Anda di halaman 1dari 46

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Masalah Tanaman menghasilkan metabolit primer dan sekunder. Metabolit primer merupakan dasar untuk pertumbuhan dan reproduksi untuk sel tanaman itu sendiri, sedangkan metabolit sekunder merupakan metabolit sampingan. Metabolit sekunder tidak begitu dipentingkan bagi tanaman itu sendiri, melainkan hanya sebagai penunjang untuk proses adaptasi, perlindungan diri, serta untuk berinteraksi dengan lingkungan. Metabolit sekunder dari tanaman banyak berfungsi bagi kehidupan manusia, antara lain sebagai bahan baku obat, kosmetika, dan sebagainya.

Metabolit sekunder tersebut, antara lain adalah alkaloid, triterpen, terpenoid, senyawa fenol, dan minyak atsiri (Crocomo dkk, 1981) Sampai saat ini masih sedikit senyawa metabolit sekunder yang telah

diproduksi melalui kultur jaringan secara komersial. Beberapa contoh senyawa metabolit sekunder yang diperoleh dari budidaya kultur jaringan tanaman, antaralain yaitu : Produksi Shikonin yaitu suatu senyawa napthaquinon yang digunakan sebagai bahan perwarna dan bahan obat-obatan telah diproduksi dalam skala komersial oleh Mitsui Petrochemical Co. Shikonin ini tergolong mahal dengan harga mencapai $ 5.000 per kilogram . Shikonin ini diproduksi dari Lithospermum erythrorhizon. Produksi nikotin dalam konsentrasi tinggi dari beberapa kalus Nicotiana Produksi berberin dari Coptis japonica, coumarin dari Cichorium intybus L. cv. Lucknow (Hendaryono dan Wijayani 1999 1999, Adnane dkk. 2001, Bais dkk. 2001, Kazufumi 2001). Produksi metabolit sekunder oleh tanaman sangat terbatas, karena tidak semua tanaman dapat menghasilkan metabolit sekunder yang bermanfaat, hanya terbatas pada kelompok suku tertentu saja. Faktor lain yang turut berpengaruh adalah sempitnya lahan untuk budidaya, habitat yang sesuai untuk tumguhnya tanaman, musim, cuaca, suhu. Oleh karena itu, tanaman

Page | 1

serta metabolit sekunder yang dihasilkan mempunyai nilai ekonomi yang tinggi. Permasalahan seperti itu, dapat diatasi dengan budidaya alternative, yaitu budidaya dengan kultur jaringan tanaman. Kultur jaringan tanaman memiliki banya keunggulan bila dibandingkan dengan cara konvensional. Keunggulannya yaitu: 1. Pengadaan bibit tidak tergantung musim 2. Bibit dapat diproduksi dalam jumlah banyak dengan waktu yang relatif lebih cepat (dari satu mata tunas yang sudah respon dalam 1 tahun dapat dihasilkan minimal 10.000 planlet/bibit) 3. Bibit yang dihasilkan seragam 4. Bibit yang dihasilkan bebas penyakit (menggunakan organ tertentu) 5. Biaya pengangkutan bibit relatif lebih murah dan mudah 6. Dalam proses pembibitan bebas dari gangguan hama, penyakit, dan gangguan lingkunan lainnya. Meskipun memiliki kelebihan di atas, teknik ini membutuhkan ketrampilan dan alat khusus dalam melakukannya. Untuk itu perlu mengetahui terlebih dahulu pengetahuan tentang perkembangan produksi senyawa metabolik sekunder melalui kultur jaringan, prosedur produksi senyawa metabolik senyawa metabolik melalui kultur jaringan, dan teknik peningkatan produksi metabolik sekunder melalui kultur jaringan Kultur jaringan tanaman pertama kali berhasil dilakukan oleh White pada tahun 1934. Pada tahun 1939, Whiter melaporkan keberhasilannya dalam membuat kultur kalus dari wortel dan tembakau. Pada tahun 1957, tulisan penting Skoog dan Miller dipublikasikan dimana mereka menyatakan bahwa interkasi kuantitatif antara auksin dan sitokinin menentukan tipe pertumbuhan dan morfogenik yang akan terjadi. Penelitian mereka pada tembakau mengindikasikan bahwa perbandingan auksin dan sitokinin yang tinggi akan menginduksi pengakaran, sedangkan rasio sebaliknya akan menginduksi pembentukan tunas. Temuan penting lainnya adalah hasil penelitian Morel tentang

perbanyakan anggrek melalui kultur jaringan pada tahun 1960, dan penggunaan yang meluas media kultur dengan konsentrasi garam mineral yang tinggi, dikembangkan oleh Murashige dan Skoog tahun 1962.

Page | 2

Pada tahun 2004, seorang mahasiswa Farmasi Bahan Alam fakultas Farmasi UGM, Amelia Indriana kultur kalus meneliti tentang pengaruh sukrosa terhadap

daun Binahong (Anredera scandens (L.) Moq). Hasil penelitian

menunjukkan bahwa pada konsentrasi tertentu, sukrosa mempengaruhi produksi dari alkaloid saponin dari tanaman Binahong ( Anredera scandens L ). Pada penelitian yang dilakukan oleh Tundjung T. Handayani, mengenai induksi pembentuka kalus bawang putih dengan IAA dan kinetin. Hasil penetilian Pembentukan kalus bawang putih dari eksplan tunas vegetatif dan efisien menggunakan kombinasi IAA 1,0 mg/l dan KIN 1,0 mg/l. Dengan kombinasi tersebut dapat dicapai persentase keberhasilan pembentukan kalus 77,78% dengan kecepatan pembentukan kalus 57,41% per minggu, dan bobot segar kalus 0,1758 g per eksplan (Handayani, Tundjung T, 2007, Induksi Pembentukan Kalus Pada Bawang Putih (Allium sativum L.) dengan IAA dan Kinetin, Jurnal A)kta Agrosia edisi khusus No. 1, 53-58) Karjadi A.K dan Buchory (2008) menyatakan bahwa eksplan dapat tumbuh dan berkembang di semua komposisi media. Kontaminasi hanyaterjadi pada beberapa kultur. Pertumbuhan eksplan yang normal ditunjukkan oleh

pertumbuhan daun yang baik, lurus, dan mengarah ke atas. Tidak didapatkan perbedaan nyata pengaruh penambahan hormon picloram, 2-ip, dan BAP terhadap pertumbuhan plantlet. Namun secara umum kombinasi antara picloram dan 2-ip dapat mempercepat pertumbuhan tunas.( Pengaruh Penambahan Auksin dan Sitokinin terhadap Pertumbuhan Tunas Bawang Putih Karjadi, A.K., dan Buchory, A. Balai Penelitian Tanaman Sayuran Jl. Tangkuban Parahu 517 Lembang, Bandung 40391, 2008) Menurut Devy, N.F. dan Hardiyanto (2009), menyatakan bahwa induksi kalus dilakukan pada segmen apikal akar bawang putih yang ditanam secara in vitro. Persentase jumlah eksplan yang berkalus cukup tinggi, berkisar antara 70-100% pada media MS+0,2 g/l CH + 1 ppm 2.4 D maupun media MS + 1 ppm 2.4 D + 0,1 ppm IAA. (Devy, N.F dan Hardiyanto, 2009, Kemampuan Regenerasi Kalus Segmen Akar pada Beberapa Klon bawang Putih Lokal Secara In Vitro, Balai Penelitian Tanaman Jeruk dan Buah Subtropika, Batu)

B. Perumusan Masalah Dari sekilas uraian di atas, kami merumuskan masalah sebagai berikut

Page | 3

1. Apa pengaruh dari pemberian 2,4 D terhadap kultur kalus .pada umbi lapis bawang putih, daun kemangi, daun binahong dan daun tapak doro pada media Murashige Skoog (MS)? 2. Apa pengaruh dari pemberian kinetin terhadap kultur tunas pada batang jaka tuwa dan batang binahong pada media Murashige Skoog (MS)? 3. Bagaimana profil KLT dari kultur kalus bawang putih yang dihasilkan ?

C. Tujuan Pada praktikum ini bertujuan untuk mengetahui 1. Pengaruh pemberian 2,4 D pada kultur kalus umbi wortel, daun binahong dan daun kemangi pada media Murashige Skoog 2. Pengaruh pemberian kinetin pada kultur tunas pada batang jaka tuwa, umbi bawang putih dan daun kemangi yang ditanam pada media Murashige Scoog (media MS), 3. Profil KLT dari kultur kalus bawang putih yang dihasilkan untuk mengetahui kulitas dari kandungan metabolitnya.

D. Tinjauan Pustaka a. Uraian Tentang Tanaman a.Jaka Tuwa (Scoparia dulcis L.) Tanaman S. Dulcis L berasal dari Amerika tropis, merupakan tumbuhan liar yang umumnya ditemukan dipematang sawah, pinggir jalan, tepi sawah atau semak-semak pada ketinggian 10-800 dpl (Heyne, 1987; Syamsudiyat dan Hutapea, 1999 dalam Windaratmuji, 2004). Bentuk herba, bercabang-cabang tingginya 0,2-0,8 m dan termasuk suku Scophulariaceae yang berbatang bulat, licin, sedikit berkayu dan berwarna hijau. Helaian daunnya berbentuk oval dengan pangkal meruncing dan ujung meruncing serta tepinya bergerigi. Daunnya tunggal tersebar, berseling dan panjang 1-2 cm dan lebar 0,5-1 cm. Pertulangan daunnya menyirip dengan permukaan kasar dan hijau (Syamsuhidayat dan Hutapea, 1999 dalam Windaratmuji, 2004). Tanaman ini memiliki bunga sempurna berwarna putih dengan benang sari 4 lepas yang hampir sama panjang dan kepala putik berbentuk bulat kecil. Bunga mempunyai mahkota bentuk bulat telur terbalik dan kelopak

Page | 4

yang berbagi dalam, kelopak tidak gugur sampai perkembangan buah (van Steenis, 1988 dalam Windaratmuji, 2004). Buahnya kotak sedang bijinya bulat, kecil dalam jumlah yang banyak. Tanaman ini mempunyai akar tunggang berwarna putih kecoklatan (Backer dan van Brink, 1965 dalam Windaratmuji, 2004). Menurut sistematika tumbuhan, tanaman jaka tuwa mempunyai

kedudukan taksa sebagai berikut: Divisi Sub Divisi Kelas Bangsa Suku Marga Jenis : Spermatophyta : Angiospermae : Dicotyledoneae : Solanales : Scorphulariaceae : Scoparia : Scoparia dulcis L (Heyne, 1987;

Tjitrosoepomo, 1996 dalam Windaratmuji, 2004). Gambar. Jaka Tuwa (Anonimd, 2009) Nama daerah adalah jaka tuwa, nama lainnya ginje menir atau ginje jepun dan berbagai tempat di Jawa digunakan sebagai pengganti candu (opium) (Heyne, 1987; van Steenis, 1988 dalam Windaratmuji, 2004). Tanaman ini memiliki aktivitas sebagai antibatuk, antidisentri, dan peluruh air seni (Syamsuhidayat dan Hutapea, 1999 dalam Windaratmuji, 2004), dan juga mempunyai aktivitas antiherpes, antiviral, hipotensif, antifungi dan antidiabetes (Anonim, 2004 dalam Windaratmuji, 2004). Seluruh bagian tanaman mengandung saponin dan flavonoid, sedangkan bagian akar mengandung alkaloid (Syamsuhidayat dan Hutapea, 1999 dalam Windaratmuji, 2004). Tanaman ini juga dilaporkan mengandung asam scopadulcic yang kerangka dasar diterpen, acacetin, lutenolin, vitexin, isovitexin, apigenin, dan asam gentisat (Anonim, 2004 dalam Windaratmuji, 2004).

b.Wortel (Daucus carota L.)

Page | 5

Secara umum tanaman wortel mempunyai nama ilmiah sebagai berikut boktel (Sunda), wortel (Jawa). Sistematika wortel adalah sebagai berikut: Divisi Sub Divisi Kelas Bangsa Suku Marga Jenis : Spermatophyta : Angiospermae : Dicotyledoneae : Umbelliflorae : Apiaceae : Daucus : Daucus carota L. Gambar. Wortel (Anonimb, 2009) Tanaman wortel berupa semak, semusim, tinggi 1-1,5 m. bebatang bulat, tegak, berbulu, hijau. Daun majemuk, menyirip, bersilang, lonjong, tepi bertoreh, ujung runcing, pangkal berlekuk, panjang 15-20 cm, lebar 10-13 cm, pertulangan menyirip, hijau. Bunga mejemuk, bentuk cawan, diujung batang, tangkai silindris, hijau, kelopak lonjong, lima helai, hijau, benang sari silindris, panjang 3mm, putih, kepala sari bulat, kuning, tangkai putik silindri, kepala putik bulat, kuning, mahkota bentuk bintang, halus, putih. Buah buni, lonjong, diameter 3 mm, coklat. Biji lonjong, putih. Akar tunggang, membentuk umbi, oranye. Umbi wortel berkhasiat sebagai obat tekanan darah tinggi dan untuk menjaga kesehatan mata. Daun, buah dan umbi wortel mengandung saponin, disamping itu daunnya mengandung tanin dan umbinya mengandung saponin dan polifenol (Hutapea, 1993). Tiap 100 g wortel mengandung 86,0 g air; 0,9 g protein; 10,7 g karbohidrat; 1,2 g serabut; 1,1 g abu; 80 mg kalsium; 30 mg fosfor; 1,5 mg besi; 2000-4300 IU vitamin A; 60 IU vitamin B; 3 mg niacin: dan 3 mg asam askorbat. Selain itu marga Daucus juga mengandung aseton, koline, etanol,asam formiat, asam oksalat, asam palmitat, pirolidin dan asam kuinat (Duke, 1987 dalam Widiastuti,1993). Minyak menguapnya mengandung limonen, pinen dan sineol, sedangkan bijinya mengandung asam tiglat, asaron dan bisabol (Perry, 1980 dalam Widiastuti,1993)

c.Kemangi (Ocimum basilicum L. forma citratum Back.)

Page | 6

Secara umum tanaman kemangi mempunyai nama ilmiah sebagai berikut kemangi (Indonesia), kemangi (Jawa), dan Surawung (Sunda) (Heyne, 1987 dalam Pustitasari, 2004). Sistematika kemangi adalah sebagai berikut: Divisi Sub Divisi Kelas Bangsa Suku Marga Jenis citratum Back. (Backer dan van den Brink, 1965; Tjitrosoepomo, 1994 dalam Pustitasari, 2004). Gambar. Kemangi (Anonime, 2009) Tanaman kemangi merupakan herba tegak yang mempunyai bau seperti sereh dan sangat harum. Tinggi tanaman kemangi 0,3-0,6 m. batangnya berwarna hijau. Tangkai daun mempunyai panjang 0,5-2 cm; helaian daun berbentuk bulat telur elips, elips atau memanjang, denagn ujung runcing, dan berukuran 3,5-7,5x1,5-2,5 cm. Tulang cabang berjumlah 3-6 buah. Bunga tersusun dalam karangan semu jumlah 6. Daun pelindung berbentuk elips (bulat telur), panjangnya 0,5-1 cm. Sisi luar kelopak berambut, panjangnya kuranh lebih 0,5 cm dan kelopaknya tidak gugur. Mahkota bunga berwarna putih, berbibir 2, panjang 8-9 mm, bibir atas bertaju 4, sedangkan bibir bawah rata. Buahnya keras, berwarna coklat tua, permukaanya gundul dan waktu dibasahi membengkak. Tanaman kemangi sering tumbuh liar, tumbuh pada ketinggian 1-450 m di atas permukaan laut, di tepi jalan dan tepi kebun (van Steenis, 1975 dalam Puspitasari, 2004). Menurut Syamsudiyat dan Hutapea (1991), daun kemangi berkhasiat sebagai peluruh air susu ibu, obat penurun panas, sariawan dan mual. Selain itu juga berguna sebagai obat diare, penghilang bau keringat, bau nafas dan bau mulut. : Spermatophyta : Angiospermae : Dicotyledoneae : Solanales : Lamiaceae : Ocimum : Ocimum basilicum L. forma

Page | 7

Daun kemangi segar mengandung minyak atsiri sebagai berikut 1,8Cineole, p-coumaric acid, p-cymene, limonene, linalool, methylchaviol, methyl cinnamate, myrcene, -pinene, -pinene, safrole, dan -terpinene (Anonim, 2001 dalam Puspitasari, 2004).). Menurut Syamsudiyat dan Hutapea (1991) daun kemangi selain mengandung minyak atsiri juga mengandung flavonoid, saponin dan tanin.

d.Bawang Putih (Allium sativum L.) Secara umum tanaman bawang putih mempunyai nama ilmiah sebagai berikut bawang putih (Melayu), lasun (Aceh), dasun (Minangkabau), lasuna (Batak), bacong landak (Lampung), bawang bodas (Sunda), bawang (Jawa), babang pote (Madura), bawang kasihong (Dayak), Launa kebo (makasar), lasuna pote (Bugis), Piamoputi (Gorontalo). Sistematika bawang putih adalah sebagai berikut: Divisi Sub Divisi Kelas Bangsa Suku Marga Jenis : Spermatophyta : Angiospermae : Monocotyledoneae : Liliales : Liliaceae : Allium : Allium sativum L. Gambar. Bawang putih (Anonimc, 2007) Tanaman bawang putih berupa herba, semusim, tinggi 50-60 cm. Berbatang semu, beralur dan hijau. Daun merupakan daun tunggal, berupa roset akar bentuk lanset, tepi rata, ujung runcing, beralur, panjang 60 cm, lebar 1,5 cm, menebal dan berdaging serta mengandung persediaan makanan yang terdiri atas subang yang dilapisi daun sehinggan menjadi umbi lapis, hijau. Bunga majemuk, bentuk payung, bertangkai panjang, putih (Syamsuhidayat dan Hutapea, 1991).

(Syamsuhidayat dan Hutapea, 1991). . Umbi lapis Allium sativum berkhasiat sebagai obat tekanan darah tinggi, obat pening dan antibiotika. Umbi lapis Allium sativum mengandung

Page | 8

saponin,

flavonoida,

dan

polifenol

di

samping

minyak

atsiri

(Syamsuhidayat dan Hutapea, 1991). e.Binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) Secara umum tanaman binahong mempunyai nama ilmiah sebagai berikut binahong (Indonesia), heartleaf madeiravine, madeira vine (Inggris), dan teng san chi (China). Klasifikasi binahong adalah sebagai berikut: Kingdom :Plantae

Subkingdom : Tracheobionta Super Divisi Divisi Kelas Sub Kelas Ordo Famili Genus Spesies : Spermatophyta : Magnoliophyta : Magnoliopsida : Hamamelidae : Caryophyllales : Basellaceae : Anredera : Anredera cordifolia (Ten.) Steenis Gambar. Tanaman Binahong (Anonima, 2009)

Nama lain dari Anredera cordifolia (Ten.) Steenis adalah Boussingaultia gracilis Miers, Boussingaultia cordifolia, Boussingaultia basselloides. Tanaman binahong berupa tumbuhan menjalar, berumur panjang (perenial), bisa mencapai panjang +/- 5 m. Akar berbentuk rimpang, berdaging lunak. Batang lunak, silindris, saling membelit, berwarna merah, bagian dalam solid, permukaan halus, kadang membentuk semacam umbi yang melekat di ketiak daun dengan bentuk tak beraturan dan bertekstur kasar. Daun tunggal, bertangkai sangat pendek

(subsessile), tersusun berseling, berwarna hijau, bentuk jantung (cordata), panjang 5 - 10 cm, lebar 3 - 7 cm, helaian daun tipis lemas, ujung runcing, pangkal berlekuk (emerginatus), tepi rata, permukaan licin, bisa dimakan. Bunga majemuk berbentuk tandan, bertangkai panjang, muncul di ketiak daun, mahkota berwarna krem keputih-putihan berjumlah lima helai tidak berlekatan, panjang helai mahkota 0, 5 - 1 cm, berbau harum. Perbanyaan generatif (biji), namun lebih sering berkembang atau

Page | 9

dikembangbiakan secara vegetative melalui akar rimpangnya (Anonima, 2009). 2. Uraian Tentang Kultur Jaringan Tanaman Kultur jaringan adalah metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan dan organ, serta

menumbuhkannya dalam kondisi aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan akhirnya tumbuh menjadi individu baru. Pada mulanya, orientasi teknik kultur jaringan hanya pada pembuktian teori totipotensi sel yaitu setiap sel dapat berkembang menjadi individu baru. Kemudian teknik kultur jaringan berkembang menjadi sarana penelitian di bidang fisiologi. Metode kultur jaringan dikembangkan untuk membantu memperbanyak tanaman, khususnya untuk tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara generatif. Bibit yang dihasilkan dari kultur jaringan mempunyai beberapa keunggulan, antara lain: mempunyai sifat yang identik dengan induknya, dapat diperbanyak dalam jumlah yang besar sehingga tidak terlalu membutuhkan tempat yang luas, mampu menghasilkan bibit dengan jumlah besar dalam waktu yang singkat, kesehatan dan mutu bibit lebih terjamin, kecepatan tumbuh bibit lebih cepat dibandingkan dengan perbanyakan konvensional. Tahapan yang dilakukan dalam perbanyakan tanaman dengan teknik kultur jaringan adalah 1) Pembuatan media Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. 2) Inisiasi Inisiasi adalah pengambilan eksplan dari bagian tanaman yang akan dikulturkan. Bagian tanaman yang sering digunakan untuk kegiatan kultur jaringan adalah tunas. 3) Sterilisasi Sterilisasi merupakan segala kegiatan dalam kultur jaringan harus

dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada

Page | 10

peralatan yang digunakan. Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus steril. 4) Multiplikasi Multiplikasi adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman dengan menanam eksplan pada media. Kegiatan ini dilakukan di laminar flow untuk menghindari adanya kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan. Tabung reaksi yang telah ditanami ekplan

diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang steril dengan suhu kamar. 5) Pengakaran Pengakaran adalah fase dimana eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan baik. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun jamur. Eksplan yang

terkontaminasi akan menunjukkan gejala seperti berwarna putih atau biru (disebabkan jamur) atau busuk (disebabkan bakteri). 6) Aklimatisasi Aklimatisasi adalah kegiatan memindahkan eksplan keluar dari ruangan aseptic ke bedeng. Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan memberikan sungkup. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan hama penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap serangan hama penyakit dan udara luar. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif. a. Media Keberhasilan kultur jaringan ditentukan dan tergantung oleh pemilihan media yang digunakan. Secara umum kebutuhan nutrisi kebanyakan tanaman sama, tetapi secara khusus hal tersebut berbeda. Kesamaannya adalah tanaman memerlukan: hara makro, hara mikro, vitamin, karbohidrat, asam amino dan N-organik, zat pengatur tumbuh, zat pemadat dan kadang ada penambahan bahan-bahan seperti air

Page | 11

kelapa, ekstrak ragi, jus tomat, ekstrak kentang, bufer organik, ataupun arang aktif (Santosa dkk, 2002) 1. Garam anorganik Kadar kalium dan nitrat sekurang-kurangnya 20-25 mM. Amonium mungkin diperlukan juga, walaupun dalam jumlah diatas 8mM dapat membahayakan. Kebutuhan untuk natrium atau klorida tidak nyata. Kadar sulfat, fosfat dan magnesium 1-3 mM tampaknya sudah mencukupi. Hara mikro yang dianjurkan adalah: iodida, asam borat, dan garam mangan, seng, molibdenum, tembaga, kobalt, dan besi. Yang terakhir ini sebaiknya dipasok dalam bentuk khelatnya (Wetter, 1991). 2. Sumber karbon Sukrosa atau glukosa 2-4% merupakan suber karbon yang paling cocok.berbagai asam organik digunakan bersama amonium yang juga mampercepat pertumbuhan sel yang dikultifikasi pada rapatan rendah (Wetter, 1991). 3. Vitamin Pemberian vitamin pada media berfungsiu sebagai membantu pertumbuhan dalam ekspaln yang ditanam. Vitamin yang digunakan berkadar kecil, yaitu 0,1-0,5 mg/liter (Santosa dan Nursadi, 2005). Thiamin merupakan satu-satunya vitamin yang penting. Pyridoxine, asam nikotinat dan mio-inositol seringkali dapat meningkatkan pertumbuha sel (Wetter, 1991). Vitamin lain yang sering digunakan adalah p-amino-benzoic acid, folate, choline cloride, riboflavin, dan ascorboic acid (Santosa dkk, 2002). 4. N-organik Sumber dari nitrogen organik dalam media, antara lain: asam amino, glutamin, dan adenin. Pemberian senyawa ini sangat penting, dikarenakan dapat membantu untuk mempertahankan suatu kalus yang masih dalam proses inisiasi (Santosa dkk, 2002). 5. Senyawa Kompleks Senyawa kompleks ini biasanya adalah protein hidrolisat, yeast ekstrak, malt ekstrak, dan berbagai bahan tanaman termasuk air kelapa (Santosa dkk, 2002).

Page | 12

6. Zat pengatur tumbuh Zat pengatur tumbuh tanaman adalah senyawa organik non-hara yang dalam jumlah sedikit dapat mendukung, menghambat dan dapat merubah proses fisiologo tanaman. Penambahan zat pengatur tumbuh pada media pertumbuhan dan diferensiasi sangat diperlukan. Zat pengatur tumbuh dalam tanaman tanaman terdiri dari kelompok yaitu auksin, sitokini, giberelin, etillen dan inhibitor dengan ciri khas serta pengaruh yang berlainan (Santosa dkk, 2002). Tabel. Peranan ZPT pada pertumbuhan dan perkembangan tumbuhan (Dewi, 2008) ZPT Fungsi utama Tempat dihasilkan dan lokasinya pada tumbuhan Auksin Mempengaruhi pertambahan panjang batang, pertumbuhan, diferensiasi dan percabangan akar; perkembangan buah; dominansi apikal; fototropisme dan geotropisme. Sitokinin Mempengaruhi pertumbuhan dan diferensiasi akar; mendorong pembelahan sel dan pertumbuhan secara umum, mendorong perkecambahan; dan menunda penuaan. Giberelin Mendorong perkembangan biji, perkembangan kuncup, pemanjangan batang dan pertumbuhan daun; mendorong pembungaan dan perkembangan buah; mempengaruhi pertumbuhan dan diferensiasi akar. Asan absisat (ABA) Menghambat pertumbuhan; merangsang penutupan stomata pada waktu kekurangan air, mempertahankan Daun; batang, akar, buah berwarna hijau. Meristem apikal tunas ujung dan akar; daun muda; embrio. Pada akar, embrio dan buah, berpindah dari akar ke organ lain. Meristem apikal tunas ujung, daun muda, embrio dalam biji.

Page | 13

dormansi. Etilen Mendorong pematangan; memberikan pengaruh yang berlawanan dengan beberapa pengaruh auksin; mendorong atau menghambat pertumbuhan dan perkembangan akar, daun, batang dan bunga Buah yang matang, buku pada batang, daun yang sudah menua

Media yang dikembangkan oleh Murashige Skoog (MS) untuk kultur jaringan tembakau digunakan secara luas untuk kultivikasi kalus pada agar demikian juga pada kultur suspensi sel dalam media cair. Keistimewaan media MS adalah kandungan nitrat, kalium dan amoniumnya yang tinggi (Wetter, 1991). Tabel. Komposisi dari media MS untuk kultur tunas dan kalus (Santosa dkk, 2002) Unsur makro NH4NO3 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4 Unur mikro KI H3BO3 MnSO44H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO42H2O CuSO4.5H2O CoCL2. 6H2O Fe-(EDTA) Sumber karbon Sukrose 30.000 0,83 6,2 22,3 8,6 0,25 0,025 0,025 43,0 mg/l 1650 1900 440 370 170

Page | 14

pH

5,7

i. Sterilisasi Menurut George (1984), metode sterilisasi yang sering digunakan dalam pengerjaan kultur jaringan tanaman, adalah: 1. Pemanasan kering Metode ini hanya digunakan untuk sterilisasi alat gelas, logam, alat lain yang tidak hangus pada pemanasan tinggi. Benda yang mengandung kapas, kertas, atau plastik tidaka dapat disterilkan dengan metode ini. Pisau bedah atua skapel jika disterilkan dengan metode ini akan menyebabakan permukaannya tumpul. Suhu dan waktu yang dibutuhkan adalah 1600C selama 4 jam. Benda yang disterilkan dibungkus dengan aluminium heavy duty. 2. Pemanasan Basah Prosedur ini membutuhkan otoklaf. Untuk sterilisasi cairan dengan volume 1 liter, dibutuhkan waktu 20 menit dan suhu sterilisasi 1210C. Sterilisasi alat-alat biasanya dilakukan dalam waktu 30 menit. Instrumen yang akan disterilkan (kecuali erlenmeyer) dibungkus dalam kertas aluminum atau kertas payung. 3. Ultra Filtrasi Beberapa komponen media, misalnya IAA, vitamin tidak satabil dalam pemanasan, karena itu untuk senyawa yang demikian itu sering disterilisasi dengan ultra filtrasi. Diameter lubang filter untuk sterilisasi metode ini adalah 0,22 mikron. 4. Sterilisasi Kimia Permukaan meja bekerja biasanya disterilisasi dengan etanol 70% atau isopropanol 70%. Sering juga disediakan wadah berisi etanol untuk mensterilakan alat-alat sebelum digunakan, yang kemudian dipijarkan diatas lampu spiritus. Bahan tanaman yang ditanam biasanya juga disterilkan dengan metose ini, yaitu dengan menggunakan 0,5% NaOCl atau larutan kalsium hipoklorit. Sering juga digunakan laturan sublimat. Setelah dikenakan pada larutan sterilan, ekspalan harus dibilas beberapa kali, terutama bila yang digunakan adalah larutan sublimat. Beberapa

Page | 15

peneliti menggunakan sterilisasi dua tahap, yaitu dilakukan prasterilisasi dengan memasukkan dalam alkohol 70% dan dogojog selama 2-3 menit sebelum dilakukan sterilisasi dengan larutan NaOCl (laritan hipoklorit) atau senyawa lain. 5. Antibiotik Sterilisasi dengan larutan antibiotik bila terpaksa, tidak dilakukan, karena diperkirakan akan mempengaruhi pertumbuhan ekspan. Sterilisasi meliputi:

i.

Sterilisasi Media Media yang digunakan harus disterilkan dengan cara

memanaskannya dengan autoklaf. Proses sterilisasi ini tergantung volume media dan ukuran botol kultur, waktu sterilisasi bervariasi antara 15 40 menit pada suhu 1210C dengan tekanan 103 K Pascal Tabel. Anjuaran Minimal Waktu yang dibutuhkan untuk sterilisasi media (Santosa, 2002) Volume media (mL) 20 50 75 250 500 1000 1500 2000 Waktu sterilisasi 15 20 25 30 35 40

Penting dicatat bahwa zat pengatur tumbuh tertentu, vitamin dan antibiotik dipengaruhi oleh panas dan karenanya perlu sterilisasi dengan memakai filter. Sterilisasi filter atau filtrasi membrane adalah melewatkan larutan (sebaiknya dibuat dengan menggunakan air steril di dalam laminar air flow cabinet) melalui membran yang telah disterilisasi, dengan ukuran pori 0.45 uM atau 0.22uM dibawah tekanan rendah ke dalam wadah steril. Jumlah yang diinginkan dari larutan steril kemudian ditambahkan ke media kultur yang telah

Page | 16

diautoklaf sebelumnya dan kemudian ditempatkan pada waterbath dengan suhu 400C. ii. Sterilisasi Alat Sterilisasi alat gelas dan metal dapat dilakukan dengan pemanasan melalui oven. Agar terbebas dari bakteri yang resisten dan partikel spora, pemanasan harus dilakukan terus menerus dalam jangka waktu yang panjang (Santosa, 2002).

ii. Eksplan Eksplan adalah organ tanaman atau potongan kecil dari jaringan tanaman yang digunakan sebagai bahan awal dalam kultur jaringan tanaman. Pemilihan ekspaln harus didasari oleh pengetahuan tentang sel, yaitu bagian mana dari tumbuhan yang mempunyai sel aktif membelah, karena ini mempunyai kemampuan untuk mengalami pertambah volume, diferensiasi, dan penambahan jumlah sel sehingga terjadi pertumbuhan. Pemilihan bagian tanaman yang digunakan sebagai eksplan tergantung pada tipe kultur yang akan dibuat, maksud dari pembuatan kultur, dan jenis tanaman yang digunakan sebagai tanaman sumber. Tanaman yang tumbuh di lingkungan eksternal hampir selalu terkomtaminasi oleh mikroorganisme, seperti bakteri dan jamur. Mikroorganisme ini akan bersaing dan merugukan pertumbuhan eksplan setelah ditanam secara in vitro, karena itu eksplan harus dibebaskan dari kontaminan sebelum ditanam (George, 1984) a. Kultur Tunas Kultur ini mengambil bagian yang bersifat meristematik seperti bagian ketiak daun atau bagian ujung batang. Jenis kultur ini sesuai dengan mikropropagasi, yaitu untuk menghasilkan jenis tumbuhan dalam jumlah yang besar dalam waktu singkat. Keuntungan pengembangan kultur tunas pucuk selain untuk perbanyakan massal tanaman, juga dapat menghasilkan bibit yang bebas penyakit sistemik (George, 1993).

Page | 17

b. Kultur Kalus Kalus adalah suatu kumpulan sel amorphous yang terjadi dari sel-sel jaringan yang membelah diri secara terus menerus. Penelitian pembentukan kalus pada jaringan terluka pertama kali dilakukan oleh Sinnott pada tahun 1960. Pembentukan kalus pada jaringan luka dipacu oleh zat pengatur tumbuh auksin dan sitokinin endogen (Dodds & Roberts, 1983). Secara in vivo, kalus pada umumnya terbentuk pada bekas-bekas luka akibat serangan infeksi mikro organisme seperti Agrobacterium tumefaciens, gigitan atau tusukan serangga dan nematoda. Kalus juga dapat terbentuk sebagai akibat stress (George & Sherrington, 1984). Kalus yang diakibatkan oleh hasil dari infeksi bakteri Agrobacterium tumefaciens disebut tumor (Muslim, 2009). Tujuan kultur kalus adalah untuk memperoleh kalus dari eksplan yang diisolasi dan ditumbuhkan dalam lingkungan terkendali. Kalus diharapkan dapat memperbanyak dirinya (massa selnya) secara terus menerus. Dalam kultur kalus, kalus homogen yang tersusun atas sel-sel parenkhim jarang dijumpai kecuali pada kultur sel Agave dan Rosa (Dodds & Roberts, 1983 dalam Muslim, 2009). Untuk memperoleh kalus yang homogen maka harus menggunakan eksplan jaringan yang mempunyai sel-sel yang seragam. Dalam pertumbuhan kalus, citodiferensiasi terjadi untuk membentuk elemen trachea, buluh tapis, sel gabus, sel sekresi dan trikoma. Kambium dan periderm sebagai contoh dari proses hitogenesis dari kultur kalus. Anyaman kecil dari pembelahan sel-sel membentuk meristemoid atau nodul vaskular yang nantinya menjadi pusat dari pembentukan tunas apikal, primordial akar atau embrioid. Sel-sel penyusun kalus berupa sel parenkhim yang mempunyai ikatan yang renggang dengan sel-sel lain. Dalam kultur jaringan, kalus dapat dihasilkan dari potongan organ yang telah steril, di dalam media yang mengandung auksin dan kadang-kadang juga sitokinin. Organ tersebut dapat berupa kambium vaskular, parenkhim cadangan makanan, perisikle, kotiledon, mesofil daun dan jaringan provaskular. Kalus mempunyai pertumbuhan yang abnormal dan berpotensi untuk berkembang menjadi akar, tunas dan embrioid yang nantinya akan dapat membentuk plantlet. Beberapa kalus ada yang mengalami pembentukan lignifikasi sehingga kalus tersebut mempunyai tekstur yang keras dan kompak. Namun ada kalus yang tumbuh terpisah-pisah menjadi fragmen-fragmen yang kecil, kalus yang

Page | 18

demikian dikenal dengan kalus remah (friable). Warna kalus dapat bermacammacam tergantung dari jenis sumber eksplan itu diambil, seperti warna kekuningkuningan, putih, hijau, atau kuning kejingga-jinggaan (Muslim, 2009). Berdasarkan kebutuhan akan zat pengatur tumbuh untuk membentuk kalus, jaringan tanaman digolongkan dalam 4 kelompok: 1) Jaringan tanaman yang membutuhkan hanya auksin selain gula dan garam-garam mineral untuk dapat membentuk kalus, 2) Jaringan yang memerlukan auksin dan sitokinin selain gula dan garam-garam mineral seperti: empulur tembakau, 3) Jaringan yang tidak perlu auksin dan sitokinin, hanya gula dan garam-garam mineral seperti jaringan cambium, 4) Jaringan yang membentuk hanya sitokinin, gula dan garam-garam mineral seperti parenkim dan xylem (Muslim, 2009). Eksplan batang, akar dan daun menghasilkan kalus yang heterogen dengan berbagai macam sel. Kadang-kadang jaringan yang kelihatannya seragam histologinya seperti pembuluh tembakau, ternyata menghasilkan kalus dengan sel yang mempunyai DNA yang berbeda yang mencerminkan level ploidi yang berbeda. Begitupun pada kultur akar kalus yang dihasilkan dapat berupa campuran sel dengan tingkat ploidi yang berbeda. Sel-sel yang heterogen dari jaringan yang komplek menunjukkan pertumbuhan yang berbeda. Dengan mengubah komposisi media, terjadi seleksi sel-sel yang mempunyai sifat khusus. Hal ini berarti bahwa media tumbuh menentukan komposisi kalus. Sel yang jumlahnya paling banyak merupakan selsel yang paling cepat membelah dan sel yang paling sedikit adalah sel yang paling lambat pertumbuhannya. Media seleksi dapat berdasarkan unsur-unsur hara atau zat pengatur tumbuh yang ditambahkan ke dalam media. Massa kultur yang ditumbuhkan terlalu lama dalam media yang tetap, akan menyebabkan terjadinya kehabisan hara dan air. Kehabisan hara dan air dapat terjadi karena selain terhisap untuk pertumbuhan juga karena media menguapkan air dari masa ke masa. Kalus tersebut kecuali kehabisan unsur hara, kalus juga mengeluarkan persenyawaan-persenyawaan hasil metabolisme yang menghambat

pertumbuhan kalus itu sendiri. Untuk menjaga kehidupan dan perbanyakan yang berkesinambungan, kalus yang dihasilkan perlu disubkulturkan (Muslim, 2009).

Page | 19

c. Kultur Suspensi Sel Kultur suspensi biasanya dimulai dari mengsubkultur potongan kalus ke media cair, kecuali itu kultur suspensi juga dapat menggunakan potongan organ (seperti hipokotil, kotiledon dan lain-lain) sebagai ekplan hanya saja teknik ini memerlukan waktu yang lebih lama. Pembelahan sel secara bertahap akan terlepas dari sel induk bebas bergerak di dalam inokulum karena adanya gerakan dari medium. Setelah beberapa saat kultur akan tersusun atas sel tunggal, kumpulan sel (agregate cellular) dengan ukuran yang bervariasi, sisa potongan eksplan dan sisa-sisa sel mati. Dalam kultur kalus dan suspensi sel dikenal istilah friabel yang maksudnya adalah sel-sel terpisah setelah mengalami pembelahan sel. Bentuk suspensi sel yang bagus adalah kultur yang persentasi kandungan sel tunggal dan kumpulan sel-sel kecilnya tinggi. Derajat pemisahan sel pada kultur telah dicirikan adanya sifat friabilitas dari sel tersebut, sifat tersebut dapat dimunculkan atau diinduksi dengan merubah komposisi unsur hara media. Seperti pada penambahan auksin dari pada sitokinin pada beberapa masalah dapat memacu produksi sel yang friabel. Namun sebaliknya ada beberapa kultur malah menjadi terhambat proses friabilitasnya. Jadi tidak ada prosedur standar yang dapat direkomendasikan untuk memulai kultur suspensi sel dari kalus, maka untuk memilih kondisi yang sesuai harus melakukan coba-coba (trial and error) (Dodds & Robert, 1982 dalam Muslim, 2009). Eksplan yang diperlukan dalam kultur suspensi sel biasanya berupa kalus remah yang belum terdiferensiasi. Pembelahan sel akan terjadi secara bertahap dan sel anakannya akan bebas terlepas dari sel induknya karena adanya goyangan dari medium kultur, sehingga dalam kultur akan ditemukan sel tunggal, agregat selular (kluster sel) dalam berbagai ukuran, residu inokulum, dan sel-sel kultur yang mati. Kultur suspensi sel yang baik kualitasnya bila di dalam kultur tersebut sebagian besar berisi sel tunggal dan kluster sel yang berukuran kecilkecil. Keadaan seperti ini dapat dikatakan kalus di dalam kultur bersifat remah. Kalus yang remah pada beberapa jenis eksplan dapat distimulasi dengan formula ZPT konsentrasi auksin yang lebih tinggi dibandingkan sitokinin, tetapi untuk jenis eksplan yang lain dapat saja menghambat terbentuknya kalus yang remah. Tidak ada prosedur standar yang baku untuk memproduksi kalus remah, jadi

Page | 20

harus dilakukan coba-coba untuk jenis eksplan yang berbeda-beda (Dodds & Robert, 1983 dalam Muslim, 2009). d. Subkultur Dodds & Robert, 1983 dalam Muslim,2009 menyarankan massa sel yang dipindahkan pada subkultur harus cukup banyak antara 5-10 mm atau seberat 20-100 mg, supaya ada pertumbuhan yang cepat dalam media baru. Subkultur sebaiknya dilakukan 28 hari sekali (4-6 minggu sekali). Namun waktu yang tepat untuk memindahkan kultur, tergantung dari kecepatan pertumbuhan kalus. Massa kalus ada 2 macam yaitu massa yang remah (friable) dan kompak. Bila massa kalus remah maka pemindahan kalus cukup dilakukan dengan menyendok kalus dengan spatula atau skapel langsung disubkultur ke media baru. Namun bila kalus kompak mesti dipindah ke petridish steril untuk dipotongpotong dengan skapel baru disubkultur ke media baru. Kalus yang sudah mengalami nekrosis (pencoklatan) sebaiknya tidak ikut disubkultur karena tidak akan tumbuh dengan baik (Muslim, 2009).

e. Metabolit Sekunder Triterpen Senyawa metabolik sekunder tersebut bermanfaat bagi manusia dan dapat dimanfaatkan untuk tujuan konsumsi, pengobatan, industri obat tradisional dan modern, industri agrokimia berupa pestisida dan insektisida, industri farmasi dan kosmetika dan lain-lain. Ekstraksi senyawa metabolik sekunder sebelumnya hanya dilakukan langsung dari bagian tanaman tersebut melalui budidaya maupun eksploitasi organ tanaman dan tumbuhan liar yang menghasilkan senyawa metabolik sekunder tersebut. Selain produksi dan ekstraksi langsung dari organ tanaman, senyawa metabolik sekunder yang diproduksi oleh jaringan tanaman dapat juga diproduksi secara invitro dalam kondisi kultur yang mendukung (Verpoorte dkk. 1999, Adnane dkk. 2001, Kazufumi dkk. 2001 dalam Muslim, 2009). Tujuan produksi senyawa metabolik sekunder dalam kultur jaringan adalah untuk mendapatkan sel, kalus atau embrio somatik yang dapat memproduksi senyawa kimia tersebut dalam jumlah besar untuk kemudian mengekstrak senyawa kimia penting tersebut. Produksi senyawa metabolik sekunder secara invitro menggunakan bioreaktor pada kultur sel secara besar-

Page | 21

besaran merupakan salah satu cara yang digunakan oleh beberapa perusahaan industri untuk memproduksi beberapa senyawa kimia secara komersial (Verpoorate dkk. 1999 dalam Muslim,2009). Produksi senyawa metabolik sekunder melalui kultur jaringan ini memiliki beberapa kelebihan dan kekurangan. Keuntungan produksinya melalui kultur jaringan dibandingkan dengan ekstraksi dari organ tanaman dan penanamannya di lapangan antara lain: 1) Produksinya tidak tergantung pada lingkungan terutama musim sehingga produksinya bisa dilakukan setiap saat yang dapat menjamin kontinuitas produksi, kuantitas dan kualitasnya dan 2) Produksi senyawa metabolik sekunder melalui kultur jaringan tidak membutuhkan tempat yang luas. Untuk produksi skala besar dapat dilakukan dalam suatu laboratorium dengan menggunakan bioreaktor. f. Kromatografi Lapis Tipis Kromatografi lapis tipis ialah metode pemisahan fisiko kimia. Lapisan yang memisahkan terdiri atas bahan berbutir-butir (fase diam), ditempatkan pada penyangga berupa pelat gelas, logam, atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah, berupa larutan, ditotolkan berupa bercak atau pita (awal). Setelah pelat atau lapisan ditaruh di dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak), pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (pengembangan). Selanjutnya senyawa yang tidak berwarna harus ditampakkan (dideteksi) (Stahl, 1985 cit Widiastuti, 2002). Deteksi paling sederhana senyawa yang dipisahkan adalah jika senyawa menunjukkan penyerapan di daerah UV gelombang pendek (254 nm) atau jika senyawa itu dapat dieksitasi di fluorosensi radiasi UV gelombang pendek atau gelombang panjang (Stahl, 1985 cit Widiastuti, 2002). Lapisan tipis sering mengandung indikator fluoresensi yang ditambahkan untuk membantu

penampakkan bercak berwarna pada lapisan yang telah dikembangkan. Indikator fluoresensi ialah senyawa yang memancarkan sinar tampakjika disinari dengan sinar berpanjang gelombang lain, biasanya ultraviolet. Jadi, lapisan hyang mengandung indikator fluoresensi akan bersinar jika disinari pada panjang

gelombang yang tepat. Jika senyawa pada bercak yangakan ditampakkan mengandung ikatan rangkap terkonjugasi atau cincin aromatik jenis apa saja, sinar UV yang mengeksitasi tidak dapat mencapai indikator fluoresensi, dan tidak

Page | 22

ada cahaya yang dipancarkan. Cara ini sangat peka dan tidak merusak senyawa yang ditampakkan (Gritter, 1991). Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan dengan angka Rf atau hRf. E. Landasan Teori Setiap organisme hidup tersusun dari satu atau lebih sel. Sel-sel tersebut merupakan unit fungsional dari organisme hidup yang mampu melakukan aktivitas metabolisme, reproduksi, dan tumbuh (Doods dan Roberts, 1982). Teori sel lain yang dikemukakan oleh Schleiden, bahwa sel mempunyai kemampuan autonom. Teori-teori tersebut yang mendasari sifat totipotensi sel yang menjadi prinsip kultur jaringan tanaman. Totipotensi adalah potensi atau kemampuan dari sebuah sel untuk tumbuh dan berkembang menjadi tanaman secara utuh jika distimulasi dengan tepat dan sesuai. Implikasi dari totipotensi adalah semua informasi tentang pertumbuhan dan perkembangan suatu organisme terdapat di dalam sel. Walaupun secara teoritis seluruh sel bersifat totipotensi, tetapi yang mengekspresikan keberhasilan terbaik adalah sel yang meristematik. Teori totipotensi ini dikemukakan oleh G. Heberlandt tahun 1898. Dia adalah seorang ahli fisiologi yang berasal dari Jerman. Pada tahun 1969, F.C.Steward menguji ulang teori tersebut dengan menggunakan objek empulur wortel. Dengan mengambil satu sel empulur wartel, F.C. Steward bisa menumbuhkannya menjadi satu individu wortel. Dediferensiasi adalah kemampuan sel-sel masak (mature) kembali menjadi ke kondisi meristematik dan berkembang dari satu titik pertumbuhan baru yang diikuti oleh dediferensiasi yang mampu melakukan reorganisasi manjadi organ baru. F. HIPOTESIS Berdasarkan konsep totipotensi dan dediferensiasi pada sel tanaman tersebut, budidaya tanaman obat dengan teknik kultur jaringan memiliki prospek yang baik sebagai budidaya alternatif dalam pengadaan bahan baku obat alami.

Page | 23

BAB II METODOLOGI A. Alat dan Bahan 1. Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi: aceptic case/kotak aseptik, autoklaf, pinset, skapel dan tangkainya, almari pengering/oven, kertas pH, indikator pH, pH universal, pengaduk mekanik, penggojog, kompor listrik, pipet volume dan propipet, kapiler, bejana pengembang KLT, lampu UV, neraca analitik, kertas aluminium serta alat gelas yang terdiri dari cawan petri, erlemeyer, beker glass, corong gelas, labu takar, gelas ukur, botol kaca, tabung reaksi dan gelas pengaduk. 2. Bahan a. Bahan Utama Bahan utama yang digunakan dalam praktikum KJT ini adalah daun dari kemangi, umbi dari bawang putih (Allium sativum), batang muda dengan bagian ketiak dari jaka tuwa (Scoparia dulcis) dan binahong (Anredrena scandens), daun muda dari binahong (Anredrena scandens) dan tapak doro (..........) b. Bahan kimia Bahan kimia yang digunakan dalam praktikum ini adalah disinfektan meliputi: sublimat, alkohol 70%, tween dan sabun cair; Petroleum Eter (PE), methanol, fase diam yaitu silika gel F 254; fase gerak yaitu Heksana-Etil asetat; fase gerak yaitu Butanol-Asam asetat, pereaksi semprot yaitu Vanilin-asam sulfat dan ammonia besi(III) klorida ; dan media padat Murashige Skoog dengan komponen penyusun meliputi: elemen anorganik makro terdiri dari: NH4NO3, KNO3, CaCl2.2H2O, MgSO4.7H2O, KH2PO4; elemen organik mikro terdiri dari: KI, H3BO3, MnSO4.4H2O, ZnSO4.7H2O, NaMoO2.4H2O, CuSO4.5H2O, CoCl2.6H2O; sumber besi terdiri dari: FeSO4.7H2O, Fe2EDTA; suplemen organik yaitu Myo-ionitol; Vitamin terdiri dari asam nikotinat, piridoksin-HCl, tiamin-HCl, glisin; sumber karbon yaitu sukrosa; dan zat pemadat yaitu agar.

B. Jalannya Penelitian 1. Pembuatan media dan steriliasi media

Page | 24

Bahan-bahan yang akan digunakan dalam pembuatan media disiapkan dan dihitung seberapa banyak bahan yang diperlukan dalam pembuatan media 600 ml. Myo-inositol 60 mg, sukrosa 18 gram dan agar 5,4 gram Elemen

anorganik makro 30 ml, elemen anorganik mikro 3 ml, sumber besi 0,6 ml, dan larutan hormon (kinetin 1,2 ml atau 2,4 D 1,2 ml) dicampur dalam beker gelas, kemudian sumber karbon (sukrosa) dan myo-inositol dimasukkan ke dalam campuran tersebut dan ditambahkan 200 ml akuades lalu aduk sampai larut. Diukur pH larutan dengan manggunakan pH meter dan dibuat pH menjadi 5,85,9. Bila terlalu asam,, maka ditambah KOH dan bila terlalu basa ditambahkan HCl. Setelah itu ditambahkan akuades ad 600 ml. Lalu agar ditambahkan

kemudian dipanaskan serta diaduk sampai larutan jernih dan mendidih. Selanjutnya larutan dituangkan ke dalam botol-botol kaca dengan volume yang sama 10 ml, kemudian botol-botol tersebut ditutup dengan aluminum foil dan disterilakan dengan autoklaf pada suhu 1210C selama 20 menit. 2. Sterilisasi alat dan ruangan a. Sterilisasi alat Dua buah erlenmeyer yang berisi 250 ml akuades dan satu buah erlenmeyer kosong ditutup dengan aluminum foil. Cawan petri diisi dengan dua lembar kertas saring dibungkus dengan kertas koran. Skapel dan pinset dibungkus dengan kertas koran. Semua alat tersebut dimasukan ke dalam autoklaf dan disterilkan pada suhu 1210 C selama 30 menit. b. Sterilisasi ruangan Kotak aseptik atau Laminar air flow disinari dengan lampu UV selama 2 jam, lalu dibersihkan dan disemprot dengan alkohol 70%. Kemudian alatalat gelas, seperti: cawan petri dan erlenmeyer; pinset, skapel, pisau, lampu spiritus, botol berisi alkohol 70% serta media disemprot alkohol 70% masukkan ke dalam kotak aseptik atau Laminar air flow. 3. Penyediaan dan sterilisasi eksplan Bagian tumbuhan yang digunakan sebagai eksplan adalah daun, batang, dan umbi yang masih muda dan telah berkembang dengan baik dan sehat. Ekspaln dicuci denga air mengalir, selanjutnya dilakukan prasterilisasi dengan air sabun dan sublimat jika diperlukan, seperti pada

Page | 25

eksplan yang berasal dari umbi. Eksplan yang telah di cuci ataupun melewati prasterilisasi kemudian di sterilisasi dengan cairan sublimat sambil digojog perlahan-lahan selama 15-20 menit. Dicuci dengan akuades steril dilakukan di dalam kotak aseptik, sesaat setelah sterilisasi. Pencucian dilakukan sebanyak 3 kali, masing-masing selama 3, 5 dan 7 menit. 4. Penanaman eksplan dan inkubasi a. Kultur tunas Eksplan yang sudah disterilakan diambil dengan piset steril, letakkan dalam cawan petri steril yang beralaskan kertas saring. Eksplan digores dengan skapel sampai terbentuk luka tetapi tidak sampai putus. Eksplan tersebut lalu ditanam dalam media dengan sedikit ditekan agar menempel pada permukaan media. Kultur tersebut kemudian

dipindahkan ke ruang inkubasi. b. Kultur kalus Eksplan yang sudah steril diambil dengan piset steril, letakkan dalam cawan petri steril yang beralaskan kertas saring. Eksplan dipotong secara horizontal pada bagian batang taupun umbi yang memiliki bagian totipoten. Eksplan tersebut selanjutnya ditanam dalam media. Kultur tersebut kemudian dipindahkan ke ruang inkubasi. 5. Kultur suspensi sel kalus bawang putih Eksplan yang ditanam dalam media akan membentuk kalus dalam jangka waktu tertentu. Kalus yang terbentuk cukup banyak dan baik serta tidak terkontaminasi jamur maupun bakteri dapat disubkultur. Subkultur dilakukan dengan cara kalus dikerok dengan skapel dan dipindahkan ke dalam petri. Diambil 25 mg kalus untuk dikulturkan . kalus ditanam pada media cair dan dishaker hingga pertemuan selanjutnya. 6. Kuantifikasi kalus Kalus yang diperoleh dari kultur kalus yang tidak disubkultur diambil dan diletakan pada aluminum foil yang sudah ditara. Kalus tersebut kemudian ditimbang untuk mengetahui berat basah kalus. Kalus basah selanjutnya dikeringkan dalam oven 600C, setelah itu ditimbang untuk mengetahui bobot kalus setelah dikeringkan. Kalus dikeringkan sampai mencapai bobot tetap. Bobot tetap diperoleh bila selisih penimbangan dua kali tidak lebih

Page | 26

dari 0,1%. Bobot tetap tersebut yang dinyatakan sebagai bobot kering kalus.

7. Analisis Kandungan Metabolit Kultur Kalus Kemangi Sejumlah kalus dimaserasi dalam tabung reaksi dengan etanol 70% sebanyak 3 ml sambil diaduk. Maserat ditotolkan pada plat KLT sebanyak 20l disertai dengan penotolan pembanding. Pembanding dibuat dari serbuk daun kemangi yang dimaserasi dengan etanol 70%. Pembanding ditotolkan sebanyak 2l. Plat KLT tersebut kemudian dielusi dengan fase gerak sampai mencapai jarak elusi yang sebelumnya telah ditetapkan yaitu 8 cm. Plat yang sudah dielusi, lalu diamati pada sinar tampak, UV 254 dan UV 366 sambil dicatat harga Rf yang dihasilkan masing-masing bercak hasil elusi. Plat tersebut selanjutnya, disemprot dengan pereaksi semprot anisaldehid asamsulfat dan dipanaskan pada suhu 1100C selama 10 menit kemudian amati dan catat harga Rf.

Page | 27

BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Keberhasilan Sterilisasi Media Dan Alat 1. Pembuatan Media Padat Murashige Skoog (MS )

Media yang digunakan dalam propagasi eksplan baik kalus maupun tunas pada praktikum ini adalah media MS padat. Pemilihan media MS padat karena media ini diperkaya nutrisi baik makro maupun mikronutrien untuk pertumbuhan eksplan, sukrosa sebagai sumber karbon, inositol sebagai suplemen organic, zat pengatur tumbuh berupa vitamin, dan zat pengatur tumbuh dengan konsentrasi tertentu. Media MS dibuat pada rentang pH 5,8-5,9 ( mendekati 6 ). Pengaturan ph ini sangat mempengaruhi, dan perlu diperhatikan. pH sangat menetukan kelarutan mineral ( nutrisi ). Ada beberapa senyawa yang hanya bisa larut dalam rentang pH tertentu. Hal ini berhubungan dengan ketersediaan unsur hara yang terlarut yang dapat diserap oleh eksplan untuk pertumbuhannya. Selain itu pH yang terlalu asam akan memyebabkan vikositas media menurun ( media menjadai encer ), sehingga ketika eksplan ditanam, eksplan akan tenggelam. Sebaliknya, jika ph terlalu basa , maka media akan menjadi lebih padat, dan menyebabkan eksplan sulit tumbuh. Bahan pemadat yang digunakan dalam pembuatan media MS padat adalah agar. Untuk membuat 600ml larutan media, agar yang ditambahkan sekitar 9 % yaitu sebanyak 5,4 gram. Konsentrasi pemadat yang terlalu tinggi dapat menyebabkan media menjadi terlalu padat, sehingga difusi zat terlarutnya menjadi sulit. Pada media padat MS untuk menumbuhkan tunas, diberi suatu zat pengatur tumbuh, yaitu kinetin dengan konsentrasi kurang dari 2ppm, yaitu sebanyak 1,2 ml . Kinetin diberikan dalam bentuk larutan. Sedangkan pada media padat MS untuk menumbuhkan kalus, diberi zat pengatur tumbuh berupa 2,4 D kurang dari bisa

Page | 28

1 ppm, yaitu sebanyak 0, 6 ml. Sebanyak 600ml larutan media dituangkan dalam 70 botol dalam keadaan panas. 2. Sterilisasi Alat dan Media Persyaratan mutlak dalam kerja kultur jaringan tanaman adalah keadaaan yang aseptis. Untuk sterilisasi alat alat kultur digunakan cara sterilisasi dengan pemanasan basah, yaitu dengan autoklaf. Pemanasan dilakukan dengan suhu 121 oC, tekanan 1 atm, selama 30 menit. Untuk sterilisasi media, digunakan autoklaf dengan suhu 121oC, tekanan 1 atm, selama 20 menit. Dengan cara ini, media berhasil disterilkan, dan terbebas dari kontaminan. Ruang kerja dalam kultur jaringan tanaman harus aseptis. Tempat yang digunakan adalah kotak aseptis, sebagai pengganti dari Laminar Air Flow Cabinet ( LAF ). Hal ini karena LAF yang tersedia sangat terbatas, tidak memenuhi semua kelompok dalam satu golongan. Sebelum digunakan, ruangan di dalam kotak disemprot dengan alcohol 70%, dan disterilisasi dahulu dengan sinar UV untuk meminimalkan kontaminan dari mikroba. Alat alat yang diperlukan untuk pekerjaan ini, dimasukkan ke dalam kotak aseptis dalam keadaan steril. Setiap peralatan, amupun bahan yang dimasukkan ke dalam kotak aseptis, lebih dulu disterilkan dengan penyemprotan alkohol 70%.

3.

Sterilisasi Dan Penanaman Eksplan Eksplan yang digunakan, berasal dari bagian yang berbeda untuk kalus, dan

tunas. Pada prinsipnya, sterilisasi yang digunakan adalah sama. Pada eksplan dilakukan praserilisasi dengan alkohol 70%, kemudian disterilkan dengan sublimat. dan dibantu dengan larutan tween untuk menurunkan tegangan permukaan eksplan, sehingga sterilannya dapat secara maksimal mensterilkan eksplan. Penanaman eksplan dilakukan secara aseptis di dalam kotak aseptis. Dalam satu pot ditanam tiga eksplan, baik untuk tunas maupun kalus. Untuk kultur kalus, ditanam pada media yang mengandung 2,4 D, sedangkan untuk kultur kalus ditanam pada media yang mengandung kinetin. Eksplan disimpan dalam ruang inkubasi dengan suhu 22-28OC. Suhu ini, merupakan suhu optimum untuk pertumbuhan eksplan.

Page | 29

Ada sebanyak 27 pot untukpengkulturan pengkulturan

kalus, dan 27 pot untuk

tunas. Masing masing tanaman disediakan 3 pot. Secara

keseluruhan, cara sterilisasi ini dapat memberikan tingkat keberhasilan sebesar 46 %.

B. ANALISIS HASIL KULTUR I. Kultur Kalus

1. Kultur Umbi Wortel a. Keberhasilan Sterilisasi Eksplan Sterilisasi eksplan sangat dibutuhkan, karena ini sangat menunjang keberhasilan kultur. Hal yang perlu diperhatikan dalam pemilihan sterilan adalah jenis, konsentrasi sterilan, dan lamanya proses sterilisasi. Eksplan yang berupa umbi akar ini,dilakukan prasterilisasi dengan alkohol 70 %, karena pada umbi akar biasanya banyak terdapat kontaminasi mikroba yang berasal dari tanah. Bahan-bahan yang ada di dalam tanah umumnya memiliki resiko kontaminasi tinggi karena tanah merupakan habitat mikroba yang terbesar. Prasterilisasi ini dapat meminimalisir jumlah kontaminan. Proses sterilisasinya menggunakan sublimat, digojog selama 30 menit. Penggojokan dilakukan secukupnya, tidak boleh sampai merusak umbi yang akan dijadikan eksplan. Proses sterilisasi dilakukan selama 30 menit, dengan pertimbangan umbi akar wortel kuat terhadap sterilan sublimat, dan memiliki resiko

kontaminasi yang tinggi karena letaknya yang ada di dalam tanah. Setelah proses sterilisasi, proses lebih lanjut dilakukan di dalam kotak aseptik. Hal ini bertujuan untuk menjaga kesterilan kerja. Tabel 1. Keberhasilan sterilisasi Eksplan Umbi Akar Wortel Materi pengamatan Jumlah pot Kontaminasi Mati Hari ke- (banyaknya pot) 1 9 7 9 1 9 9 4 13 9 5 14 9 6 31 9 7 32 9 8 34 2 1 7 41 1 2 8

Pada praktikum ini didapatkan prosentase keberhasilan pertumbuhan kalus wortel adalah sebesar 10%, hanya ada 1 pot yang berisi 3 eksplan yang bisa Page | 30

tumbuh. Hal ini mungkin disebabkan karena waktu untuk melakukan sterilisasi kurang lama, sehingga sterilan belum bekerja secara optimal pada permukaan eksplan.

Gambar 1. Kultur kalus wortel yang terkontaminasi bakteri

Gambar 2. Kultur kalus wortel yang membusuk( mati ) Kontaminasi yang terjadi ini, bisa disebabkan oleh sterilisasi eksplan yang kurang tepat, karena pada dasarnya umbi akar wortel kuat terhadap sterilan sublimat, dan memiliki resiko kontaminasi yang tinggi karena letaknya yang ada di dalam tanah. Proses pengerjaan kurang aseptic dan teliti juga berpengaruh, misalnya lubang kotak aseptis tidak tertutup rapat,sehingga memungkinkan kontaminan

berasal dari sirkulasi udara atau pada saat penutupan dengan plastik, keadaan dalam pot masih panas akibat pemanasan mulut pot setelah eksplan ditanam yang bisa menyebabkan pembusukan pada eksplan karena pengembunan.

b. Induksi Kalus

Page | 31

Eksplan berasal dari bagian umbi akar wortel, yang diambil dari bagian tengahnya yang berwarna kuning. Bagian ini merupakan bagian yang totipoten. .

Gambar3. bagian dari umbi akar wortel yang totipoten Pada umumnya untuk eksplan yang mempunyai kambium tidak perlu penambahan ZPT untuk menginduksi terbentuknya kalus karena secara alamiah pada jaringan berkambium yang mengalami luka akan tumbuh kalus untuk menutupi luka yang terbuka. Namun pada kasus lain, menurut Kordan 1959 dalam Dodds & Robert, 1983 , dituliskan bahwa keberadaan kambium di dalam eksplan tertentu dapat menghambat pertumbuhan kalus bila tanpa penambahan zat pengatur tumbuh eksogen. Penambahan ZPT tersebut dapat satu macam atau lebih tergantung dari jenis eksplan yang digunakan. Pembelahan sel di dalam eksplan dapat terjadi tergantung dari ZPT yang digunakan, seperti auksin, sitokinin, auksin dan sitokinin, dan ekstrak senyawa organik komplek alamiah. Pada praktikum ini ZPT yang ditambahkan adalah berupa 2,4 D ( Dikloro fenoksi asetil asetat ) dengan konsentrasi kurang dari 1 ppm. Dikloro fenoksi aestil asetat (2,4 D) merupakan auksi sintetik. Auksin sangat dikenal sebagai hormon yang mampu berperan menginduksi terjadinya kalus, mendorong proses morfogenesis kalus membentuk akar atau tunas, mendorong proses embryogenesis, dan dapat mempengaruhi kestabilan genetik sel tanaman (Santoso dan Nursandi, 2003). Tabel 2. Pertumbuhan Kalus Umbi Akar Wortel Materi pengamatan Jumlah pot Tumbuh kalus Hari ke- (banyaknya pot) 1 9 7 9 1 8 9 2 10 9 3 16 9 4

Page | 32

Belum ada respon

Berdasarkan pengamatan kurang lebih 6 minggu, diperoleh hasil bahwa tidak ada kalus yang benar benar terlihat tumbuh bagus. Pada minggu pertama kalus belum ada respon. Pada minggu ke-2 mulai ada inisiasi kalus sebanyak 4 pot. Namun terlihat juga tanda-tanda kontaminasi bakteri, ciri-cirinya adalah pada eksplan terlihat lembek dan berwarna coklat kehitaman. Beberapa eksplan ada yang kering, kisut, dan pigmen warnanya berubah menjadi lebih pucat. Pada minggu ke -4 kontaminasi semakin banyak, sehingga ada 6 pot yang dibuang. Pada akhir praktikum, kira-kira umur eksplan 47 hari,hanya ada 1 pot yang

masih bertahan, namun eksplan dalam pot tersebut tidak menunjukkan respon apapun, sedangkan sisanya mati karena membusuk. Oleh karena itu , pada praktikum ini tidak diperoleh kalus dari umbi akar wortel. Kalus yang tidak tumbuh ini, kemungkinan karena factor gradiasi nutrisi, dimana pada media unsur dari 2,4 D nya sangat sedikit sekali atau bahkan tidak ada, dan seperti pada teorinya Kordan 1959 dalam Dodds & Robert, 1983 di atas, umbi wortel mempunyai cambium, jadi tanpa diimbangi oleh adanya penambahan ZPT, maka cambium ini malah akan menghambat pertumbuhan kalus.

Gambar 4. Kultur kalus wortel yang sehat, tetapi tidak ada respon 2. Kultur Kalus Daun Kemangi a. Keberhasilan sterilisasi eksplan Tabel 3. Keberhasilan sterilisasi Eksplan Daun Kemangi Materi pengamatan Jumlah pot Hari ke- (banyaknya pot) 1-6 9 7-8 9 9-21 9 22 4 23-28 2

Page | 33

Kontaminasi Mati

5 -

6 -

2 2

Pada hari Ke-7 dari masa inkubasi terjadi kontaminasi sebanyak 5 pot, yaitu 3 pot terkontaminsi jamur dan 2 pot terkontaminasi bakteri. Kontaminasi jamur bertambah 1 pot pada hari ke-9. Kontaminasi terjadi karena proses sterilisasi baik media maupun eksplannya tidak sempurna. Kontaminasi juga bisa terjadi seraca endogen karena bawaan penyakit yang terdapat dalam sumber ekplannya. Pada hari ke-22 tanaman dalam 2 pot mati dan pada hari ke-23 sebanyak 7 pot yang mati. Penyebab kematian eksplan adalah kontaminasi dan browning. Browning adalah suatu karakter yang munculnya warna coklat atau hitam yang sering membuat tidak terjadinya pertumbuhan dan perkembangan eksplan. Kejadian ini terjadi karena digunakan bahan eksplan yang tidak normal, media dan suplemen media yang beragam, penggunaan bahan sterilisasi, pengirisan, penggunaan api dan lain-lain. Selain itu, browning juga bisa terjadi karena adanya reaksi enzimatik. Enzim yang berperan pada proses ini adalah polifenol oksidase, suatu enzim komplek. Enzim komplek tersebut diantaranya adalah fenol hidroksilase, kreoslase, dan katekolase. Untuk terjadinya reaksi

pencoklatan yang dikatalis oleh enzim tersebut, maka selain harus ada substrat juga harus tersedia gugus protestik Cu++ dan oksigen sebagai aseptorhidrogen. Pada proses pencoklatan enzimatis, substrat yang berperan adalah: p-difenol, monofenol, falovonoid, tanin, katekol, asam kafeat, asam protokatekoat, dan asam klorogenat. Mengatasi problem pencoklatan dapat dilakukan dengan beberapa cara, misalnya: 1). Mengeluarkan senyawa fenol, 2). Memodifikasi potensial redoks media, 3). Mengurangi agen yang menyebabkan terjadinya pencoklatan, 4). Menghambatan enzim fenil oksidase, 5). Pengaturan pH rendah, 5). Penggunaan ruang gelap. Namun, usaha-usaha tersebut tidak dilakukan.

b. Induksi Kalus Pada praktikum ini media untuk kultur kalus diberi zat pengatur tumbuh asam 2,4 Diklorofenoksiasetat (2,4 D), yang termasuk golongan auksin. Menurut

Gamborg dan Shyluk (1981), auksin adalah hormon yang terlibat penting dalam kultur jaringan tanaman untuk pertumbuhan dan perkembangan kalus. Setiap Page | 34

tanaman memiliki hormon endogen yang berbeda-beda, sehingga banyaknya zat pengatur tumbuh yang diperlukan setiap tanaman untuk menghasilkan kalus juga berbeda-beda. Zat pengatur tumbuh akan berinteraksi dengan hormon endogen dan menentukan keberhasilan induksi kalus serta diferensiasinya (Imaculata, 2004).

Tabel 4. Pertumbuhan Kalus Daun Kemangi Materi pengamatan Jumlah pot Tumbuh kalus Belum ada respon Hari ke- (banyaknya pot) 1-6 9 9 7-8 9 7 9-21 9 7 22 4 4 23-28 2 2 -

Berdasarkan data di atas, dapat diketahui bahwa setelah hari ke-7 inkubasi, tumbuh kalus sebanyak 7 pot. Panen dilakukan pada hari ke-28 masa inkubasi diperoleh sebanyak 2 pot. Pot pertama digunakan untuk ditetapkan bobot kering sedangkan pot kedua digunakan untuk analisis metabolit sekundernya. Hasil sebesar 0,537g. penimbangan diperoleh berat kalus pada pot pertama

3. Daun Binahong a. Keberhasilan Sterilisasi Eksplan Eksplan yang berupa daun ini,dilakukan proses prasterilisasi dengan air

sabun, dan dibilas dengan air bersih yang mengalir dengan pertimbangan jumlah kontaminasi tidak terlalu banyak, seperti pada umbi. Prasterilisasi ini dapat meminimalisir jumlah kontaminan pada permukaan daun. Proses sterilisasinya menggunakan sublimat, digojog selama 30 menit. Penggojokan tidak terlalu kuat, jika terlalu kuat dikhawatirkan dapat merusak daun yang akan dijadikan eksplan. Proses sterilisasi dilakukan selama 30 menit. Tabel 5. Keberhasilan sterilisasi Eksplan Daun Binahong Materi Pengamatan Hariv ke-(banyaknya pot)

Page | 35

1 Jumlah pot Kontaminasi Mati 9 -

6 9 1 1

7 8 3 -

Setelah tahap sterilisasi, eksplan daun dibilas dengan akuades, dan pengerjaannya dilakukan di dalam kotak aseptik, agar mengurangi kontaminasi. Pada praktikum ini , yaitu sekitar 26 hari didapatkan prosentase keberhasilan pertumbuhan kalus daun binahong 63%. Di akhir praktikum ini masih bertahan sebanyak 6 pot tanpa kontaminasi. Hal ini berarti cara sterilisasi ini cukup baik untuk sterilisasi eksplan yang berupa daun.

b. Induksi Kalus Tabel 6. Pertumbuhan Kalus Daun Binahong Hari Materi Pengamatan 1 Jumlah pot Tumbuh kalus Belum ada respon 9 9 ke(banyaknya

pot) 6 9 1 8 12 9 2 7

Eksplan berasal dari bagian daun. Tepi daun dihilangkan, dan dibagi menjadi 6 bagian untuk memperkecil ukuran. Pada eksplan diberi perlukaan sedikit,

dengan tujuan untuk memacu pertumbuhan kalus. Hal ini berdasarkan konsep dasar sifat totipotensi sel, dimana sel akan membelah jika ada stimulus, misalnya luka. Dengan pemberian ZPT 2,4 D diharapkan bisa meningkatkan pertumbuhan kalus pada eksplan daun binahong. Pengamatan dilakukan selama kurang lebih 3 minggu. Pada minggu pertama ternyata,pada beberapa eksplan mulai terjadi inisiasi kalus. Berbeda pada kultur umbi akar wortel, pada eksplan daun lebih cepat tumbuhnya. Namun ada beberapa pot yang mulai terkontaminasi oleh jamur, eksplan kisut kehitaman, dan pada media ada yang berubah warna menjadi agak memerah ( merah muda ). Timbulnya perubahan warna ini, mungkin disebabkan oleh metabolit sekunder

Page | 36

dari jamur yang bereaksi dengan unsur hara mikro yang terdapat kandungan logam, seperti Mg, Al yang bisa membentuk khelat dan menyebabkan timbulnya warna.

Gambar 5. eksplan yang kisut, dan kehitam-hitaman. Kalus pada daun binahong hanya berumur 26 hari. Pada akhir pengamatan diperoleh 2 pot yang tumbuh kalus, namun tidak dilakukan pemanenan, 3 pot terkontaminasi jamur, dan 7 pot belum ada respon tumbuh. Dari pengamatan ini, pengaruh pemberian 2,4 D pada kultur daun binahong adalah dapat mempercepat pertumbuhan kalus. II. Kultur Tunas 1.Kultur Tunas Batang Joko Tuwo a. Keberhasilan Sterilisasi Eksplan Tabel 7. Keberhasilan Sterilisasi Eksplan Batang Joko Tuwo Materi pengamatan Jumlah pot Kontaminasi Mati Hari ke- (banyaknya pot) 1 9 13 9 3 15 8 2 1 30 7 2 2 41 7 2 2 50 4 5 57 4 5

Pada hari ke-13 inkubasi sebanyak 3 pot terkontaminasi, 2 pot terkontaminasi bakteri dan 1 pot terkontaminasi jamur. Pada hari ke-14 setelah penanaman sebanyak 1 pot kultur mati. Sebelumnya kultur dalam pot tersebut mengalami browning. Kejadian ini terjadi karena digunakan bahan eksplan yang tidak normal, penggunaan bahan sterilisasi, pengirisan, penggunaan api dan lainlain. Jumlah pot yang mati bertambah pada hari ke-30.

b.Induksi Tunas

Page | 37

Media yang digunakan pada praktikum ini adalah media MS padat. Hal ini mengacu pada penelitian Dalay (1998) yang berhasil menumbuhkan kalus dari tanaman selasih (Ocimum basilicum L. forma violaceum) menggunakan media MS. Kemangi dan selasih merupakan spesies yang sama, jadi dengan menggunakan media yang sama diharapkan hasil yang tidak jauh berbeda. Media MS memiliki kandungan mineral dan nitrogen yang tinggi dalam bentuk ammonium (Gamborg dan Shyluk, 1981). Kadar ammonium yang tinggi ini diperlukan untuk proses regenerasi. Kandungan garam mineral yang tinggi layak utuk memenuhi kebutuhan sel tanaman dalam kultur. Media ini telah digunakan secara luas untuk berbagai jenis eksplan dari tumbuhan dikotil dan monokotil (Dixon, 1985). Dalam praktikum ini, untuk menumbuhkan tunas digunakan zat pengatur tumbuh kinetin yang merupakan senyawa golongan sitokinin. Senyawa golongan sitokinin dapat menstimulir terjadinya pembelahan sel dan proliferasi kalus dalam kultur jaringan sehingga diharapkan tunas dapat tumbuh dengan cepat (Santosa, 2002). Tabel 8. Pertumbuhan Tunas Batang Joko Tuwo Materi pengamatan Jumlah pot Tumbuh tunas Tumbuh kalus Belum ada respon Hari ke- (banyaknya pot) 1 9 9 13 9 8 1 15 8 8 30 7 7 41 7 7 1 50 4 4 1 57 4 4 2 -

Pada hari ke-13 setelah penanaman, tumbuh tunas sebanyak 8 pot dan 1 pot belum menunjukkan respon. Pada hari ke-41 tumbuh kalus pada kultur tunas tersebut. Kalus tumbuh pada tunas yang tumbuh dengan bagus yang menghasilkan daun yang lebat dan hijau segar. Diasumsikan kalus tersebut tumbuh karena tunas sudah tidak bisa tumbuh lagi. Ruang tumbuh kultur pada pot sangat terbatas sehingga ketika eksplan masih memiliki kemampuan untuk tumbuh maka pertumbuhannya diarahkan ke yang lain yaitu kalus. Selain itu telah diketahui fungsi lain dari kinetin yaitu merangsang proliferasi kalus. 2.Kultur Tunas Bawang Putih a. Keberhasilan Sterilisasi Eksplan Page | 38

Tabel 9. Keberhasilan Sterilisasi Eksplan Bawang Putih


Hari Materi pengamatan

29

36

40

Jumlah pot Kontaminasi Mati

6 -

6 -

9 -

9 1 -

7 -

7 1 2

7 1 2

Jumlah pot yang diinkubasi sebanyak 9 pot, terdapat 6 pot yang masingmasing berisi 3 eksplan dan 3 pot lainnya masing-masing berisi 2 eksplan. Tunas yang berhasil ditumbuhkan sebanyak 7 pot dengan rata-rata

pertumbuhan tunas pada hari ke-3. Tingkat keberhasilan sterilisasi sebesar 77,78%. Kendala yang timbul pada eksplan tunas bawang putih adalah kontaminasi. Fenomena kontaminasi menunjukkan bahwa semakin media diperkaya maka tingkat kontaminasi juga semakin besar. Fenomena

kontaminasi sangat beragam, keragaman tersebut dapat dilihat dari jenis kontaminannya (bakteri, jamur, yeast, virus, kapang), waktu terjadinya (cepat, sedang, lambat), dan berdasarkan apa yang dikontaminasi (Santosa, 2002). Kontaminasi dapat terjadi karena sterilisasi yang kurang baik sehingga bakteri atau jamur yang terdapat pada eksplan belum sepenuhnya hilang.

b. Induksi Tunas Tabel 10. Pertumbuhan Tunas Umbi Bawang Putih Hari Materi Pengamatan Jumlah pot Tumbuh kalus Tumbuh tunas Belum respon ada 6 3 3 6 6 9 8 1 9 8 1 7 7 7 1 7 7 1 7 1 2 3 8 29 36 40

Page | 39

Tanda-tanda yang timbul selama masa inkubasi adalah perubahan warna bagian bawah umbi bawang putih (bekas irisan) dari putih menjadi merah. Dari beberapa eksplan yang ditanam selain tumbuh tunas juga tumbuh akar terutama pada eksplan yang terdapat pada pot T1, K1 dan K2. Pada akhir praktikum, dilakukan pengukuran terhadap tinggi tunas. Tinggi tunas pada pot T1 sepanjang 1 cm, tinggi tunas pada pot T2 lebih dari 5 cm, tinggi tunas pada pot I1 2 cm, dan tinggi tunas pada pot I3 sepanjang 1 cm.

3.Kultur Tunas Umbi Binahong a. Keberhasilan Sterilisasi Eksplan Tabel 11. Keberhasilan Sterilisasi Eksplan Umbi Binahong Hari Materi pengamatan Jumlah pot Kontaminasi Mati 9 9 9 1 libur 9 2 9 2 1 2 3 4 5 6 7

Jumlah pot yang diinkubasi sebanyak 9 pot, masing-masing berisi 3 eksplan. Tunas yang berhasil ditumbuhkan sampai akhir praktikum sebanyak 3 pot, rata-rata tunas tumbuh pada hari ke-3.Tingkat keberhasilan sterilisasi sebesar 33,33%.

b. Induksi Tunas Tabel 12. Pertumbuhan Tunas Umbi Binahong Hari Materi Pengamatan Jumlah pot Tumbuh kalus Tumbuh tunas 9 9 9 3 Libur 9 3 9 3 1 2 3 4 5 6 7

Page | 40

Belum respon

ada

5 Libur

Tunas tumbuh setelah hari ke-3 inkubasi sebanyak 3 pot. Sedangkan 5 pot yang lain belum menunjukkan adanya pertumbuhan. Pengamatan pada tunas binahong tidak dapat dilakukan dengan maksimal karena pratikum sudah berakhir, padahal masih ada eksplan yang belum tumbuh tunas. C. Kuantifikasi hasil kultur Kalus yang dipanen adalah kalus daun kemangi, pada kalus ini telah terjadi browning. Kalus dipanen pada minggu terkahir praktikum. Dilakukan bobot basah pada kalus yang berhasil dipanen. Panen dilakukan dengan cara, pilih kalus yang tumbuh dalam media padat, ambil dan letakkan pada cawan petri. Kalus dibersihkan dari agar yang menempel dengan pinset. Buat wadah dari aluminium foil sebagai wadah dari kalus yang telah dipanen, lalu wadah tersebut ditimbang atau ditara. Kalus dimasukkan dalam wadah yang sudah ditara, kemudian ditimbang lagi, hasil penimbangan tersebut merupakan bobot basah kalus. Keringkan dalam oven suhu 500C. Timbang kembali sampai diperoleh bobot tetap. Bobot tersebut sebagai bobot kering. Bobot segar kalus sebesar 0,537 gram dan bobot keringnya sebesar 0,520 gram. Pengeringan hingga mencapai bobot tetap jika dalam dua kali penimbangan selisih bobot kalus kurang dari 0,25%. Bila belum mencapai bobot tetap, maka kalus harus dikeringkan lagi. Bobot kering dicapai setelah pengeringan ke-3, pada pengeringan tersebut selisih antara pengeringan ke-2 dan pengeringan ke-3 sebesar 0,001 gram dengan persentase susut pengeringan sebesar 0,19% Pengeringan dilakukan dengan oven pada suhu 400C, suhu yang digunakan tidak terlalu tinggi juga tidak terlalu rendah, bertutujuan untuk menghindari degradasi senyawa kimia dalam kultur akibat pemanasan berlebih. D. Kultur Suspensi Sel Subkultur dilakukan pada kultur kalus bawang putih. Kultur dipindahkan dari media MS padat ke MS cair. Pertama-tama kalus bawang putih dipisahkan dari

Page | 41

eksplan dengan dikerok menggunakan scapel. Eksplan yang disubkulturkan diambil sebanyak 25mg kemudian di shaker selama satu minggu. Satu minggu kemudian massa kalus yang telah teragregasi menjadi sel-sel tunggal. Hal ini terjadi akibat perkuan penggojogan selama satu minggu. Sel-sel yang ada dalam kultur suspense sel ini kemudian diamati dengan mikroskop.

Gambar 6. Sel kalus kemangi

Gambar7. Sel kalus wortel Pengamatan sel dilakukan pada kalus daun kemangi dan umbi akar wortel, eksplan miliki golongan 1. Kultur bawang putih tidak dilakukan pengamatan karena waktu yang tersedia tidak cukup. Dari gambar tersebut terlihat ada berbagai bentuk sel. Sel yang berbentuk bulat menunjukkan sel viable, sel yang berbentuk batang atau mengkerut menunjukkan sel yang lapar. Pengamatan selsel viable lebih mudah dilakukan dalam kultur suspensi sel ini karena sel-sel terdispersi. Bila sel-sel viable yang terdapat dalam kultur banyak menunjukkan proses kultur berhasil dan memiliki prospek yang baik untuk diambil metabolit sekundernya atau disubkulturkan lagi hingga terbentuk plantula.

Page | 42

E. Analisis Metabolit Sekunder Analisis metabolit sekunder dari kalus daun kemangi dilakukan dengan krommatografi lapis tipis. Kalus dipisahkan dari eksplan dan media kemudian dilakukan maserasi dengan etanol sebanyak 3ml. Sebanyak 20l sampel ditotolkan pada pelat KLT, silica gel F254 beserta sampel dari kelompok lain dan pembanding. Plat dielusi dengan fase gerak heksan:etil asetat (7:3) dengan jarak 8 cm. Selanjutnya plat langsung disemprot dengan pereaksi anisaldehida dan dideteksi pada sinar tampak dan UV366nm. Tabel 13. Hasil Analisis KLT No. 1. P. Rf 0,43 0,4 Setelah disemprot UV 366 Biru Biru Tampak Hijau-biru Hijau

8 cm

Gambar8. Kromatogram sinar tampak

Gambar9. Kromatogram UV366nm Page | 43

Pada sinar tampak terlihat bercak berwarna hijau pada pembanding dan bercak berwarna hijau kebiruan pada sampel. Namun warna bercak terlihat sama bila dilihat di UV366nm. Harga Rf antara pembanding dan sampel hampir sama, yaitu 0,4 untuk pembanding dan 0,43 untuk sampel. Berdasarkan data tersebut dapat disimpulkan bahwa sampel memiliki polaritas dan gugus fungsi yang hampir sama dengan pembanding. P merupakan pembanding. Pembanding berupa esktrak etanol daun kemangi segar. Dari gambar kromatogram tersebut terlihat bercak hasil elusi ekstrak kalus daun kemangi lebih sedikit dibandingkan dengan ekstrak daun kemangi. Hal ini dapat terjadi karena umur kalus yang masih muda sehingga belum menghasilkan metabolit sebanyak tanaman aslinya.

Page | 44

BAB IV KESIMPULAN DAN SARAN A. KESIMPULAN 1. Pemberian 2,4D pada kultur kalus umbi wortel, daun binahong, dan daun kemangi pada media Murahige Skoog memberikan pengaruh terhadap kecepatan tumbuhnya kalus. 2. Pemberian kinetin pada kultur tunas para binatanag joko towu, umbi bawang putih, dan umbi bangun kemangi. 3. Berdasarkan analisis kualitatif dengan KLT diperoleh : Harga Rf sampel Rf =0,43 Warna bercak = - tampak =hijau - UV366nm = fluresensi biru Harga Rf pembanding = 0,4 Warna bercak = -tampak = hijau kebiruan - UV 366nm = Fluoresensi biru Warna dan harga Rf yang hampir sama menunjukkan bahwa sampel memiliki polaritas dan gugus fungsi yang hampir sama dengan pembanding. B. SARAN 1. Kultur yang telah berhasil menghasilkan plantula yang baik diharapkan dilakukan penelitian selanjutnya hingga tahap hardening. 2. Diharapkan proses penelitian tidak berhenti hingga tahapa budidaya saja tetapi dilanjutkan ke tahap uji aktivitas biologi.

Page | 45

3. Untuk mendapatkan hasil kultur yang terbaik hendaknya praktikum dilaksanakan pada pagi hari agar tanaman eksplan mmasih dalam kondisi segar.

Page | 46