III.

METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Hipotesia Penelitian Diduga ada pengaruh salinitas media yang berbeda pada perubahan profil hematologi, jaringan insang dan hati serta recovery pada ikan Lele Dumbo (C. gariepinus) yang terinfeksi penyakit kuning dengan ikan Lele Dumbo (C. gariepinus) normal. 3.2. Materi Penelitian

3.2.1. Alat Alat yang digunakan dalam penelitian disajikan pada Tabel 1. Tabel 1. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian No. Nama alat Ketelitian 1. Pisau / gunting 2. Sterofoam 3. Slide glass 4. Objek glass 5. Mikroskop binokuler 4 x 100 6. Spuit suntik 0,1 mL 7. Botol sampel darah 10 mL 8. Timbangan 1 gram 9. Water quality checker 10. 11. Refaktometer Waterbath 0,1 Kegunaan Alat bedah Alas pembedahan Untuk sediaan jaringan Penutup sampel jaringan Untuk mengamati jaringan Untuk mengambil darah Tempat menyimpan darah Menimbang hewan uji Untuk mengetahui kualitas air Untuk mengetahui salinitas air Untuk meregang jaringan

yang telah dipotong sebelum 12. 13. 14. 15. Automatic microtome Automatic tissue Prosessor Room cabinet Kamera Digital dilekatkan pada gelas obyek Untuk memotong jaringan Untuk memproses dehidrasi clearing dan infiltrasi Tempat proses pewarnaan / staining Untuk mengambil gambar jaringan

3.2.2. Bahan Bahan yang digunakan untuk penelitian disajikan pada Tabel 2. Tabel 2. Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian NO Bahan Kegunaan 1. Larutan formalin 10 % Untuk menghindari pencemaran jaringan

terjadinya oleh fisik enzim dan

(autolisis) atau bakteri serta untuk mempertahankan 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. struktur potongan jaringan Ethanol 100 %, 95 %, 70 %, 80 Untuk menarik molekul air di dalam % Entelan Haematoxylin dan eosine. Xylene Parafin encer Aquades Tissue EDTA jaringan Untuk menempelkan organ pada obyek glass Untuk pewarnaan jaringan yang telah ditempelkan pada obyek glass Untuk menarik air dari jaringan Untuk menutup jaringan yang telah diwarnai pada obyek glass. Untuk membersihkan preparat Membersihkan kotoran Koagulan darah

3.2.3. Hewan uji Hewan uji yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah 48 ekor ikan Lele Dumbo (C. gariepinus) yang terserang penyakit kuning dan 48 ekor ikan Lele Dumbo (C. gariepinus) sehat diiaklimatisasi selama 7 hari. Ukuran ikan Lele Dumbo (C. gariepinus) yang digunakan dengan panjang 20-25 cm dan berat 100 gr/ekor. Digunakan ke 96 ekor ikan uji yang dibagi dalam 8 akuarium dengan kepadatan 12 ekor/akuarium.

3.3. Metode Penelitian Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimen. Metode eksperimen adalah metode untuk mendapatkan data dengan melakukan percobaan, baik dilakukan di lapangan maupun di laboratorium (Hadi, 1997). Penelitian ini mengacu pada Boyd (1990), ikan air tawar mampu beradaptasi dengan salinitas mencapai 7 . Oleh karena itu pada penelitian ini salinitas yang digunakan adalah 0 , 4 , 8 dan 12 . Pola rancangan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 4 perlakuan. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 3 kali. Perlakuan yang diberikan adalah perbedaan salinitas media yaitu:
1. Perlakuan A, salinitas media 0 2. Perlakuan B, salinitas media 4 3. Perlakuan C, salinitas media 8 4. Perlakuan D, salinitas media 12

Prosedur penelitian ini dilakukan dengan dua tahapan yaitu tahap persiapan dan tahap pelaksanaan penelitian.
3.3.1. Tahap persiapan

Tahap persiapan ini meliputi persiapan alat dan bahan, aklimatisasi hewan uji, serta pembuatan media pemeliharaan. 1. Persiapan alat dan bahan Persiapan alat dan bahan dilakukan sebelum penelitian dimulai, alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri atas peralatan selama aklimatisasi, peralatan pengambilan darah, peralatan pengambilan jaringan hati dan insang dan peralatan pada waktu pemeliharaan salinitas.

2. Aklimatisasi hewan uji Ikan Lele Dumbo (C. gariepinus) diaklimatisasi selama 7 hari dalam wadah akuarium. 3. Pembuatan media pemeliharaan Pada tahap ini dilakukan persiapan wadah pemeliharaan, yaitu berupa akuarium dengan ukuran 58x48x38 cm sebanyak 8 buah. Sebelum wadah ini digunakan dicuci terlebih dahulu dengan air bersih, kemudian direndam dengan methilen blue, setelah itu dibilas kembali dengan air bersih dan dikeringkan. Selain wadah tempat pemeliharaan, dibersihkan pula selang, aerator dan peralatan lainnya. Air yang digunakan untuk pemeliharaan diperoleh dari air PAM yang sebelumnya telah diendapkan dan diaerasi selama 24 jam dalam bak-bak penampungan. Untuk kenaikan salinitas air 1 dilakukan proses dengan cara penambahan air laut ke dalam air tawar, satu hari sebelum perlakuan salinitas.

3.3.2

Tahap pelaksanaan penelitian Tahap pelaksanaan penelitian meliputi perlakuan salinitas dan pengambilan

darah, pemeriksaan jaringan hati dan insang, sebagai berikut:

1. Perlakuan salinitas

Perlakuan salinitas dilakukan dengan cara memindahkan ikan dari wadah aklimatisasi ke wadah lain dengan salinitas berbeda dan dipelihara selama 7 hari. 2. Pengambilan darah

Pengambilan darah ikan Lele Dumbo (C. gariepinus) dilakukan setelah pemeliharaan dengan salinitas yang berbeda. Sampel darah diambil dengan spuit suntik 3 mL pada bagian pangkal ekor atau bagian insang. Darah yang diambil sebanyak 1 mL. Darah yang sudah terambil dimasukkan ke dalam botol sampel yang sudah diberi EDTA (Ethilen Diamine Tetra Acetate). EDTA berfungsi sebagai garam natrium atau kalium yang dipakai untuk antikoagulans (pencegahan pembekuan darah). Pemeriksaan darah meliputi penghitungan jumlah eritrosit, leukosit, bilirubin, hemoglobin, hematokrit dan glukosa darah. Setelah pengambilan darah dilakukan pemeriksaan histologi hati dan insang.
3. Pengambilan jaringan hati dan insang

Pengambilan jaringan hati dan insang dilakukan setelah pengambilan darah ikan. Ikan diambil hati dan insangnya, kemudian di masukkan kedalam botol sampel yang telah diberi formalin 10 % untuk dilakukan pembuatan preparat.

3.4. Pengumpulan Data 3.4.1. Profil darah ikan Lele Dumbo (C. gariepinus) Pengukuran profil darah seperti jumlah eritrosit, leukosit, kadar hemoglobin dan hematokrit diukur menggunakan ABX MICROS 60. Penghitungan kadar glukosa darah menggunakan alat On Call Plus. Pengamatan profil darah dengan pembuatan preparat ulas. Cara kerja pemeriksaan jumlah eritrosit, leukosit, kadar hemoglobin dan hematokrit adalah sebagai berikut:
1. Diperiksa apakah terdapat jendal (pembekuan) pada sampel darah atau tidak,

2. Darah dihomogenkan dengan disentrifuge, 3. Tabung sampel darah diletakkan dibawah jarum penghisap darah sambil

dipegang,
4. Ditulis nama tabung sampel yang akan diperiksa, 5. Tombol ditekan dan jarum akan keluar untuk mengambil darah, 6. Diusahakan agar jarum tidak menempel ke bagian dasar atau dinding tabung, 7. Ditunggu beberapa saat hingga jarum secara otomatis terangkat, 8. Bar ditekan maka darah dalam proses penghitungan, 9. Data akan ditampilkan pada layar, dan 10. Data yang tercetak pada layar akan diprint

3.4.2. Preparasi histologi Pembuatan preparat jaringan dilakukan mengacu pada metode Kurniasih (1999), dengan prosedur sebagai berikut: 1. Organ target yang diambil adalah hati dan insang, 2. Fiksasi jaringan dengan menggunakan larutan buffer formalin sebanyak 20 kali volumenya dengan tujuan mematikan sel dengan mengeraskan jaringan secara cepat selama 24 jam atau lebih. Agar tidak terjadi kekeliruan masing masing sampel diberi tanda / simbol, 3. Dehidrasi proses pengeluaran kandungan air dalam jaringan dengan menggunakan tissue processor. Pertama dimulai dengan perendaman organ ke dalam ethanol 80 % 1 kali masing-masing selama 1 jam, ethanol 95 % 2 kali masing-masing selama 1 jam dan ethanol 100 % 3 kali masing-masing 1 jam, 4. Dilakukan proses clearing (penjernihan) dengan menggunakan xylene 3 kali masing-masing 1 jam,

5. Infiltrasi dengan merendam organ ke dalam parrafin cair 3 kali masingmasing 1 jam, 6. Blocking setelah melalui proses dehidrasi, maka jaringan yang akan berada dalam imbeding cassete dipindah ke dalam block parrafin, kemudian diisi dengan parafin cair dan didinginkan cepat, 7. Block parrafin di letakkan pada holder sesuai dengan microtome, permukaan blok dipotong pada bagian tepinya sehingga hanya disisakan bagian parafin yang ada jaringannya. Setelah diatur sedemikian rupa agar permukaan sayatan dengan mata pisau, maka dilakukan pemotongan jaringan dengan ketebalan 5 - 7 mikron, 8. Mounting hasil pemotongan yang tipis dan hamper menyerupai pita diletakan diatas permukaan air di dalam waterbath (40 0C) dan diusahakan jaringan mengembang dengan baik. Jaringan diangkat dan ditempelkan pada gelas objek yang telah diolesi dengan mayer egg albumin. Preparat jaringan dibiarkan semalam disimpan dalam incubator suhu 37 0C agar merekat erat pada gelas objek, 9. Pewarna preparat direndam dalam xylene sebanyak 3 kali masing-masing 5 menit dan 1 kali selama 2 menit. Kemudian direndam dalam ethanol 100 % 2 kali masing-masing selama 1 menit, ethanol 100 % 2 kali masing-masing 1 menit, ethanol 70 % 1 kali selama 1 menit. Rendam dalam hematoxyline selama 10 menit selanjutnya dicuci dengan air mengalir selama 15 menit kemudian dipindah dalam acid alkohol selama 3 - 10 menit kemudian direndam pada air mengalir selama 15 menit. Selanjutnya diwarnai dengan eosin 1 % selama 15 detik - 2 menit dipindahkan potongan jaringan ke dalam ethanol 70 %,

pindahkan lagi dalam ethanol 95 % masing-masing sebanyak 2 kali selama masing-masing 1 menit, dipindahkan dalam ethanol 100 % 2 kali masingmasing selama 1 menit. Rendam organ dalam xylene 3 kali masing-masing 2 menit, 10. Preparat yang terkelupas diangin-anginkan dan setelah kering ditutup dengan gelas penutup (deck glass) dan direkatkan dengan preparat canada balsam/etellen, preparat yang sudah jadi diberi label sesuai dengan perlakuan agar mudah dalam pengamatan, serta 11. Pengamatan perubahan histologi pada jaringan yang terserang penyakit kuning dan membandingkan pada jaringan sehat/normal. Pengamatan dibawah mikroskop dengan perbesaran 40 x, 100 x, 400 x. 3.4.3. Recovery dan Kelulushidupan Pengamatan recovery dilakukan dengan melihat jumlah ikan Lele Dumbo (C. gariepinus) berwarna kuning berubah menjadi berwarna hitam atau normal serta dilihat perubahan jumlah bilirubin yang terkandung dalam profil darah ikan sebelum diberi perlakuan dibandingkan profil darah ikan setelah diberi perlakuan salinitas yang berbeda. Kelulushidupan diamati dengan melihat jumlah ikan Lele Dumbo (C. gariepinus) yang mati selama pemeliharaan kemudian dibandingkan dengan jumlah ikan Lele Dumbo (C. gariepinus) pada awal pemeliharaan dinyatakan dalam persen. Menurut Effendi (1979), data kelangsungan hidup diukur dengan menggunakan rumus: SR = x 100 %

Keterangan : SR = Kelulushidupan (%)

Nt No 3.5.

= Jumlah ikan Lele Dumbo (Clarias gariepinus) pada akhir pengamatan = Jumlah ikan Lele Dumbo (Clarias gariepinus) pada awal pengamatan Kualitas air Pada pengukuran suhu dan DO menggunakan Water quality checker selama

pemeliharaan salinitas. 3.6. Analisa Data Data yang diperoleh selama penelitian selanjutnya dianalisa secara deskripftif. Analisa data dengan metode deskriptif yaitu memberikan gambaran yang jelas tentang hal-hal yang terjadi secara kualitatif dilakukan selama percobaan berlangsung (Nasution, 2003). Data yang dianalisa meliputi kelulushidupan, profil darah (jumlah eritrosit, leukosit, hemoglobin, hematokrit dan glikosa darah) serta gambaran jaringan insang dan hati.