Improved Solid-Phase Extraction Method for SystematicToxicological Analysis in Biological Fluids PRINSIP KERJA Penetapan kadar senyawa asam,

netral dan basa yang diekstraksi dari cairan biologis dengan SPE kolom C8-kation exchange dan dideteksi dengan menggunakan GC-NPD TINJAUAN SIFAT FISIKO KIMIA SENYAWA TARGET Senyawa target : Senyawa asam, netral dan basa. - Dalam urin Medium Tinjauan Sifat Fisiko Kimia Senyawa Asam, contohnya phenobarbital, fenitoin dan internal standar (alobarbital) Phenobarbital - pKa - Kelarutan - Jarak Lebur Fenitoin - pKa - Kelarutan - Jarak Lebur Alobarbital - pKa - Kelarutan - Jarak Lebur : 7,8 : Larut dalam 700 bagian air; 15 bagian etanol; 20 bagian eter; larut dalam larutan basa : 173 C : 8,3 : Praktis tidak larut dalam air; larut dalam 60 bagian etanol; 500 bagian kloroform; 30 bagian aseton; 600 bagian eter : 295-298 C : 7,4 : Larut dalam 1000 bagian air; 8 bagian etanol; 40 bagian kloroform; 13 bagian eter; 700 bagian benzena : 174-178 C : metabolit Senyawa pengotor : - Dalam darah : protein, metabolit dan sel darah : cairan biologis (darah dan urin)

Senyawa Basa, contohnya morfin, MDMA, kokain, diazepam, lidokain dan internal standar (nalorphine, trihexylamine dan prazepam)

Morfin - pKa - Kelarutan : 8 dan 9,9 : 1 bagian larut dalam 17,5 bagian air, dalam 100 bagian etanol, sangat mudah larut dalam campuran kloroformisopropanol dan praktis tidak larut dalam eter - Jarak Lebur : 254-256C : Pada pH 9 dalam benzene (9,41), hexane (8,69), etil asetat (8,84) - Kelarutan - Jarak Lebur : larut dalam etil asetat, benzen, dan heksan : 100-110 C : 8,6 : Larut dalam 600 bagian air; 6,5 bagian etanol; 0,7 bagian kloroform; 3,5 bagian eter; larut dalam etil asetat dan aseton - Jarak Lebur : 98 C : 3,3 : Sedikit larut dalam air; larut dalam 25 bagian etanol; 2 bagian kloroform; 39 bagian eter - Jarak Lebur : 131-135 C : 7,9 : Tidak larut dalam air; larut dalam etanol, kloroform, benzena dan eter - Jarak Lebur : 68-69 C

MDMA - pKa

Kokain - pKa - Kelarutan

Diazepam - pKa - Kelarutan

Lidokain - pKa - Kelarutan

Nalorphine - pKa : 7,8

- Kelarutan - Jarak Lebur Trihexylamine - pKa - Kelarutan - Jarak Lebur Prazepam - pKa - Kelarutan - Jarak Lebur

: Agak sukarlarut dalam air dan eter; larut dalam etanol, aseton dan kloroform : 208 C ::: <75 C : 2,7 : Larut dalam etanol dan kloroform : 145-146C

SKEMA KERJA

Sampel Biologis Sampel Biologis

Sifat Analit Asam Asam Pretreatment Sampel Basa Basa

Dilarutkan dalam 11ml dapar Dilarutkan dalam ml dapar fosfat pH 66 fosfat pH + 0,1 ml Internal Standar Disonifikasi selama 10 Disonifikasi selama 10 menit menit

Khusus sampel urin, terlebih Khusus sampel urin, terlebih dahulu dahulu dihidrolisis dihidrolisis dengan dengan penambahan enzim penambahan enzim glucuronidase glucuronidase pH diatur agar berada dalam rentang 4pH diatur agar berada dalam rentang 44,5, divortex kemudian dipanaskan pada 4,5, divortex kemudian dipanaskan pada suhu 60-65C selama 22jam suhu 60-65C selama jam Seluruh jenis sampel dilarutkan dalam 11 Seluruh jenis sampel dilarutkan dalam ml aquadest ml aquadest
+ 0,1 ml Internal Standar

pH diatur agar berada dalam pH diatur agar berada dalam rentang 6-6,5 dengan rentang 6-6,5 dengan penambahan 1M KOH atau 1M penambahan 1M KOH atau 1M HCl HCl

Disonifikasi selama 10 menit Disonifikasi selama 10 menit

pH diatur agar berada dalam rentang 8pH diatur agar berada dalam rentang 88,5 dengan penambahan dapar fosfat pH 8,5 dengan penambahan dapar fosfat pH 88

Disonifikasi kembali selama 10 menit Disonifikasi kembali selama 10 menit Disentrifugasi selama 10 menit pada Disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 2500 rpm kecepatan 2500 rpm

SPE (Solid Phase Extraction) SPE (Solid Phase Extraction) GC-NPD

SPE Senyawa Asam

Pengkondisian Kolom - 2 ml metanol - 2 ml buffer fosfat pH 6

Pemasukan Sampel

Dibiarkan selama 2 menit agar sampel meresap ke dalam kolom Pencucian

- 1 mL 0.1M bufer fosfat (pH 6)/metanol (80:20), lalu dikeringkan dengan vakum selama 5 menit, laju alir 1.5 mL/min - 1 mL 1M asam asetat, lalu dikeringkan dengan vakum selama 2 menit, laju alir 1.5 mL/min - 1 mL n-hexana, lalu dikeringkan dengan vakum selama 2 menit, laju alir 1.5 mL/min

Pengelusian Analit

kolom dielusi dengan menggunakan 4 ml metilenklorida Eluat diuapkan pada suhu kamar dengan bantuan gas nitrogen

SPE Senyawa Basa Pengkondisian Kolom Pengkondisian Kolom 2 ml metanol 2 ml air

Pemasukan Sampel Pemasukan Sampel Dibiarkan selama 2 menit agar sampel meresap ke dalam kolom Pencucian Pencucian 2 ml air, laju alir 2 mL/min 2 ml buffer asetat pH 4, laju alir 1 mL/min

Pengelusian Analit Tahap 11 Pengelusian Analit Tahap Eluat Eluat (Benzodiazepin) (Benzodiazepin)

kolom dielusi dengan menggunakan 2 ml asetonitril, eluat ditampung, kolom dibiarkan mengering dengan vakum selama 2 menit Pengelusian Analit Tahap 22 Pengelusian Analit Tahap kolom dielusi kembali dengan menggunakan 4 ml kloroform yang dijenuhkan dengan ammonia: isopropanol (80:20) (2%) Eluat (Senyawa Basa Lainnya) Eluat (Senyawa Basa Lainnya)

Ditambahkan dengan 0,1 ml methanol yang diasamkan Ditambahkan dengan 0,1 ml methanol yang diasamkan (0,1 ml HCl dalam 100 ml methanol) kemudian diuapkan (0,1 ml HCl dalam 100 ml methanol) kemudian diuapkan pada suhu kamar dengan bantuan gas nitrogen pada suhu kamar dengan bantuan gas nitrogen

PEMBAHASAN Senyawa Asam Preperlakuan sampel Darah atau urin (2.5 mL) dilarutkan dengan 1 mL bufer fosfat (pH 6), dan ditambahkan 0,1 mL larutan internal standar (alobarbital). Penambahan bufer fosfat dtujukan untuk mengatur pH sampel menjadi asam. Dengan demikian senyawa yang bersifat asam akan berubah menjadi bentuk bebasnya dan nantinya dapat tertambat dalam fase diam C8 yang bersifat non polar. Sedangkan alobarbital dipilih sebagai internal standar karena alobarbital jarang digunakan dalam pengobatan ataupun disalahgunakan. Selain itu alobarbital memiliki sifat fisikokimia dan karakter retensi yang mirip dekat dengan sebagian besar analit asam. Sampel kemudian disonik selama 10 min, lalu pH diatur hingga 6-6.5 dengan KOH 1 M atau HCl 1 M. Sampel kemudian disonik kembali selama 10 min, dilakukan pengaturan pH kembali jika perluhingga 6-6.5. Sampel lalu disentrifugasi selama 10 min (250 rpm). Sonifikasi bertujuan untuk mencampur sampel dengan dapar dan internal standar yang telah ditambahkan sebelumnya. Selain itu sonifikasi bertujuan untuk melepaskan obat dari ikatan protein pada plasma. Pengaturan pH yang berulangkali bertujuan agar pH sampel tetap sama, terutam pada darah dimana sering terjadi fluktuasi.Lapisan supernatan kemudian diambil. Proses SPE Pengkondisian Kolom Ditambahkan 2 mL metanol, dikuti 2 mL bufer fosfat pH 6. Kolom dijaga agar tidak sampai kering. Penambahan metanol bertujuan untuk mengaktifkan kolom, sedangkan penambahan bufer fosfat pH 6 bertujuan agar kondisi kolom sama dengan kondisi sampel sehingga analit tetap berada dalam bentuk bebasnya.

Pemasukkan Sampel Sampel yang telah diberi praperlakuan kemudian dimasukkan. Sampel dibiarkan meresap pada kolom selama kurang lebih 2 menit. Hal ini bertujuan agar analit dapat tertambat dengan sempurna pada kolom.

Pencucian Kolom dicuci berturut-turut dengan: 1. 1 mL 0.1M bufer fosfat (pH 6)/metanol (80:20), lalu dikeringkan dengan vakum selama 5 menit, laju alir 1.5 mL/min.Campuran ini ditujukan untuk mengganggu ikatan ionik dan hidrofobik lemah antara pengotor dan penjerap. Campuran ini mampu mengeleminasi pengotor yang bersifat basa lemah dan kuat, sedangkan senyawa yang bersifat asam akan tetap tertambat pada penjerap. Hal ini dimungkinkan karena pH campuran bersifat asam sehingga senyawa yang bersifat basa akan berubah menjadi bentuk ionnya dan telepas dari penjerap yang bersifat non polar.

2. 1 mL 1M asam asetat, lalu dikeringkan dengan vakum selama 2 menit, laju alir 1.5 mL/min. Pencucian dengan asam asetat ditujukan untuk menghilangkan pengotor lain sementara analit tetap dalam bentuk bebas dan tertambat pada kolom.

3. 1 mL n-hexana, lalu dikeringkan dengan vakum selama 2 menit, laju alir 1.5 mL/min.Penggunaan n-hexana ini ditujukan untuk mengeleminasi pengotor seperti lemak. Selain itu n-hexana ini ditujukan untuk mengusir air. Adanya air akan menyebabkan proses pengeringan sampel nantinya akan menjadi lebih sulit.

Pengelusian analit Vakum dimatikan lalu kemudian dimasukkan 4 mL metilenklorida untuk mengelusi analit. Metilenklorida ditampung tanpa menggunakan vakum. Metilenklorida digunakan sebagai pengelusi karena sifatnya yang non polar, sehingga analit yang bersifat non polar akan terlarut ke dalamnya. Selain itu, metilenklorida memiliki titik didih yang rendah (40oC), sehingga mudah dihilangkan. Proses pengelusian ini tidak menggunakan vakum dan hanya memanfaatkan gravitasi. Hal ini bertujuan agar pelarut dapat mengalami kontak dengan lebih sempurna dengan analit.

Senyawa Basa Sampel pretreatment untuk senyawa basa

Darah (2,5 ml) dilarutkan dengan 1 ml air dan 0,1 ml internal standar (nalorphine 100 mg/l) dan trihexylamine dan prazepam 10 mg/l).Sampel disonik selama 10 menit pada temperatur ruang, pH diadjust sampai 8-8,5 dengan buffer fosfat pH 8. Penambahan air serta sonifikasi ini berguna untuk memecah ikatan protein pada sampel. Internal standar yang digunakan lebih dari 1 jenis, hal ini diakibatkan karena analit yang diekstraksi memiliki berbagai struktur kimia yang berbeda, yaitu golongan opiat, golongan amfetamin, golongan kokain dan golongan benzodiazeopin. Nalorphine dipih sebagai internal standar karena memiliki profil ekstraksi dan kromatografi yang mirip dengan morfin. Namun pada senyawa lain hal ini tidak terpenuhi, karena itu digunakan trihexylamine (THA) untuk internal standar golongan amfetamin dan kokain. Alasan lain penggunaan dua internal standar ini adalah waktu retensinya. THA terelusi diawal sedangkan nalorphine terelusi mendekati akhir dari kromatogram sehingga memberikan rentang yang luas. Untuk golongan benzodiazepine digunakan prazepam yang memiliki karakter fisikokimia dan kromatografi yang sama dengan benzodiazepine. Selain itu prazepam tidak digunakan dalam drug of abuse maupun obat yang diresepkan. Penggunaan buffer pH 8 digunakan untuk mengkondisikan analit yang bersifat basa berada dalam bentuk ion sehingga dapat tertambat dalam kolom SPE yang penukar ion yang bersifat polar.

Gambar 1. Kromatogram GC-NPD dari fraksi senyawa basa yang diperoleh dari sampel urin pengguna opiat, kokain dan amfetamin IS2=nalorphine, IS3=THA

Gambar 2. Kromatogram GC-NPD dari fraksi senyawa glongan benzodiazepin yang diperoleh dari sampel empedu

Sampel disonik kembali selama 10 menit, pH dicek kembali. Hal ini dilakukan karena setelah sonifikasi tersebut dapat terjadi fluktuasi pH akibat berat jenis sampel yang tinggi. Sampel lalu disentrifugasi 2500 rpm selama 10 menit, hal ini dilakukan untuk memisahkan pengotor berupa protein dari matriks sampel berdasarkan perbedaan berat jenis. Pengotor tersebut akan ada di fase bawah sedangkan analit ada pada supernatan. Supernatan digunakan kembali untuk ekstraksi lebih lanjut. Untuk sampel urin, 2 ml larutan glukoronidase (5000 unit/ml) ditambahkan dalam 2,5 ml sampel dan pH diadjust hingga 4-4,5. Sampel lalu divortex, dan diinkubasi pada waterbath pada suhu 60-650 C. Penambahan glukoronidase berguna untuk menghilangkan ikatan glukoronida, yang biasanya merupakan hasil metabolisme pada senyawa morfin, kodein dan benzodiazepine, pengaturan pH hingga 4 bertujuan untuk membantu proses hidrolisis glukoronid tersebut. Setelah 2 jam, pH diatur hingga 8-8,5 dengan buffer pH 8. Prosedur selanjutnya sama dengan sampel darah. SPE untuk senyawa basa (termasuk benzodiazepine) Pengkondisian Kolom

Pertama, kolom diprekondisikan dengan menggunakan 2 ml metanol dan 2 ml air berturut-turut. Hal ini dilakukan untuk pengaktifan kolom sebelum digunakan untuk mengekstraksi.Vakum tidak dihidupkan untuk mencegah kolom kering.

Pemasukan Sampel Sampel yang telah dikondisikan dimasukkan ke dalam kolom. Paling tidak dibutuhkan 2 menit untuk melewatkan sampel ke dalam kolom agar terserap sempurna dalam kolom.

Pencucian Dua ml air (2 ml/menit) dan 2 ml buffer asetat pH 4 dialirkan ke kolom dengan laju alir 1 ml/menit berturut-turut. Penambahan air digunakan untuk mengelusi senyawa yang bersifat polar dari dalam kolom, sementara analit yang terikat dalam kolom tidak ikut terelusi karena air tidak dapat mengganggu ikatan ion antara analit dengan kolom.

Penambahan buffer fosfat selanjutnya akan mengubah analit golongan benzodiazepine dalam bentuk bebasnya sementara analit golongan lain tetap berada dalam bentuk ionnya. Benzodiazepine memiliki rentang pKa yang luas dari 1,2-12 serta memiliki dua nilai pKa (bromazepam, lorazepam, flurazepam, nitrazepam) sehingga dapat berada dalam bentuk bebas pada pH 4.

Pengelusian 1. Kolom lalu dialiri dengan 2 ml asetonitril dan dielusi tanpa menggunakan vakum. Asetonitril lalu diuapkan dengan bantuan nitrogen dan direkonstitusi dalam 100 l metanol (fraksi C, yang mengandung senyawa benzodiazepin). Karena benzodiazepine telah berada dalam bentuk bebas, senyawa tersebut dapat terelusi pada pelarut organic seperti asetonitril yang bersifat semipolar. Sedangkan analit lain yang berbentuk ion tidak ikut terelusi.

2. Kolom lalu dikeringkan dengan vakum selama 2 menit untuk menghilangkan sisa asetonitril dalam kolom. 3. Kolom dialiri dengan 4 ml kloroform yang dijenuhkan dengan ammonia: isopropanol (80:20) (2%) tanpa menggunakan vakum, eluat yang diperoleh ditampung. Dengan menggunakan pelarut kloroform yang dijenuhkan dengan ammonia yang bersifat basa, dapat mengganggu ikatan antara analit dengan kolom. Ammonia yang bersifat basa akan memecah ikatan antara analit yang bersifat ion dengan kolom, sehingga analit akan terpisah dari kolom dan berada dalambentuk bebas akibat peningkatan pH. Analit yang sudah dalam bentuk bebasnya ini kemudian akan terelusi oleh campuran pelarut kloroform dan isopropanol yang bersifat semipolar.

4.

Terakhir, 0,1 ml metanol yang diasamkan (0,1 ml HCl dalam 100 ml metanol) ditambahkan ke dalam fraksi, lalu diuapkan dengan bantuan nitrogen pada suhu kamar dan direkonstitusi dalam 100 l metanol (step 7). Penambahan metanol yang diasamkan dengan HCl ini bertujuan untuk membuat senyawa golongan amfetamin yaitu MDMA, MDA dan MDEA berada dalam bentuk garamnya, karena senyawa tersebut dalam bentuk bebasnya mudah menguap.