisme 3. Larutan iodine A. Tes Methyl Red Voges Proskauer 1. Pembiakkan 24 jam dari organisme yang akan diajukan, termasuk : Staphylococcus epidermides Escberisbia coli Entherobacter aerogenes Proteus vulgaris Basilus subtilis 2. Satu tabung air daging MR-VP perorganisme 3. Tabung tes steril 4. Pippeter dan pippet steril 5. Reagen : Indikator methyl red Reagen A Barrit Reagen B Barrit A. Penggunaan Sitrat 1. Pembiakkan 24 jam dari organisme yang akan diajukan, termasuk : Staphylococcus epidermides Escberisbia coli Entherobacter aerogenes Proteus vulgaris Basilus subtilis 2. Satu tabung agar sitrat Simmon perorganisme Prosedur Kerja : 1. Fermentasi Gula Makalah Mikrobiologi 82
a. Ambil dan labeli tabung media untuk tiap organisme yang akan diujikan berikut : Air daging phenol red glukosa (dalam tabung durham), Air daging phenol red sukrosa, Air daging phenol red lactosa, Air daging phenol red mannitol. b. Inokulasi satu dari tiap tabung fermentasi gula dengan tiap organisme. Pindahkan secara aseptic satu loop penuh pembiakkan pada tabung. c. Inokulasi semua tabung pada suhu 370C selama 24 jam. d. Setelah inkubasi, amati pertumbuhan pada setiap tabung, produksi asam, dalam air daging glukosa, produksi gas. Catat hasil yang didapat pada formulir laporan laboratorium. 1. Hidrolisis Kanji a. Ambil dan labeli satu plate agar kanji untuk tiap organisme yang diajukan. b. Dengan menggunakan teknik aseptic, inokulasi tiap plate dengan satu lapis tunggal dibagian tengah plate. c. Inkubasi semua plate pada suhu 370C selama 24 jam. d. Setelah diinkubasi, tuang plate dengan larutan iodine. Biarkan beberapa menit agar warna terbentuk. Area yang bersih (warna ungu yang tidak terwarnai) disekeliling koloni mengindikasikan bahwa kanji telah terhidrolisasi. Jika warna ungu meluas ke koloni, hidrolisisbtidak terjadi. Anda akan menemukan bahwa jika anda meninggalkan plate yang dituangi iodine di bwah cahaya, maka warna ungu akan memudar. Pastikan untuk mencatat hasil dengan segera setelah menambahkan iodine. e. Catat hasil yang didapat pada formulir laporan laboratorium. 1. Tes Methyl Red Voges Proskauer a. Ambil dan labeli satu tabung air daging MR-VP untuk tiap organisme. b. Inokulasi setiap tabung, pastikan anda menggunakan teknik aseptic. c. Inkubasi tabung yang diinokulasi pada suhu 370C selama 24 jam. d. Setelah inkubasi, pindahkan 1,0 ml air daging MR-VP pada sebuah tabung tes steril. e. Pada volume yang lebih besar, tambahkan 0,5 ml (sekitar 10 tetes) indicator methyl red. Jika indicator tetap berwarna merah tes bersifat positif, jika berwarna kuning tes negatif.
83
Pada tabung yang berisi 1,0 ml air daging MR-VP, tambahkan 0,6 ml (kira-kira 12 tetes) reagen A barrit dan 0,2 ml (sekitar 4 tetes) reagen B barrit. Campurkan dengan benar lalu tunggu selama 10 menit agar warna terbentuk. Warna merah mengindikasikan tes positif, dan warna kuning mengindikasikan tes negatif. 1. Penggunaan Sitrat a. Ambil dan labeli satu tabung agar sitrat Simmon untuk tiap organisme. b. Dengan menggunakan teknik aseptic, inokulasi permukaan slant dengan loop inokulasi. c. Inokulasi semua tabung pada suhu 370C selama 24 jam. d. Amati slant sitrat Simmon untuk perubahan warna. Keberadaan warna biru pada permukaan slant menunjukkan tes yang positif. e. Catat hasil yang didapat pada formulir laporan laboratorium. 2.6Karakteristik Fisiologi Bakteri II Alat dan Bahan : 1. Tabung Reaksi 2. Kawat nikrom 3. Pipet tetes 4. Kaki tiga 5. Gelas kimia 6. Kassa asbes 7. Batang pengaduk 8. Botol semprot 9. Inkubator 10.Kulkas 11.Media gelatin nutrisi 12.Media air daging tryptone 13.Reagen Kovac 14.Media Agar Besi Peptone 15.Media air daging urea 16.Indikator phenol merah 17.Media air daging nitrat 18.Reagen nitrat A 19.Reagen nitrat B 20.Serbuk Zinkum 21.Organisme yang akan di uji Prosedur Kerja : f. Makalah Mikrobiologi 84
a. Hidrolisis Gelatin Siapkan media gelatin nutrisi dengan komposisi: 1. Beef extract 3 gram 2. Peptone 5 gram 3. NaCl 5 gram 4. Gelatin 5 gram 5. Air suling 1 liter Campurkan semua komposisi tersebut kedalam gelas kimia, panaskan . Kemudian masukkan kedalam tabung reaksi yang telah di beri label. Inokulasi dengan organisme yang akan di uji. Inkubasi pada suhu yang sesuai. Setelah inkubasi, masukkan tabung yang berisi media dan organisme tersebut kedalam baskom yang berisi es, kemudian lihat apakah gelatin terhidrolisa atau tidak, jika tidak media tersebut akan menjadi padat. a. Produksi Indole Siapkan media air daging dengan komposisi: 1. Beef extract 3 gram 2. Peptone 5 gram 3. NaCl 5 gram 4. Tryptone 5 gram 5. Air suling 1 liter Campurkan semua komposisi tersebut kedalam gelas kimia, panaskan . Kemudian masukkan kedalam tabung reaksi yang telah di beri label. Inokulasi dengan organisme yang akan di uji. Inkubasi pada suhu yang sesuai. Setelah inkubasi, tambahkan reagen kovac 10 tetes, jika pad permukaan terdapat larutan warna merah berarti organisme tersebut positif memproduksi indole. a. Produksi Hidrogen sulfid Siapkan media agar triple gula besi dengan komposisi: 1. Beef extract 3 gram 2. Ekstra Khamir 3 gram 3. Peton 15 gram 4. Proteose Peton 5 gram 5. Laktosa 10 gram 6. Sukrosa 10 gram 7. Glukosa 1 gram Makalah Mikrobiologi 85
8. 9. 10. 11. 12. 13.
Ferro sulfat NaCl Natrium tiosulfat Phenol Red Agar Air
0,2 gram 5 gram 0,3 gram 0,024 gram 12 gram 1000 mL
Campurkan semua komposisi tersebut kedalam gelas kimia, panaskan . Kemudian masukkan kedalam tabung reaksi yang telah di beri label. Inokulasi dengan organisme yang akan di uji. Inkubasi pada suhu yang sesuai. Setelah iinkubasi, amati apakah terdapat endapan warna hitam atau tidak? Jika iya, organisme tersebut positif memproduksi hidrogen sulfide.
a. Hidrolisis urea Siapkan media air 1. Beef extract 2. Peptone 3. NaCl 4. urea 5. Air suling
daging urea dengan komposisi: 3 gram 5 gram 5 gram 5 gram 1 liter
Campurkan semua komposisi tersebut kedalam gelas kimia, panaskan . Kemudian masukkan kedalam tabung reaksi yang telah di beri label. Inokulasi dengan organisme yang akan di uji. Inkubasi pada suhu yang sesuai. Setelah inkubasi, tambahkan 3-5 tetes phenol merah, jika media berubah menjadi warna merah maka organisme tersebut positif menghidrolisis urea. a. Reduksi nitrat Siapkan media air daging nitrat dengan komposisi: 1. Beef extract 3 gram 2. Peptone 5 gram 3. NaCl 5 gram 4. Nitrat 5 gram 5. Air suling 1 liter
86
Campurkan semua komposisi tersebut kedalam gelas kimia, panaskan . Kemudian masukkan kedalam tabung reaksi yang telah di beri label. Inokulasi dengan organisme yang akan di uji. Inkubasi pada suhu yang sesuai. Setelah di inkubasi, tambahkan 3 tetes reagen nitrat A dan reagen nitrat B pada tabung tersebut, jika terdapat warna merah maka positif untuk reduksi nitrat. Jika tidak, tambahkan serbuk zinkum, akan terbentuk warna merah, jika masih tetap tidak ada, maka dapat di simpulkan organisme tersebut mereduksi nitrat menjadi ammonia bukan nitrit. 2.6Karakteristik Fisiologi Bakteri III Alat dan Bahan : 1. Pembiakan 24 jam dari : Lactococcus lactis Micrococcus lucteus Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus epidermidis Staphylococcus aureus 2. Satu plate agar nutrisi perorganisme A. Tes Katalase 1. Hydrogen peroksida 2. Kaca mikroskop 3. Pipet Pasteur 4. Tusuk gigi A. Tes Oksidase 1. Reagen oksidase 2. Kertas filter 3. Petri plate 4. Tusuk gigi A. Tes Koagulase 1. Plasma koagulase 2. Tabung tes steril 3. Pipet A. Tes D-Nase 1. Agar D-Nase yang mengandung indikator- satu plate untuk tiap dua organisme yang diujikan . 2. Pembiakan 24 jam : Serralia marcescen Enterobacter aerogenesis Makalah Mikrobiologi 87
A. Hidrolisis Eskulin 1. Talls agar eskulin-empedu- satu tabung untuk tiap organisme yang diujikan. 2. Pembiakan 24 jam : Enterococcus faecallis Sterptococcus mitis A. Motilitas 1. Talls agar motilitas- satu tabung untuk tiap organisme yang diujikan. 2. Pembiakan 24 jam : Enterobacter aerogenesis Staphlylococcus epidermidis
Prosedur Kerja :
1. Siapkan streak plate satu untuk tiap organisme 2. Inkubasi pada suhu 370C selama 24-48 jam 3. Setelah inkubasi lakukan tes berikut pada organisme A. TES KATALASE 1. Tes spot-katalease : tempatkan satu tetes hydrogen peroksida pada sebuah kaca mikroskop yang bersih. Dengan menggunakan tusuk gigi, pindahkan secaraq hati hati sebuah koloni ynag terisolasi dengan streak plate.dan tambahkan pada hydrogen peroksida. Amati apakah ada gelembung . catatan : pastikan untuk membuang tusuk gigi seperti yang di intruksikan. ATAU Tes plate katalease : tambahkan satu tetes hydrogen peroksida secara hati hati pada koloni yang terisolasi di streak plate amati apakah ada gelembung. 2. Jika te3rdapat gelembung ,maka iragasme bersifat katalease positif 3. Catat penghamatan anda dalam formulir laporan laborlatorium. A. TES OKSIADASI 1. TES SPOT-OKSIDASI tempatkan selembar kertas filler pada petri dish yang kosong. Tempatkan bebereapa tetes raegen oksidase pada keratas filter. Dengan menggunakan tusuk gigi ,pindhakan
88
sebuah kkolni terisolasi dari streak plate ke kertas filter yanmg sudah lembab,amati perubahan warna yang terjadi. ATAU Tes plate oksidase tempatkan satu tetes reagen pada koloni yang diujikan ,amati perubahan yang terjadi. 2. Perubahan warna menjadi warna pink lalu ungu mengidentifikasikan bahwa organisme tersebut oksidasi positif 3. C atat hasil pengamatan pada formulir laporan laboratorium A. TES KOLAGUlASE 1. Tes skrininf kaca mikroskop : tempatkan 2 tets reagen kplasma kolaguase di pusat kaca.denga menggunakan tusuk gigi pindahkan koloni dari streak plate lalau emusikan pada tetesan plasma .jika organism tersebut positif, maka tetesan tersebut akan teraglutinasi sedangkan kolaguase negatif akan termulasi dengan mudah dan menghasilkan suspensi yang buram CATATAN : instuktur anda mungkin akan mendemonstrasikan prosedur inin .jika nada melakukan tes ini pastikan membuang tususk gigi sesuai dengan instruksi ATAU Metode induksi tsbung : dengan menggunakan pipet steril ,pindahkan 0.1 mL mili plasam kolaguase ke dalam tabung gas tambahkan 0.4mL air suling.dengan menggunakan loop inokulasi ,pindahkann beberapa koloni n dari streak plate ke dala tabung. Inkubasi selama 4 jam.organismekolaguase positif akan mengokulasi volume plasma selama 24jam. 2. Catat hasil pengamatan pada laporan laboratorium A. TES Dnase 1. Dengan menggunakan maarker, bagi plate Dnase menjadi 2, gambar sebuah lingkaran dengan ukuran unag receh dengan tiap tiap bagian. Inokulasi satu oraganisme pada tiap plate , sebarkan hingga memenuhi lingkaran. 2. Inkubasi pada suhu 370C selama 24-48 jam
89
3. Jika organisme telahmenghasilkan Dnase makan akan terjadi dekolorasi pencelupan disekeliling area pertumbuhan hal ini berarti tes positif untuk produksi Dnase. A. TES ESKULIN 1. Dengan menggunakan jaarum inokulasi ,inokulasi setiap tabung tes eskulin empedu dengan satu tab ke puast tabung .\ 2. Inkubasi tabung pada suhu 370C selama 24-48 jam 3. Amati abung keberadaan warna hitam sepanjang garis inokulasi mengidentifiaksi bahwa eskulin telah dihidrolisis reaksi ini menjadi positif untuk hirdrolisis eskulin .jika terdapat warna hitam catat apakah organisme dapat tumbuh dengan keberadaan empedu. 4. Catat hasil pengamatan pada formulir laporan laboratorium. Gunaakan (+) unutk mengidentifikasikan hasil postif dan (-) untuk megidentifeikasikan tes eskulin negatif dan (0) untuk tes eskulin ketiadaan . A. MOTILITAS 1. Inokulasi agar motilitas dengan stu tab pada pusa tabung 2. Indkubasi tabung pada suhu 370C selama 24-48 jam 3. Amati pertumbuhan sepanjang garis stab pada agar motilitas .jika organisme bersifat non motile, stab akan teridentifikasikan dengan jelas; jika organismetersebut motile ,stab akan terlihat buram yang mengidentifikasikan bahwa bakteri telah bergerak didalam media. 4. Catat hasil peangamatan pada laporan laboratorium. 2.6Pengujian Agen Anti Mikroba Alat dan Bahan : 1. Biakan kaldu 24 jam dari : Eschericia coli Staphylococcus aureus Bacillus subtilis 2. Media per kelompok Mueller-Hinton agar plate Blood agar plates Makalah Mikrobiologi 90
3. Berbagai antiseptic dan atau disinfektan paling sedikit 6 yang disediakan siswa bila membawa agar-agen mikroba yang ingin mereka uji 2. Cawan petri steril yang berisi disk kerta filter steril 3. Lap steril 4. Pinset steril Prosedur Kerja : A. Metode Difusi Disk 1. Sediakan 1 piring agar Mueller Hinton dan 1 piring agar Blood untuk tipa organisme yang akan diuji. Berilabel dengan nama organism dan informasi identifikasinya. 2. Masukkan lap ke dalam biakan kaldu organisme. Bersihkan permukaan piring agar Mueller Hinton dan Blood. 3. Ulangi langkah 1 dan 2 untuk organisme yang digunakan. 4. Tentukan antiseptic mana atau desinfektan mana yangakan digunakan. 6 agen yang tersedia harus digunakan pada tiap piring. Tunjukkan pada bagian bawah tiap piring posisi disk dan agen kimia yang ada pada disk. 5. Gunakan pinset steril untuk mengambil salah satu kertas-filter larutan yang diinginkan dan biarkan menyerap larutan dengan gerak kapiler. 6. Simpan disk pada arah yang ditandai pada cawan petri yang disuntik. Pastikan untuk menekan disk dengan pelan pada permukaan agar menggunakan pinset. Ini akan memastikan penempelan yang lebih baik pada permukaan saat piringnya ditelungkupkan untuk inkubasi 7. Ulangi langkah 5 dan 6 pada larutan yang diuji, pastiakn anda menetralisasi kembali pinset sebelum pemakaian. 8. Inkubasi piring tersebut pada suhu 370C hingga sesi laboratorium berikutnya. 9. Setelahinkubasi, zona penghambat harus ditentukan untuk tiap larutan pada setiap piring. Untuk menentukan zonanya, ukur diameter zona atau gandakan jarak zona saat diukur dengan mm. Catat hasilnya dalam Format Laporan Laboratorium. A. Metode Dilusi-Penggunaan 1. Bagilah tube kaldu bergizi menjadi dua bagian-satu untuk tusuk gigi dan sau lagi untuk pin karat. 2. Beri label tiap set tubes dengan namaberikut. a. Tusuk gigi, tidak direndam (control) b. Tusuk gigi, direndam 1 menit. c. Tusuk gigi, direndam 2 menit. d. Tusuk gigi, direndam 5 menit. Makalah Mikrobiologi 91
e. Tusuk gigi, direndam 10 menit. f. Tusuk gigi, direndam 15 menit. g. Pin, tidak direndam (control) h. Pin, direndam 1 menit. i. Pin, direndam 2 menit. j. Pin, direndam 5 menit k. Pin, direndam 10 menit. l. Pin, direndam 15 menit. 1. Tuang 10 ml biakan bakteri ke dalam salah satu cawan petri. Tambahkan tusuk gigi dan pin anti karat, biarkan terendam 5 meit. PAstikan keduabenda tersebut tertutupi suspense broth. 2. Gunakan pinset untuk memindahkan tusuk gigi dan pin dari kaldu dan simpan dalam selembar kertas filter untuk menghilangkan kelebihan biakan broth. 3. Pindahkan salah satu tusuk gigi kedalam tube a. dan pin ke dalam g.. Ini akan menjadi waktu 0 atau tube kontrol. Apa sasaran penggunaan kontrol ini ? 4. Tuangkan 10ml agen anti mikroba ke dalam cawan petri kedua. Tambahkan 5 tusuk gigi dan pin yang tersisa ke dalam piring. Mulai penghitungan segera setelah ditambahkan. 5. Pindahkan 1 tusuk gigi dan 1 pin ke dalam tube kaldu bergizi yang sesuai dengan interval waktu yang telah ditentukan. Ingatlah, weaktu ditentukan setelah disimpandalam agen anti mikroba. Waktu 1 menit 2 menit 5 menit 10 menit 15 menit 6. Simpan semua tube di inkubator. 7. Pastikan untuk membuang cawan petri dengan hati-hati pertunjuk instruktur. Setelah inkubasi, catat apakah pertumbuhan dalam tiap tube. Bandingkan organism yang anda teliti dengan organism yang lain. Catat hasilnya dalam Format Laporan Laboratorium. 2.6Analisa Bahan Makanan Alat dan Bahan : 1. Batang pengaduk 2. Blender Makalah Mikrobiologi 92 Letakkan tusuk pada tabung # gigi Letakkan tabung # pin pada
3. Botol timbang 4. Bunsen 5. Cawan petri 6. Disc steril 7. Gelas kimia 8. Gelas ukur 9. Incubator 37C 10. Kaca arloji 11. Kaki tiga 12. Kassa asbes 13. Lumpang dan alu 14. Neraca analitik 15. Pinset 16. Pipet tetes 17. Pipet ukur 1 ml steril 18. Tabung reaksi 19. Ose dan peralatan rutin laboratorium mikrobiologi lainnya 20. Agar kaldu steril 21. Aqua DM 22. Brilliant green Arag dan SS agar 23. Dektrosa 24. Kaldu urea 25. Laktosa 26. Larutan pepton 0,1% 27. Maltosa 28. Manitol 29. Media NA 30. Medium Tetrathionat Broth atau Selenit Broth 31. NC 32. Reagen pewarnaan Gram Makalah Mikrobiologi 93
33. Sacharosa Prosedur Kerja : 1. Estimasi Kandungan Mikroba Dalam Makanan Segar a) Cairkan agar kaldu dalam tabung reaksi pada penangas b) Hancurkan 10 gram sampel dengan menggunakan blender atau lumpang dan alu dicampur air pepton 0,1% 10ml c) Encerkan sampai 1000 x d) 1ml dari tiap enceran masukkan kedalam media NA yang sudah dicairkan pada 40C kocok lalu tuangkan ke dalam cawan petri steril e) Inkubasi pada suhu 30C selama 5 hari f) Setiap hari amati dan hitung bakteri yang tumbuh dalam CFU/gram 1. Pemeriksaan Shigella dan Salmonella a) Timbang 50 gram sampel blender dengan 50 ml pepton 0,1% b) Masukkan 50 ml hancurkan makanan ke dalam 50 ml medium tetrathionat brath atau selenit broth c) Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37C d) Suspense dari tetrathionat atau selenit broth tanam pada BGB dan SS agar dengan teknik pour plate atau streak plate e) Inkubasi pada suhu 37C selama 24-48 jam f) Bakteri yang tumbuh periksa dengan pewarnaan gram g) Hasil yang positif bila pada SS agar, koloni berubah warna menjadi kuning transparan dan pada BGA koloni berwarna ros
94
1.
Test Biokimiawi a) Dengan Jarom ose inkubasi secara aseptic koloni ShigellaShalmonella dari SS agar di atas permukaan Agar Miring b) Dengan ose inokulasi Shigella-Shalmonella kepada masing tabung yang berisi dektrosa, maltose, sacharosa, laktosa, manitol, urea, dan urea agar miring c) Inkubasi semuanya pada temperature 3C selama 24-48 jam d) Amati hasilnya dan cocokan dengan table reaksi biokimia beberapa jenis mikroorganisme (pada panduan mikrobiologi halaman 159)
1.
Pemeriksaan Bakteri Golongan Coli a) Timbang 10 gram sampel, blender dengan 90ml pepton 0,1% b) 10ml hancurkan masukkan masing-masing ke dalam 3 tabung BGB atau Mc Conkey. 1,0ml masukkan masingmasing ke dalam masing-masing 3 tabung BGB sisanya. c) Inkubasi pada suhu 37C selama 24-48 jam d) Amati pembekuan asam fan gas, hitung JPT.
1.
Pemeriksaan Staphylococcus Airreus a) Timbang 10 gram bahan yang hendak diperiksa dan campurkan ke dalam 90ml larutan pepton 0,1% steril b) Gerus dan blender sampai hancur
95
c) Inkubasi 1ml larutan bahan makanan dalam Minatol Broth pada cawan petri steril, tuangkan Manitol salt Agar ke dalam cawan petri tersebut d) Inkubasi cawan petri tersebut pada suhu 37C selama 48 jam e) Amati hasilnya dan lakukan pewarnaan gram pada koloni yang menunjukkan hasil positif 1. Pemeriksaan Clostridium sp. a) Gerus bahan makanan yang diperiksa sebanyak 10 gram dengan blender. Encerkan dengan 90ml larutan Pepton 0,1% b) Masukkan ke dalam tabung reaksi kosong steril, masukkan secara aseptis 10ml larutan bahan makanan; 1ml larutan bahan makanan dan 0,1 ml larutan bahan makanan tersebut masing-masing 3 buah tabung reaksi c) Tambahkan ke dalam masing-masing tabung tersebut media RCA yang telah dicairkan. Biarkan membeku kembali. d) Di atas media RCA, tambahkan sedikit paraffin yang telah dicairkan. e) Inkubasi pada suhu 37C selama 48 jam. f) Amati hasil apakah terjadi pembentukkan warna hitam di sekitar dinding tabung sebelah dalam. 1. Pemeriksaan Antibiotik a) Pembuatan Disc Steril
96
i. Buat lingkaran berdiameter 1cm dari kertas saring, lalu gunting ii. Celupkan gunting kertas saring yang berbentuk lingkaran tadi ke dalam alcohol 70%, angkat dengan pinset dan masukkan ke dalam cawan petri steril, biarkan kering. a) Cara Analisa i. Pipet 0,2 ml suspense Bacillus subtilis dalam cawan petri steril ii. Gerus 10 gram bahan makanan dan tambahkan 90ml larutan pepton 0,1% iii.Celupkan Disc steril dalam larutan bahan makanan tersebut. iv.Letakkan Disc ini di atas permukaan agar kaldu yang telah diinokulasi dengan suspense bakteri Bacillus subtilis v. Inkubasi cawan petri tersebut pada suhu 37C selama 24 jam Amati apakah terjadi daerah hambatan pertumbuhan koloni di sekitar Disc.
2 3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 Makalah Mikrobiologi 97
3.10Analisa Air Alat dan Bahan : a. Penentuan jumlah total mikroorganisme Alat : Cawan petri steril Pipet ukur 1 mL Tabung reaksi steril Erlenmeyer steril 250 mL Gelas kimia 250 mL Batang pengaduk Kaca arloji Corong Gelas ukur 50 mL Incubator
Bahan : Alat : Cawan petri steril Swab steril Pipet tetes steril Media NA steril Sample air
a. Deteksi kehadiran Shigella Salmonella
Bahan : Media Tetrathionat Broth 10 mL Media SS Agar Reagen pewarnaan gram Media kaldu urea Media kaldu laktosa, kaldu manitol, kaldu sakarosa, kaldu maltose, kaldu dekstrosa Makalah Mikrobiologi 98
a. Penentuan nilai JPT/MPN bakteri coli Alat : 9 tabung reaksi Pipet steril Cawan petri steril
Bahan : Media laktosa tunggal Media laktosa ganda Media EMB agar Reagen pewarnaan gram Sampel air
1. 2. 3. 4. 5. 6. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
Prosedur Kerja : PENENTUAN JUMLAH TOTAL MIKROORGANISME AIR Encerkan sampel air 1.000.000 kali. Masukkan media Na steril kedalam cawan yang berisi suspense sampel tadi. Kocok homogenkan dengan cara menggoyang cawan kekiri dan kekanan kedepan dan kebelakang sebanyak 5 kali. Inkubasi dalam suhu kamar selama 5 hari. Hitung koloni bakteri yang tumbuh setiap harinya dari kedua pengenceran tsb. Nyatakan dalam CFU/mL DETEKSI KEHADIRAN SHIGELLA dan SALMONELA Celupkan swab kedalam sampel air biarkan 30 menit Celupkan swab tadi kedalam tetrationat broth Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C Gesekan swab yang telah diinkubasi pada media SS agar dalam cawan petri steril Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C Lakukan pewarnaan gram terhadap bakteri yang diduga Shigella dan Salmonella yang tumbuh pada SS agar Tanam bakteri yang tumbuh pada suhu 37 C selama 24-48 jam Untuk mengetahui jenis mikroba yang dimaksud cocokan hasil yang diperoleh dari masa inkubasi dan dari hasil pewarnaan gram dengan karakteristik yang dimiliki oleh Shigella dan Salmonella. PENENTUAN NILAI JPT/MPN bakteri Coli
99
PRESUMTIVE TEST: Membuat media laktosa tunggal: Timbang 8 gram beef ekstrak, 5 gram pepton, 5 gram laktosa Larutkan beef ekstrak dan pepton dalam aquadest dan didihkan, angkat Tambahkan laktosa dan indikator BCP 1% sebanyak 0,8 mL Setelah homogeny masukan ke dalam tabung reaksi yang berisi tabung durham dengan posisi terbalik, tutup dengan kapas berlemak Sterilkan dengan otoklaf pada suhu 121 C tekanan 15 psi selama 15 menit Membuat media laktosa ganda: Timbang 6 gram beef ekstrak, 10 gram pepton, 10 gram laktosa Cara pembuatan sama dengan media laktosa tunggal Siapkan BCP 1% 1,6 mL 3 tabung laktosa tunggal inokulasi dengan 0,1 mL sampel air 3 tabung laktosa tunggal inokulasi dengan 1 mL sampel air 3 tabung laktosa ganda inokulasi dengan 10 mL sampel air Inkubasi pada suhu 37C selama 24 jam Amati perubahan yang terjadi yang menunjukkan adanya fermentasi laktosa oleh bakteri Coli terutama Eschericia coli Hitung jumlah tabung yang menunjukan reaksi positif Cocokkan dengan tabel dan tentukan MPNnya Bila masa inkubasi 24 jam menunjukkan negative inkubasi dilanjutkan menjadi 48 jam Amati kembali dengan cara yang sama. CONFIRMED TEST: Ambil salah satu positif terutama inkubasi 24 jam Tanam pada media EMB agar dengan teknik pour plate Inkubasi selama 1-2 x 24 jam Amati koloni yang tumbuh pada EMB terutama koloni berwarna merah kehijauan dengan kilat metalik atau merahmuda atau merah muda dengan lender banyak Koloni warna tersebut periksa dengan pewarnaan gram Jika ditemukan bakteri basili langsung warna merah muda (gram negative) artinya sampel air yang dianalisa positif tercemar bakteri golongan Coli.
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 1. 2. 3. 4. 5. 6.
COMPLETED TEST: 1. Koloni warna tadi diinkubasikan lagi kedalam media kaldu laktosa 2. Inkubasi pada suhu 37C selama 1-2 x 24 jam Makalah Mikrobiologi 100
3. Bila hasilnya sama seperti pada presumptive test maka penelitian anda benar 4. Untuk membedakan bakteri golongan Coli umum dan Coli fekal buat pekerjaan diatas secara duplo (2 rangkap) 5. Satu seri inkubasi pada suhu37C (untuk golongan Coli tidak akan tumbuh pada suhu 37C) dan satu seri pada suhu 44,5C (golongan Coli fekal tumbuh baik pada suhu 44,5C). 2.1Pemeriksaan Susu Alat dan Bahan : 1. Susu sapi segar 2. Susu bubuk putih Bendera non-expired 3. Susu bubuk putih Bendera expired 4. Methylen Blue 5.Water Bath 6. Tabung reaksi 7. Rak tabung reaksi 8. Serbet 9. Kain flannel 10. Pipet tetes 11. Penjepit tabung Prosedur Kerja : 1. Perhitungan Jumlah Total Bakteri (Standard Plate Count) a. Sampel susu yang akan diperiksa dikocok, kemudian diencerkan menjadi 0,1ml (masuk 1 ml sample susu kedalam 9 ml aquades steril). b. Masukkan ke dalam cawan-cawan petri ini agarkaldu yang telah dicairkan dan didinginkan hingga 450C ,goyanggoyangkandan biarkan membeku. c. Inkubasi semua cawan-cawan petri ini dalam keadaan terbalik pada suhu 370C selama 48 jam. d. Hitung jumlah koloni bakteri per 1 ml sample susu. 1. Perhitungan Mikroorganisme Jumlah Bakteri Dalam Susu. Cara kerja: a. Dengan sebuah pensil, tandai pada gelas objek bersih daerah sebaran 1 cm2. Teteskan pada daerah ini 0.01 ml sample susu dan sebarkan. b. Biarkan sample susu mengering dan jangan pergunakan pemanasan. c. Celupkan preparat di atas perwarna Levowitz-weber selama 2 menit. d. Keringkan kelebihan perwarna pada kertas saring. e. Bilas preparat dengan air dan biarkan mengering di udara. Makalah Mikrobiologi 101
f. Periksa preparat di bawah mikroskop pada pembesaran 1000 kali, jumlah sel mikroba per 1 ml sampel susu. 1. Pengaruh Bakteri Terhadap Air Susu. Cara kerja : a. Isikan susu ke dalam 5 tabung reaksi steril masing-masing sebanyak 5 ml. b. Isikan susu ke dalam 5 tabung reaksi steril dan tambahkan 5 tetesBCP steril. c. 4 tabung susu dan susu tambah BCP masing-masing diinokulasi sebagai kontrol. d. Inkubasikan pada suhu 370C selama 5 hari. e. Amati dan catat apa yang terjadi dengan susu. Bandingkan antara susu dengansusu tambah BCP. Adakah perbedaan ? Apa perbedaan tersebut. 1. Test Reduksi Methlene Blue. Prinsip percobaan ini berdasarkan kemampuan bakteri untuk meghasilkan enzimdehidrogenese yang mengadakan oksidasi dan melepaskan oksigen. Methylene Blue yang ditambahkan ke dalam susu akan menerima hydrogen tadi dan menyebabkan terjadinya reduksi warna biru menjadi tidak berwarna. Umumnya kecepatan perubahan warna berbanding lurus dengan jumlah miroorganisme dan susu. Metode Kerja : a. Masukkan 0.5 ml Methylene Blue dalam 10 ml air susu. b. Kocok dan biarkan pada suhu 370C. c. Periksasesudah 2 jam, 1 jam, 11 jam, 2 jam, 22 jam, dan 4 jam. Apakah terjadi perubahan warna ?
Waktu reduksi (dalam gas) 2 1 11 2 3 4 42 5 Makalah Mikrobiologi
Perhitungan Koloni per 1 ml sample 800.000 atau lebih
400.000 250.000 150.000 102
52 6 52-8 8 lebih
100.000 60.000 25.000 10.000
Catatan : Sample yang hendak diperiksa harus disimpan semalam pada suhu 200C. PEMERIKSAAN COLIFORM Tes Presumptif : Metoda Kerja : Buatkan enceran samle susu dari 0.1 ml dengan jalan menambahkan 1 ml sample susu ke dalam tabung reaksi yang berisi 9ml air steril (gunakan pipet steril untuk hal ini) Dengan pipet steril; tanamkan masing-masing 10 sample susu dalam 5 tabung reaksi yangmasing-masig berisi media B.G.B 2% dan masing-masing diencerkan 0.1 ml sample susu dalam5 tabung reaksi yang berisi media B.G.B 2%. Inkubasi tabung-tabung reaksi tersebut pada suhu 35-370C selama 48 + 3 jam. Periksa apakah terjadi pembentukan gas atau tidak?
a. b.
c. d.
TES KONFIRMATIF a. b. c. d. e. Metoda Kerja : Denagn pertolongan jarum penanam gesekan dari masing-masing tabung reaksi test presumtif yang memperlihatkan hasil positif sedikit suspense di atas media E.M.B dalam cawan petri steril. Inkubasi cawan-cawan tersebut selama 24 jam pada suhu 37C. Inubasi sedikit koloni dari masing-masing cawan petri yang memperlihatkan hasil positif dalam media pepton 5% lactosae dan inkubasi pda suhu 37oC selama24 jam. Periksa apakah terjadi gelembung gas atau tidak ? cocokkan hasilnya dengan label 3.
103
BAB IV PENGAMATAN
1.1. STERILISASI Bahan Cawan steril Air steril Cawan steril Air tidak steril Cawan steril Udara ++ Bulat 30<x> 300 +++ Bulat >300 Gambar Pertumbuhan Koloni + Bentuk Bulat datar Jumlah Koloni < 30
1.2. ANALISIS MIKROSKOPIS Gambar Penjelasan Bacillus subtilis Morfologi : Bacil Daya Pembesaran : 1500 x
S. aureus Morfologi : Coccus Daya Pembesaran : 1500 x
104
E. coli Morfologi : Bacil Daya Pembesaran : 1500 x
P. aerogenosa Morfologi : Bacil Daya Pembesaran : 1500 x
1.3.
MEDIA ISOLASI
105
TABEL PENGAMATAN NO MEDIA GAMBAR JENIS MEDIA PEMBAHASAN
Escherichia Coli
Media yang telah kami buat, diinkubasi pada suhu 37C, selama 24 jam. Untuk media Plate agar Tryptic Soy untuk pembiakan air dagingnya menggunakan Escherichia Coli. bakteri Terjadi
Plate 1 agar Tryptic Soy S. aureus Media Selektif
pertumbuhan pada plate.
Media yang telah kami buat, diinkubasi pada suhu 37C, selama 24 jam. Untuk media Plate agar Tryptic Soy untuk pembiakan air dagingnya menggunakan Aureus. bakteri E. Terjadi
pertumbuhan pada plate.
Escherichia Coli
Media yang telah kami buat, diinkubasi pada suhu 37C, selama 24 jam. Untuk media Plate agar Phenylethanol untuk 106
ORGANISME
Bakteri :P. aerogenosa
Cairan tubuh : Air Anggota tubuh : Liur Tangan
Tampilan Koloni Topografi Koloni Tepian Koloni Warna koloni Perbuahan pada media Pertumbuhan
Flat Rhizoid wooly Fliamentious Rhizoid Surface dilluse 4+
Flat Irregular wavy Round scalloped Surface dilluse 2+
Flat Irregular wavy Round scalloped Surface dilluse 3+
1.4. TEKNIK ISOLASI
1.5. PERHITUNGAN POPULASI MIKROBA Gambar Penjelasan Jenis ruang penghitung : Neubaueur Panjang tengah : salah satu sisi grid
0,0625 = 0,25 mm Kedalaman Ruang Penghitung : 0,2 ml Volume ruang di atas grid tengah Makalah Mikrobiologi 107
: 0,2 x 0,0625 = 0,0125 m3 Jumlah bujursangkar terkecil per mm2 : 16 1.6. 1. Tes katalase (+) terdapat buih/busa saat media yang sudah diinkubasi bersama koloni direaksikan dengan H2O2 KARAKTERISTIK FISIOLOGI BAKTERI
2. Tes Oksidae
(+) Pada indicator universal memberikan warna biru kehitaman setelah direaksikan antara KMnO4 dengan koloni yang ada pada media 3. Tes Koagulase Makalah Mikrobiologi 108
(+) koloni yang diinokulasi dan direaksikan dengan pereaksi membentuk gumpalan 4. Motilitas Motilitas dengan bakteri S.aureus Adanya penghitaman pada media
Motilitas dengan bakteri P.aerogenosa Adanya penghitaman pada media
5. Hidrolisis Gelatin Dengan bakteri E.coli
Dengan S.aureus
bakteri Dengan B.subtilis
bakteri
109
Media tidak solid ( tetap cair ) setelah didiamkan di dalam air dingin/ air es
6. Produksi Indole Dengan bakteri E.coli dan reagen kovac
Dengan bakteri Dengan bakteri S.aureus B.subtilis dan reagen kovac dan reagen kovac
Terdapat warna kemerahan di atas permukaan media ( + ) tes produksi indole 7. Produksi hydrogen Sulfide Dengan bakteri E.coli Dengan bakteri Dengan S.aureus B.subtilis
bakteri
Adanya penghitaman pada media ( + ) Hydrogen sulfide digunakan 8. Hidrolisis Urea Dengan bakteri E.coli Dengan S.aureus Makalah Mikrobiologi
bakteri Dengan B.subtilis
bakteri
110
Adanya warna merah pada media ( + ) Urea telah dihidrolisis dan ammonia telah dikeluarkan 5. Reduksi nitrat Dengan bakteri E.coli Dengan bakteri Dengan S.aureus B.subtilis
bakteri
Muncul warna kekuningan pada media (+) reduksi nitrat, hanya saja organism mengurangi nitrat menjadi nitrit dan adanya reduksi nitrit menjadi gas nitrogen
111
BAB V PENUTUP
1.1. Kesimpulan Mikrobiologi adalah sebuah cabang dari ilmu biologi yang mempelajari mikroorganisme. Objek kajiannya biasanya adalah semua makhluk (hidup) yang perlu dilihat dengan mikroskop, khususnya bakteri, fungi, alga mikroskopik, protozoa, dan Archaea. Virus sering juga dimasukkan walaupun sebenarnya tidak sepenuhnya dapat dianggap sebagai makhluk hidup. Mikrobiologi dimulai sejak ditemukannya mikroskop dan menjadi bidang yang sangat penting dalam biologi setelah Louis Pasteur dapat menjelaskan proses fermentasi anggur (wine) dan membuat serum rabies[2] Perkembangan biologi yang pesat pada abad ke-19 terutama dialami pada bidang ini dan memberikan landasan bagi terbukanya bidang penting lain: biokimia. Penerapan mikrobiologi pada masa kini masuk berbagai bidang dan tidak dapat dipisahkan dari cabang lain karena diperlukan juga dalam bidang farmasi, kedokteran, pertanian, ilmu gizi, teknik kimia, bahkan hingga astrobiologi dan arkeologi. 1.2. Saran 1) Semoga dengan dibuatnya makalah ini, dapat memberikan manfaat dan pengetahuan baru bagi penyusun pada umumnya dan bagi pembaca pada khususnya 2) Kami berharap pembuangan limbah hasil inkubasi dibuang dengan sebaik-baiknya sehingga tidak menimbulkan pencemaran 3) Kami berharap dalam praktikum mikrobiologi kelengkapan APD ditambah untuk mencegah mikroba yang terkontaminasi
112
DAFTAR PUSTAKA
Anonimous., 2006. Susu. http:// http://manglayang.blogsome.com. [15 September 2008]. Buckle, K. A., R. A. Edwards., G.H. Fleet., and Wooton. 1987. Ilmu Pangan. Penerjemah H. Purnomo dan Adiono. UI-Press, Jakarta. Budi, U. 2006. Dasar Ternak Perah. Buku Ajar. Departemen Peternakan FP USU, Medan. Mc Donald, P. 2002. Animal Nutrition. John Wiley & Sons, Inc., New York. Moehyi, S. 1992. Penyelenggaraan makanan Institusi dan Jasa Boga. Penerbit Bhratara, Jakarta. Robinson, D. S. 1987. Food: Biochemistry and Nutritional Value. John Wiley & Sons, Inc., New YorK. Williamson, G. and Payne,W.J.A. 1993. Pengantar Peternakan di Indonesia. Gadjah Mada University Press, Yogyakarta. Irianto, Koes. 2007. Mikrobiologi Menguak Dunia Organisme Jilid 1. Bandung : CV. Yrama Widya. Tim Dosen Biologi. 2009. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Umum. Surabaya : Universitas Airlangga. Waluyo, Lud. 2007. Mikrobiologi Umum. Malang : UMM Press. http://wildablog.blogspot.com/2009/12/uji-mikrobiologi-air.html http://blogkita.info/pemeriksaan-airminum/javascript:moreSmiliesAappendSmiley(':surprise:') http://alkhanza7.multiply.com/journal/item/3/Gerak_bakteri yhttp://eriz119.blogspot.com/2011/01/motilitas-bakteri.html Dwidjoseputro, Prof.Dr.D. 1990. Dasar-dasar Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta Irianto, K.2006. Mikrobiologi.Yrama Widya : Bandung Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. Universitas Muhamadiyah Malang; Malang http://dydear.multiply.com/journal/item/1/BAKTERI id.wikipedia.org/wiki/metabolisme_karbohidrat Johnson, TR, & Case, CL (2007). Laboratory experiments in microbiology . Johnson, TR, & Case, CL (2007). Eksperimen Laboratorium mikrobiologi. (8th ed.). (8 ed.). San Francisco: Pearson Education. San Francisco: Pearson Education. Citrobacter, Enterobacter will display (+) result while E. 113
http://paculajaib.blogspot.com/2011/03/kata-pengantar-abstrak-danlatar.html http://www.scribd.com/doc/47396220/melakukan-analisis-mikroskopis Syafaatin, Ani.2010.Panduan Laboratoirum Mikrobologi.SMK Negeri 7;Bandung http://id.wikipedia.org/wiki/Mikrobiologi http://id.shvoong.com/exact-sciences/biology/1639454-pengantarmikrobiologi-umum/
114

Tugas Akhir Mikrobiologi

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Tugas Akhir Mikrobiologi

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

Mita Nurhayati 2 An 2 SMK Negeri 7 Bandung

BAB II KAJIAN PUSTAKA

Jangan mensterilisasi larutan agar dengan pH < 6,0

Atur pengatur suhu oven disterilkan selama 2-3 jam.

Disposable filter cup unit

Disposable filtration unit dengan botol penyimpan

Keuntungan Kelemahan dilarutkan

: Tidak berbau : Tidak bersifat

menghomogenkan suspensi bakteri dan media, kemudian diinkubasi.

Sebagian bakteri dapat melarutkan agar dan terlihat tenggelam ke dalamnya.

BAB III PROSEDUR KERJA

8. 9. 10. 11. 12. 13.

Ferro sulfat NaCl Natrium tiosulfat Phenol Red Agar Air

0,2 gram 5 gram 0,3 gram 0,024 gram 12 gram 1000 mL

daging urea dengan komposisi: 3 gram 5 gram 5 gram 5 gram 1 liter

a. Deteksi kehadiran Shigella Salmonella

Waktu reduksi (dalam gas) 2 1 11 2 3 4 42 5 Makalah Mikrobiologi

Perhitungan Koloni per 1 ml sample 800.000 atau lebih

400.000 250.000 150.000 102

100.000 60.000 25.000 10.000

S. aureus Morfologi : Coccus Daya Pembesaran : 1500 x

E. coli Morfologi : Bacil Daya Pembesaran : 1500 x

P. aerogenosa Morfologi : Bacil Daya Pembesaran : 1500 x

TABEL PENGAMATAN NO MEDIA GAMBAR JENIS MEDIA PEMBAHASAN

Plate 1 agar Tryptic Soy S. aureus Media Selektif

pertumbuhan pada plate.

pertumbuhan pada plate.

Bakteri :P. aerogenosa

Cairan tubuh : Air Anggota tubuh : Liur Tangan

Flat Rhizoid wooly Fliamentious Rhizoid Surface dilluse 4+

Flat Irregular wavy Round scalloped Surface dilluse 2+

Flat Irregular wavy Round scalloped Surface dilluse 3+

1.4. TEKNIK ISOLASI

Motilitas dengan bakteri P.aerogenosa Adanya penghitaman pada media

5. Hidrolisis Gelatin Dengan bakteri E.coli

bakteri Dengan B.subtilis

6. Produksi Indole Dengan bakteri E.coli dan reagen kovac

bakteri Dengan B.subtilis

Anda mungkin juga menyukai