Keragaman bakteri asam laktat dari bioetanol proses

abstrak Latar Belakang: Bakteri dapat bersaing dengan ragi untuk nutrisi selama proses produksi bioetanol, berpotensi menyebabkan kerugian ekonomi. Ini adalah studi pertama yang bertujuan untuk kuantifikasi dan identifikasi asam laktat Bakteri (LAB) hadir dalam proses bioetanol industri di distilleries berbeda dari Brasil. Hasil: Sebanyak 489 isolat LAB diperoleh dari empat distilleries tahun 2007 dan 2008. Banyaknya LAB di tangki fermentasi bervariasi antara 6,0 105 dan 8,9 108 CFUs / mL. Gula sari tebu mentah terkandung 7,4 107-6,0 108 CFUs LAB. Sebagian besar isolat LAB yang berasal dari genus Lactobacillus menurut rRNA operon enzim restriksi profil. Berbagai spesies Lactobacillus terjadi selama proses bioetanol, namun spesies yang paling sering ditemukan menjelang akhir musim panen adalah L. fermentum dan L. Vini. perbedaan rep-PCR menunjukkan pola co-terjadinya populasi yang berbeda dari spesies L. fermentum dan L. Vini, menunjukkan keragaman intraspesifik besar. Perwakilan isolat dari kedua spesies memiliki kemampuan untuk tumbuh dalam medium mengandung sampai 10% etanol, menunjukkan seleksi bakteri toleran etanol selama proses berlangsung. Kesimpulan: Penelitian ini menjabat sebagai survei pertama dari keragaman LAB dalam proses bioetanol di Brasil. itu kelimpahan dan keragaman LAB menunjukkan bahwa mereka memiliki dampak yang signifikan dalam proses bioetanol.

latar belakang Bioetanol merupakan komoditas menguntungkan sebagai terbarukan sumber energi. Brazil adalah bioetanol terbesar kedua produsen planet ini, dengan produksi 16 miliar liter per tahun. Para distilleries 360 Brasil aktif menggunakan tebu jus dan / atau molasses, gula (12-16 Brix di yang wort) sebagai substrat untuk fermentasi oleh Sacharomyces Saccharomyces [1-3]. Beberapa faktor dapat mempengaruhi menghasilkan proses, termasuk (i) manajemen, (ii) rendah kinerja ragi, (iii) kualitas tebu jus dan sirup, dan (iv) kontaminasi mikroba. Proses bioetanol harus dikembangkan di septik kondisi selama semua periode produksi. Salah satu paling umum strategi untuk mengendalikan kontaminasi mikroba adalah pembersihan tangki fermentasi dan desinfeksi dari ragi. Sel-sel ragi yang digunakan kembali selama enam bulan dari musim panen [4]. Pada akhir setiap fermentasi siklus, yang memakan waktu antara 8 dan 10 jam,

sel ragi dikumpulkan dan dipindahkan ke pra-fermentor tank di mana mereka dicuci dalam asam sulfat encer solusi untuk mengurangi kontaminasi bakteri. Jenis pengobatan dapat menyebabkan metabolisme yang serius stres dalam sel ragi, penurunan kelangsungan hidup mereka [5]. Alternatif lain untuk mengontrol kontaminasi mikroba adalah perawatan pra-substrat fermentasi (jus tebu dan molases) oleh pasteurisasi. hal ini dapat mengurangi kontaminasi bakteri untuk tingkat yang lebih rendah (103 ca. sel / ml), tetapi biaya tinggi untuk pendinginan substrat adalah tidak ekonomis. Industri antibiotik juga sering digunakan oleh distilleries banyak di pra-fermentasi panggung, meskipun dampak lingkungan yang mungkin mereka dapat menyebabkan [4]. Kontaminasi bakteri muncul untuk mengurangi proses produktivitas, dengan mengurangi pertumbuhan ragi, viabilitas, dan fermentasi kapasitas [6,7]. Bakteri Asam Laktat (BAL) adalah sangat berlimpah dalam proses bioetanol mungkin karena toleransi mereka untuk etanol, pH rendah dan tinggi suhu [8]. Laktat dan asam asetat yang diproduksi oleh LAB dapat mengganggu dalam metabolisme ragi [8]. proliferasi LAB dalam tangki fermentasi sering terduga, menyebabkan ditutupnya kilang untuk pembersihan dan desinfeksi. Perkembangan LAB memiliki memang efek negatif dalam proses dan dapat menyebabkan serius kerugian ekonomi. Oleh karena itu, sangat penting untuk memiliki pemahaman yang lebih baik dari kelimpahan dan keragaman LAB selama proses bioetanol untuk merancang proses produksi lebih efisien. untuk kami pengetahuan, ini adalah studi pertama di timur laut Brasil distilleries bertujuan karakterisasi bioetanol proses mikrobiota. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menganalisis kelimpahan dan keragaman LAB di proses bioetanol. Empat perwakilan distilleries (Japungu, Miriri, Giasa dan Trapiche) di Timur Laut Brasil dipantau antara 2007 dan 2008. hasil Jumlah rata-rata CFUs di Japungu, Miriri, Giasa dan Trapiche bervariasi antara 3,7 107 dan 1,2 108, 7,5 8,9 106 dan 107, 6,0 105 dan 8,9 108, dan 1,8 5,9 107 dan 108, masing-masing (Gambar 1). Gula sari tebu mentah terkandung 7,4 107-6,0 108 LAB CFUs. Isolat tebu jus LAB tidak diidentifikasi dalam penelitian ini. Etanol konten dalam proses bervariasi antara 5,9 dan 7,9%. Sebanyak 489 isolat LAB putatif diperoleh dari tangki fermentasi empat distilleries (file tambahan 1). Pemutaran dari 489 dugaan LAB isolat dengan cara pembatasan analisis enzim rRNA operon memungkinkan dugaan cepat

identifikasi spesies yang ditemukan di bioetanol proses. Pembatasan rinci referensi pola dari masing-masing spesies (file tambahan 2) dan contoh L. fermentum L. Vini dan pola disajikan (Gambar 2). Pola khas berisi tiga diagnostik band (antara 500 dan 1000 pb). Sebagian besar isolat diidentifikasi dalam genus Lactobacillus dalam proses fermentasi dalam empat distilleries dengan cara mereka Amplified DNA Restriction Analysis Ribosomal (ARDRA) pola. Hanya 13 isolat tetap sebagai tak dikenal LAB. Ada jumlah yang lebih tinggi dari spesies LAB dalam pertama 30 hari dari proses fermentasi (3A Gambar). Lactobacillus plantarum yang sering ditemukan pada awal dari proses fermentasi di Miriri dan Japungu distilleries. L. manihotivorans ditemukan pada awal dari proses fermentasi di Miriri, sedangkan Paramesenteroides Weissella ditemukan di Trapiche. Secara keseluruhan, ada dominasi L. fermentum dan L. Vini setelah 60 hari fermentasi. Dua spesies, L. fermentum dan L. Vini, berhubungan dengan mayoritas dari isolat yang diperoleh dalam penelitian ini (Gambar 3B). sana kecenderungan pengurangan jumlah spesies LAB menjelang akhir dari proses tersebut, menunjukkan terjadinya resistensi antibiotik dan / atau terjadinya infeksi endemik persisten. Para keras kondisi proses (antibiotik, suhu tinggi, rendah pH, dan konsentrasi etanol tinggi) mungkin memiliki selektif tekanan atas mikrobiota, yang mengarah ke pemilihan jenis tertentu LAB resisten. L. ferintoshensis, L. diolivorans-seperti, L. nagelii, LAB tak dikenal, dan Oenococcus kitaharae-seperti juga ditemukan pada akhir proses fermentasi. Trapiche penyulingan menunjukkan paling berbeda komposisi LAB mungkin karena satu-satunya menggunakan molase. Identifikasi dugaan berdasarkan pada enzim restriksi analisis rRNA dikonfirmasi untuk beberapa L. Vini dan L. fermentum isolat menggunakan pheS dan 16S rRNA urutan gen (data terlampir; GenBank bawah Nomor aksesi. HQ009762-HQ009795; tambahan berkas 3). Misalnya, isolat JP7.3.7, TR7.5.7, TR7.5.13, TR7.5.15 memiliki> Urutan 99% pheS kesamaan terhadap Vini L.. Oenococcus kitaharae seperti isolat dan Lactobacillus sp. isolat juga tentatif diidentifikasi oleh urutan gen, membenarkan mereka
status spesies yang tidak diketahui. Rep-PCR menggunakan analisis GTG5 primer dilakukan untuk mengevaluasi intra-spesifik keragaman L. fermentum dan L. Vini. Perwakilan isolat dari spesies L. fermentum dari

empat distilleries diperoleh dalam yang sama dan di berbagai periode sampling yang memiliki pola sidik jari yang berbeda, menunjukkan keragaman genom tinggi co-terjadi populasi (Gambar 4). Demikian juga, perwakilan L. Vini isolat memiliki pola yang berbeda (Gambar 5). Para genom tinggi keragaman diamati pada L. fermentum dan L. Vini selama proses fermentasi dalam empat distilleries disarankan co-terjadinya beberapa populasi mungkin melalui pengenalan jenis baru melalui kereta substrat selama proses tersebut. Populasi ini mungkin disesuaikan dengan mentolerir etanol. Perwakilan L. fermentum dan L. Vini isolat yang diperoleh dalam penelitian ini tumbuh dalam kaldu mengandung sampai etanol 10%, mencapai 106 sel / mL in48 jam percobaan di laboratorium. Dalam kontrol perawatan, sel tumbuh dalam kaldu tanpa etanol Selain mencapai kepadatan yang sama dalam waktu kurang dari 24 jam. diskusi Studi ini menunjukkan bahwa LAB umumnya ditemukan di proses bioetanol di distilleries Brasil. fermentasi substrat (gula tebu dan molases) tampaknya penting sumber kontaminasi. Kelimpahan bakteri di substrat tergantung pada beberapa faktor, termasuk asal tebu, waktu dari panen untuk menghancurkan dan tingkat hujan pada periode [1,9]. dominasi L. Vini dan L. fermentum setelah 30 hari untuk fermentasi proses menunjukkan bahwa kedua spesies tersebut sangat disesuaikan dengan proses bioetanol. L. fermentum mungkin menginduksi flokulasi sel ragi [10]. Spesies L. Vini baru-baru ini diklasifikasikan berdasarkan kelompok isolat berasal dari keharusan anggur difermentasi [11]. Hal ini terkait dengan L. nagelii dan L. satsumensis. L. Vini secara fisiologis serbaguna, memiliki bersifat homofermentatif fakultatif anaerob metabolisme, kemampuan untuk fermentasi heksosa dan pentosa (ribosa dan arabinosa) menjadi asam laktat dan pertumbuhan antara 25 C dan 45 C Keragaman LAB telah ditandai di jenis-jenis proses fermentasi. dalam Amerika Serikat, proses fermentasi menggunakan pati jagung atau serat hidrolisat sebagai substrat untuk fermentasi. dalam proses, L. acidophilus, L. agilis, L. amylovorus, L. brevis, L. casei, L. hilgardii, L. fermentum, L. plantarum dan W. paramesenteroides biasanya ditemukan [6,7]. para bakteri keragaman juga dianalisis dalam fermentasi etanol proses di Vietnam [12]. L. brevis, L. plantarum, Pediococcus pentosaceus, Weissella confusa dan W. paramesenteroides adalah LAB paling sering ditemukan. Selain itu,

bakteri asam asetat (Acetobacter orientalis dan A. pasteurianus), penghasil amilase bakteri (Bacillus subtilis, B. circulans, B. amyloliquefaciens dan sporothermodurans B.) dan beberapa bakteri patogen tanaman (Burkholderia ubonensis, Ralstonia solanacearum dan Pelomonas puraquae) juga dilaporkan. Spesies Lactobacillus adalah Vini diamati dalam hubungan dengan pertumbuhan ragi Dekkera bruxellensis dalam penyulingan bioetanol Swedia [13]. Proses ini melewati masa penurunan fermentasi sebelum stabilisasi. Penelitian ini juga menemukan tinggi kelimpahan Dekkera bruxellensis (107 CFUs / mL), mungkin menunjukkan hubungan antara ragi ini dan LAB. Pengaruh LAB Sacharomyces cerevisiae pada viabilitas dilaporkan oleh inokulasi L. fermentum dan L. delbrueckii dalam proses curah tumbuk gandum [14]. Lactobacillus paracasei dilaporkan mempengaruhi viabilitas ragi ketika konsentrasi asam laktat dalam proses melebihi 8 g / L [15]. Efek ini akan lebih parah ketika dikombinasikan dengan asam asetat [16]. induksi flokulasi ragi telah dikaitkan dengan beberapa fermentum L. strain bersinergi dengan kehadiran kalsium, yang menyebabkan hilangnya viabilitas ragi [17]. penurunan viabilitas sel ragi juga disebabkan oleh sel-sel tidak aktif L. fermentum, menunjukkan bahwa metabolit bakteri dapat mengganggu pada populasi ragi [18]. strain dari L. plantarum, L. fructivorans, L. fructosus dan L. buchneri juga mampu menginduksi flokulasi ragi tergantung pada kepadatan sel [19,20]. percobaan dilakukan pada skala laboratorium simulasi kontaminasi dengan L. fermentum menunjukkan bahwa kelangsungan hidup sel-sel ragi gula konsumsi dan hasil etanol yang sangat terpengaruh ketika asam asetat lebih tinggi dari 4,8 g / L [10]. Dalam penelitian ini pengamatan seperti mikrobiota perubahan selama proses berlangsung, kehadiran berbeda populasi L. Vini dan L. fermentum, dan co-ocurrence angka tinggi D. bruxellensis dan L. Vini menunjukkan ekologi mikroba kompleks dalam bioetanol proses. Kelimpahan dan keragaman LAB diamati pada empat distilleries dianalisis dalam penelitian ini juga menunjukkan bahwa proses bioetanol dapat ditingkatkan melalui penggunaan (i) kualitas tinggi baku bahan (gula tebu), terutama segar tanaman dengan beban rendah tanah dan mikroba cuci, (ii) tanaman tebu dengan air bersih, (iii) substrat kualitas yang lebih tinggi (tebu jus dan molases) yang akan berisi beban yang lebih rendah LAB, dan (iv) strain spesifik dirancang antimikroba perawatan menargetkan LAB paling sering ditemukan. Sering kali panen tanaman tebu uncoupled dari langkah-langkah selanjutnya dari proses (produksi jus misalnya),

mengakibatkan sebagian perakaran tanaman dan mikroba pertumbuhan. Para CFU tinggi jumlah yang diperoleh dalam belajar menunjukkan bahwa kontaminasi adalah biasa di bioetanol proses. Variabilitas genomik diamati pada repPola PCR menunjukkan kembali inokulasi yang berbeda jenis L. fermentum dan L. Vini seluruh memproses mungkin karena praktek manajemen. Karena data industri dari empat distilleries diperiksa dalam penelitian ini menyarankan bahwa konsentrasi asam laktat dalam proses fermentasi adalah tinggi, dan mengingat LAB dilaporkan sebagai komponen utama dari mikrobiota dari proses bioetanol di penelitian lain [6,7], kami menggunakan media umum elektif yang memungkinkan pertumbuhan LAB untuk mengisolasi jumlah tertinggi dari jenis bakteri. Hal ini penting untuk melihat bahwa MRS pulih berbagai jenis LAB. Media ini tidak selektif untuk jenis tertentu LAB, menunjukkan bahwa pulih berbagai jenis beredar LAB. Meskipun, kita tidak bisa mengesampingkan kemungkinan bahwa beberapa LAB telah diabaikan dalam penelitian ini, tetapi dalam hal apapun kami menganggap bahwa penelitian ini memberikan kontribusi awal untuk lapangan. Kesimpulan Ini adalah studi pertama yang bertujuan survei luas LAB keragaman dalam proses bioetanol di Brasil. Hasil disajikan di sini jelas menggambarkan LAB yang merupakan penting komponen dari proses bioetanol. Peningkatan praktek manajemen dapat meningkatkan hasil dari proses bioetanol. Penelitian ini membuka jalan baru penelitian yang bertujuan untuk kontrol dan teknologi penggunaan LAB. Karena kemampuan mereka untuk tumbuh dalam lingkungan yang keras kondisi, bakteri ini mungkin menawarkan gen baru dan jalur untuk aplikasi teknologi. Selain itu, rinci taksonomi pekerjaan berlangsung akan menjelaskan Spesies baru ditemukan dalam proses bioetanol. Metode Strain, kondisi budaya dan pemeliharaan sel Sampel industri dianalisis sini dikumpulkan bulanan dari tangki fermentasi seluruh panen periode, dimulai dengan hari pertama fermentasi sampai dengan akhir proses (180 hari), dalam empat distilleries di musim panen 2007-2008. Trapiche (Sirinham-PE, Brasil) yang digunakan molase, sedangkan Giasa (Pedras de Fogo-PB, Brasil), dan Miriri Japungu (Santa Rita-PB, Brasil) yang digunakan jus tebu. Keempat distilleries melakukan pembersihan ragi dengan cara sulfat berair solusi untuk mengurangi kontaminasi bakteri. Antibiotik (penisilin dan ionofor monensin) juga sering digunakan untuk mengurangi bakteri

kontaminasi dalam empat distilleries. Data etanol produksi diperoleh langsung dari produsen. Sampel dikumpulkan dalam kantong plastik steril, diangkut di atas es dan diproses pada hari yang sama dengan cara pengenceran dalam saline steril sampai 3 10-4, dan 0,1 ml pengenceran ini itu dilapisi ke media MRS [21] cycloheximide mengandung pada 0,1% untuk menghambat pertumbuhan jamur. Pelat diinkubasi pada 37 C dalam stoples anaerob selama 4 hari. Duapuluh perwakilan morphotypes koloni bakteri adalah dipilih untuk identifikasi taksonomi lebih lanjut. Isolat yang diselenggarakan dalam gliserol 30% pada -80 C. Secara total 7 sampel (Hari 1, 30, 60, 90, 120, 150, dan 180) digunakan untuk memperkirakan CFU bakteri angka dalam empat distilleries. Setiap sampel dianalisis dalam rangkap dua. Etanol toleransi Tes dilakukan dengan isolat LAB perwakilan tumbuh di MRS broth dilengkapi dengan Etanol (100 g / L) pada 37 C dan pH 6,5. Pertumbuhan sel diperkirakan dengan cara pengukuran densitas optik pada 600 nm menggunakan Biophotometer (Eppendorf). Dilusian sampel (0,1 mL) juga dilapisi ke Wallerstein laboratorium agar-agar menengah (WLN) nutrisi yang mengandung 0,1% Bromocresol hijau untuk penentuan kelimpahan ragi dan identifikasi dugaan [22].

ARDRA sidik jari Fragmen dari spacer 16S-23S diamplifikasi dengan primer 16-1A (5'-GAATCGCTAGTAATCG-3 ') yang anneals untuk nukleotida 1361-1380 dari 16S rRNA gen (menggunakan L. casei lokasi genom) dan 23-1B (5'-GGGTTCCCCCATTCGGA-3 ') yang anneals untuk nukleotida 123-113 gen rRNA 23S (menggunakan L. casei genom lokasi) [23]. Reaksi amplifikasi yang terkandung 0,5 pM primer masing-masing, 0,2 mM dNTP mix, 1,5 mM MgCl2 dan 5 U Taq DNA polimerase (Invitrogen) dalam 50 volume akhir uL. Amplifikasi PCR menggunakan Program termal standar (dua menit pada 94 C, diikuti dengan 35 siklus dari 94 C selama 30 detik, 55 C selama satu menit dan 72 C selama satu menit, dengan ekstensi akhir langkah pada 72 C selama 10 menit). ARDRA analisis dilakukan menggunakan 12 enzim restriksi SphI, NcoI, NheI, SSPI, SfuI, EcoRV, drai, VspI, HincII, EcoRI, HindIII dan AvrII seperti yang dijelaskan sebelumnya [23]. Pembatasan profil dari isolat yang diperoleh dari proses bioetanol dibandingkan dengan database ARDRA dilaporkan oleh Moreira dkk. [24]. Para ARDRA profil dari isolat adalah dibandingkan dengan database ARDRA. Sebuah mengisolasi

setelah profil ARDRA pencocokan profil ARDRA dari spesies LAB dikenal diidentifikasi ke dalam spesies ini. pheS dan 16S rRNA urutan Para rRNA 16S diamplifikasi dengan PCR menggunakan primer 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ') dan 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ') [25], sedangkan pheS diamplifikasi dengan primer 21-F (5'-CAYCCNGCHCGYGAYATGC3 ') dan 22-R (5'-CCWARVCCRAARGCAAARCC3 ') atau 23-R (5'-GGRTGRACCATVCCNGC HCC-3 ') [26]. Reaksi yang terkandung 0,5 pM primer masing-masing, 0,2 mM dNTP mix, 1,5 mM MgCl2 dan 1 U Taq DNA polimerase (Invitrogen) dalam volume akhir 50 uL. Amplifikasi dan sequencing dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [27]. Urutan gen dianalisis menggunakan perangkat lunak BioEdit v7.0. pheS dan 16S rRNA nukleotida urutan disimpan di GenBank di bawah aksesi no. HQ009762-HQ009795. REP-PCR sidik jari DNA analisis sidik jari dilakukan dengan menggunakan (GTG) 5 primer seperti yang dijelaskan sebelumnya [27,28]. amplifikasi reaksi berisi 0,2 pmol dari primer (GTG) 5, 0,2 mM dNTP mix, 3 mM MgCl2, 0,025 ug / uL BSA dan 1 U Taq DNA polimerase (Invitrogen). itu Program PCR termal (Tujuh menit pada 95 C, diikuti dengan 30 siklus dari 95 C selama satu menit, 40 C selama satu menit dan 65 C selama delapan menit, dan ekstensi akhir pada 65 C selama 16 menit) digunakan seperti yang dijelaskan sebelumnya [27,28]. Produk PCR diperiksa pada agarosa 1,5% gel pada 5 V / cm selama empat jam dalam 0,5 TBE buffer, bernoda di etidium bromida. Gambar Gel dicatat menggunakan sistem PhotoCapture . Kesamaan antara pola ditentukan oleh inspeksi visual. tambahan bahan Tambahan file 1: Tabel 1 daftar Regangan. Saring daftar dengan tempat, tanggal, dan sumber isolasi. Tambahan file 2: Tabel pola Pembatasan 2 dari 16S-23S intergenik spacer LAB dari proses bioetanol fermentasi. pola pembatasan 16S-23S spacer intergenik LAB dengan 12 enzim. File tambahan 3: urutan Gene. 16S rRNA dan gen pheS urutan LAB perwakilan beberapa Ucapan Terima Kasih Para penulis berterima kasih kepada Prof JOF Morais untuk diskusi yang subur. ini pekerjaan ini didukung oleh dana dari jubah / PROCAD-NF program dan oleh program beasiswa dari lembaga pendanaan Capes Brasil, CNPq dan FACEPE. Para penulis juga berkat Genetech Bioproductivity S / A (Recife, Brasil) dan distilleries untuk jenis mereka membantu dengan sampel industri, dan DNA sequencing platform CPqAM / FIOCRUZ (Recife, Brasil) dan IBUFRJ (Rio de Janeiro, Brasil) untuk analisis sekuensing DNA bakteri. F.L.T.

mengakui pendanaan FAPERJ, CNPq, dan jubah. penulis rincian 1Institute Biologi, Universitas Federal Rio de Janeiro (UFRJ) di Rio de Janeiro, Brasil. 2Department Genetika, Federal University of Pernambuco (UFPE), Recife, Brasil. 3Department Biologi Umum, Federal University of Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, Brasil. Penulis kontribusi BTLL dan BMS dilakukan LAB isolasi, rRNA pembatasan analisis profil dan rep-PCR; JLSM, ACN dan VA berpartisipasi dalam profil pembatasan rRNA analisis; BTLL dan APBM dilakukan tes toleransi etanol dan, 16S sekuensing pheS sekuensing; MAMJ dan FLT didanai proyek, dianalisis data dan menulis naskah. Semua penulis membaca dan menyetujui final naskah. Diterima: 31 Juli 2010 yang diterima: 23 November 2010 Diterbitkan di: 23 November 2010