Anda di halaman 1dari 6

Laporan Praktikum Proyek Genetika Molekuler Mikroba Percobaan 04 Transformasi

Nama NIM Tgl. Percobaan Tgl. Pengumpulan Kelompok Asisten

: Ridwan Muhamad Rifai : 10408040 : 30 September 2010 : 7 Oktober 2010 :6 : Rahma

Program Studi Mikrobiologi Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati Institut Teknologi Bandung 2010

1. Tujuan a. Mengisolasi bakteri yang berhasil mengalami transformasi plasmid p-GEMT b. Mengisolasi bakteri yang berhasil mengalami transformasi plasmid p-GEMT yang telah diligasi

2. Metode Transformasi dilihat dari namanya berarti perubahan. Perubahan yang dimaksudkan di sini adalah perbahan karakteristik suatu bakteri karena dimasukki oleh suatu materi genetik yang disebut plasmid yang menambah/mengubah kemampuan metabolisme bakteri terhadap suatu substrat. Transformasi terjadi secara alami di alam namun juga dapat dilakukan secara artifisisal. Tidak semua sel bakteri dapat mengalami transformasi. Sel yang siap melakukan transformasi disebut sel kompeten.(MERCK, 2010)

Sel kompeten dapat dibuat dari kultur Escherichia coli murni yang diterapi dengan metode CaCl. Bila sel didinginkan dalam kation bivalen semisal Ca2+ membuat membran sel permeabel terhadap plasmid DNA. Sel kemudian diinkubasi dalam es selama beberapa lama agar terjaga kekompetenannya dan ketika akan ditransformasikan maka diberi heat-shock pada 42oC sehingga plasmid dapat masuk. (Alberts, 2002)

Plasmid yang digunakan adalah p-GEMT yang memiliki fragmen DNA resisten ampicillin sehingga bila transformasi berhasil maka sel bakteri akan resisten dan dapat hidup dalam medium ber-ampicillin. Sedangkan bila transformasi gagal maka tak akan ada bakteri yang dapat tumbuh dalam medium berampicillin.

Selain itu ada satu jenis plasmid lagi yang digunakan yaitu p-GEMT namun telah diligasi oleh suatu fragmen DNA dengan panjang 750 kb (lih. Percobaan 3 : Purifikasi DNA dan Ligasi). Proses ligasi fragmen DNA ini menyebabkan gen lacZ putus sehingga enzim -galactosidase tak dapat diekspresikan. Enzim ini menghidrolisis Xgal, suatu modifikasi dari galaktosa, menjadi galaktosa dan 5-bromo-4-kloro-3hidroksiindol. Selanjutnya 5-bromo-4-kloro-3-hidroksiindol ini akan teroksidasi dan

berubah menjadi 5,5-dibromo-4,4-dikloro-indigo. Berikut adalah pemetaan dari plasmid p-GEMT.

Untuk mendeteksi proses transformasi p-GEMT terligasi ini tidak cukup dengan melihat keresistennan bakteri dalam medium ber-ampicillin. Dilakukan blue-white screening untuk menentukan apakah proses transformasi berhasil. Telah diketahui bahwa enzim -galactosidase tak dapat diekspresikan pada plasmid yang terligasi sehingga substrat X-gal pada medium tak dapat dihidrolisis menjadi galaktosa dan 5bromo-4-kloro-3-hidroksiindol. Otomatis tak dapat dihasulkan pula 5,5-dibromo4,4-dikloro-indigo yang berwarna biru. Karena itu, sel bakteri yang berhasil ditransformasi oleh plasmid p-GEMT terligasi akan berwarna putih karena tak menghasilkan 5,5-dibromo-4,4-dikloro-indigo. Sedangkan bila transformasi plasmid p-GEMT terligasi gagal maka koloni bakteri akan tetap berwarna biru. (Cohen, 1972)

3. Hasil Pengamatan Berikut adalah foto hasil pengamatan koloni bakteri kompeten
Hasil Pengamatan Keterangan Tgl. Praktikum: 30.09.2010 Tgl. Pengamatan: 01.10.2010 Sampel: bakteri kontrol positif hasil transformasi Medium : agar LB dengan ampicillin Suhu Inkubasi: 25oC (suhu ruang) Ket.: Ditumbuhi koloni berwarna putih dan membentuk koloni cukup besar.

Tgl. Praktikum: 30.09.2010 Tgl. Pengamatan: 01.10.2010 Sampel: bakteri kontrol negatif hasil transformasi Medium : agar LB dengan ampicillin Suhu Inkubasi: 25oC (suhu ruang) Ket.: Ditumbuhi koloni berwarna putih

Tgl. Praktikum: 30.09.2010 Tgl. Pengamatan: 01.10.2010 Sampel: bakteri hasil transformasi Medium : agar LB dengan ampicillin Suhu Inkubasi: 25oC (suhu ruang) Ket.: Ditumbuhi satu koloni berwarna putih (lingkaran kuning) dan koloni satu koloni berwarna biru (lingkaran merah).

Foto diambil sekitar 10-12 jam setelah inkubasiuntuk memastikan ampicillin bekerja efektif

4. Pembahasan Untuk mengamati transformasi dilakukan tiga macam perlakuan yaitu : a. Bakteri kompeten (kontrol negatif) b. Bakteri kompeten + p-GEMT (kontrol positif) c. Bakteri kompeten + p-GEMT terligasi Dari hasil pengamatan terlihat bahwa semua medium perlakuan ditumbuhi oleh bakteri. Berikut adalah pembahasannya.

Pada kontrol negatif, terlihat ada koloni bakteri walau sedikit dan berkumpul di tengah. Seharusnya tak ada koloni bakteri pada perlakuan ini karena bakteri kompeten yang ditambahkan tidak memiliki kemampuan untuk bertahan dari ampicillin dan tak memiliki plasmid resisten ampicillin. Pertumbuhan bakteri akan terhambat dan dalam 10-12 jam seharusnya belum nampak adanya koloni. Diasumsikan bahwa koloni yang muncul itu adalah kontaminan karena hanya muncul membujur dari tepi ke bagian tengah.

Pada kontrol positif terlihat banyak koloni bakteri. Memang seharusnya tumbuh koloni pada perlakuan ini namun dengan kondisi cawan petri yang terbakar dan menimbulkan lubang di atasnya maka asumsi bahwa koloni yang tumbuh benarbenar bakteri kompeten yang tertransformasi terbantahkan. Ada juga kemungkinan kontaminan. Namun bagaimanapun pertumbuhan koloni mengindikasikan bakteri yang resisten terhadap antibiotik yang dimungkinkan juga dengan proses transformasi plasmid p-GEMT ke dalam bakteri kompeten.

Pada hasil ligasi terdapat dua koloni, satu berwarna biru dan satu lagi berwarna putih. Warna biru mengindikasikan transformasi berhasil namun ligasi tak berhasil karena 5,5-dibromo-4,4-dikloro-indigo dihasilkan yang berujung pada tidak terputusnya lacZ karena ligasi. Warna putih mengindikasikan transformasi dan ligasi keduanya berhasil. Warna putih menunjukkan bahwa 5,5-dibromo-4,4-dikloroindigo tidak dihasilkan yang berarti gen lacZ terputus pleh aktifitas ligasi.

5. Kesimpulan a. Terisolasi bakteri kompeten yang berhasil ditransformasi dengan plasmid pGEMT yang diindikasikan dengan tumbuhnya koloni bakteri pada medium ber-ampicillin b. Terisolasi bakteri kompeten yang berhasil ditransformasi dengan plasmid pGEMT terligasi yang diindikasikan dengan tumbuhnya koloni bakteri berwarna putih pada medium ber-ampicillin

6. Daftar Pustaka
Alberts, Bruce, et al. 2002. Molecular Biology of the Cell. New York: Garland Science Cohen, Stanley, Annie Chang dan Leslie Hsu. 1972. Nonchromosomal Antibiotic Resistance in Bacteria: Genetic Transformation of Escherichia coli by R-Factor DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences 69 (8): 21104 MERCK. 2010. Dorlands Medical Dictionary.

http://www.mercksource.com/pp/us/cns/cns_hl_dorlands_split.jsp?pg=/ppdocs/u s/common/dorlands/dorland/eight/000110198.htm. 071010 : 5.51AM

Anda mungkin juga menyukai