INTRODUCCIN

En esta prctica vamos a determinar la actividad enzimtica de la -amilasa salival y tambin se aprender el proceso de digestin del almidn La enzima -amilasa, est presente en la saliva, esta inicia la degradacin del almidn, la cual es la principal fuente de carbohidratos de la dieta humana. Esta enzima hidroliza al azar los enlaces (14) que une residuos de glucosa en el almidn, excepto de los enlaces cercanos a los extremosy a los puntos de ramificacin de las cadenas de enlace (16). Esta enzima es activada por los iones cloruro. Despus en el estmago, la alta concentracin de protones va a inactivar la -amilasa salival, esto detiene momentneamente la digestin de carbohidratos; pero la digestin de almidn contina en el intestino delgado por la accin de la -amilasa pancretica. Este proceso va dar productos en una mezcla de disacridos de maltasosa, trisacridos maltotriosa y oligosacridos conocidos como dextrinas, las cuales poseen ramificaciones; es decir enlaces (16). Por todo lo ya mencionado, nosotros debemos conocer la importancia de la digestin, adems debemos conocer que alimentos contienen almidn, y no solo ello sino tambin que deberamos conocer que protenas, que carbohidratos,entre otros, poseen los alimentos que vamos a ingerir, de esta manera estaremos contribuyendo a la buena nutricin y al bienestar de nuestra salud.

MARCO TERICO

EL proceso digestivo inicia en la boca y por tanto es aqu donde el alimento se vera expuesto a las primeras enzimas, una de ellas es la amilasa salival conocida tambin como ptialina o sacarasa, encargada de degradar carbohidratos. La saliva humana contiene entre 0 -3 mg/ml de esta enzima. .Para que el cuerpo humano proveche los carbohidratos es necesario degradarlo previamente . El reconocimiento de estos carbohidratos se puede realizar por medios de distintas pruebas: El reactivo de lugol se intercala por la molcula de almidn y esto se detecta por la coloracin violeta que toma la mezcla. Este polisacrido esta formado por molculas de glucosa y es exclusivo de las clulas vegetales. Realmente est formado por dos tipos de polmeros ambos de glucosa: la amilosa que es la que realmente se tie con el yodo del lugol y la amilopectina.

El catin cprico (Cu++) del reactivo de Benedict reacciona con los glcidos reductores pasando a xido cuproso, que es un precipitado de color rojo ladrillo. Esta es una reaccin que resulta positiva slo si el glcido es reductor. Los glcidos reductores se manifiestan en medio alcalino, pero el Cu++ en ese medio tiende a precipitar espontneamente como xido cprico (que en esa forma no reacciona), de manera que es necesaria la presencia de tartrato doble de sodio y potasio en el reactivo para "secuestrar" al catin Cu++, a fin de evitar la formacin del xido cprico, y permitir que reaccione con los glcidos reductores

PROCEDIMIENTO

DIGESTIN DEL ALMIDON POR LA ALFA AMILASA SALIVAL Rotular los tubos y pipetearlos de la siguiente manera Uno de los miembros de la mesa tendr que donar saliva en una vaso de precipitacin, enjuagndose bien la boca antes d la prueba, y diluir un volumen de 1:3 con agua destilada. TUBOS D1 1 0,5 1,2 D2 1 0,5 1,2 D3 1 1,2 0,5 -

Almidon 1%(ml) Tampn fosfato 0,1M PH 6,8(ml) HCL 0,5 M (ml) Agua destilada (ml) NaCl 0,9 g% (ml)

Mezclar y llevar al bao maria (37c) por 5 min, luego agregar: Saliva diluida (ml) Incubar por 10 minutos en bao maria (37C) Agitar cada 3 minutos durante los 10 minutos de incubacin. 0,5 0,5 0,5

PRUEBA DE LUGOL Preparar otra batera de tubos y pipetear de la siguiente manera: L1 0,5 2 L2 0,5 2 L3 0,5 2

TUBOS D1 (ml) D2 (ml) D3 (ml) Rvo. Lugol (ml)

Determinar cuales tubos dieron reaccin positiva o negativa

PRUEBA DE BENEDICT Preparar otra batera de tubos y pipetear de la siguiente manera:

TUBOS D1 (ml) D2 (ml) D3 (ml) Rvo de benedict (ml)

B1 0,5 0,5

B2 0,5 0,5

B3 0,5 0,5

Calentar los tubos en agua hirviente por 3-5 minutos. Determinar cuales tubos dieron reaccin positiva o negativa.

DISCUSIN DE RESULTADOS

PRUEBA DE LUGOL La prueba de lugol se realiza para identificar la presencia de polisacridos, en este caso el almidn. Si despus de aadir los digeridos a los tubos de lugol se observa que tiene un color azul, eso significa que hay presencia de almidn por lo tanto la reaccin no tuvo lugar. Esto ocurri en el tubo 3 por la presencia del HCl que le dio un PH acido e imposibilit la actividad e la enzima. Por otro lado si la reaccin da un color amarillo intenso, eso quiere decir que no hay presencia de almidn por lo tanto, hay si tuvo lugar la actividad de la enzima. Esto ocurre en los tubos 1 y 2, donde en el tubo 1 por la presencia del ion Cl+ actua como un modulador positivo y en el tubo 2 aunque no encontramos al ion CL+ tambin tubo lugar la reaccin.

Respuesta frente al lugol:

L1 NEGATIVO

L2 NEGATIVO

L3 POSITIVO

PRUEBA DE BENEDICT L a prueba de lugol se realiza para identificar la presencia de azucares reductores como la maltosa, maltotriosa, dextrinas. el reactivo de Benedict tiene CuSO4 .H2O. En el caso de que se hayan obtenido azucares reductores por la accin de la enzima, el cobre que se encuentra como Cu+2 (ion cprico) sera reducido a Cu+1 y se formara oxido cuproso, un precipitado rojo ladrillo. esto ocurre en los tubos 1y2. Por otro lado en el caso que no hubo reaccin enzimtica en este caso por la presencia de HCl en el tubo 3 no encontramos azucares reductores y el cu+2 jams ser reducido. Por otro lado en el tubo numero 1 la actividad enzimtica fue mas rpida por la presencia del ion Cl-.

RESPUESTA FRENTE A BENEDICT:

B1 POSITIVO

B2 POSITIVO

B3 NEGATIVO

CONCLUSIONES

Cuando simulamos el medio del estmago , comprobamos que la enzima no realiza su funcin.El pH del estmago inactiva la amilasa y luego la digestin contina en el intestino delgado con la amilasa pancretica. El cambio por lugol a azul violeta se da con la presencia del sustrato ( carbohidrato no reductor). El in cloruro acta como regulador positivo. Con el reactivo de Benedict se usa para identificar monosacridos.Una reaccin positiva hace que vire a un color anaranjado. Un azcar reductor es aquel que presenta un carbonilo libre, este es fcil de oxidar por agentes suaves como en este caso el Cu2+ y dar como resultado un grupo carboxilo. Se habla de azcares reductores cuando tienen su OH anomrico libre, y stos son los que dan positivo en la prueba de Benedict.

CUESTIONARIO

1.-Qu caractersticas presenta la -amilasa salival, y la -amilasa pancretica?

La -amilasa (1,4- -D-Glucan glucanohidrolasa, EC 3.2.1.1) es una enzima del aparato digestivo. Hidroliza el almidn de los alimentos y el glicgeno para formar maltosa al fragmentar sus cadenas en los enlaces hemiacetal alternados. La enzima es normalmente secretada en el tubo digestivo a partir de las glndulas partidas en la saliva llamada tambin ptialina y el pncreas. la -amilasa degrada el almidn de una forma mucho ms desordenada: ataca enlaces 1-4 en zonas aleatorias de la cadena, incluso a ambos lados de los enlaces 1-6.dependiendo del tiempo de contacto se obtiene como producto de esta reaccin un conjunto de oligosaridos variados, en parte ramificados, denominados dextrinas, de peso molecular variable. Si se prosigue la reaccin las cadenas rectas se acaban convirtiendo en maltosa y maltotriosa. Esta enzima acta en un medio alcalino (pH = 6,7) que solo se encuentra en la saliva o en el intestino delgado, en el estomago solo puede seguir con su actividad mientras tenga almidn que digerir ya que de alguna forma lo protege del pH acido. La alfa-amilasa pancretica tiene propiedades similares a la salival pero su actividad es mucho mayor.

En la siguiente figura se ve un esquema de la actuacin de la amilasa.

2.-Qu caractersticas presenta el almidn, como est compuesto?

Es la forma ms generalizada, aunque no la nica, de reserva energtica en vegetales. Se almacena en forma de grnulos, y puede llegar a constituir hasta el 70% del peso de granos de cereales (maz y trigo) o de tubrculos, se encuentra en semillas, races, tubrculos etc., lugares donde la planta almacena energa. Alimentos como el maz tierno y las patatas tienen en torno al 15% de almidn. Proporciona el 70-80% de las caloras consumidas por los humanos Se encuentra formando granos esfricos que pueden verse al microscopio y se pueden diferenciar por su apariencia entre unas y otras especies. Est compuesto por dos polmeros distintos, ambos de glucosa, la amilosa y la amilopectina. El almidn presenta en su conjunto una estructura cristalina. Bajo luz polarizada presenta el esquema tpico de "Cruz de Malta". De esta estructura cristalina es responsable la amilopectina debido a que en ella se forman Puentes de hidrgeno entre las ramificaciones dando lugar a una estructura muy estable que se puede considerar como cristalina. Se puede decir que la amilopectina es la parte insoluble mientras que la amilosa es la parte soluble. Veamos los componentes del almidn. Amilosa: Polmero compuesto por unin de unidades de glucosa (OH del carbono anomrico en posicin axial). Slo aparecen enlaces 1-4, por lo que su estructura es lineal (esto no significa que las cadenas sean rectas, sino que se enrollan formando una hlice). Aparece en una proporcin en torno al 20-25% del almidn total aunque con abundantes excepciones como son el guisante, que presenta una proporcin del 60%, y en el otro lado los cereales creos, que no presentan nada de amilosa.

Amilopectina: Polmero compuesto por unin de unidades de glucosa mediante enlaces 1-4, pero ramificado con uniones 1-6 cada 20 a 25 restos de glucosa. Es la parte ramificada del almidn.

3.-Cul es el rol del ion sodio en la actividad de la -amilasa salival? El ion sodio se encontrar como cloruro de sodio, va a actuar con la -amilasa salival rompiendo su enlace y dndole ion sodio y tambin ion cloro, este ltimo actuar con

la enzima como un cofactor, de modo que el ion sodio quedar libre, dndole un PH alto para que la enzima reaccione.

4.-Segn la experiencia desarrollada, qu indica el resultado del tubo 1 con respecto al tubo 2? PRIMERO.- Para la prueba de lugol, la cual detecta la presencia de sustrato, los resultados para los tubos 1 y 2 fueron NEGATIVOS (no hubo cambio de color), porque ya se haba metabolizado el almidn y quedaba poco o nada de ste, pero se pudo observar una diferencias significante entre ambos tubos en nuestra mesa ya que al parecer el almidn no de degrado del todo en el tubo 2 por lo que presenciamos un cambio de color intermedio entre el tubo 1 y 3 que respondera a una presencia considerable de almidn lo que hizo reaccionar al lugol. SEGUNDO.- Para la prueba de Benedict, la cual detecta la presencia de productos, se observ un cambio de color de azul a rojo ladrillo que fue ms intenso y con mayor precipitado en el tubo 1 con respecto al tubo 2, esto indicaba que en el tubo 1 haba mayor presencia de producto (azcares reductores) y por tanto mayor formacin de Cu2O que es el que le da ese color caracterstico, a causa de la presencia adicional del NaCl que acta como modulador positivo de la reaccin enzimtica.

5.-Segn la experiencia desarrollada, qu indica los resultados del tubo 1 y 2 con respecto al tubo 3? En la prueba de lugol, la variacin de color de amarillo a azul violeta (resultado positivo) en el tubo 3 indicaba la presencia de la amilosa con un cambio de color a azul claro propio del complejo de la amilosa con el yodo, y de la amilopectina con un cambio de color a rojo propio del complejo del yodo con la amilopectina, de la fusin del rojo y azul claro resulta ese azul violeta. En cambio en el tubo 1 y 2 el color amarillo vario para nuestra mesa, indicando el metabolismo de todo o casi todo el almidn para el primer tubo pero no para el segundo tubo. En la prueba de Benedict, para los tubos 1 y 2 el resultado fue positivo (cambio de color de azul a rojo ladrillo) porque haba presencia de productos; en cambio en el tubo 3, el resultado negativo indicaba ausencia de productos debido a la inactivacin de la enzima por el medio cido del HCl.

6.-Qu posibilidad resultara si el donante de la saliva no se enjuag bien la boca?

En esta prctica, se requiri la muestra de saliva para la obtencin de amilasa salival, la cual necesita de un medio casi neutro para su activacin. La razn de ser del enjuague bucal o de la saliva, es que con este se buscaba eliminar en la medida de lo posible otros elementos que no fueran amilasa; sin embargo, en nuestra mesa parece haber ocurrido lo contrario ya que el donante no se enjuago bien la boca, por lo tanto su muestra de saliva constara adems de enzima, de muchos azcares (residuos de comida), y una cantidad mucho mayor de bacterias bucales; lo que acarreara un medio ms cido en el cual la actividad de la amilasa podra resultar disminuida, y los resultados terminaron alterados para la prueba de Lugol y pudimos apreciar en el tubo 2 un color intermedio entre el tubo 1 (color amarillo) y el tubo 3 (azul violeta oscuro) . Esto debido a que los azcares, que sirven de alimento para las bacterias de la placa dental, son fermentados por stas produciendo cido lctico, y de esta manera es que el pH disminuye alterando la actividad enzimtica.

Bibliografa Bioqumica clnica y Patologa molecular Volumen II Autores: X. Fuentes Arderiu M. J. CastieirasLacambra J. M. QueraltCompa http://books.google.com.pe/books?id=nM8ED6gYou0C&pg=PA872&lpg=PA872&d q=rol+del+ion+sodio+en+la+amilasa+salival&source=bl&ots=HoSonjKmAk&sig=kJ KgJFOoLWcNahd6g28PPF1fcG8&hl=es&sa=X&ei=aGqsT6XfHOjb0QGJqPyFBA& ved=0CFgQ6AEwAg#v=onepage&q=rol%20del%20ion%20sodio%20en%20la%20 amilasa%20salival&f=false