ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN KONFIRMASI MIKROBA

I. Tujuan Percobaan Dapat memahami prinsip isolasi, identifikasi, dan konfirmasi mikroba, serta dapat melakukannya dengan baik. II. Teori Dasar Isolasi mikroba merupakan upaya pembiakkan suatu jenis mikroba tertentu yang diperoleh dari suatu sampel di dalam suatu media yang spesifik, sehingga selanjutnya dapat dilakukan identifikasi dan konfirmasi. Setiap mikroba memiliki kebutuhan akan zat pertumbuhan yang spesifik sehingga hal ini dapat dijadikan acuan dalam pemilihan media untuk isolasi, identifikasi dan konfirmasi. Media spesifik yaitu media yang digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu mikroba. Contohnya adalah Kosers Citrate medium, yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon. Identifikasi mikroba yaitu Untuk mengetahui sifat-sifat morfologi bakteri, maka bakteri dapat diperiksa dalam keadaan hidup atau mati. Pemeriksaan morfologi bakteri ini perlu, untuk mengenal nama bakteri. Disamping itu juga perlu pengenalan sifat-sifat fisiologisnya bahkan sifat-sifat fisiologis ini kebanyakan merupakan faktor terentu dalam mengenal nama spesies suatu bakteri. Sedangkan konfirmasi mikroba yaitu untuk mengetahui jenis bakteri dan koloninya. Konfirmasi jenis bakteri dapat menggunakan berbagai pewarnaan, reaksi ensimatis atau reaksi biokimia, terutama jika identifikasi menggunakan media masih meragukan/belum memuaskan. Pada umumnya media yang digunakan untuk membiakkan mikroba mengandung air, sumber energi (protein dan karbohidrat), zat hara (sumber karbon, nitrogen, sulfur, fosfat, oksigen dan hidrogen), serta faktor penunjang pertumbuhan (seperti asam amino, vitamin). Suatu media yang memenuhi kebutuhan mikroba untuk bertahan hidup dan melakukan aktivitasnya secara normal diperlukan untuk melakukan isolasi jenis mikroba tertentu. Setiap media spesifik memiliki kandungan senyawa tertentu yang dapat mendukung pertumbuhan mikroba tertentu tetapi menghambat pertumbuhan jenis mikroba lainnya. Sebagai contoh Media

MCA ( Mac Conkey Agar) mengandung zat warna yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram Positif, sedangkan bakteri Gram Negatif tetap tumbuh. Media yang digunakan yaitu MCA (Mac Conkey Agar), Vogel Johnson Agar(VJA), Cetrimide Agar (CA), Simmon sitrat dan Triple Sugar Iron Agar (TSIA). Media MacConkey Agar mempunyai keistimewaan memilah bakteri enterik gram negatif yang memfermentasi laktosa, karena media ini mengandung laktosa, crystal violet dan neutral red bile salt. Kemampuan E. coli memfermentasi laktosa menyebabkan penurunan pH, sehingga mempermudah absorpsi neutral red untuk mengubah koloni menjadi merah bata dan bile/ empedu diendapkan. Koloni lain (S. aureus; P. aeruginosa dan Salmonella), bila tumbuh tidak akan berwarna karena tidak mampu memfermentasi laktosa. Mikroba lain yang dapat tumbuh pada media ini antara lain Enterobacter; Proteus; Salmonella; Shigella, Aerobacter; Enterococcus. Vogel Johnson Agar Medium mengandung mannitol, tellurite dan lithium chloride yang berperan untuk mengisolasi bakteri yang bersifat koagulase positip, karena semua yang bersifat koagulase positip akan tumbuh pada media ini. S. aureus mempunyai koloni hitam sebagai akibat pengendapan hasil reduksi tellurite. Media di sekitar koloni akan berubah menjadi kuning akibat fermentasi mannitol. Adanya lithium chloride: sangat bermanfaat untuk menghambat pertumbuhan bakteri lain termasuk E. coli. Namun demikian media ini kurang mampu memilah S. aureus karena semua koagulase positip dapat tumbuh termasuk S. epidermidis dan Proteus. Cetrimide Agar Medium biasanya digunakan untuk isolasi Pseudomonas. Kandungan cetrimide yang merupakan quarternary ammonium merupakan senyawa yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri lain, karena menyebabkan kebocoran unsur-unsur di dalam sel, namun tidak terjadi pada Pseudomonas. Pada media cetrimide konvensional beberapa bakteri dapat tumbuh seperti Klebsiella, Proteus dan Providencia. Untuk menghambat pertumbuhan mereka dapat ditambahkan cetrimide. Pada media ini, P. aeruginosa dapat dibantu dengan menggunakan media Pseudomonas Selective Medium yang mengandung Nalidixi acid untuk menghambat pertumbunan bakteri lain. Simmon sitrat atau nama lainnya Simmons Citrate Medium mengandung amonium dihidrogen fosfat, natrium klorida, natrium sitrat. Magnesium sulfat, agar, bromtimol biru, aquades dan memiliki pH 6,9.

Triple Sugar Iron Agar medium, biasanya digunakan untuk konfirmasi pengujian E. coli dan dapat digunakan untuk identifikasi bakteri gram negatif yang memfermentasi dekstrosa/laktosa/sukrosa dan produksi H2S. Dari fungsi tersebut media ini dapat diusulkan untuk konfirmasi Salmonella dan memilahkan dari Pseudomonas yang tumbuh pada media lain BSA dan BGA. Terjadinya fermentasi dekstrosa oleh Salmonella akan menurunkan pH menjadi asam. Kondisi ini akan menyebabkan perubahan phenol red (media merah) menjadi kuning. Sedangkan Pseudomonas karena tidak mampu memfermentasi dekstrosa, maka media akan tetap berwarna merah. Dengan demikian media ini dapat dengan mudah memilah Salmonella dari Pseudomonas. III. Alat dan Bahan

Alat o Tabung reaksi steril o Rak tabung reaksi o Pinset o Ose bundar dan lurus o Pipet ukur 5 dan 10 ml o Bunsen o Papan pembentutuk agar miring o Inkubatok agar miring o Inkubator 37C Bahan o Suspensi bakteri ; S. Aures ; P. Aeruginosa ; E. Coli o Potasium telurite o Media Mac Conkey Agar (MCA), Vogel Jonson agar (VJA), Cetrimide Agar (CA), Simmon sitrat, dan Triple Sugar Iron Agar (TSIA).

IV. Prosedur Percobaan

Media MCA, VJA, dan CA dibuat dalam bentuk Plat Agar, sedangkan media Simmon sitrat dan TSIA dalam bentuk agar miring. Kemudian masing-masing warna media Dicatat dan didokumentasikan sebelum di inokulasi dengan bakteri. Setelah itu Masing-masing suspensi bakteri di inokulasikan pada media MCA, VJA, CA, Simmon Sitrat, dan TSIA. Seluruh kultur bakteri di inkubasi pada inkubator 37C selama 1 minggu dan pengamatan dilakukan setiap hari yang mencakup : Warna media : Dibandingkan dengan warna media sebelum diinokulasi dengan bakteri, secara keseluruhan, disekitar / disekeliling koloni bakteri. Pada agar miring TSIA : digambarkan bila ada perbedaan warna sesuai dengan posisi media (di dasar, tenga dan permukaan tabung) Ukuran dan Warna koloni bakteri Adanya endapan hitam atau retakkan pada media

Hasil Pengamatan Dibuat Tabel

VI. Pembahasan Bakteri Staphylococcus aureus pada media MCA yang diamati pada hari Kamis (11/11/2010), tumbuh sedikit dipermukaan media pada daerah I dan media yang semula berwarna merah tua berubah menjadi merah muda. Warna koloni bakteri ini merah muda. Sedangkan pengamatan yang dilakukan pada hari Jumat (12/11/2010), bakteri tumbuh lebih banyak pada daerah I dan daerah yang lainnya tidak tumbuh, sedangkan warna media berubah menjadi kuning kecoklatan. Warna koloninya merah muda. Bakteri S. Aureus merupakan bakteri gram positif yang akan terhambat pertumbuhannya pada media MCA karena pada media MCA mengandung garam empedu dan kristal ungu yang akan menghambat pertumbuhan mikroorganisme gram positif, maka pada media ini bakteri S. Aureus hanya tumbuh sedikit. Perubahan warna pada media MCA terjadi karena fermentasi laktosa dan penurunan pH. Pada pengamatan hari kamis (11/11/2010) bakteri Staphylococcus aureus pada media VJA tumbuh banyak di semua daerah dan di semua permukaan. Warna media berubah yang semula orange menjadi kuning muda dan warna koloni dari bakteri ini putih susu. Sedangkan

pengamatan pada hari jumat (12/11/2010) bakteri tumbuh lebih banyak di permukaan. Warna media tetap berwarna kuning muda dan warna koloninya putih susu. Pada media ini bakteri S. Aureus dapat tumbuh dengan baik karena kandungan yang terdapat pada media VJA adalah mannitol, tellurite dan lithium chloride yang berperan untuk mengisolasi bakteri yang bersifat koagulase positip, karena semua yang bersifat koagulase positip akan tumbuh pada media ini. Sedangkan perubahan warna yang terjadi pada media disebabkan oleh asam yang dihasilkan pada metabolisme bakteri atau akibat fragmentasi manitol. Adanya lithium chloride: sangat bermanfaat untuk menghambat pertumbuhan bakteri lain termasuk E. coli. Namun demikian media ini kurang mampu memilah S. aureus karena semua koagulase positip dapat tumbuh termasuk S. epidermidis dan Proteus. Pada pengamatan hari kamis (11/11/2010) bakteri Staphylococcus aureus belum ada yang tumbuh pada media CA tetapi warna medianya tetap berwarna kuning bening. Sedangkan pengamatan pada hari jumat (12/11/2010) bakteri tidak tumbuh dan media tetap berwarn kuning bening. Pada media ini bakteri tidak tumbuh karena mengandung cetrimide yang merupakan quarternary ammonium yaitu senyawa yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri kecuali bakteri Pseudomonas, karena menyebabkan kebocoran unsur-unsur di dalam sel. Pada pengamatan hari kamis (11/11/2010) bakteri Staphylococcus aureus belum ada bakteri yang tumbuh pada media Simmon Sitrat. Warna media tetep berwarna hijau tua. Sedangkan pengamatan pada hari jumat (12/11/2010) bakteri belum tumbuh tetapi warna media bagian atasnya berubah menjadi biru tua dan bagian bawahnya tetap berwarna hijau tua. Perubahan warna pada media tersebut menunjukan adanya bakteri yang tumbuh karena bakteri S. Aureus dapat menggunakan sitrat sebagai sumber karbon tunggal dan ion ammonium sebagai sumber nitrogen tunggal. Perubahan warna terjadi karena penggunaan sitrat akan meningkatkan pH media. Peningkatan pH media tersebut menyebabkan perubahan warna pada indikator bromthymol biru yang mengubah media menjadi warna biru. Bakteri ini termasuk dalam bakteri aerob fakultatif. Pada pengamatan hari kamis (11/11/2010) bakteri Staphylococcus aureus bakeri tumbuh pada media TSIA di permukaannya. Warna media yang semula berwarna merah berubah menjadi kuning muda. Warna koloninya putih susu. Sedangkan pengamatan pada hari jumat (12/11/2010) bakteri tumbuh lebih banyak di permukaan media. Warna media berubah menjadi

kuning emas. Warna koloninya putih susu. Perubahan ini disebabkan karena bakteri dapat memfermentasi glukosa / laktosa / sukrosa. Bakteri Escherichia coli pada media MCA yang diamati pada hari Kamis (11/11/2010), tumbuh banyak di permukaan media. Warna media yang semula merah tua berubah menjadi kuning muda. Warna koloni bakteri ini putih susu. Sedangkan pengamatan yang dilakukan hari jumat (12/11/1010) bakteri tumbuh lebih baik dan lebih banyak. Warna media tetap kuning muda (keemasan). Warna koloninya putih susu. Pada media ini bakteri dapat tumbuh dengan baik karena dapat menguraikan laktosa. Kemampuan E. coli memfermentasi laktosa menyebabkan penurunan pH, sehingga mempermudah absorpsi neutral red untuk mengubah koloni menjadi merah muda. Pada hari Kamis (11/11/2010), bakteri Escherichia coli tumbuh banyak pada media VJA di semua daerah. Warna media merah muda yang semula warna orange dan warna koloninya putih susu. Sedangkan pengamatan yang dilakukan pada hari Jumat(12/11/2010), bakteri tumbuh dengan baik dipermukaan media dan di daerah I media pecah (menonjol ke atas) dan warna media tetap seperti hari kamis berwarna merah muda. Warna koloninya putih susu. Perubahan warna pada media disebabkan karena bakteri tidak dapat memfermentasi manitol yang terkandung di dalam media sehingga media berubah menjadi merah muda. Pada hari kamis (11/11/2010) bakteri Escherichia coli tumbuh pada media CA dipermukaannya. Warna media berubah menjadi putih bening yang semula berwarna kuning bening. Warna koloninya putih susu. Sedangkan pengamatan yang dilakukan pada hari jumat (12/11/2010) bakteri lebih banyak dipermukaan dan didalam media. Warna media tetap seperti hari Kamis berwarna putih bening. Warna koloninya putih susu. Pertumbuhan tersebut karena bakteri ini merupakan bakteri gram negatif yang dapat tumbuh pada media CA seperti halnya pseudomonas. Pada hari kamis (11/11/2010) bakteri Escherichia coli belum ada yang tumbuh pada media Simmon Sitrat. Warna media tetap berwarna hijau tua. Sedangkan pengamatan yang dilakukan pada hari Jumat (12/11/2010) warna media berubah menjadi biru tua. Perubahan warna tersebut menunjukkan adanya bakteri yang tumbuh karena mampu menggunakan sitrat sebagai sumber karbon tunggal dan mereka dapat memetabolisme garam amonium dalam medium dan penggunaan sitrat meningkstksn pH media. Peningkatan pH tersebut menyebabkan perubahan warna pada indikator bromthymol biru yang mengubah warna media menjadi biru.

Pada hari kamis (11/11/2010) bakteri Escherichia coli tumbuh pada media TSIA dipermukaannya. Warna media berubah menjadi kuning muda dan di bagian bawahnya berwarna hitam yang semula berwarna merah. Sedangkan pengamatan yang dilakukan pada hari Jumat (12/11/2010) bakteri tumbuh dipermukaan dan bagian bawah media yang berwarna hitam. Terdapat gelembung oksigen diatas permukaan hitam. Warna media bagian atas kuning dan bagian bawahnya hitam. Bakteri ini dapat tumbuh dengan baik pada TSIA karena media ini biasanya digunakan untuk konfirmasi pengujian E. coli dan dapat digunakan untuk identifikasi bakteri gram negatif yang memfermentasi dekstrosa/laktosa/sukrosa dan produksi H2S. Terjadinya fermentasi dekstrosa oleh bakteri gram negatif akan menurunkan pH menjadi asam. Kondisi ini akan menyebabkan perubahan phenol red (media merah) menjadi kuning. Sedangkan warna hitam karena terbentuknya H2S positif dari farmentasi H2 dan CO2. Bakteri Pseudomonas aeruginosa pada media MCA yang diamati pada hari Kamis (11/11/2010), belum tumbuh pada media ini. Warna media berubah menjadi merah muda yang semula berwarna merah tua. Sedangkan pengamatan dilakukan pada hari Jumat (12/11/2010) bakteri belum tumbuh dan warna media tetap berwarna merah muda. perubahan warna tersebut menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri karena bakteri ini termasuk gram negatif yang dapat menguraikan laktosa . penguraian laktosa menyebabkan penurunan pH sehingga mempermudah absorbsi neutral red untuk mengubah koloni menjadi merah muda. Pada hari Kamis (11/11/2010) bakteri P. aeruginosa tumbuh pada media VJA berupa titik-titik permukaan media. Warna media berubah menjadi merah muda yang semula berwarna orange. Warna koloninya putih susu. Sedangkan pengamatan pada hari Jumat (12/11/2010) bakteri tumbuh lebih banyak. Warna media merah muda tetapi disekelilingnya berwarna kuning. Warna koloninya putih susu. Perubahan warna menjadi merah muda disebabkan karena manitol tidak difermentasi sedangkan perubahan warna media menjadi kuning disebabkan karena perubahan warna merah fenol akibat menanggapi indikator dalam pembentukkan asam. Pada hari Kamis (11/11/2010) bakteri P. aeruginosa belum ada yang tumbuh pada media CA. Warna media berubah menjadi putih bening yang semula berwarna kuning bening. Sedangkan pada pengamatan hari Jumat (12/11/2010) bakteri belum tumbuh dan warna media tetap berwarna putih bening. Pada media ini, P. aeruginosa tidak tumbuh karena tidak dibantu dengan menggunakan media Pseudomonas Selective Medium yang mengandung Nalidixi acid untuk menghambat pertumbunan bakteri lain.

Pada hari Kamis (11/11/2010) bakteri P. aeruginosa belum ada yang tumbuh pada media simmon sitrat dan media berwarna hijau tua. Sedangkan pada pengamatan hari Jumat (12/11/2010) bakteri belum ada yang tumbuh tetapi warna media bagian atas berwarna biru tua dan bagian bawahnya berwarna hijau tua. Perubahan warna tersebut menunjukkan adanya bakteri yang tumbuh karena mampu menggunakan sitrat sebagai sumber karbon tunggal dan mereka dapat memetabolisme garam amonium dalam medium dan penggunaan sitrat meningkstksn pH media. Peningkatan pH tersebut menyebabkan perubahan warna pada indikator bromthymol biru yang mengubah warna media menjadi biru. Pembentukkan warna biru terdapat pada bagian atas media karena bakteri ini memerlukan oksigen karena bakteri ini termasuk bakteri aerob obligate. Pada hari Kamis (11/11/2010) bakteri P. aeruginosa belum ada yang tumbuh dan media tetap berwarna merah. Sedangkan pada hari Jumat (12/11/2010) belum ada bakteri yang tumbuh dan media berwarna merah. Bakteri ini tumbuh karena Pseudomonas tidak mampu memfermentasi dekstrosa, maka media akan tetap berwarna merah. VII. Kesimpulan Isolasi mikroba merupakan upaya pembiakkan suatu jenis mikroba tertentu yang diperoleh dari suatu sampel di dalam suatu media yang spesifik, sehingga selanjutnya dapat dilakukan identifikasi dan konfirmasi. Identifikasi mikroba yaitu Untuk mengetahui sifat-sifat morfologi bakteri, maka bakteri dapat diperiksa dalam keadaan hidup atau mati. Pemeriksaan morfologi bakteri ini perlu, untuk mengenal nama bakteri. Sedangkan konfirmasi mikroba yaitu untuk mengetahui jenis bakteri dan koloninya. Konfirmasi jenis bakteri dapat menggunakan berbagai pewarnaan, reaksi ensimatis atau reaksi biokimia, terutama jika identifikasi menggunakan media masih meragukan/belum memuaskan. Tabel pertumbuhan bakteri pada media spesifik MEDIA BAKTERI S. Aureus E. Coli P. Aureginosa Keterangan : (+) = bakteri tumbuh dengan baik MCA +* + + VJA + + CA + + SS + + + TSIA + + +

(-) = bakteri tidak tumbuh (*) = pertumbuhan terhambat

VIII. Daftar Pustaka Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta. Pelczar, Michael J. Dasar - Dasar Mikrobiologi I. 2006. UI-Press: Jakarta. Volk , W. A & Wheeler. M. F. 1993. Mikrobiologi Dasar Jilid 1 Edisi ke 5. Erlangga. http://www.kalbe.co.id/files/cdk/files/10PeranMediauntukIdentifikasiMikroba124.pdf/ PeranMediauntukIdentifikasiMikroba124.html diakses pada tanggal 07/12/2010 http://myaluzz.wordpress.com/2010/02/09/laporan-mikrobiologi/ diakses pada tanggal 07/12/2010 http://perpustakaan.pom.go.id/KoleksiLainnya/Buletin%20Info%20POM/0208.pdf diakses pada tanggal 07/12/2010