Anda di halaman 1dari 6

BAB III METODE KERJA

3.1. Waktu dan Tempat PKL Praktek Kerja lapangan ini telah dilaksanakan selama 40 hari pada tanggal 9 April-18 Mei 2012, di Laboratorium Kimia Bahan Alam, Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI (Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia), Jalan Raya Bogor Km 46, Cibinong-Bogor, Jawa Barat.

3.2. Alat dan Bahan Adapun alat-alat yang digunakan pada Praktek Kerja Lapangan adalah erlenmeyer, beacker glass, gelas ukur, cawan petri, laminar air flow cabinet, botol vial, corong kaca, rotary shaker, jarum ose, sonicator, oven, timbangan analitik, autoclave, rotary evaporator, hot plate, vacum, corong Burcner, gunting, labu pemisah, kamera, peralatan tulis, pipet tetes, pinset, desikator. Bahan-bahan yang digunakan adalah isolat kapang endofit CL Bel 5F, Potatoes Dextrose Agar (PDA), Kentang, Sukrosa, Etil Asetat, Akuades, kapas, kertas saring, kain saring, Isolat Kapang Endofit Cl.Bel.5F.

3.3. Prosedur Kerja 3.3.1. Pembuatan Media Media PSB (Potatoes Sukrose Agar) Erlenmeyer berukuran 3000 ml disiapkan untuk membuat media PSB sebanyak 2500 ml. Kentang dikupas, dan dipotong kecil-kecil kemudian ditimbang sebanyak 500 gr. Lalu dimasukkan ke dalam Erlenmeyer dan ditambah akuades sebanyak 2500 ml, kemudian dipanaskan hingga mendidih. Setelah mendidih, disaring ektrak kentang dengan menggunakan kain. Erlenmeyer berukuran 500 ml disiapkan sebanyak 12 buah. Ekstrak kentang yang telah disaring dituang ke dalam Erlenmeyer yang telah disiapkan, dan masing-masing diisi sebanyak 200 ml. Penambahan sukrosa dilakukan dengan berbagai konsentrasi yaitu 200 mg, 1000 mg, 2000 mg,

29

3000 mg, 4000 mg, dan 5000 mg, dilakukan duplo. Dihomogenkan hingga sukrosa terlarut, ditutup Erlenmeyer dengan sumbat kapas kemudian disterilkan dengan menggunakan autoclave pada suhu 121oC, 2 atm selama 15 menit. 3.3.2. Fermentasi Kapang Endofit Dalam Media PSB Isolat Kapang Endofit Cl.Bel.5F dari tanaman kunyit (Curcuma longa L.) adalah koleksi dari laboratorium Kimia Bahan Alam, Pusat Penelitian Bioteknologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong-Bogor, Jawa barat. Isolat kapang endofit Cl.Bel.5F

diinokulasikan satu ose ke dalam masing-masing media PSB dengan variasi penambahan sukrosa 200, 1000, 2000, 3000, 4000, dan 5000 yang telah disterilkan, lalu diinkubasi dengan rotary shaker dengan kecepatan 120 rpm pada suhu ruangan selama 14 hari, dan 21 hari untuk duplo yang akan dihasilkan ektrak biomassa dan filtrat. 3.3.3. Ektraksi Biomassa Kapang endofit yang sudah diinkubasi sambil di shaker selama 2 minggu ditambahkan etil asetat untuk membunuh kapang sambil dikocok lalu disaring dengan vakum ke dalam Erlenmeyer yang baru dengan menggunakan kertas saring yang sebelumnya sudah diketahui beratnya. Setelah disaring, di dapat ektrak biomassa yang tersaring, dioven sampai + 24 jam. Lalu ektrak filtratnya ditambahkan etil asetat 200 ml. Setelah 24 jam sampai biomassa dan kertas saring kering (jangan sampai gosong, suhu + 50oC) dicatat dan ditimbang berat keringnya dengan rumus: Berat Kering = (gr Biomassa + Kertas Saring) gr Kertas Saring Awal

Sehingga didapatkan berat kering dari biomassa kapang. Kertas saring + biomassa yang sudah kering tersebut dipotong-potong + 1 cm2 lalu dimasukkan ke dalam Erlenmeyer dan ditambahkan etil asetat secukupnya + 10 ml (kertas saring cukup terendam) lalu disonikator kemudian didiamkan selama 24 jam. Biomassa yang sudah direndam dipisahkan atau

30

disaring dengan kapas, dan etil asetat yang didapatkan dari saringan tersebut dimasukkan ke dalam botol vial dan dikeringkan dengan kipas angin hingga terbentuk ekstrak biomassa yang kering. Dilakukan pengulangan sebanyak 2 kali pada masing-masing ektrak biomassa + kertas saring yang telah dipotong-potong. Setelah kering botol vial yang telah berisi ekstrak biomassa ditutup dengan aluminium foil dan dimasukkan ke dalam refrigenerator. Selanjutnya dilakukan hal yang sama juga pada kapang endofit pada perlakuan inkubasi sambil di shaker selama 3 minggu. 3.3.4. Partisi Filtrat Filtrat yang telah ditambah etil asetat 200 ml, dipartisi dengan menggunakan labu pemisah. Filtrat dituang ke labu pemisah kemudian pastikan kran (glass stopcock) dan tutup labu tertutup rapat, lalu dikocok rata sampai rata. Dibiarkan campuran hasil permentasi dan pelarut pada labu pemisah dengan statip + 30 menit (hingga terbentuk dua lapisan). Lalu dipisahkan bagian lapisan bawah yang berupa endapan filtrat yang mengandung air ditampung dengan Erlenmeyer dengan membuka kran (glass stopcock) pada bagian bawah labu pemisah secara perlahan, sehingga yang tertinggal di dalam labu pemisah hanya etil asetat saja, dilakukan pengulangan sebanyak 2 kali pada masing-masing isolat kapang. Lalu etil asetat yang terbentuk dimasukkan ke dalam botol dan dievaporasi, kemudian didapatkan ektrak filtrat, dimasukkan ke dalam botol vial dan dikering anginkan dengan kipas angin hingga terbentuk ekstrak filtrat yang kering. Setelah kering botol fial yang berisi ekstrak filtrat ditutup aluminium foil dan dimasukkan ke dalam refrigenerator. Selanjutnya dilakukan hal yang sama juga pada kapang endofit pada perlakuan inkubasi sambil di shaker selama 3 minggu. 3.3.5. Analisis KLT (Kromatografi Lapis Tipis) Ekstrak filtrat dan ektrak biomassa yang telah kering dilarutkan dengan etil asetat secukupnya lalu di sonicator agar larut. Lalu disiapkan BP (Baku Pembanding) Curcuma longa L., dan dibuat pelarut dengan komposisi kloroform dan methanol dengan perbandingan 9 : 1. Kertas kromatografi

31

dipotong dan disesuaikan dengan kebutuhan, digaris bagian atas dan bawah secara hati + 0.7-1 cm, lalu ditotolkan BP, dan 6 ekstrak biomassa (diatur jarak antara ektrak yang satu dengan yang lainnya). Kemudian dilakukan hal yang sama pada ektrak biomassa pada perlakuan 3 minggu dan ektrak filtrat pada perlakuan 2 minggu dan 3 minggu pada kertas kromatografi yang berbeda. Pelarut dimasukkan ke dalam chamber (Bejana

kromatografi), penjenuhan bejana dilakukan dengan fase gerak, dinding bejana dilapisi kertas saring agar dapat memperkecil penguapan pelarut dan menghasilkan bercak yang lebih baik. Lalu ditutup untuk mengkondisikan chamber terjenuhkan oleh uap pelarut (seluruh kertas saring telah terserap pelarut. Setelah kertas kromatografi tersebut ditotol, dimasukkan 1 per 1 ke dalam chamber untuk direaksikan sampai pada garis di atasnya. Setelah direaksikan kertas kromatografi di keluarkan dari chamber, dan dikering anginkan (bagian depan jangan tersentuh). Kemudian dilihat di bawah sinar UV untuk melihat senyawa-senyawa yang terbentuk dan diberi tanda dengan menggunakan pensil. Lalu, kertas kromatografi tersebut disemprot dengan serium sulfat dan dipanaskan di atas penangas kemudian akan terlihat pemisahan seperti yang terlihat di bawah UV. 3.3.6. Uji Toksisitas Dengan Metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) Pengujian BSLT dengan menggunakan larva Artemia salina Leach. Yang dilakukan terhadap ektrak kering biomassa dan filtrat hasil bioproduksi kapang endofit (Cl.Bel.5F) dari tanaman kunyit (Curcuma longa L.). a. Penetasan telur Artemia salina Leach. Sejumlah + 20 mg telur Artemia salina Leach. dimasukkan ke dalam wadah penetasan yang sudah berisi air laut sintetik yang dibuat dengan cara menimbang 38 gr garam tanpa yodium dan dilarutkan dalam 1 L aquadest. Kemudian disaring dengan saring dengan kertas saring whatman dan diberi penyinaran dengan lampu TL 18 watt. Setelah 24 jam telur yang sudah menetas menjadi nauplii dipindahkan

32

ke tempat lain, 24 jam setelah itu nauplii tersebut sudah dapat digunakan sebagai hewan uji. b. Persiapan larutan uji Sejumlah 20 mg masing-masing ektrak kering biomassa dan filtrat dilarutkan ke dalam 4 ml pelarut yang sesuai (etil asetat) sehingga diperoleh konsentrasi larutan 10.000 ppm. Sejumlah 3 vial dibuat untuk kontrol. c. Uji Toksisitas Sejumlah 500 l, 50 l, dan 5 l dipipet dari larutan induk yang telah dibuat, berturut-turut dimasukkan ke dalam vial kemudian diuapkan sampai kering. Kemudian dimasukkan + 3 ml air laut ke dalam masing-masing botol vial. Larutan diaduk sampai homogen, jika sampel sukar larut dalam air laut sintetik maka ditambahkan dimetil sulfoksida (DMSO) 1% sebanyak 10-15 l. Lalu dimasukkan air laut yang berisi 10 ekor nauplii (larva udang) yang telah berumur 2 hari. Selanjutnya ditambahkan air laut sampai 5 ml, hingga konsentrasi akhir dalam tiap-tiap vial adalah 1000 bpj, 100 bpj, 10 bpj. Tiap konsentrasi dibuat tiga kali pengulangan (triplo). Kemudian disimpan di tempat yang cukup cahaya selama 24 jam. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam dengan melihat jumlah Artemia salina Leach. yang mati dari masing-masing konsentrasi. Tingkat kematian atau mortalitas (%) dihitung dengan membandingkan antara jumlah total Artemia salina Leach. yang mati dengan jumlah total yang diuji. 3.4. Analisis Data 1) Analisis ektrak kering biomassa dan filrat hasil bioproduksi kapang endofit (Cl.Bel.5F) dari tanaman kunyit (Curcuma longa L.) Untuk menghitung ektrak kering biomassa dan filtrat digunakan rumus: Ektrak kering = (gr Botol vial + Biomassa/Filtrat) gr Botol vial awal

33

2) Analisis ektrak biomassa dan filtrat secara Kromatografi Lapis Tipis Setiap fraksi dianalisis dengan KLT (Kromatografi Lapis Tipis), hasil diamati di bawah lampu UV254 dan UV366. Kemudian diamati pola yang terbentuk dari setiap fraksi, fraksi yang pola bercaknya sama digabung sehingga diperoleh fraksi-fraksi yang lebih sederhana. 3) Analisis data uji toksisitas secara BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) Analisis data dilakukan dengan metode analisis statistik (regresi probit) yaitu dengan memasukkan fungsi x (log konsentrasi) dan y (% kematian) ke dalam regresi linear, sehingga di dapat nilai a, b, dan r. Persen kematian diperoleh dengan membandingkan angka mati (AM) dan angka hidup (AH) dari larva Artemia salina Leach. Dari data yang sudah didapat, kemudian dimasukkan ke dalam persamaan y = a + bx, sehingga diperoleh tingkat kematian (mortalitas) sebanyak 50% dari hewan coba dengan menghitung nilai LC50. Tingkat toksisitas suatu ektrak mengikuti pedoman sebagai berikut: LC50 < 30 g/ml 31 < LC50 < 1000 g/ml LC50 > 1000 g/ml = Sangat toksik = Toksik = Tidak toksik.