PERHITUNGAN TOTAL MIKROBA Tujuan : Mahasiswa memahami cara perhitungan total mikroba dan mampu melakukan perhitungan total

mikroba dengan benar. Dasar Teori : Prinsip metode hitungan cawan adalah sebagai berikut: Jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk menghitung jumlah mikroba karena alasan-alasan sebagai berikut: (1) Hanya sel yang masih hidup yang dihitung. (2) Beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus. (3) Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba Karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari satu sel mikroba dengan penampakan pertumbuhan spesifik. Selain keuntungan-keuntungan tersebut, metode hitungan cawan juga mempunyai kelemahan-kelemahan sebagai berikut: (1) Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel mikroba yang sebenamya, karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk satu koloni. (2) Medium dan kondisi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai yang berbeda. (3) Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak dan jelas, tidak menyebar. (4) Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi beberapa hari sehingga pertumbuhan koloni dapat dihitung. Metode hitungan cawan dapat dibedakan atas dua cara yaitu: (1) Metode tuang (pour plate) (2) Metode permukaan (surface/spread plate). (3) Metode Tuang (Pour Plate) Dari pengenceran yang dikehendaki, sebanyak 1 ml atau 0.1 ml larutan tersebut dipipet ke dalam cawan petri menggunakan pipet l ml atau 0.1ml. Sebaiknya waktu antara dimulainya pengenceran sampai menuangkan ke dalan cawan petri tidak boleh lebih lama dari 30 menit. Kemudian ke dalam cawan tersebut dimasukkan agar cair steril yang telah diinginkan sampai 50C sebanyak kira-kira 15 ml. Selama penuangan medium, tutup cawan tidak boleh dibuka terlalu lebar untuk menghindari kontaminasi dari luar. Segera setelah penuangan, cawan petri digerakkan di atas meja secara hati-hati untuk menyebarkan sel-sel mikroba secara merata, yaitu dengan gerakan melingkar atau gerakan seperti angka delapan, setelah agar memadat, cawan-cawan tersebut dapat diinkubasikan di dalam inkubator dengan posisi terbalik. Inkubasi dilakukan pada suhu dan waktu tertentu sesuai dengan jenis mikroba yang akan dihitung. Medium agar yang digunakan juga disesuaikan dengan jenis mikroba yang akan ditumbuhkan. Selama inkubasi, sel-sel yang masih hidup akan tumbuh dan membentuk koloni yang dapat terlihat langsung oleh mata. Setelah akhir masa inkubasi, koloni yang terbentuk dihitung. Setiap_koloni dapat dianggap berasal dari satu sel yang membelah menjadi banyak sel, meskipun mungkin juga berasal dari lebih dari satu sel yang letaknya berdekatan. Perhitungan jumlah koloni dapat dilakukan

34

menggunakan "Quebec Colony Counter". Ketelitian akan lebih tinggi jika dilakukan pemupukan secara duplo, yaitu menggunakan dua cawan petri untuk setiap 1 pengenceran. Cara Menghitung Koloni Perhitungan jumlah koloni akan lebih mudah dan cepat jika pengenceran dilakukan secara desimal. Sebagai contoh misalnya penetapan jumlah mikroba pada susu. Pengenceran awal 1:10 dibuat dengan cara mengencerkan 1ml susu ke dalam 9 ml larutan pengencer, dilanjutkan dengan pengenceran yang lebih tinggi, misalnya sampai 10-5 atau 10-6,tergantung pada mutu susunya. Semakin tinggi jumlah mikroba yang terdapat di dalam susu, semakin tinggi pengenceran yang harns dilakukan. Jika setelah inkubasi misalnya diperoleh 60 dan 64 koloni masingmasing pada cawan duployang mengandung pengenceran 10-4, maka jumlah koloni dapat dihitung sebagai berikut (1 ml larutan pengencer dianggap mempunyai berat 1 g): Faktor pengenceran = Pengenceran x Jumlah yang ditumbuhkan. = 10-4 x 1.0 = 10-4 = Jumlah koloni x 1/faktor pengenceran per cawan = (60 + 64)/2 x 1/10-4 = 6.2 x 105 STANDAR PERHITUNGAN Untuk melaporkan suatu hasil analisis mikrobiologi digunakan suatu standar yang disebut "Standard Plate Count" (SPC), yang menjelaskan mengenai earn menghitung koloni pada cawan serta earnmemilih data yang ada untuk menghitung jumlah koloni di dalam suatu contoh" Cara menghitung koloni pada cawan adalah sebagai berikut: 1. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara 30 dan 300. 2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan, dapat dihitung sebagai satu koloni. 3. Suatu deretan (rantai) koloni 'yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni. Data yang dilaporkan sebagai SPC harus mengikuti peraturan-peraturan sebagai berikut: 1. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka, yaitu angka peItarna di depan koma dan angka kedua di belakang koma. Jika angka yang ketiga sarna dengan atau lebih besar dari 5, harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada angka yang kedua. Jumlah koloni Standard Plate Count Keterangan Per pengenceran 10-2 10-3 10-4 238 28 1 2.3 x 104 28 dan 1< 30 5 700 125 10 1.3 x 10 700>300; dan 10< 30 TBUD TBUD 197 2.0 x 106 TBUD > 300

35

TBUD = Terlalu banyak untuk dihitung Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan angka kurang dari 30 koloni pada cawan petri, hanyajumlah koloni pada pengenceran terendah yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 30 dikalikan dengan besarya pengeneeran, tetapi jumlah yang sebenamya harus dicantumkan dalam tanda kurung. Jumlah koloni Per pengenceran 10-2 10-3 10-4 16 1 0 Standard Plate Count <3.0 nx 103 1.6 x 103 Keterangan

Hitung pengenceran 10-2

Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan lebih dari 300 koloni pada cawan petri, hanya jumlah koloni pada pengenceran yang tertinggi yang dihitung, misalnya dengan eara menghitung jumlahnya pada 1/4 bagian eawan petri, kemudian hasilnya dikalikan empat. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 300 dikalikan dengan besamya pengeneeran, tetapi jumlah yang sebenarya hams dicantumkan dalam tanda kurung. Jumlah koloni Per pengenceran 10-2 10-3 10-4 TBUD TBUD 355 TBUD 325 Standard Plate Count Keterangan

>3.0 x 106 (3.6 X 106) >3.0 x 105 (3.3 X 105)

Hitung pengenceran 10-4 Hitung pengenceran 10-3

Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan 1 koloni denganjumlah antara 30 dan 300, dan perbandingan I antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih keeil atau sarna dengan 2, tentukan rata-rata dari kedua nilai tersebut dengan memperhitungkan I pengencerannya. Jika perbandingan antara hasil tertinggi r dan terendah lebih besar dari 2, yang dilaporkan hanya hasil yang terkecil. Jumlah koloni Per pengenceran 10-2 293 10-3 41 10-4 4 Standard Plate Count Keterangan

3.5 x 104 1.4 x 104

140

32

Hitung rata-ratanya karena 41000/29300 = 1.4 x (<2) Hitung pengenceran 10-2 karena 32000/14000 = 2.3 (>2)

36

Jika digunakan dua cawan petri (duplo) per pengenceran, data yang diambil harus dari kedua cawan tersebut, tidak boleh diambil salah satu, meskipun salah satu dari cawan duplo tersebut tidak memenuhi syarat di antara 30 dan 300 Jumlah koloni Per pengenceran 10-2 175 208 10-3 16 17 10-4 1 0 Standard Plate Count Keterangan

1.9 x 104

Rata-rata pengenceran 10-2

dari

Jumlah koloni Per pengenceran 10-2 138 162 290 280 291 305 10-3 42 43 36 32 25 27 10-4 2 4 4 1 3 0

Standard Plate Count 1.5 x 104 3.1 x 104 3.0 x 104

Keterangan

Rata-rata dari pengenceran 10-2 karena perbandingan antara pengenceran 10-3 dan 10-4 adalah 2.4 Rata-rata dari pengenceran 10-2 dan 10-3 karena perbandingan antara kedua pengenceran adalah 1.2 Rata-rata dari pengenceran 10-2 meskipun 305>300 (angka yang lain <30)

37