UFRRJ INSTITUTO DE AGRONOMIA CURSO DE PS-GRADUAO EM FITOTECNIA

TESE

Emprego de leos Essenciais de Plantas Medicinais no Controle de Aspergillus spp. em Sementes de Amendoim (Arachis hypogaea L.)

Elson de Carvalho Viegas

2004

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE AGRONOMIA CURSO DE PS-GRADUAO EM FITOTECNIA

EMPREGO DE LEOS ESSENCIAIS DE PLANTAS MEDICINAIS NO CONTROLE DE Aspergillus spp. EM SEMENTES DE AMENDOIM (Arachis hypogaea L.)

ELSON DE CARVALHO VIEGAS

Sob a Orientao da Professora Claudia Antonia Vieira Rossetto e Co-orientao da Professora Margarida Gorte Ferreira do Carmo

Tese submetida como requisito parcial para obteno do grau de Doutor em Cincia em Fitotecnia.

Seropdica, RJ Dezembro de 2004

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE AGRONOMIA CURSO DE PS-GRADUAO EM FITOTECNIA

ELSON DE CARVALHO VIEGAS Tese submetida ao Curso de Ps-Graduao em Fitotecnia como requisito parcial para obteno do grau de Doutor em Cincia, em Fitotecnia.

Tese aprovada em 13/12/2004

Claudia Antonia Vieira Rossetto (Dr) UFRRJ Orientadora

Margarida Gorte Ferreira do Carmo (Dr) UFRRJ

Paulo Cesar Rodrigues Cassino (Dr) UFRRJ

Ronoel Luiz de Oliveira Godoy (Dr) EMBRAPA

Humberto Ribeiro Bizzo (Dr) EMBRAPA

A Frei Joo que, juntamente com seus discpulos, nunca me deixou esmorecer, me estimulando e fortalecendo para que eu chegasse vitorioso ao final deste trabalho.

DEDICO

AGRADECIMENTOS

Agradeo DEUS por me proporcionar sade e disposio para trabalhar alm de colocar em meu caminho irmos que muito contriburam para o xito deste trabalho. Ao Professor PAULO CESAR RODRIGUES CASSINO que foi o grande articulador da minha ps-graduao. Professora CLAUDIA ANTONIA VIEIRA ROSSETTO que, alm de minha orientadora de pesquisa, foi a paciente companheira de trabalho e cuidadosa revisora dos textos escritos. Professora MARGARIDA GORTE FERREIRA DO CARMO que colocou seu laboratrio a minha disposio, alm de ajudar a orientar os meus estagirios durante os testes in vitro e na redao final da tese. Dra ANNA MARIA BITTENCOURT, poca pesquisadora da EMBRAPA Agroindstria de Alimentos, pela preciosa colaborao na identificao dos fungos. Ao Dr BENJAMIN GILBERT, da Fundao Oswaldo Cruz, pela indicao do uso de leos essenciais na pesquisa. Dra DAISE LOPES, da EMBRAPA Agroindstria de Alimentos, que gentilmente cedeu dezessete leos essenciais e indicou-me a primeira bibliografia a ser consultada. Ao Dr RONOEL LUIZ DE OLIVEIRA GODOY, da EMBRAPA Agroindstria de Alimentos, que ajudou-me a esclarecer vrias questes do trabalho com a mxima cordialidade, alm de incentivar-me freqentemente na fase derradeira da tese. Ao Dr HUMBERTO RIBEIRO BIZZO, da EMBRAPA Agroindstria de Alimentos, que sempre me recebeu com boa vontade. Ao Dr ANTONIO CARLOS SIANI, da Fundao Oswaldo Cruz, que sugeriu incluir e cedeu o leo essencial de Lippia sidoides e o citral. TATIANA DE MORAES LIMA, que na qualidade de bolsista e amiga, foi incansvel nas tarefas relativas ao primeiro captulo, no se deixando abater mesmo nos momentos mais difceis. Ao Dr OTNIEL FREITAS SILVA, da EMBRAPA Agroindstria de Alimentos, sempre solcito quando precisamos. ANDRA SOARES, dedicada estagiria, que muito colaborou com o sucesso deste trabalho. LAIS PESSOA DOS SANTOS FERREIRA, estagiria que sempre esteve disposta para xito das atividade de laboratrio. FABINA GOIS DO NASCIMENTO que, como estagiria prestimosa, nos ajudoi, sem medir esforos, na fase mais complexa da tese. BIANCA GONALO MEYRELES que, durante o seu perodo de estgio, ajudou, com dedicao, na confeco das tabelas. Ao Engenheiro Agrnomo e companheiro JOS CARLOS POLIDORO, que colaborou na realizao da anlise estatstica e na elaborao dos grficos. Ao Professor CARLOS DE SOUZA ABBOUD, do Departamento de Fitotecnia e Coordenador do Curso de Ps-graduao, que deu todo o apoio para realizao da tese. Ao Convnio FAPUR/SMS-RJ pelo apoio concedido, atravs da liberao de suas bolsistas, para realizao deste trabalho. A todos os bolsistas e estagirios do Laboratrio de Anlise de Sementes do Departamento de Fitotecnia, que demonstraram sempre amizade, companheirismo e colaborao. todos os Professores de nossa Universidade que sempre torceram para o meu sucesso. Aos amigos leais que me mantiveram sempre fortalecido com suas oraes e estmulo.

SUMRIO

pgina INTRODUO GERAL ............................................................................... 1 1.1 1.2 1.2.1 1.2.2 1.3 1.4 A Espcie ............................................................................................ Colonizao de Gros por Aspergillus .............................................. Em amendoim ..................................................................................... Em milho ............................................................................................. Micotoxinas ......................................................................................... Influncia de Fatores do Ambiente na Colonizao e Formao de Aflatoxinas ...................................................................................... 1 2 2 4 4 5 5 6 7 8 9 9 9 10 12 12 21 22 23 24 25

1.4.1 Fungos do grupo Aspergillus flavus ................................................... 1.4.2 1.5 1.6 1.7 Em amendoim ..................................................................................... Controle da Colonizao e Subseqente Aflatoxinas ...................... Ao de Fungos na Deteriorao de Sementes ................................. Uso de Extratos de Plantas Medicinais para Controle ...................

1.7.1 De Aspergillus flavus em gros .......................................................... 1.7.2 De Aspergillus flavus em sementes .................................................... 1.7.3 1.8 1.9 2 De outros fungos ................................................................................. Objetivos Gerais ................................................................................. Referncias Bibliogrficas .................................................................

CAPTULO I. ISOLAMENTO DE Aspergillus spp. E PRODUO DE AFLATOXINAS ............................................................................................. 2.1 2.2 2.3 2.4 Resumo ................................................................................................ Abstract ............................................................................................... Introduo ........................................................................................... Material e Mtodos .............................................................................

2.5 2.6 2.7 3

Resultados e Discusso ....................................................................... Concluses ........................................................................................... Referncias Bibliogrficas .................................................................

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CAPTULO II. AVALIAO DE LEOS ESSENCIAIS DE PLANTAS MEDICINAIS NO DESENVOLVIMENTO DE Aspergillus spp. ................................................................................................................... 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 Resumo ................................................................................................ Abstract ............................................................................................... Introduo ........................................................................................... Material e Mtodos ............................................................................. Resultados e Discusso ....................................................................... Concluses ........................................................................................... Referncias Bibliogrficas .................................................................

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CAPTULO III. QUALIDADE FISIOLGICA DE SEMENTES DE AMENDOIM INFLUENCIADAS PELOS PRODUTOS DE ORIGEM VEGETAL ....................................................................................................... 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 Resumo ................................................................................................ Abstract ............................................................................................... Introduo ........................................................................................... Material e Mtodos ............................................................................. Resultados e Discusso ....................................................................... Concluses ........................................................................................... Referncias Bibliogrficas .................................................................

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NDICE DE TABELAS

Pgina Quadrado mdio para a porcentagem de fungos em vagens e sementes de amendoim, cultivado em rea com e sem calagem provenientes de plantas colhidas com 104, 114, 124 e 134 DAS, e secas em estufa e ambiente. 28 Avaliao na poca da seca. Seropdica-RJ. 2002. ........................................ Quadrado mdio para % de fungos em vagens e sementes de amendoim cultivado em solo com e sem calagem, provenientes de plantas colhidas aos 104, 114, 124 e 134 DAS e secas em estufa e ambiente. Avaliao na poca das guas. Seropdica-RJ. 2002. .................................................................... Dados mdios de porcentagem de fungos em vagens e sementes de amendoim provenientes de solo submetido ou no a aplicao de calcrio e que foram secas em estufa e ambiente. Avaliao na poca das guas e da seca. Seropdica-RJ. 2002. ............................................................................. Quadrado mdio porcentagem de fungos em amostras de solo, cultivado com amendoim e submetido ou no a aplicao de calcrio, que foram coletadas aos 104, 114, 124 e 134 DAS. Avaliao na poca da seca. Seropdica-RJ. 2002. ...................................................................................... Quadrado mdio para porcentagem de fungos em amostras de solo, cultivado com amendoim submetido ou no a aplicao de calcrio, que foram coletadas aos 104, 114, 124 e 134 DAS. Avaliao na poca das guas. Seropdica-RJ. 2002. .......................................................................... Dados mdios de fungos (UFC/g de solo) em amostras submetidas ou no a aplicao de calcrio e que foram coletadas aos 104, 114, 124 e 134 DAS. Avaliao na poca das guas e da seca. Seropdica-RJ. 2002. .................... Dados mdios de porcentagem de fungos em vagens e sementes de amendoim e de UFC/g de solo. Avaliao na poca das guas e da seca. Seropdica-RJ, 2002. ...................................................................................... Caracterizao pela Cromatografia de Camada Delgada, dos isolados do grupo Aspergillus flavus, que foram identificados inicialmente em meio ADM, segundo a produo de aflatoxinas. Seropdica-RJ. 2002. ................. Outros grupos de Aspergillus identificados nos isolados das amostras de solo, de vagem e de sementes, nos perodos de seca e guas de 2001. Seropdica-RJ. 2002. ...................................................................................... Dados mdios de dimetro de halos de inibio (mm) formados pela ao de trs fungicidas em diferentes concentraes sobre isolado do grupo Aspergillus flavus (T23-semente). Seropdica-RJ. 2002. ................................

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Dados mdios de dimetros dos halos de inibio (mm) formados pela ao do fungicida benomyl nas duas concentraes testadas sobre isolado do grupo Aspergillus flavus (T52-semente) em diferentes concentraes. Seropdica-RJ. 2002. ...................................................................................... Resumo da anlise de varincia para os dados obtidos pela ao do fungicida benomyl sobre isolados do grupo Aspergillus flavus (T23semente, T41-solo, T52-semente e T63-semente). ............................................. Dados mdios de dimetros de halos de inibio (mm) formados pela ao do fungicida benomyl sobre diferentes isolados do grupo Aspergillus flavus (T23-semente, T41-solo, T52-semente e T63-semente).Seropdica-RJ. 2002. ... Resumo da anlise de varincia para os dados obtidos pela ao de leos essenciais sobre isolados do grupo Aspergillus flavus (T52-semente e T63semente). ......................................................................................................... Dimetros dos halos de inibio (mm) formados em isolados do grupo Aspergillus flavus (T52-semente e T63-semente) em funo da atividade de leos essenciais de plantas medicinais (2 mg/mL de solvente), do solvente DMSO+MeOH (50% v/v) e do fungicida benomyl (0,5 mg/mL). Seropdica-RJ. 2003. ...................................................................................... Resumo da anlise de varincia para os dados obtidos pela ao de leos essenciais selecionados sobre isolado do grupo Aspergillus flavus (T52semente), comparados ao solvente e ao fungicida. ......................................... Halos mdios obtidos pela ao de leos essenciais com melhores resultados sobre isolado do grupo Aspergillus flavus (T52-semente), comparados ao solvente e ao fungicida. Seropdica-RJ. 2002. ...................... Resumo da anlise de varincia obtida pela ao de leos essenciais de alho e de casca de canela sobre 32 isolados do grupo Aspergillus flavus. ............. Dimetros mdios dos halos de inibio (mm) formados em isolados do grupo Aspergillus flavus em funo da atividade dos leos essenciais de alho e de canela. Seropdica-RJ.2003. ........................................................... Resumo da anlise de varincia para os dados obtidos pela ao do leo de canela e do fungicida benomyl sobre fungos do grupo Aspergillus flavus (T18-semente, T52-semente e T63-semente). .................................................... Resumo da anlise de varincia para os dados obtidos pela ao do leo essencial de Lippia sidoides e do citral sobre isolados do grupo Aspergillus flavus (T2-solo, T24-semente e T35-vagem) ..................................................... Resumo da anlise de varincia para os dados obtidos pela ao do leo essencial de alho e do fungicida benomyl sobre ilsolados do grupo Aspergillus flavus (T52-semente, T18-sememte e T63-sememte). ....................

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Avaliao da atividade do leo essencial de casca de canela nas concentraes de 2, 4, 6, 8, 10 e 12 mg/mL do solvente sobre fungos do grupo Aspergillus flavus (T18-semente, T52-semente e T63-semente), na concentrao de 107 condios/mL. Seropdica-RJ. 2003. .............................. Resumo da anlise de varincia para os dados obtidos pela ao dos leos essenciais de alho e casca de canela sobre isolados do grupo Aspergillus flavus (T2-solo, T20-semente, T24-semente, T35-vagem e T55-vagem) aps 12 meses de armazenamento. ......................................................................... Dimetros dos halos mdios de inibio (mm) formados em isolados do grupo Aspergillus flavus (T2, T20, T24, T35 e T55), em funo da atividade dos leos essenciais de alho e casca de canela, aps 12 meses de armazenamento. Seropdica-RJ.2003. ............................................................ Avaliao da atividade dos leos essenciais de alho e de casca de canela sobre isolados do grupo Aspergillus flavus (T2, T20. T24, T35 e T55), aps 12 meses de armazenamento destes leos. Seropdica-RJ. 2003. ....................... Avaliao comparativa em porcentagem da atividade do leo essencial de casca de canela, sobre a ocorrncia de isolados do grupo Aspergillus flavus (T18, T52, T63), avaliadas em 10/2002, e isolados (T2, T20, T24, T35, T55), avaliadas em 07/2003, aps 12 meses de armazenamento do leo essencial. Seropdica-RJ. 2003. ..................................................................................... Dados de porcentagem de fungos em sementes de amendoim, cultivar Tatu, tratadas com leos essenciais. Seropdica-RJ. 2003. ..................................... Quadrado mdio para os dados de plntulas normais de primeira contagem, germinao, plntulas anormais infeccionadas (PAI), sementes mortas (SM) e massa seca de plntulas (g), submetidas ao uso de fungicidas sintticos e naturais (1 experimento). ........................................................... Dados mdios de porcentagem de plntulas normais de primeira contagem, germinao, de plntulas anormais infeccionadas (PAI) e de sementes mortas (SM), e massa seca de plntulas (g) obtidas no primeiro experimento de sementes de amendoim cv. Tatu. Seropdica-RJ. 2003. ....... Quadrado mdio para os dados de germinao, plntulas anormais infeccionadas (PAI), sementes mortas (SM) e massa seca de plntulas, submetidas ao uso de fungicidas naturais (2 experimento). ......................... Dados mdios de porcentagens de emergncia, plntulas anormais infeccionadas (PAI) e sementes mortas (SM) e de massa seca de plntulas (g), obtidos no (2 experimento) de amendoim cv. Tatu. Seropdica-RJ. 2003. ............................................................................................................... Quadrado mdio para os dados de plntulas normais de primeira contagem, germinao, plntulas anormais infeccionadas (PAI) e sementes mortas, submetidas ao uso de solventes (3 experimento). .........................................

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Dados mdios de porcentagens de plntulas normais na primeira contagem, germinao, plntulas anormais infeccionadas (PAI) e sementes mortas (SM), obtidos no 3 experimento de amendoim cv. Tatu, tratadas com solventes. Seropdica-RJ. 2003. ..................................................................... Quadrado mdio para os dados de plntulas normais de primeira contagem, germinao, plntulas anormais infeccionadas (PAI) e sementes mortas, submetidas ao uso de fungicidas naturais (4 experimento). Seropdica-RJ. 2004. ............................................................................................................... Dados mdios de porcentagens de plntulas normais na primeira contagem, germinao, plntulas anormais infeccionadas (PAI) e sementes mortas (SM), obtidos no 4 experimento de amendoim cv. Tatu. Seropdica-RJ. 2003. ............................................................................................................... Quadrado mdio para os dados de plntulas normais de primeira contagem, germinao, plntulas anormais infeccionadas (PAI) e sementes mortas, submetidas ao uso de fungicidas sintticos e naturais (5 experimento). ...... Dados mdios de porcentagens de plntulas normais na primeira contagem, germinao, plntulas anormais infeccionadas (PAI) e sementes mortas (SM), obtidos no 5 experimento de amendoim cv. Tatu. Seropdica-RJ. 2003. ............................................................................................................... Quadrado mdio para os dados de plntulas normais de primeira contagem, germinao, plntulas anormais infeccionadas (PAI), sementes mortas (SM) e massa seca de plntulas, submetidas ao uso de fungicidas sintticos e naturais (6 experimento). ........................................................................... Dados mdios de porcentagens de plntulas normais na primeira contagem, germinao, plntulas anormais infeccionadas (PAI), sementes mortas (SM) e massa seca de plntulas, obtidos no 6 experimento de amendoim cv. Tatu. Seropdica-RJ. 2003. .......................................................................

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NDICE DE FIGURAS Pgina 1. 2. Porcentagem de fungos do grupo Aspergillus flavus nas vagens de amendoim, em funo da poca de amostragem (DAS), no cultivo da seca . Porcentagem de Rhizopus nas vagens de amendoim em funo da poca de amostragem (DAS) e do procedimento de secagem, por ocasio da avaliao realizada no cultivo da seca. ............................................................ Porcentagem de fungos do grupo Aspergillus flavus nas sementes de amendoim, em funo de poca de amostragem (DAS) e procedimento de secagem, por ocasio da avaliao realizada no cultivo das guas. ................ Porcentagem de Rhizopus spp. em sementes de amendoim, em funo da poca de amostragem (DAS) e da calagem, por ocasio da avaliao do cultivo das guas. ........................................................................................... Dimetro de halo de inibio formado em isolados do grupo Aspergillus flavus (T18-semente, T52-semente e T63-semente), em mm, em funo de diferentes concentraes de leo essencial de casca de canela e do fungicida benomyl. .......................................................................................................... Dimetro de halo de inibio formado em isolados do grupo Aspergillus flavus (T2, T24 e T35), em mm, em funo de diferentes concentraes de leo essencial de Lipia sidoides. ..................................................................... Dimetro de halo de inibio formado em isolados do grupo Aspergillus flavus (T2-solo, T24-semente e T35-vagem), em mm, em funo de diferentes concentraes de citral. ................................................................................... Dimetro de halo de inibio formado em isolados do grupo Aspergillus flavus T52-semente, T18-semente e T63-semente), em mm, em funo de diferentes concentraes de leo essencial de alho e do fungicida benomyl. Dimetro de halo de inibio formado em isolados do grupo Aspergillus flavus (T52-semente, T18-semente e T63-semente), em mm, em funo de diferentes concentraes de leo essencial de canela e do fungicida benomyl. .......................................................................................................... 30

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ABREVIATURAS E SMBOLOS
ADM meio de cultura composto de triptona (15 g); extrato de levedura (10 g); citrato frrico (0,5 g); agar (15 g); gua destilada (1000 mL) gua disponvel microrganismos para o desenvolvimento de

aw BDA CCD CYA

meio de cultura composto de batatinha sem pele (200 g); sacarose (20 g); agar (17 g); gua destilada (1000 mL) cromatografia de camada delgada meio de cultura composto de NaNO3 (3 g); K2HPO4 (1 g); KCl (0,5 g); MgSO4.7H2O (0,5 g); FeSO4.7H2O (0,01 g); extrato de levedura (5 g); sacarose (30 g); agar (15 g); gua destilada (1000 mL); soluo de traos de metal (1 mL) meio de cultura composto de NaNO3 (2 g); K2HPO4 (1 g); MgSO4.7H2O (0,5 g); KCl (0,5 g); FeSO4 (0,01 g); sacarose (30 g); gua destilada (1000 mL); soluo de traos de metal (1 mL) Dimetil sulfxido Metanol meio de cultura composto de sacarose (20 g); sulfato de magnsio (0,5 g); nitrato de potssio (3 g); extrato de levedura (7 g); gua destilada (1000 mL)

Czapek-Dox agar

DMSO MeOH SMKY

Soluo de traos de metal composta de ZnSO4.7H2O (1 g); CuSO4.5H2O (0,5 g); gua destilada (1000 mL) T ufc Y YES isolados obtidos no cultivo da seca Unidades formadoras de colnias isolados obtidos no cultivo das guas meio de cultura composto de extrato de levedura (20 g); MgSO4.5H2O (0,5 g); sacarose (150 g); agar (20 g); gua destilada (1000 mL)

RESUMO GERAL VIEGAS, Elson de Carvalho. Emprego de leos Essenciais de Plantas Medicinais no Controle de Aspergillus spp. em Sementes de Amendoim (Arachis hypogaea L.). Seropdica: UFRRJ, 2004. 78 p. (Tese de Doutorado em Fitotecnia). O amendoim (Arachis hypogaea L.) pode ser destinado a propagao e ao consumo. Na semeadura, os fungos, tais como Aspergillus spp., podem causar deteriorao das sementes e levar a perda de germinao. Assim como, quando usado para alimentao, estes fungos podem contaminar os gros e produzir aflatoxinas. Existem vrios procedimentos para controle da colonizao destes fungos, tais como, o emprego de produtos qumicos, de sementes resistentes e, recentemente de produtos naturais provenientes de partes de plantas. Os objetivos do presente trabalho foram o de avaliar o desenvolvimento do grupo Aspergillus flavus e a subseqente sntese de aflatoxinas em gros de amendoim, provenientes de plantas que cresceram na presena ou ausncia de calagem, colhidas em distintas pocas e secas em estufa e ambiente, em dois cultivos (guas e seca); avaliar, in vitro, a toxicidade de leos essenciais de vegetais contra fungos do grupo A. flavus, isolados da cultura do amendoim; e avaliar a qualidade fisiolgica das sementes de amendoim da cultivar Tatu, tratadas com fungicidas sintticos e leos essenciais de plantas. Pelos resultados foi constatado que a calagem no preveniu a contaminao de vagens e de sementes em ambos os cultivos. As condies de secagem em ambiente propiciaram menor incidncia de fungos do grupo A. flavus nas vagens provenientes do cultivo das guas e nas sementes provenientes do cultivo da seca. Dos isolados caractersticos do grupo A. flavus, 41 % provenientes do cultivo da seca e 47 % das guas no produziram aflatoxina. Foi constatado ainda que a maior inibio do desenvolvimento micelial de A. flavus foi obtida com o emprego dos leos essenciais de casca de canela e de bulbilho de alho, na dose de 2,0 mg/ml de solvente (DMSO+MeOH) e que o efeito inibitrio dos leos essenciais sobre o crescimento micelial foi varivel conforme o fungo (isolado) testado. Alm disso, as sementes embebidas em metanol, etanol e DMSO+MeOH e suas misturas com os leos essenciais apresentaram reduo acentuada de germinao e do vigor. J, os produtos a base de p de alho e de canela favoreceram a germinao e o vigor das sementes e reduziram as plntulas infeccionadas. Palavras chave: Cinnamomum zeilanicum Breyn., Allium sativum L., contaminao, aflatoxina.

ABSTRACT VIEGAS, Elson de Carvalho. Medicinal plants essential oil in the Aspergillus flavus control on the peanut seeds (Arachis hypogaea L. Seropdica: UFRRJ, 2004. 78 p. (Philosophiae Doctor). Peanut kernels can be used as propagules or for food. When used as seeds, Aspergillus spp. can cause deterioration and loss of germination when used for consumption aflatoxin produced by these fungi may cause helath threats. There are several products to control colonization of these fungi such as chemicals, resitant seeds and morc recently natural products obtained from plants parts. The objectives of this work were: (i) to evaluete the development of fungi from the group Aspergillus flavus and aflatoxin synthesis in peanut kernels obtained from plants growing with or without lime, harvested in the different times and dried in stove or under room temperature in the rainy and dry season; (ii) to evaluate essential oils for their toxicity against fungi belonging to the A. Flavus gruoup, isolated from peanuts and (iii) to evaluate seed physiological quality of peanut cv Tatu, treated with synthetic fungicides and essential oils. Results indicated that liming did not prevent pods or kernels from fungal contamination in both seasons. When dried at room temperature a lower fungal incidence on pods grown in the rainy season and lon seeds produced in the dry season ocurred. Kernels harvested at the dry season, and dried in stove were more contaminated by the fungi, 41% of the isolates obtained from the rainy season and 47% from the rainy season did not product aflatoxins. The highest inhibition to A. Flavus mycelial development was obtained after the use of cinnamon and garlic oils. The degree of inhibition by the oils was different for each isolate. Seeds immersed in methanol, ethanol and DMSO+MeOH and their mixtures, reduced germination and seed vigor, whereas products containning garlic and cinnamon powders favored germination and seed vigor, as well as reduced the number of infected seedlings. Key words: Cinnamomum zeilanicum Breyn., Allium sativum L., contamination, aflatoxin.

1 INTRODUO GERAL
1.1 A Espcie Muito antes dos portugueses chegarem ao Brasil em 1500, o amendoim j era conhecido e utilizado pelos ndios brasileiros. Em algumas tribos ele era chamado de Mandubi ou Mandobim e em outras de Manobi (SAN MARTIN, 1985). A primeira referncia escrita sobre o amendoim, em toda a histria da humanidade, foi encontrada num texto escrito em 1578 e registrada por Jean de Lery. Eram relatos de franceses que viajaram pelo Nordeste brasileiro, junto s primeiras expedies que aportaram no Novo Mundo e que mantiveram contato com os ndios (SAN MARTIN, 1985). Em 1929, o botnico J. Geraldo Kulman, viajando com o Marechal Rondom pelo serto brasileiro, conseguiu amostras de sementes de uma variedade suculenta e grande de amendoim, plantada pelos ndios Nambiquaras. Estas sementes foram para a Itlia e Inglaterra e da para os Estados Unidos, onde, aps melhorada e selecionada, tornou-se uma das principais variedades plantadas neste pas, como tambm em vrios pases da sia, frica e Amricas. O amendoim tem grande valor econmico, como produto de consumo interno e de exportao, sendo comercializado como gro com ou sem casca, como leo refinado e como seu farelo, que o maior volume de exportao (SAN MARTIN, 1985). Apresenta teores elevados de leos e protenas e considerado um dos alimentos humanos mais concentrado e, ao mesmo tempo, de fcil digesto (BRUCHER, 1989) A cultura propagada por sementes, que podem transportar e, ou, transmitir vrios patgenos como Rhizopus sp., Sclerotium rolfsii Sacc., Diplodia natalensis PoleEvans, Rhizoctonia solani Kuehn, Aspergillus flavus, A. niger, Fusarium spp. e Penicillium spp., que causam podrido de pr e ps emergncia, alm de Cercospora arachidicola Hori e Cercosporidium personatum (Berk. & Cust.) Deighton que causam manchas foliares (MORAES, 1980; MORAES & MARIOTTO, 1985; LIMA & ARAUJO, 1999). A cultura do amendoim importante para o Brasil e em especial para o Estado de So Paulo, onde, no ano agrcola de 2003/2004, foi obtida uma produo de 6.004.043 sacas de 25 kg em 58.817 ha na safra das guas e h uma previso de safra da seca de 1.476.281 sacas de 25 kg numa rea de 19.298 ha (IEA, 2004). O amendoim, quando usado para alimentao humana e em raes denomina-se gro, sendo que h problemas de aflatoxinas pela contaminao por fungos. O homem e os animais domsticos como bovinos, sunos, eqinos e aves consumindo doses subletais dessas toxinas por alguns dias, desenvolvem sintoma de toxidez no qual os danos ao fgado so os mais significativos (CIEGLER, 1975; HAYES, 1978). Um dos aspectos mais importantes para se manter a qualidade sanitria de gros de amendoim o manejo pr-colheita, uma vez que a sua contaminao sempre foi tratada como um problema de armazenamento, sendo o prprio armazm, a fonte de inculo (DHINGRA & COELHO NETTO, 1998). Mais recentemente, passou-se a aceitar que os gros podem chegar aos armazns, apresentando-se infectados e infestados com Aspergillus spp., pois dependendo das condies climticas e da cultivar, a colonizao pelo fungo e, a subseqente formao de aflatoxinas podem ocorrer no campo, bem antes da maturao (ANDERSON et al., 1975). Esta substncia importante quando as sementes so destinadas ao consumo como gro, por causar problemas de sade pblica (DHINGRA & COELHO NETTO, 1998).

J FERNANDEZ et al. (1997) avaliando o efeito da aplicao de calcrio em reas de cultivos de amendoim, constataram que os gros com maior espessura do tegumento, devido ter sido proveniente de plantas que foram crescidas em reas submetidas calagem, podem favorecer a diminuio da incidncia de Aspergillus spp. e da biossntese de aflatoxinas, dependendo do potencial do inculo. Alm disso, quando as plantas so secas a sombra, a produo de toxinas ocorre, independente da calagem; entretanto, quando as plantas so secas no campo ou no campo seguindo-se de secagem artificial, o desenvolvimento de fungos pode ser reduzido com o aumento do contedo de clcio das sementes. Tambm PITT et al. (1991) concluram que o maior contedo de clcio do tegumento da semente responsvel pela reduo do crescimento do Aspergillus flavus em cultivo de poca seca. Assim, alm da poca de colheita, a secagem tambm tem sido considerada como uma das operaes crticas e que determina a viabilidade da semente do amendoim, principalmente da poca das guas (NAUTIYAL & ZALA, 1991). Extratos de plantas medicinais tm sido utilizados intensamente, nos ltimos anos, em estudos farmacolgicos com resultados favorveis no controle e na cura de enfermidades, nas reas humana e animal (APPLETON & TANSEY, 1975; AMER et al., 1980; LOURIA et al., 1989; URBINA et al., 1993; ZOHRI et al., 1995; LEDEZMA et al., 1996; SAN-BLAS et al., 1997). De forma similar, alguns trabalhos tambm tm sido realizados quanto a sua utilizao no controle de patgenos associados s sementes (COUTINHO et al., 1999; MOURA & PESSOA, 2000; MORAIS et al., 2002; GABRIEL et al., 2002). O extrato aquoso de Andrographis peniculata foi utilizado em diferentes dosagens para controle de Aspergillus flavus o que resultou na reduo da produo de aflatoxinas em meio SMKY, tendo sido obtido com 10,0 mg/mL, reduo de 42,5 a 78,6 % de produo de aflatoxinas B2 e B1 respectivamente, alm de 75,1 % no crescimento do fungo (KUMAR & PRASAD, 1992). 1.2 Colonizao de Gros por Aspergillus 1.2.1. Em amendoim Historicamente, a contaminao de gros e outros alimentos com aflatoxinas sempre foi tratada como um problema do armazenamento, com crenas de que a fonte de inculo seria o prprio armazm. Durante o armazenamento, o crescimento do fungo depende quase que exclusivamente da umidade do substrato, em equilbrio com a umidade relativa do ar de 85 a 95%. A temperatura determina a velocidade de crescimento do fungo nos substratos de gros, nozes e raes, e considerada tima entre 30 e 35C. Secando-se os produtos rapidamente e mantendo-os a baixa umidade (aw 0,75), previne-se a formao de aflatoxinas, que so particularmente importantes em milho, amendoim e algodo. Em produtos com umidade acima de aw 0,85, em armazns, pode ocorrer a contaminao com aflatoxinas em trigo, cevada, soja, feijo e outros (DHINGRA & COELHO NETTO, 1998). As duas espcies mais importantes de Aspergillus, produtoras de aflatoxinas, so morfologicamente muito relacionadas, tanto que a maioria dos autores no as diferenciam. No entanto, o comportamento ecolgico e biolgico das duas bem distinto. A. parasiticus parece ser bem adaptado ao ambiente terrestre, por isso mais comum em amendoim e A. flavus, por outro lado, mais adaptado ao ambiente areo e dominante em milho, algodo, arroz e nozes. Enquanto a maioria das cepas de A. parasiticus produz todas as quatro formas de aflatoxinas, as de A. flavus s produz as aflatoxinas B1 e B2 (DHINGRA & COELHO NETTO, 1998). No amendoim, o inculo areo tem pouca importncia, porque a maior parte da infeco ocorre nos frutos subterrneos, embora a infeco, via flor, no possa ser subestimada. A. parasiticus esporula abundantemente em restos culturais e as

populaes fngicas so mais altas nos fragmentos de matria orgnica que no solo livre (DHINGRA & COELHO NETTO, 1998). Na geocarposfera foram detectados 165 ufc/g de solo com restos culturais de centeio e apenas 18 ufc/g ou menos, de solo onde no havia restos da cultura de centeio (GRIFFIN & GARREN, 1976). Segundo WELLS & KREUTZER (1972), flores de amendoim inoculados com uma suspenso de condios de A. flavus foram prontamente colonizadas pelo fungo sem dano aparente para o desenvolvimento de vulos. Sob condies favorveis de campo, o fungo pode colonizar flores de amendoim sem causar sintomas durante o perodo de florada, permanecendo saudvel at a colheita. Condios produzidos nas anteras, formam o inculo secundrio que podem infectar outras flores. Alm disto, partes das flores de amendoim, que dificultam a polinizao cruzada, pois nesta cultura ocorre 98% de auto-polinizao, tambm dificultam a contaminao do estigma. Contudo alguns insetos podem possibilitar esta contaminao. A temperatura pode influenciar na infeco da flor, sendo que solos com temperatura mais elevada favorecem a germinao de esporos pela necessidade maior tambm de irrigao, enquanto que solos com temperatura baixa no predispem a esta infeco (SANDERS et al., 1984). O amendoim uma cultura agrcola nica, cuja flor fertilizada no ambiente areo e, pelo alongamento do ginforo, o embrio empurrado para baixo da superfcie do solo. Assim o fruto (geocarpo) desenvolve-se no ambiente subterrneo, em contato com microrganismos e sujeito a sua invaso. A colonizao de sementes de amendoim, no campo, tambm segue caractersticas bsicas, similares ao milho. A infeco de sementes pode ocorrer via sistmica, atravs da flor e, diretamente, via parede de frutos. Parece, contudo, que a infeco direta a mais importante, em termos prticos. Apesar das altas populaes de A. flavus encontradas em campos de amendoim e em paredes de geocarpos em desenvolvimento, a infeco de sementes e produo de aflatoxinas relativamente baixa, a no ser em condies adversas ou quando os frutos so danificados por insetos ou apresentem rachaduras causadas por mudanas rpidas na umidade do solo (HORN et al., 1994; DHINGRA & COELHO NETTO, 1998). Estudos mostraram que os frutos no danificados tambm podem estar colonizados por A. flavus e conter aflatoxinas, embora em menor quantidade, desde que se desenvolva em condies ambientais propcias (MEHAN et al., 1991). A abundante esporulao do fungo nas anteras pode estar associada aos insetos, transportando de flor a flor o inculo (GRIFFIN & GARREN, 1976b). Os pegs areos de plantas de amendoim, crescidos sob condies gnotobiticas (barreira sinttica), aps inoculao das flores com condios de A. flavus, foram realmente colonizados pelo fungo sem aparente danos ao desenvolvimento do embrio. O fungo isolado de superfcies dos pegs anteriormente esterilizadas com HgCl2 a 0,1% por um minuto, desenvolveu-se em todos os estgios de maturao da vagem (WELLS & KREUTZER, 1972). A invaso direta durante o desenvolvimento de frutos de amendoim por A. flavus no solo na regio da geocarposfera, na fase de pr-colheita, tem sido, geralmente, aceita como o provvel caminho para a eventual contaminao dos gros com aflatoxina, aps a penetrao da barreira oferecida pelo pericarpo. Contudo, A. flavus pode estar presente no desenvolvimento do ovrio de amendoim na extremidade do peg antes dele ser impelido para o interior do solo (DIENER et al., 1987). 1.2.2. Em milho Como muitos dos estudos realizados sobre o mecanismo de infeco e disseminao do grupo Aspergillus flavus, bem como o da produo de aflatoxinas foram realizados com a cultura do milho, fundamental fazer algumas citaes que podem ser importantes tambm para a cultura do amendoim.

ANDERSON et al. (1975) demonstraram que a contaminao dos gros de milho ocorreu no campo, antes da colheita, indo depois para os armazns infestados com A. flavus, sendo o mesmo tambm demonstrado por USHA et al. (1993), para arroz. No sul e sudeste dos Estados Unidos, o problema das aflatoxinas crnico. Entretanto, no cinturo de milho do meio-oeste daquele pas, a incidncia de gros com aflatoxinas espordica, ocorrendo s em anos em que h altas temperaturas e poucas chuvas na poca de desenvolvimento destes gros (LILLEHOJ et al., 1975; HESSELTINE & BOTHAST, 1977), o que foi tambm observado por JONES & DUNCAN (1979) e HOLTMEYER & WALLIN (1980, 1981), com relao irrigao. Para estes autores, nos Estados Unidos, a concentrao de condios de Aspergillus flavus no ar, em parcelas no irrigadas, foi quase o dobro da observada em parcelas irrigadas e dos propgulos capturados, 65% mostraram ser produtores de aflatoxinas. No Brasil, de acordo com DHINGRA & COELHO NETTO (1998) no h estudos. Sementes de milho contaminadas por A. flavus, quando semeadas, transmitem o fungo para a prxima gerao. As hifas originrias de condios presentes na superfcie de sementes (ou entre os cotildones) em germinao, invadem as plntulas em emergncia, via estmatos e tambm pela cutcula aparentemente intacta em colonizao sistmica, porm sem causar sintomas na planta. O fungo pode ser detectado em todas as partes da planta de milho, inclusive na inflorescncia e nas sementes originrias das novas plantas (MYCOCK et al., 1990, 1992). 1.3 Micotoxinas So metablitos secundrios produzidos por alguns fungos, que so liberados ou no nos substratos nos quais eles crescem e que causam doenas (micotoxicoses) quando ingeridos em alimentos contaminados (DHINGRA & COELHO NETTO, 1998). Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Phomopsis, Pithomyces e Acremonium, produzem mais de 300 micotoxinas nos substratos que colonizam. Com relao aos gros, as aflatoxinas, fumonisinas, zearalenona e deoxinivalenol (vomitoxina), so mais freqentes e importantes (DHINGRA & COELHO NETTO, 1998). Aflatoxina um termo coletivo para um grupo de toxinas produzidas por algumas cepas de A. flavus e A. parasiticus, durante seu crescimento em substrato favorvel sua produo. Todas as formas de aflatoxinas so compostos heterocclicos altamente oxigenados e tm um ncleo de cumarina fundida com bifurano e contm um anel pentenona ou uma lactona. As duas principais formas de aflatoxinas, B e G (blue e green), caracterizadas e visualizadas pela cor da sua fluorescncia em UVP (ultravioleta prximo), so subclassificadas como B1, B2, G1 e G2, de acordo com a cor e seqncia da localizao no cromatograma de camada delgada. A pequena diferena estrutural entre elas responsvel por altssima diferena, na toxidez de cada uma, sendo aflatoxina B1 a mais txica e a mais comum de todas. As aflatoxinas esto classificadas entre os mais txicos compostos naturais, de ocorrncia comum, aos quais o homem e os animais esto expostos (DHINGRA & COELHO NETTO, 1998). Em estudos detalhados sobre dose-resposta foi observado que aflatoxina B1 o mais potente agente carcinognico natural conhecido, tendo sido encontrado resultados mais graves em ratos machos do que em fmeas. Foi observado tambm que a aflatoxina G1 potencialmente da mesma magnitude que B1 (WOGAN et al., 1967; BUTLER et al., 1969). Elas causam morte e outros sintomas de toxicidade quando raes ou alimentos contaminados so ingeridos por animais e humanos, respectivamente (DIENER et al., 1987). A dose nica letal, por quilo de peso corporal, de aflatoxinas B1 e G1 foi de 0,73 mg e 1,18 mg para

patinhos de um dia, respectivamente, e 1,16 mg e 2,0 a 4,0 mg para ratos, respectivamente. J as aflatoxinas B2 e G2 foram menos potentes em patinhos (1,76 mg e 2,83 mg respectivamente) alm de no serem txicas para ratos na dosagem de 200,0 mg/kg de peso corporal. As formas B2, G1 e G2 tambm so carcinognicas, mas com menor potncia. Todas as aflatoxinas tm efeito carcinognico, teratognico, mutagnico e imunossupressor (BUTLER et al., 1969; WOGAN et al., 1971). Estudos feitos nas Filipinas evidenciam tambm o aumento de cncer primrio de fgado, pela ingesto de alimentos contaminados com aflatoxinas associadas ao consumo de bebidas alcolicas (CARLBORG, 1979; BULATAO- JAYME et al., 1982). A suscetibilidade s aflatoxinas depende no s da espcie, mas tambm do sexo, da raa, da idade, da atividade hormonal e do estado nutricional (HAYES, 1978; CIEGLER, 1975). Em animais lactantes, parte da toxina liberada no leite, entre 12 e 24 horas aps a ingesto de alimentos contaminados e continua at 3 a 4 dias aps esta ingesto, quando atinge seu mximo, se estabiliza at o 14 dia e em seguida apresenta apenas traos (POLAN et al., 1974). A aflatoxina B1, aps ingerida na rao, convertida no metablito txico que vai se expressar atravs do leite como M1 (milk). Sua toxidez, no entanto, no se altera significativamente pois 0,02 mg de B1/kg de rao ingerida vai expressar 0,07 g de M1 /L de leite bovino (HAYES, 1978). A maior parte das informaes sobre ecologia e biologia de Aspergillus flavus e A. parasiticus e sobre os fatores determinantes da colonizao de gros e acmulo de aflatoxinas, foi gerada no sul e sudeste dos Estados Unidos, onde os problemas de aflatoxinas crnico (DHINGRA & COELHO NETO, 1998). A contaminao dos gros com aflatoxinas na pr-colheita parece ser significativa nos Estados Unidos, principalmente em amendoim, milho e sementes de algodo, embora a contaminao possa ocorrer em qualquer cultura que no tenha sido seca adequadamente aps a colheita (DIENER et al., 1987). A poeira durante a colheita, trilha, ensacamento, limpeza, armazenamento e processamento de gros contaminados tambm pode contaminar o ser humano. As doses subletais ingeridas diariamente pelos seres humanos em vrias regies do mundo vem fazendo vtimas silenciosamente. A falta de informao se deve, principalmente, pobreza, indisponibilidade e despreparo de mdicos, falta de laboratrios para anlise de sangue, urina e alimentos e ao desinteresse das agncias governamentais (DHINGRA & COELHO NETTO, 1998). 1.4 Influncia de Fatores do Ambiente na Colonizao de Gros e Formao de Aflatoxinas 1.4.1 Fungos do grupo Aspergillus flavus A. flavus um fungo mesoflico, com timo de temperatura para crescimento entre 35 e 38C, mnimo entre 8 e 15C e mximo entre 40 e 45C. Desde que haja presena de inculo, em quantidade suficiente na poca mais suscetvel, altas temperaturas e estresse hdrico so os dois fatores primordiais para colonizao e formao de aflatoxinas nos gros em pr-colheita (DHINGRA & COELHO NETTO, 1998). SCHINDLER et al. (1967), testando a influncia da temperatura no desenvolvimento de duas estirpes de Aspergillus flavus em meio Wort e a produo de aflatoxina, observaram que no houve produo de aflatoxina sob temperaturas de 2, 7, 41, 46 e 52C e concluram que se a produo desta toxina em alimentos, raes e outros produtos semelhante produo em meio Wort, pode ser possvel evitar contaminao de aflatoxina nestes produtos sob temperaturas seguras. Estes autores afirmaram ainda que quando so feitos estudos da influncia das condies ambientais no crescimento do fungo e na produo de aflatoxinas, ocorrem divergncias de resultados entre os diferentes autores e isto se deve provavelmente variabilidade gentica dos isolados

trabalhados ou ao tempo utilizado na experincia. Assim, um isolado que no produziu aflatoxina sob altas temperaturas por cinco dias, quando submetido s mesmas condies por 12 semanas produziu, o que indica que aquela aflatoxina pode ser recuperada depois de 6 semanas, pois o fungo passa a produzi-la. A descrio dos fungos deste grupo se baseou na classificao segundo SINGH et al. (1991), como se segue: Classe: Deuteromycotina; Ordem: Hyphomycetes (Moniliales); Famlia: Moniliaceae; Gnero: Aspergillus; Espcies: Aspergillus flavus Link [Dimetro da colnia: 4,0 a 4,5cm; Anverso: verde-amarelado; Reverso: cremeamarelado; Cabea: radiada, tornando-se imprecisamente colunar com o tempo (idade); Estipe: longa, verrugosa, hialina; Vescula: em forma de abbada, frtil na superfcie inteira; Mtula: presente, pequena; Filides: pequenas, ampuliforme; Condio: globoso a subgloboso, usualmente rugoso, verde-amarelado; Micotoxinas: aflatoxinas B1 e B2] e Aspergillus parasiticus Speare [Dimetro da colnia: 3,2 a 3,5cm; Anverso: verdeamarelado tornando-se verde escuro com o tempo; Reverso: creme-amarelado; Cabea: radiada; Estipe: longa, rugosa; Vescula: globosa, frtil na superfcie inteira; Mtula: poucas ou ausente; Filides: ampuliforme com longo, extenso pescoo; Condio: globoso, muito rugoso, mostrando freqentemente tecido conectivo. Esverdeado; Micotoxinas: aflatoxinas B1, B2, G1 e G2]. 1.4.2 Em amendoim A temperatura e a umidade do ar parecem ter papel independente na produo de aflatoxinas em milho, cuja infeco ocorre no ambiente areo. No caso do amendoim, os dois fatores agem conjuntamente. Em gros de amendoim no danificados, nem a seca nem a alta temperatura sozinhos estimulam a colonizao de gros e, a subseqente, acumulao de aflatoxinas (HILL et al., 1983; BLANKENSHIP et al., 1984). Em condies de seca, o limite de temperatura na geocarposfera, para formao de aflatoxinas, situa-se entre 25 e 28C, e uma reduo nesta regio, de 29,6 para 25,2C resulta em no formao de aflatoxinas. A colonizao de gros inversamente proporcional maturidade dos gros, sendo maior nos gros cultivados em temperaturas elevadas sob condio de seca. Embora, em condio de irrigao, os gros continuem sem o acmulo de aflatoxinas. No campo, em condio de seca natural, temperatura do solo de 44,6C, tem sido encontradas entre fileiras, sem que haja formao de aflatoxinas, ainda que o fungo cresa nessa temperatura (HILL et al., 1983). O limiar para formao de aflatoxinas fica entre 30 e 40 dias de seca antes da colheita. Esses resultados corroboram com dezenas de observaes de campo, onde concentraes de aflatoxinas so mais altas nos anos secos. Postula-se que, nas condies de seca, alta colonizao de vagens pode estar relacionada eliminao de competidores, como Aspergillus niger, que compete com sucesso com A. flavus em condies de altas temperatura e umidade do solo (HILL et al., 1983; BLANKENSHIP et al., 1984). Outra possvel influncia da umidade reduzida est na diminuio no metabolismo dos gros, aumentando sua suscetibilidade infeco e a colonizao (DHINGRA & COELHO NETTO, 1998). Foi tambm associada a colonizao de gros de amendoim, nas condies de seca, capacidade de sntese de fitoalexinas, porque estas no foram sintetizadas quando a aw caiu abaixo de 0,95 (DORNER et al., 1989). O contedo de gua do gro parece ser o fator mais importante no controle da capacidade de produzir fitoalexinas, nos gros imaturos de amendoim. Esse mecanismo natural de resistncia colonizao quebrado sob estresse hdrico (DIENER et al., 1987; DHINGRA & COELHO NETTO, 1998). Outrossim PITT et al. (1991) observaram forte evidncia de que A. flavus e A. parasiticus podem invadir sistematicamente plantas de amendoim pelo solo e sementes contaminadas. Plantas crescidas em solos inoculados com A. parasiticus mostraram invaso de 40 a 76% por A. flavus, em valores crescentes, das razes at o pice do

caule. A explicao dada foi de que provavelmente o fungo penetrou atravs de cicatrizes nos cotildones pois as sementes originrias apresentaram somente 1 a 4% de invaso. 1.5. Controle da Colonizao e Subseqente Aflatoxinas Para SCHINDLER et al. (1967), a temperatura que freqentemente recomendada para a secagem artificial do amendoim favorece o desenvolvimento de Aspergillus flavus. Porm esta temperatura pode no coincidir com aquela que favorvel para produo de aflatoxina. Desta forma os autores concluram que a produo de aflatoxina no est relacionada com o crescimento de A. flavus. J, AZAIZEH et al. (1990) obtiveram extratos metanlicos de tegumentos e cotildones de sementes de vinte e trs gentipos de amendoim e aps filtragem e secagem, diluram o tanino existente no resduo com gua destilada em diferentes concentraes e adicionaram ao meio YES. Posteriormente, foi feita a infestao de Aspergillus parasiticus e verificaram o efeito deste tratamento sobre o crescimento micelial do fungo e a produo de aflatoxinas. Os autores concluram que alguns destes extratos inibiram significativamente o crescimento do fungo e reduziram os nveis de aflatoxinas produzidas. Tambm MEHAN et al. (1991) tm constatado que o tipo de solo pode interferir na infeco de gros por A. flavus e na contaminao por aflatoxina . Ainda DORNER et al. (1992), infestando solo com uma estirpe de Aspergillus parasiticus NRRL 13539 no produtora de aflatoxina e avaliando a atividade biocompetidora deste agente durante os anos de 1987, 1988 e 1989 no controle de estirpes produtoras de aflatoxina em ps colheita de amendoim, concluram que os solos tratados no apresentaram altas populaes de Aspergillus flavus e A. parasiticus e que isto foi uma importante considerao ecolgica relativa para a utilizao deste sistema de biocontrole. Para MAZZANI & LAYRISSE, (1992) ensaios desenvolvidos com oito gentipos de amendoim no apresentaram resultados significativos quanto resistncia a Aspergillus flavus com relao variao ambiental (irrigado, estresse hdrico e em condies de chuva). J, PRADO et al. (1999), avaliando a resistncia de quatro gentipos de amendoim (Tatu, VRR-247, 2117 e 2155) quanto a produo de aflatoxina B1, aps inoculao com Aspergillus flavus, observaram comportamentos diferentes entre eles, sendo que o gentipo 2117 apresentou menores nveis de contaminao, sugerindo maior resistncia infeco pelo fungo e, ou produo de aflatoxina. Os autores concluram ainda, que alm da necessidade do conhecimento dos mecanismos indutores da resistncia, necessrio conhecer melhor as variaes de interao gentipos x estirpes do patgeno, do seu potencial toxignico, do processo de inoculao e das condies de cultivo e colheita. Entretanto REDING et al. (1993), inoculando condios de Aspergillus parasiticus, verificaram menor produo de aflatoxina em gros de amendoim provenientes de plantas que se desenvolveram em solo que foi suplementado com gesso, em comparao s sementes provenientes de plantas provenientes do tratamento controle. Estes autores verificaram, ainda, diminuio da biomassa de fungos, a qual correlacionou-se com a diminuio da biosntese de aflatoxina. Tambm, CLAVERO et al. (1994), ao inocularem gros de amendoim com condios de Aspergillus spp., verificaram que a produo de toxinas foi maior naquelas colhidas a partir de plantas que receberam apenas 2,00 kg/ha de clcio e, que houve reduo de 50% na produo de toxina quando a concentrao de clcio foi aumentada para 4,4 kg/ha. J, SANTURIO et al. (1994), avaliando, in vitro, a capacidade de adsorso de bentonitas e aluminosilicatos aflatoxina (utilizando aflatoxina B1 com pureza de 99%-

Sigma Chemical Company), obtiveram resultados acima de 72% com aluminosilicato de sdio e clcio hidratado, bentonita sdica e bentonita sdica natural. Contudo PATKAR et al. (1995), tratando gros de arroz, sorgo e amendoim com cido propinico em diferentes concentraes, concluram que esta substncia pode ser alternativa para controlar fungos de armazenamento. Entretanto, quando aplicado em material a ser utilizado como semente, provoca queda de germinao com o perodo de estocagem. Por outro lado, PRADO et al. (1995), trabalhando com sementes de amendoim da cultivar Tatu vermelho tratadas com sais de alumnio, ferro, zinco e nquel em diferentes concentraes, inoculadas com Aspergillus flavus NRRL 6513, incubadas por sete dias e analisadas quanto a produo de aflatoxina B1, observaram que alumnio, ferro e zinco inibiram a produo de aflatoxina B1 em todas as concentraes e que o nquel estimulou, a 4g/g e inibiu a 1,0 e 2,0g/g. Os autores sugeriram que a utilizao de solos ou de gentipos com elevados teores de alumnio, ferro e zinco, pode contribuir para menor contaminao por aflatoxinas. As reas de amendoim, submetidas a irrigao abundante, apresentaram baixa infeco por A. flavus quando comparados com aquelas submetidas estresse hdrico (NAHDI, 1996). Finalmente, ZOVICO et al. (1999) buscando detectar a presena de aflatoxina, por seleo eletrnica pela cor, em amendoim descascado, com o objetivo de melhorar a qualidade de lotes quanto diminuio da contaminao por aflatoxinas, avaliaram 42 lotes comerciais de 300kg sabidamente contaminados com aflatoxinas. A seleo eletrnica separou gros considerados sadios e rejeitou os contaminados. Aps amostragem e avaliao dos dois grupos, verificaram que somente em trs lotes no foram detectadas aflatoxinas. No houve assim melhora nos nveis iniciais de aflatoxinas, indicando que a distribuio das mesmas estava generalizada pois os gros selecionados tambm estavam contaminados. 1.6. Ao de Fungos na Deteriorao de Sementes As sementes de amendoim durante o beneficiamento mecnico, podem sofrer ferimento, tornando estas sementes mais vulnerveis rpida perda de viabilidade, dependendo da umidade das sementes e da temperatura de armazenamento (RAO et al., 1996). Os fungos mais comuns associados s sementes de amendoim so: Aspergillus spp., Penicillium spp, Rhyzopus spp., Fusarium spp., Macrophomina phaseolina, Botrytis cinrea, Chaetomium spp, Rizoctonia solani, Sclerotium rolfssi e Phomopsis spp. (MORAES & MARIOTO, 1985, sendo que, Aspergillus spp. e Penicillium spp. so os mais freqentes (NAKAMURA & NISHIMURA, 1974; LIMA & ARAJO, 1999; USBERTI & AMARAL, 1999, VANZOLINI et al., 2000) e so os principais causadores da deteriorizao de sementes de amendoim (RAO et al., 1996; LIMA & ARAJO 1999). Entretanto HALLOIN (1975) e TANAKA & CORRA (1981), estudando a influncia de Aspergillus flavus, A.niger e Rhizopus spp. na deteriorao de sementes de algodo, inoculadas com estes fungos, observaram que Aspergillus spp. reduz a germinao e o vigor destas sementes mais rpido que Rhyzopus spp., sendo que este ltimo tambm afeta as sementes durante o processo de germinao. Os fungos de maior incidncia so Aspergillus spp., Penicillium spp. e Rhizopus spp. (FERNANDEZ et al., 1997; USBERTI & AMARAL, 1999). Espcies de Aspergillus dos grupos Aspergillus flavus e Aspergillus niger, tem causado decrscimo de germinao, devido deteriorao das sementes (McLEAN et al., 1984) e, assim como Penicillium spp., tem promovido leses nas plntulas, levando ao menor desenvolvimento desta (BACKMAN & HAMMOND, 1976; ITO et al., 1992).). LIMA

& ARAJO (1999) constataram que Rhizopus spp. causa tombamento de pr e de psemergncia. Estes fungos podem contaminar e infectar as sementes de amendoim no campo (ROSSETTO et al., 2003). 1.7. Uso de Extratos de Plantas Medicinais para Controle 1.7.1. De Aspergillus flavus em gros A eficcia do uso de extratos de cebola (Allium cepa L.) e de alho (Allium sativum L.) alm de eugenol foi testada por BILGRAMI et al. (1992) em gros de milho contra a produo de aflatoxina por A. flavus. Estes autores verificaram reduo do crescimento micelial em at 61,94% com extrato de alho, e reduo da produo de aflatoxina em at 60,44% devido ao extrato de cebola e de 60,35% pelo eugenol, acompanhando a reduo do crescimento micelial do fungo.. Para PASTER et al., (1995) os gros de trigo tratados por 24 horas com os leos essenciais de organo (Origanum vulgare L.) e tomilho (Thymus vulgaris L.) apresentaram inibio no crescimento de Aspergillus spp. com 2,0 L/litro e 4,0 L/litro, respectivamente. Entretanto, ao ser mantida a exposio dos gros aos leos por mais de 24 horas, houve reduo na capacidade germinativa proporcional ao tempo de exposio, o que inviabiliza sua utilizao em sementes nestas condies. 1.7.2. De Aspergillus flavus em sementes Foi conseguido por BANSAL & SOBTI (1990) resultado promisssor com o uso de extrato de folha de neem (Azadirachta indica A. Juss) no controle de Aspergillus niger e A. flavus em sementes de amendoim, no diferindo dos resultados obtidos com thiran e mancozeb, alm de favorecerem a germinao e a sanidade de plntulas e reduzir a porcentagem de sementes deterioradas. Foi verificado por FERRACINI et al. (1990) que extratos de ambrsia (Chenopodium ambrosioides L.), Cimaba cedron P., aruba (Simarouba amara Aubl.), qussia (Quassia spp.), Pterocaulon balansae e cinamomo (Melia azedarach L.) inibiram, in vitro, os fungos Fusarium solani f. sp. phaseoli, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum e Sclerotium rolfisii, e que a incorporao de folhas de C. ambrosioides no solo promoveu o controle do tombamento de plntulas de feijoeiro causado por R. solani. J MISHRA & DUBEY (1994) avaliaram a atividade fungitxica de uma srie de leos essenciais, extrados por meio de hidrodestilao de folhas de capim limo [Cymbopogon citratus (DC) Stapf.], erva de So Joo (Ageratum conizoides L.), limo Tahiti [Citrus aurantifolia (Christm.) Swingle], junpero comum (Juniperus communis L.), cnhamo-agrimnia (Eupatorium cannabium L.), alfavaco [Hyptis suaveloens (L.) Poit], hortel comum (Mentha viridis L.), pinheiro (Pinus spp.) e alpinia (Alpinia carinata Val), de talos de insenso frances (Boswellia serrata Roxb.), de cascas de tangerina (Citrus reticulata Blanco) e laranaja (Citrus sinensis Osbeck), de rizoma de aafro (Curcuma longa L.), e de raiz de vetiver [Vetiveria zizanioides (L.) Nash], sobre Aspergillus flavus. Para os autores, C. citratus apresentou atividade positiva Concentrao Mxima de Inibio (CMI) de 3.000 ppm. A tcnica utilizada foi a de discos de miclio, em meio BDA. Em testes de fitotoxicidade do citral, substncia presente em maior concentrao no leo essencial de C. citratus, no foi observado efeito sobre a germinao de sementes e crescimento das plntulas de trigo e arroz. Estes autores testaram ainda a atividade fungitxica do citral sobre vrias espcies de Penicillium, Alternaria, Fusarium, Aspergillus e Botrytis, nas concentraes de 500ppm (hipotxica), de 1000ppm (txica) e de 1500ppm (hipertxica) e concluram que houve total inibio de crescimento fngico somente com a concentrao hipertxica. Entretanto para Aspergillus parasiticus, a concentrao hipotxica promoveu total inibio do fungo.

Foi verificado por ADEGOKE & ODESOLA (1996) que sementes de feijo e de milho tratadas com leo essencial ou com o p do capim limo e armazenadas por 10 dias, no apresentaram deteriorao fsica, alterao no odor e na colorao, assim como crescimento de Aspergillus flavus, enquanto o mesmo no foi observado na amostra controle (no tratadas). Para MONTES-BELMONT & CARVAJAL, 1998) os leos essenciais de onze plantas foram estudados para controle de A. flavus em milho, tendo sido alcanada a inibio total de desenvolvimento do fungo por canela (Cinnamomum zelanicum Breyn.), hortel (Mentha piperita L.), manjerico (Ocimum basilicum L.), organo (Origanum vulgare L.), Teloxys ambrosioides, cravo da ndia [Syzygium aromaticum (L.) Norril.] e tomilho (Thymus vulgaris L.), alm de no haver efeito fitotxico na germinao e desenvolvimento das plntulas. 1.7.3 De outros fungos Atravs de experimento in vitro, BOLKAN & RIBEIRO (1981) conseguiram reduo do crescimento micelial de 66,9, 76,3 e 37,6% em Rhizoctonia solani Kuhn, em Fusarium moniliforme var. subglutinans Wr. & Reink e em Cylindrocladium clavatum Rodges & May, respectivamente, usando extrato de bulbo de alho (Allium sativum L.) a 5.000 ppm. Foram conduzidos por CHALFOUN & CARVALHO (1987) dois ensaios com extrato de bulbo de alho, obtido por triturao, prensagem e filtrao, e com leo industrial de bulbo de alho (Allium sativum L.), obtido por prensagem a frio com leo de soja, para controle de Gibberella zeae (Schw.), de Alternaria zinniae Pape e de Macrophomina phaseolina (Tass.) Goid. Os autores verificaram a eficincia do extrato e do leo industrial de alho no controle destes fungos, variando de 85 100% de inibio. Tambm BASTOS (1992) obteve completa inibio do crescimento micelial de Crinipellis peniciosa e de Phytophthora palmivora em meio BDA acrescido de 10.000ppm de extrato de bulbo de alho (A. sativum L.). Tambm BARROS et al. (1995), utilizando extrato de bulbo de alho (A. sativum L.) acrescido ao meio BDA, observaram reduo significativa no crescimento micelial dos fungos Curvularia spp. e Alternaria spp., embora no tenha afetado a germinao dos condios destes fungos. Alm disto, BASTOS (1997), utilizando o leo de folhas de aperta-ruo (Piper aduncum L.) extrado por destilao a vapor e posteriormente suspenso em gua destilada, obteve 100% de inibio na germinao dos basidisporos do fungo e total inibio do crescimento micelial de Crinipellis perniciosa. Porm WILSON et al. (1997), avaliando a atividade fungitxica dos extratos de 347 plantas, obtidos por fragmentao dos tecidos e coleta e filtragem do fludo liberado, e de 49 leos essenciais obtidos por destilao ou escarificao, concluram que 13 extratos mostraram altos nveis de atividade antifngica sobre Botrytis cinrea, predominando entre eles os das plantas dos gneros Allium e Capsicum. Dos leos essenciais, Cymbopogon martini, Thymus zygis, Cinnamomum zeilanicum Breyn. e Eugenia caryophyllata, demonstraram a maior atividade antifngica sobre aquele fungo. Os constituintes mais freqentes nestes leos essenciais que mostraram alta atividade antifngica foram: -mirceno, -pineno, -pineno e cnfora. Foi observado por RIBEIRO & BEDENDO (1999) efeito inibitrio no crescimento micelial de Colletotrichum gloeosporiodes, cultivado em meio BDA, atravs de extratos aquosos de alho (Alluim sativum L.), hortel (Mentha piperita L.), mamona (Ricinus communis L.) e pimenta (Capsicum sp.) nas concentraes a partir de 200 ppm, sendo que o extrato de alho inibiu significativamente o crescimento de miclio porm no reduziu a produo de esporos. Por outro lado, os demais extratos promoveram reduo do desenvolvimento de miclio e da esporulao do patgeno.

O extrato bruto e sumo de algumas plantas medicinais foi testado por FEITOSA et al. (2000) sobre fungos cultivados em meio BDA, obtiveram 85% de eficincia sobre Cladosporium gloeosporioides com o sumo de babosa (Aloe vera L.) a 15%. Tambm a aplicao de tintura de ju (Ziziphus joazeiro Mart) a 20% reduziu em 62% o crescimento de Lasiodiplodia theobromae e a de extrato bruto de moringa (Moringa oleifera Lam.) reduziu em 87% o crescimento de Macrophomina phaseolina. Experimento conducido por FRANZENER et al. (2000), em meio BDA acrescido de extratos aquoso e alcolico, permitiu que estes autores observassem redues de 9 a 39% e de 45 a 76% no crescimento micelial de Bipolaris sorokiniana em presena dos extratos, tanto aquoso quanto alcolico, de cnfora (Artemsia camphorata Vill.) e de ginseng brasileiro [Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen], respectivamente, sendo que o extrato aquoso de A. camphorata a 10% inibiu completamente a esporulao do fungo. Alm disso, tambm houve induo para a sntese de fitoalexinas. Porm MORAIS (2000), avaliando a ao, in vitro, de 45 extratos de plantas sobre Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, obteve apenas atividade fungisttica de leo de copaba (Copaifera spp.) e de leo de sucupira (Pterodon ermaginatus Vogel). Entretanto PEREIRA et al. (2000) obtiveram inibio de 100% na germinao de condios de Colletotrichum gloeosporiodes e de Fusarium oxysporum f.sp. cubensis utilizando extratos alcolicos de abiu, caj e pau-de-balsa. Estes mesmos autores conseguiram reduo significativa no crescimento micelial de Sclerotium rolfsii cultivado em meio BDA, com o emprego de extrato aquoso de carambola, de morotot e de ing-vermelho, assim como reduo na produo de esclerdios com sororoca, breu-branco e seringueira. Assim tambm DINIZ et al. (2000) obtiveram inibio do crescimento de Sclerotinia minor, cultivado em meio de aveia, com aplicao de leos de tomilho (Thymus vulgaris L.), de estrago (Artemsia draconculus ), de manjerico roxo (Ocimum basilicum L.), de manjerona (Origanum majorana L.) e de menta citrata (Menta piperita var. citrata). Ao ser estudado por NICOMEDES JUNIOR et al. (2000), o efeito fungitxico do extrato bruto de alho (A. sativum L.) sobre o crescimento micelial de Fusarium oxysporum, de Rhizoctonia solani e de Sclerotium rolfsii, cultivados em meio BDA, os autores observaram inibio significativa do crescimento micelial destes fungos, sendo que os halos produzidos na concentrao de 50% para F. oxysporum e S. rolfsii foi superior ao do fungicida. Posteriormente, os autores trataram plantas de tomateiro, conduzidas em vasos, previamente inoculados com Fusarium sp. e Sclerotium sp. e observaram significativo aumento da massa de folhas frescas e dos teores de aminocidos livres, acares livres e amnio nas folhas. Tambm KE-QIANG & BRUGGEN (2001) obtiveram in vitro inibio total na germinao de esporngios e zooporos de Phytophthora infestans com a utilizao de extratos de bulbos de alho (Allium sativum L.), cortados em pequenos pedaos, macerado em gua, filtrado a vcuo e preparado em diferentes concentraes, no diferindo da ao do fungicida convencional. Assim como SOUZA et al. (2002) constataram que os extratos metanlicos (2,5% p/v) de erva-cidreira [Lippia alba (Mill) N.E. Brown] e de funcho (Foeniculum vulgare Mill) apresentaram diminuio significativa no crescimento micelial dos fungos Sclerotium sp.e Fusarium sp. (efeito fungisttico) cultivados em meio BDA. 1.8 Objetivos Gerais a) Avaliar o desenvolvimento de fungos e espcies do grupo Aspergillus flavus e a subseqente biosntese de aflatoxina em gros de amendoim, provenientes de plantas

que cresceram na presena ou ausncia de calagem, que foram colhidas em distintas pocas e secas em estufa e ambiente, em dois cultivos (guas e da seca); b) Analisar a ao de leos essenciais de plantas medicinais sobre espcies do grupo Aspergillus flavus isolados do gro, da vagem e do solo; c) Verificar a qualidade das sementes de amendoim submetidas ao tratamento com leos essenciais e ps provenientes de plantas medicinais. 1.9 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ADEGOKE, G.O. & ODESOLA, B.A. Storage of maize and cowpea and inhibition of microbial agentes of biodeterioration using the powder and essential oil of lemon grass (Cymbopogon citratus). International Biodeterioration and Biodegradation, Essex, v. 37, n.1/2, p. 81-84, 1996. AMER, M.; TAHA, M.; TOSSON, Z. The effect of aqueous garlic extract on the growth of dermatophytes. International Journal of Dermatology, Filadelfia, v. 19, p. 285-287, 1980. ANDERSON, H.W.; NEHRING, E.W.; WICHSER, W.R. Aflatoxin contamination of corn in the field. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Washington, v. 23, n. 4, p. 775-782, 1975. APPLETON, J.A. & TANSEY, M.R. Inhibition of growth of zoopathogenic fungi by garlic extract. Mycologia, Lawrence, v.67, p. 882-885, 1975. AZAIZEH, H.A.; PETTIT, R.E.; SARR, B.A.; PHILLIPS, T.D. Effect of peanut tannin extracts on growth of Aspergillus parasiticus and aflatoxin production. Mycopathologia, Dordrecht, v. 110, p. 125-132, 1990. BACKMAN, P.A. & HAMMOND, J.M. Germination losses associated with delayed application of seed treatment fungicides after peanut shelling. Plant Disease Reporter, Beltsville, v. 60, n. 1, p. 1-3, 1976. BANSAL, R.K. & SOBTI, A.K. Na economic remedy for the control of two species of Aspergillus on groundnut. Indian Phytopathology, Nova Delhi, v. 43, p. 451-452, 1990. BARROS, S.T.; OLIVEIRA, N.T.; MAIA, L.C. Efeito do extrato de alho (Allium sativum) sobre o crescimento micelial e germinao de condios de Curvularia spp. e Alternaria spp. Summa Phytopathologica, Piracicaba, v. 21, n. 2, p. 168-170, 1995. BASTOS, C.N. Inibio do crescimento micelial e germinao de esporos de Crinipellis perniciosa e Phytophthora palmivora por extrato de bulbo de alho (Allium sativum). Fitopatologia Brasileira, Braslia, v. 17, n. 4, p. 454-456, 1992. BASTOS, C.N. Efeito do leo de Piper aduncum sobre Crinipellis perniciosa e outros fungos fitopatognicos. Fitopatologia Brasileira, Braslia, v. 22, n. 3, p. 441-446, set. 1997.

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2 CAPTULO I ISOLAMENTO DE Aspergillus spp. E CARACTERIZAO QUANTO A PRODUO DE AFLATOXINAS

2.1 RESUMO O amendoim uma cultura importante tanto para a alimentao humana quanto animal, principalmente pelo teor de protenas, alm do uso industrial para extrao de leo. Em seus gros ocorre com freqncia a contaminao por aflatoxinas, altamente cancergenas, que so produzidas por fungos do grupo Aspergillus flavus. Associando estes conhecimentos e pela descoberta de que a infestao destes fungos podem ter origem j no campo, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o desenvolvimento destes fungos em amostras de solo, vagens e sementes, em funo da calagem, da secagem e dos momentos de amostragem. Amostras foram feitas num Planossolo durante as 1a e 2a safras de 2001 (cultivo da seca e das guas) e avaliadas no Laboratrio de Anlise de Sementes da UFRRJ, quanto ao potencial de inculo do solo e qualidade sanitria das vagens e sementes. Foi feita a deteco de aflatoxinas nos isolados de Aspergillus flavus, previamente identificados em meio ADM e inoculados em meio YES, atravs da leitura em Cromatografia de Camada Delgada (CCD). A calagem no interferiu na populao de fungos do grupo A. flavus no solo e no preveniu sua contaminao nas vagens e sementes de amendoim, provenientes dos cultivos das guas e da seca. As condies de secagem em ambiente propiciaram menor incidncia de fungos do grupo A. flavus nas vagens provenientes do cultivo das guas e nas sementes provenientes do cultivo da seca. Foi constatado que dos isolados caractersticos do grupo A. flavus, 41 % proveniente do cultivo da seca e 47 % das guas no produziram aflatoxinas. Palavras chaves: amostragem, calagem, secagem.

2.2 ABSTRACT

Peanut is an important crop for human and animal consumption due to its high contents in proteins and oil seed contamination by aflatoxins, a highly cancerous group of substance, produced by fungi belonging to the Aspergillus flavus group is frequent. Considering that infestation of these fungi may start in the field, the objective of this work was to evaluate the development these fungi in pods, kernels and soil samples obtained from plants grown with or without lime, harvested in different times and heat-dried in stove or under room temperature in the dry or rainy season. Populations fungi in soil samples or associated to the kernels and pods, and aflatoxin production potential were evaluated at each harvest. There was no effect of liming on the population of A. Flavus group in the soil samples as well as on pods and seeds grown in the rainy or dry season. Drying conditions under room temperature favores a small fungal incidence of in pods obtained from the rainy season and in seeds from the dry season. . 41% of the isolates obtained from the rainy season and 47% from the rainy season did not produce aflotoxins. Key words: harvest time, lime, drying conditions.

2.3 INTRODUO

A qualidade sanitria da semente de amendoim inicia-se com um manejo adequado pr-colheita, pois dependendo das condies climticas e da cultivar, a contaminao, a colonizao pelo fungo e a subseqente formao de aflatoxinas podem ocorrer no campo, bem antes da maturao (ANDERSON et al., 1975). A avaliao feita por FERNANDEZ et al. (1997) aps a aplicao de calcrio em cultivos de amendoim, permitiu que fosse constatado que sementes com tegumento mais espesso, devido ter sido proveniente de plantas que foram submetidas calagem, podem favorecer a diminuio da incidncia de Aspergillus spp. e da biossntese de aflatoxinas, dependendo do potencial do inculo. Alm disso, constataram que a forma de secagem associada calagem pode reduzir o desenvolvimento do fungo. A temperatura e a umidade do ar parecem ter papel independente na produo de aflatoxinas em milho, cuja infeco ocorre no ambiente areo. No caso do amendoim, os dois fatores agem conjuntamente. Em gros de amendoim no danificados, nem a seca nem a alta temperatura sozinhos favorecem a infeco de gros e o subseqente acumulo de aflatoxinas (HILL et al., 1983; BLANKENSHIP et al., 1984). Em condies de seca, o limite de temperatura na geocarposfera, para formao de aflatoxinas, situa-se entre 25 e 28C, e uma reduo nesta regio, de 29,6 para 25,2C resulta em no formao de aflatoxinas. A colonizao de gros inversamente proporcional maturidade dos gros, sendo maior nos gros cultivados em temperaturas elevadas sob condio de seca. Embora tenha sido observado que mesmo sob condio de irrigao, os gros continuem sem o acmulo de aflatoxinas. No campo, em condio de seca natural, temperatura do solo de 44,6C, tem sido encontradas entre fileiras, sem que haja formao de aflatoxinas, ainda que o fungo cresa nessa temperatura (HILL et al., 1983). O limiar para formao de aflatoxinas fica entre 30 e 40 dias de seca antes da colheita. Esses resultados corroboram com dezenas de observaes de campo, onde concentraes de aflatoxinas so mais altas nos anos secos. Postula-se que, nas condies de seca, alta colonizao de vagens pode estar relacionada eliminao de competidores, como Aspergillus niger, que compete com sucesso com A. flavus em condies de altas temperatura e umidade do solo (HILL et al., 1983; BLANKENSHIP et al., 1984. Outra possvel influncia da umidade reduzida est na diminuio no metabolismo dos gros, aumentando sua suscetibilidade infeco e a colonizao (DHINGRA & COELHO NETTO, 1998). Foi tambm associada a colonizao de gros de amendoim, nas condies de seca, capacidade de biosntese de fitoalexinas, porque estas no foram biossintetizadas quando a aw caiu abaixo de 0,95 (DORNER et al., 1989). O contedo de gua do gro parece ser o fator mais importante no controle da capacidade de produzir fitoalexinas, nos gros imaturos de amendoim. Esse mecanismo natural de resistncia colonizao quebrado sob estresse hdrico (DIENER et al., 1987; DHINGRA & COELHO NETTO, 1998). O objetivo do presente captulo foi avaliar o desenvolvimento de fungos do grupo Aspergillus flavus e a subseqente biossntese de aflatoxinas, em amostras de solo, vagem e sementes de amendoim, em funo da calagem, da secagem e momentos de amostragem, bem como o de isolar estes fungos para posteriores experimentos.

2.4 MATERIAL E MTODOS 2.4.1 Obteno das amostras No Laboratrio de Anlise de Sementes, em 2002, foram analisadas as amostras de solo, vagem e sementes, coletadas no campo, nos experimentos conduzidos com

amendoim cv. Botutat (ZANOTTO, 1993), produzido na 1a e 2a safra de 2001 (cultivo da seca abril a agosto/2001 e cultivo das guas outubro 2001 a janeiro de 2002), num Planassolo, segundo RAMOS et al. (1973). No campo, o delineamento experimental utilizado foi o de blocos ao acaso em parcela subsubdividida, com quatro repeties. Os tratamentos foram constitudos por ausncia (0,0 t/ha) e presena de calcrio dolomtico (23,5% de CaO e 21,5% de Mg0 e 80% de PRNT, que foi aplicado em dezembro de 2000, na concentrao de 1,8 t/ha, para elevar a saturao por bases a 70%), por quatro pocas de amostragem (a partir de 104o dia aps a semeadura - DAS) e, por dois procedimentos de secagem das vagens (em estufa a 30oC e em ambiente, sem controle de temperatura e umidade relativa do ar). As parcelas (presena e ausncia de calcrio) foram constitudas por cinco linhas, espaadas de 0,6 m entre si, com 20 m de comprimento, divididas em quatro subparcelas (pocas de amostragem) de 5 m de comprimento e subdivididas em duas subsubparcelas (procedimento de secagem) de 2,5 m. Foi considerada como rea til na colheita as trs linhas centrais de cada subsubparcela, desprezando-se 0,5 m de cada extremidade, compreendendo uma rea de 4,5 m2. 2.4.2 Avaliao da quantidade de inculo do solo Em cada amostragem, o solo foi coletado junto s razes e frutos de 10 plantas de amendoim, de cada uma das subparcelas. Em seguida, foi colocado para secar ao ambiente por 24 horas. Para a avaliao do teor de gua, aps a secagem, foram pesadas 5 amostras de 10 g, seguindo a metodologia de EMBRAPA (1997). Para isolamento dos fungos existentes no solo, utilizou-se o meio BDA acrescido de 60 g de NaCl diludos em 20 mL de gua destilada (BERJAK, 1984), que foi submetido esterilizao em autoclave por 20 minutos a 120C e suplementado com 1,0 mL de antibitico (estreptomicina + sulfato de neomicina), aps o meio ter esfriado.

Uma amostra de 5 g de solo seco foi suspendida em 15 mL de gua esterilizada contida em Erlenmeyer, seguida de agitao por 15 minutos. Desta suspenso foi retirada uma alquota de 0,5 mL seguindo o processo de diluio em srie 1:10 at a diluio de 10-4. De cada diluio, foram tomadas alquotas de 0,1 mL que foram distribudas em trs placas de Petri (10 cm x 15 mm) contendo o meio BDA+NaCl (6%)+antibitico (0,03%). As placas foram acondicionadas em germinador regulado para 20C e 12 horas de luz por sete dias. Ao final deste perodo foi feita a identificao e a contagem das colnias e a repicagem daquelas identificadas como sendo do grupo Aspergillus flavus para tubos de ensaio contendo o mesmo meio.
2.4.3 Avaliao da qualidade sanitria das vagens e das sementes
Por subsubparcela, as vagens foram divididas em duas amostras de 30 vagens, sendo que uma delas foi tratada com soluo comercial de hipoclorito de sdio (HClO) a 2%, por trs minutos.

A amostra tratada com HClO e a no tratada foram utilizadas para a avaliao da presena de fungos na superfcie das vagens e das sementes, respectivamente. Em

ambos os casos a preparao das placas e seu acondicionamento seguiram o procedimento anterior. Para o primeiro caso, cinco fragmentos, tomados ao acaso, foram distribudos por placa e para o segundo, da amostra tratada com hipoclorito de sdio, 10 sementes foram distribudas por placa. A avaliao foi efetuada aps o perodo de incubao atravs da observao das sementes e dos fragmentos do pericarpo do fruto sob microscpio binocular, sendo feita a contagem de colnias. Cada repetio foi representada por quatro placas (no caso dos fragmentos) e cinco placas (no caso das sementes). As colnias de Aspergillus spp. foram isoladas e repicadas de forma semelhante ao anterior. 2.4.4 Isolamento e identificao Para a confirmao da identificao dos isolados de Aspergillus spp., que foram provenientes de amostras de solo, vagem e semente que estavam mantidos em tubos de ensaio e, para a posterior caracterizao do grupo Aspergillus flavus, foi utilizado o meio ADM, conforme BOTHAST & FENNELL (1974). A identificao dos isolados pertencentes ao grupo Aspergillus flavus foi realizada com base na pigmentao alaranjada, produzida pelo fungo e observada no verso das placas. A caracterizao e identificao das outras espcies do gnero Aspergillus foi realizada com base na taxonomia usada por PITT & HOCKING (1997). Para isto, foi utilizado o meio CYA e confirmada atravs de SINGH et al. (1991). A identificao de outros fungos, tais como, Rhizopus spp., foi baseada em AGRIOS (1997). 2.4.5 Deteco de aflatoxinas produzidas pelos isolados do grupo Aspergillus flavus Primeiramente, os isolados caracterizados como sendo do grupo A. flavus, e mantidos nos tubos de reserva, foram transferidos para outros tubos contendo meio BDA a fim de que todos tivessem a mesma idade. Aps sete dias, estes foram armazenados em leo mineral e mantidos em cmara fria situada no Laboratrio de Anlise de Sementes da UFRRJ. O leo mineral utilizado foi autoclavado (120C/20 min e 24 horas aps 120C/20 min) e seco (170C/2 horas) na estufa, 15 dias antes de ser utilizado. Por ocasio da avaliao da sntese de aflatoxina, os isolados de grupo Aspergillus flavus, foram repicados das culturas com sete dias de crescimento em tubos com BDA, para placas de Petri (10cm x 15mm) contendo meio YES e incubados por trs dias a 25C. Para determinar o potencial dos isolados obtidos produzem aflatoxinas foram utilizadas duas tcnicas. Na de extrao rpida, fragmentos de cultura fngica foram retirados diretamente das placas de Petri com meio YES atravs de uma ala de platina e macerados em cerca de 2 mL de clorofrmio. Em seguida, com auxlio de pipeta de Pasteur, foi retirada uma alquota aproximada de 5 L para aplicao direta em pontos previamente marcados e identificados nas placas de slica-gel (20x20 cm x 0,25 mm). Nestas placas, tambm foram aplicados o padro de aflatoxinas (B1, B2, G1 e G2), nas concentraes de 5 L e de 10 L (Merck 5628). As placas foram mantidas por 15 minutos em cmara de saturao com a fase mvel (clorofrmio:acetona - 9:1). As toxinas foram identificadas por sua fluorescncia em luz ultravioleta de ondas longas (364 nm) e por comparao das amostras com relao as toxinas padres.

A determinao pelo mtodo do carimbo foi realizada atravs de discos de miclio retirados das colnias dos diferentes isolados, por meio de um sacador de rolhas de metal de 0,5 cm de dimetro, colocados diretamente nos pontos previamente marcados na placa de CCD e ali mantidos at que se formasse um crculo mido, quando ento foram retirados. Os padres foram aplicados e a leitura foi realizada da mesma forma que no mtodo de extrao anterior. Estas duas ltimas etapas foram desenvolvidas no Laboratrio de Micologia da EMBRAPA Agroindstria de Alimentos. 2.4.6 Procedimento estatstico Os dados foram submetidos aos testes de Cochran e Bartlet e de Lilliefors para a homogeneidade da varincia e normalidade. Quando no foi observada a homogeneidade e normalidade, os dados foram transformados em arcseno x / 100 , em x + 0,5 , e em log (x) e submetidos a anlise de varincia. As mdias foram comparadas pelo Teste de Tukey, a 5% de probabilidade ou submetidas ao ajuste por regresso polinominal. A seleo da funo que melhor ajustou os dados foi feita com base no coeficiente de determinao. Nas Tabelas esto apresentados os dados originais, sem transformao. 2.5 RESULTADOS E DISCUSSO No houve interao significativa entre pocas de amostragem, calagem e secagem para os fungos do grupo Aspergillus flavus bem como para Rhyzopus spp. nas duas pocas de cultivo. No entanto, houve interao entre secagem e calagem para Rhyzopus spp. nas sementes produzidas na poca da seca, assim como entre poca de amostragem e secagem para fungos do grupo Aspergillus flavus nas sementes do cultivo das guas (Tabelas 1 e 2). No cultivo das guas, as vagens e as sementes de amendoim, obtidas de plantas crescidas em rea com calagem, apresentaram menor contaminao por Rhyzopus spp., independente da secagem (Tabela 3). No entanto, no cultivo da seca, as sementes que foram provenientes de plantas crescidas em rea onde foi aplicado calcrio, apresentaram menor contaminao por estes fungos, quando secas em ambiente, do que em estufa. Alm disso, as vagens secas em ambiente, apresentaram menor contaminao por estes fungos, quando provenientes do tratamento com calagem (Tabela 3). Em relao aos fungos do grupo Aspergillus flavus, no houve diferena quanto contaminao das vagens e das sementes provenientes de plantas crescidas em rea com ou sem calagem, em ambos cultivos (Tabela 3). No entanto, PITT et al. (1991), e FERNANDEZ et al. (1997) constataram que as sementes provenientes de reas que receberam o calcrio apresentaram menor contaminao por Aspergillus spp. do que as no submetidas calagem. As vagens de amendoim produzidas no cultivo das guas, quando foram secas em ambiente, apresentaram maior contaminao por fungos do grupo Aspergillus flavus (Tabela 3), provavelmente devido a esta secagem ter sido mais lenta do que a em estufa, favorecendo o crescimento do fungo. J, as sementes produzidas no cultivo da seca, quando foram secas em estufa, apresentaram maior contaminao pelos fungos do grupo A. flavus (Tabela 3), provavelmente devido ao aparelho estar regulado para 30 C, temperatura mais prxima daquela considerada como tima para o desenvolvimento destes fungos (35-38 C), conforme DHINGRA & COELHO NETTO (1998).

Tabela 1. Quadrado mdio para a porcentagem de fungos em vagens e sementes de amendoim, cultivado em rea com e sem calagem provenientes de plantas colhidas com 104, 114, 124 e 134 DAS, e secas em estufa e ambiente. Avaliao na poca da seca. Seropdica-RJ. 2002. Fontes de Variao GL Calagem (Cal.) Erro (A) poca (p.) p.XCal. Erro (B) Secagem (Sec.) Sc.Xp. Sc.XCal. Sec.Xp.XCal. Resduo C.V. (%) 1 3 3 3 18 1 3 1 3 24 Grupo Aspergillus flavus Vagem Semente 0,0243ns 0,0109ns 0,0216 0,0135 0,1746** 0,0161ns 0,0045ns 0,0003ns 0,0283 0,0130 0,0206ns 0,0755* 0,0212ns 0,0369ns 0,0085ns 0,00003ns 0,0024ns 0,0035ns 0,0296 0,0167 144,63 21,57 Rhyzopus spp. Vagem Semente 0,1025ns 0,1372* 0,0467 0,0187 0,2487** 0,0605ns 0,0499ns 0,0394ns 0,0463 0,0495 0,8946** 0,1133* 0,1402ns 0,0199ns 0,0750ns 0,1718* 0 0484ns 0,0407ns 0,0537 0,0235 80,263 151,65

ns = no significativo; ** significativo a 1 %; * significativo a 5 %

Tabela 2. Quadrado mdio para porcentagem de fungos em vagens e sementes de amendoim cultivado em solo com e sem calagem, provenientes de plantas colhidas aos 104, 114, 124 e 134 DAS e secas em estufa e ambiente. Avaliao na poca das guas. Seropdica-RJ. 2002. Fontes de Variao Calagem Erro (A) poca (p.) p.XCal. Erro (B) Secagem (Sec.) Sec.Xp. Sec.XCal. Sec.Xp.XCal. Resduo C.V. (%) GL 1 3 3 3 18 1 3 1 3 24 Grupo Aspergillus flavus Vagem Semente 0,0001ns 0,0075ns 0,0569 0,0314 0,0628ns 0,0366ns 0,0522ns 0,0550ns 0,0725 0,0287 0,6705** 0,1057ns 0,0263ns 0,1526* 0,0242ns 0,0377ns 0,0602ns 0,0079ns 0,0342 0,0331 42,457 107,71 Rhyzopus spp. Vagem Semente 9,5712** 0,0737* 0,2301 0,0150 0,7926ns 0,0470** 1,4463ns 0,0322* 1,4007 0,0084 1,0635ns 0,0060ns 3,4958ns 0,0214ns 1,8057ns 0,0002ns 1,3213ns 0,0034ns 1,5557 0,0136 132,49 173,44

ns = no significativo; ** significativo a 1 %; * significativo a 5 %

Tabela 3. Dados mdios de porcentagem de fungos em vagens e sementes de amendoim provenientes de solo submetido ou no a aplicao de calcrio e da secagem em estufa e ambiente. Avaliao na poca das guas e da seca. Seropdica-RJ. 2002.
guas Tratam. Aspergillus flavus Vagem C/calagem S/calagem Ambiente Estufa C.V.(%) 37,0A 36,4A 25,8b 47,6a 42,45 Semente 6,8A 5,4A 4,5a 7,7a 107,71 Rhyzopus spp. Vagem 11,1B 26,6A 16,2a 21,4a 132,49 Semente 0,9B 3,6A 1,8a 2,8a 173,44 Aspergillus flavus Vagem 7,8A 10,8A 11,2a 7,4a 144,63 Semente 1,5A* 2,4A 0,7b 3,1a 21,57 Vagem 22,5A 36,7A 41,0a 16,0b 80,26 Seca Rhyzopus spp. Semente Ambiente Estufa 1,3Bb 3,3Aa 12,5Aa 3,1Ba 151,65

*Mdias seguidas das mesmas letras (maisculas para aplicao de calcrio, minsculas para secagem) no diferem entre si ao nvel de 5 % de probabilidade, pelo teste de Tukey.

Avaliando a porcentagem de fungos do grupo A. flavus nas vagens provenientes do cultivo da seca, em funo da poca de amostragem (DAS) (Figura 1), foi constatado aumento da contaminao at 114 DAS. Apartir de 124 DAS, houve uma reduo acentuada, provavelmente em funo da ocorrncia de precipitao pluvial no perodo que antecedeu esta amostragem, favorecendo o desenvolvimento de organismos competidores, como constatado por HILL et al. (1983) e por BLANKENSHIP et al. (1984). A contaminao de Rhyzopus spp. nas vagens provenientes do perodo da seca, principalmente, aps a secagem em estufa, acentuadamente diminuiu com o decorrer das coletas (Figura 2). Entretanto, foi verificado que a precipitao pluvial ocorrida no perodo anterior ao de coleta aos 124 DAS, favoreceu a colonizao do fungo, principalmente nas vagens secas em ambiente, j que estas apresentavam maior teor de gua devido ao processo de secagem ter sido mais lento. Quando foi avaliada a presena de fungos do grupo A. flavus nas sementes de amendoim, provenientes do cultivo das guas, aps a secagem em estufa, foi verificada reduo acentuada da contaminao por estes fungos (Figura 3). PAYNE et al. (1986) verificaram maior contaminao por este fungo em gros de milho em rea com irrigao, onde o alto teor de gua das espigas favoreceu a referida contaminao. Com relao presena de Rhyzopus spp. em sementes de amendoim, obtidas de plantas sem calagem e provenientes do cultivo das guas, foi verificado reduo acentuada da contaminao a partir de 104 DAS. Alm disso houve menor contaminao naquelas oriundas da rea tratada, aos 134 DAS (Figura 4). Para FERNANDEZ et al. (1997), as sementes com maior teor de clcio, fornecido pela calagem do solo, so mais resistentes penetrao deste fungo, assim como de Aspergillus spp. e Penicillium spp., devido ao espessamento das trs camadas do tegumento (exotesta, mesotesta e endotesta) da semente (FERNANDEZ et al., 2000).

20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 104 114 Colheita (DAS) 124 134 %

y = -0,0838x2 + 19,924x - 1165,9 R2 = 1

Figura 1. Porcentagem de fungos do grupo Aspergillus flavus nas vagens de amendoim , em funo da poca de amostragem (DAS), no cultivo da seca .

60 50 40 30 % 20 10 0 104 -10

114

124

134

Colheita (DAS)

y (ambiente) y = -0,0915x2 + 21,173x - 1171,7 R2 = 0,9844 y (estufa) y = 0,033x2 - 8,762x + 587,34 R2 = 0,4055 Figura 2. Porcentagem de Rhizopus nas vagens de amendoim em funo da poca de amostragem (DAS) e do procedimento de secagem, por ocasio da avaliao realizada no cultivo da seca.

14 12 10 % 8 6 4 2 0 104 114 Colheita (DAS) 124 134

y (estufa) = 0,0013x2 - 0,5705x + 57,807 R2 = 0,6534 y (ambiente) = 0,02x2 - 4,38x + 240 R2 = 0,98 Figura 3. Porcentagem de fungos do grupo Aspergillus flavus nas sementes de amendoim, em funo de poca de amostragem (DAS) e procedimento de secagem, por ocasio da avaliao realizada no cultivo das guas.

12 10 8 6 % 4 2 0 104 -2

114 Colheita (DAS)

124

134

y (sem calagem) = 0,026x2 - 6,418x + 395,96 R2 = 0,9674 y (com calagem)= -0,0118x2 + 2,7375x - 155,33 R2 = 0,2724 Figura 4 Porcentagem de Rhizopus spp. em sementes de amendoim, em funo da poca de amostragem (DAS) e da calagem, por ocasio da avaliao do cultivo das guas. No houve interao significativa entre poca de amostragem e calagem para a populao de A. flavus e A. terreus no solo, no cultivo da seca. No entanto, no cultivo

das guas houve efeito da calagem sobre a populao de A. terreus no solo e de poca de amostragem para a populao dos fungos do grupo A. flavus (Tabelas 4 e 5). A populao de fungos do grupo A. flavus no solo, no cultivo das guas, no diferiu em funo da calagem (Tabela 6). J, quando foi avaliada a populao de A. terreus no solo, foi observado aumento desta na rea que recebeu calcrio, em relao que no recebeu. No entanto, no cultivo da seca, no houve diferena entre os tratamentos para a populao deste fungo. Quando foi avaliada a populao fngica, considerando a poca de cultivo, foi observado que a incidncia de fungos do grupo A. flavus nas vagens e a populao destes fungos no solo, foi maior no cultivo das guas do que no da seca, enquanto a incidncia de Rhyzopus spp. nas vagens e nas sementes no diferiu entre as pocas de cultivo, o mesmo ocorrendo com a populao de A. terreus no solo (Tabela 7). Avaliando os 143 isolados obtidos de amostras do solo, de vagem e da semente de amendoim, que apresentaram caractersticas do grupo A. flavus, determinado em meio ADM, aproximadamente 18 % que foram provenientes do cultivo da seca e 8 % provenientes do perodo das guas, so Aspergillus parasiticus, enquanto, aproximadamente 41 % provenientes do perodo da seca e 45 % proveniente do perodo das guas, tanto podem ser A. flavus quanto A. parasiticus, pois, segundo DHINGRA & COELHO NETTO (1998), A. parasiticus produz os quatro tipos de aflatoxinas, enquanto A. flavus s produz B1 e B2. Foi constatado tambm, neste grupo, que aproximadamente, 41 % de isolados provenientes do perodo da seca e 47 % do perodo das guas, no produziram aflatoxinas (Tabela 8). Estes resultados tambm foram obtidos por FARIAS et al. (2000) em milho aps colheita no estado do Paran, evidenciando a variabilidade entre cepas de fungos do grupo A. flavus, quanto ao potencial de biossntese de micotoxinas. Entre os outros grupos de Aspergillus, que foram isolados, nos dois cultivos, em amostras de solo, vagens e sementes, 18 % pertencem ao grupo A. terreus, 21 % ao grupo A. glaucus, 11 % ao grupo A. niger e 13 % no foram identificados (Tabela 9).

Tabela 4. Quadrado mdio para fungos (UFC/g) em amostras de solo, cultivado com amendoim e submetido ou no a aplicao de calcrio, aps as coletas terem sido realizadas aos 104, 114, 124 e 134 DAS. Avaliao na poca da seca. Seropdica-RJ. 2002. Fontes de Variao Calagem Erro (A) poca CalagemXpoca Resduo C.V. (%)
ns = no significativo

GL 1 3 3 3 18

Grupo Aspergillus flavus 3,4775ns 2,1699 7,2537ns 0,4958ns 3,0313 44,54

Grupo Aspergillus terreus 3,1933ns 2,2618 5,2409ns 4,7499ns 4,4212 73,64

Tabela 5. Quadrado mdio para fungos (UFC/g) em amostras de solo, cultivado com amendoim submetido ou no a aplicao de calcrio, aps as coletas terem sido realizadas aos 104, 114, 124 e 134 DAS. Avaliao na poca das guas. Seropdica-RJ. 2002.

Fontes de Variao Calagem Erro (A) poca CalagemXpoca Resduo C.V. (%)

GL 1 3 3 3 18

Aspergillus flavus 1,0388ns 4,0496 18,6076** 5,0814ns 2,6319 25,88

Aspergillus terreus 4,6808** 0,2986 0,6818ns 0,4164ns 1,8386 32,34

ns = no significativo; ** significativo a 1 %

Tabela 6. Dados mdios de fungos (UFC/g de solo) em amostras submetidas ou no a aplicao de calcrio, aps as coletas terem sido realizadas aos 104, 114, 124 e 134 DAS. Avaliao na poca das guas e da seca. Seropdica-RJ. 2002. guas Tratamento Aspergillus Aspergillus terreus flavus Com 38750A* 271500A calagem Sem 37041A 13875B calagem C.V. (%) 25,88 32,34 Seca Aspergillus flavus 191500A 149000A 44,54 Aspergillus terreus 406875A 212750A 73,64

*Mdias seguidas das mesmas letras, na coluna, no diferem entre si ao nvel de 5 % de probabilidade, pelo teste de Tukey.

Tabela 7. Dados mdios de porcentagem de fungos em vagens e sementes de amendoim, e, de UFC de fungos/g de amostra de solo. Avaliao na poca das guas e da seca. Seropdica-RJ. 2002.
Tratamento Aspergillus flavus Vagem poca das guas poca da seca C.V. (%) 36,7A* 8,5B 62,74 Semente 6,1A 1,9A 140,05 Rhyzopus spp. Vagem 18,8A 28,5A 148,41 Semente 2,3A 5,1A 180,85 Aspergillus flavus 42.750A 17.270B 38,54 Solo Aspergillus terreus 46.375A 22.687A 49,86

*Medias seguidas das mesmas letras, na coluna, no diferem entre si ao nvel de 5 % de probabilidade, pelo teste de Tukey.

Tabela 8. Caracterizao pela Cromatografia de Camada Delgada, dos isolados do grupo Aspergillus flavus, que foram identificados inicialmente em meio ADM, segundo a produo de aflatoxinas. Seropdica-RJ. 2002. Perodo Tipos de aflatoxinas
Negativo B1 B1+B2 B1+B2+G1 B1+G1 B1+B2+G1+G2 B1+G1+G2 TOTAL

Seca guas Total

23 41 64

13 14 27

10 25 35

2 2

3 1 4

1 5 6

4 1 5

56 87 143

Tabela 9. Outros grupos de Aspergillus identificados nos isolados das amostras de solo, de vagem e de sementes, obtidas nos perodos de seca e guas de 2001. Seropdica-RJ. 2002. Perodo Seca guas Total Aspergillus terreus 5 13 18 Aspergillus glaucus 1 20 21 Grupo Aspergillus niger 7 4 11 Aspergillus spp. 8 5 13

TOTAL 21 42 63

2.6 CONCLUSES 1. A calagem no interferiu na populao de fungos do grupo Aspergillus flavus no solo e no preveniu sua contaminao nas vagens e sementes do amendoim, provenientes dos cultivos das guas e da seca. 2. As condies de secagem em ambiente propiciaram menor incidncia de fungos do grupo A. flavus nas vagens provenientes do cultivo das guas e nas sementes provenientes do cultivo da seca. 3. Nas colheitas efetuadas aos 114 e 124 DAS, houve maior incidncia de fungos do grupo A. flavus nas vagens provenientes do cultivo da seca. 4. Dos isolados caractersticos do grupo A. flavus, 41 % provenientes do cultivo da seca e 47 % das guas no produziram aflatoxina 2.7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS AGRIOS, G.N. Plant Pathology, 4 ed., San Diego: Academic Press, 1997. 635p. ANDERSON, H.W.; NEHRING, E.W.; WICHSER, W.R. Aflatoxin contamination of corn in the field. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Washington, v. 23, n. 4, p. 775-782, 1975. BERJAK, P. Report of the seed storage committee working group on the effects of storage fungi on seed viability. 1980-1983. Seed Science and Technology, Zurich, v. 12, p. 233-253, 1984. BOTHAST, R.J.; FENNELL, D.I. A medium for rapid identification and enumeration of Aspergillus flavus and related organisms. Mycologia, Lawrence, v. 66, n. 3, p. 365369, 1974. BLANKENSHIP, P.D.; COLE, R.J.; SANDERS, T.H.; HILL, R.A Effect of geocarposphere temperature on pre-harvest colonization of drought-stressed peanut by Aspergillus flavus and subsequent aflatoxin contamination. Mycopathologia, Dordrecht, v. 85, p. 69-74, 1984. DHINGRA, O.D. & COELHO NETTO.R.A. Micotoxinas em gros. Reviso Anual de Patologia de Plantas, Passo Fundo, v. 6, p. 49-101, 1998.

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3 CAPTULO II. AVALIAO DO EFEITO DE LEOS ESSENCIAIS DE PLANTAS MEDICINAIS NO DESENVOLVIMENTO DE Aspergillus spp.

3.1 RESUMO

Diante da propriedade inibitria de leos essenciais vegetais sobre o desenvolvimento miceliano de fungos e da importncia de espcies do grupo Aspergillus flavus, que apresentam potencial para biossntese de aflatoxinas, o presente captulo teve como objetivo avaliar, in vitro, a toxicidade de leos essenciais de vegetais contra fungos do grupo A. flavus, isolados da cultura do amendoim. Primeiramente, foi avaliada a toxicidade de dezessete leos essenciais vegetais no desenvolvimento micelial de dois isolados do grupo A. flavus, em comparao ao fungicida sinttico benomyl e ao solvente utilizado. Posteriormente, foi avaliada a toxicidade de 37 isolados do grupo A. flavus, durante 12 meses, com o emprego dos leos de casca de canela (Cinnamomum zeilanicum Breyn.) e de bulbilho de alho (Allium sativum L.). A maior inibio do desenvolvimento miceliano de A. flavus foi obtida com o emprego dos leos essenciais de casca de canela e de bulbilho de alho, na dose de 2,0 mg/ml de solvente (DMSO+MeOH). O efeito inibitrio dos leos essenciais sobre o crescimento miceliano foi varivel conforme o isolado testado. Palavras chaves: Cinnamomum zeilanicum Breyn., Allium sativum L., leos essenciais, fungicida.

3.2 ABSTRACT Considering the inhibitory property of plant essential oils on the development of fungi, and theimportance of the group Aspergillus flavus with potential for aflatoxin synthesis, this research was conceived to evaluate the effect of essential oils against fungi belonging to the A. flavus group , isolated from peanut crop. The effect of 17 essential oils against two isolates A. flavus-like fungi were tested, in comparison to the synthetic fungicide benomyl.Then the effect of Cinnamomum zeilanicum Breyn. and Allium sativum L. oils were tested in 37 fungi isolates, for 12 months. The highest inhibition on the development of A. flavus was found when cinnamon and garlic essential oils were applied, at the 2,0 mg oil /ml of DMSO: methanol. The essential oils growth inhibitory effects varied with fungi isolate. Key words: Cinnamomum zeilanicum Breyn., Allium sativum L., essential oils, fungicide

3.3 INTRODUO Extratos de plantas medicinais tm sido utilizados intensamente nos ltimos anos em estudos farmacolgicos com resultados favorveis no controle ou na cura de enfermidades, de homens e animais (APPLETON & TANSEY, 1975; LOURIA et al., 1989; URBINA et al., 1993; LEDEZMA et al., 1996; ZOHR et al., 1995; SAN-BLAS et al., 1997). Ainda, trabalhos tm sido realizados visando a sua utilizao no controle de patgenos associados aos gros, indicando um futuro promissor nesta rea (KISHORE et al., 1983; BANKOLE & ADEBANJO, 1995; BELM et al., 1996). Em relao ao controle de Aspergillus, DUBE et al. (1989) trabalharam com leo essencial de manjerico (Ocimum basilicum L.), obtido por hidrodestilao atravs do aparelho de Clevenger, que foi distribudo em placas de Petri com meio Czapek-Dox agar e acetona e que recebeu posteriormente discos de 5 mm de culturas puras de Aspergillus flavus e de A. parasiticus. Os autores constataram completa inibio de crescimento miceliano dos fungos com 1,5 mL/L (ao fungisttica) e atividade fungicida total com 6,0 mL/L. A toxicidade de inibio do miclio de 100 % promovida pelo leo foi conseguida com at 300 dias de estocagem desse leo. J DWIVEDI et al. (1991) trabalhando com leos essenciais de folhas e sementes de algumas plantas, obtidos por hidrodestilao atravs do aparelho de Clevenger, observaram que o leo de sementes de cenoura (Daucus carota L.) a 3.000 g/L inibiu totalmente o crescimento de A. flavus. Tambm BILGRAMI et al. (1992) constataram eficcia do uso de eugenol e de extratos de cebola (Allium cepa L.) e alho (Allium sativum L.) na reduo da produo de aflatoxina por A. flavus, com a inibio de crescimento micelial. Assim como MISHRA & DUBEY (1994) avaliaram a atividade fungitxica de uma srie de leos essenciais, extrados por meio de hidrodestilao de folhas de capimlimo [Cymbopogon citratus (DC) Stapf.], erva-de-So Joo (Ageratum conizoides L.), lima-da-Prsia (Citrus aurantifolia Swing), junpero (Juniperus communis L.), cnhamo-amargo (Eupatorium cannabium L.), alfavaco [Hyptis suaveloens (L.) Poit.], hortel (Mentha viridis L.), pinheiro (Pinus spp.) e galangal (Alpinia carinata), de talos de incenso-indiano (Boswellia serrata), de cascas de tangerina (Citrus reticulata Blanaco) e laranja-doce (Citrus sinensis Osbeck), de rizoma de aafro (Curcuma longa L.), e de raiz de vetiver (Vetiveria zizanioides), sobre Aspergillus flavus. Para os autores, C. citratus apresentou atividade positiva 3.000 ppm, empregando a tcnica de discos de miclio, em meio BDA. Estes autores testaram ainda a atividade fungitxica do citral sobre vrias espcies de Penicillium, de Alternaria, de Fusarium,de Aspergillus e de Botrytis, nas concentraes de 500 ppm (hipotxica), de 1.000 ppm (txica) e de 1.500 ppm (hipertxica) e concluram que houve total inibio de crescimento fngico somente com a concentrao hipertxica. Entretanto, para Aspergillus parasiticus, a concentrao hipotxica promoveu total inibio do fungo. Contudo MAHMOUD (1994), estudando o efeito dos constituintes qumicos de 20 leos essenciais sobre o crescimento de Aspergillus flavus e a produo de aflatoxinas, observaram que citral, citronelal e eugenol impediram o crescimento do fungo e a formao de aflatoxina at os oito dias de incubao. Entretanto, aps 15 dias, houve incremento na produo da toxinas, sendo maior que o controle. Foi verificado por MISHRA et al. (1995) que A. flavus, A. niger e Fusarium oxysporum, isolados de sementes armazenadas de Cicer arietinum e guandu [Cajanos cajan (L.) Millsp.], quando submetidos a ao do leo essencial de rizomas de Nardostachys jatamansi DC e cultivado em meio Czapek-Dox agar, apresentaram inibio total do crescimento micelial (100%) na concentrao de 1,0x103 L/L, demonstrando atividade fungisttica.

Tambm, RAHMAN et al. (1999) conseguiram inibio de A. flavus, cultivado em meio Sabouraud, dextrose, agar (DAS), com a aplicao de leos essenciais, solubilizados em DMSO, de Cuminum cyminum (66,7%) e de Elettaria cardamomum (58,1%). J MOURA & PESSOA (2000), utilizando tintura de alecrim pimenta (Lippia sidoides Cham.), obtiveram resultado de 72% de eficincia contra o crescimento micelial, in vitro, de Aspergillus sp., isolado de sementes de algodo. Alm disso, ALBUQUERQUE et al. (2002), utilizando leo essencial de alecrim da chapada (Lippia gracillis H.B.K.) misturado ao meio BDA, observaram inibio do crescimento micelial de Aspergillus sp., de Geotrichum sp. e de Penicillium sp., capturados do ar em laboratrio de cultura de tecidos. O objetivo do presente captulo foi avaliar a ao de leos essenciais de plantas sobre o crescimento de Aspergillus sp., isolado de amostras de vagens e de sementes de amendoim, e de amostras de solo cultivado com amendoim. 3.4 MATERIAL E MTODOS Os experimentos foram conduzidos nos Laboratrios de Anlise de Sementes e de Patologia de Sementes, da UFRRJ, em 2003. Utilizaram-se leos essenciais de partes de diversas plantas, extrados pelo mtodo do arraste do vapor utilizando-se o aparelho Clevenger, e cedidos pela EMBRAPA Agroindstria de Alimentos. As amostras foram armazenadas em freezer, no perodo de 1986 a 2001. As espcies vegetais de onde foram extrados os leos essenciais esto assim relacionadas: Zingiber officinale Rox. (gengibre), Salvia officinalis L. (slvia), Pimenta officinalis Lindl. (pimenta da Jamaica), Piper nigrum L. (pimenta do Reino), Laurus nobilis L. (louro), Myristica fragrans Boutt. (noz moscada), Origanum vulgare L (organo), Allium sativum L. (alho), Thymus vulgaris L. (tomilho), Cinnamomum zeilanicum Nees (canela), Cymbopogon ciatratus (DC) Stapf. (capim limo), Foeniculum vulgare Mill (funcho), Eugenia caryophyllata Thumb. (cravo da ndia), Origanum majorana L. (manjerona) e Rosmarinus officinalis L. (alecrim). Para avaliao da toxicidade dos leos essenciais foram testados a sua ao contra diferentes isolados do grupo A. flavus, obtidos de sementes de amendoim produzidas na poca da seca de 2001, e preservados em leo mineral por seis meses, em condies de cmara fria. Foram selecionados, conforme mencionado no captulo I, apenas os isolados que apresentaram potencial para biossntese de aflatoxina, identificados atravs da tcnica de cromatografia de camada delgada. Para preparo do inculo, os isolados primeiramente foram cultivados em meio BDA por sete dias, 20 C e sob 12 horas de luz. A partir das culturas, foi efetuada a suspenso dos condios em gua esterilizada e em seguida as respectivas suspenses foram submetidas diluio em srie at a concentrao de 107 condios/mL. 3.4.1 Seleo do padro fungicida e do solvente dos leos essenciais Antes de se proceder avaliao dos leos essenciais foi realizado um ensaio para seleo do padro a ser usado como testemunha. Para tanto, foram avaliados trs fungicidas comerciais, benomyl e chlorothalonyl (0,2 g de p.a/20 mL de gua destilada) e thiran (1,0 g/20 mL de gua destilada). A partir das concentraes iniciais, foram efetuadas as diluies, em srie 1:10, at se atingir a diluio 10-5. Em seguida cada amostra e suas respectivas diluies foram autoclavadas por 20 minutos temperatura de 120 oC.

Para avaliar a sensibilidade dos isolados aos fungicidas e determinar a concentrao ideal para os testes in vitro utilizou-se a tcnica de escavao em placa, conforme Morais (2000). Para tanto foram preparadas placas de Petri (15 cm x 15 mm) contendo meio BDA nas quais foram distribudos uniformemente 300 L de suspenso de condios (107 condios/mL) do isolado T23 do grupo A. flavus, visando a formao de um filme denso de miclio. Logo aps a distribuio da suspenso de condios, foram feitos seis orifcios eqidistantes no meio, atravs de um sacador de metal de 7 mm de dimetro. Nos diferentes orifcios foram adicionados 100 L de suspenso dos diferentes fungicidas e respectivas diluies, em um total de trs repeties por amostra. As placas foram acondicionadas em cmara de crescimento regulada para 20 C e 12 horas de luz por sete dias. Aps este perodo, foram feitas as medies dos halos de inibio formados com auxlio de uma rgua milimetrada. Para confirmar a concentrao ideal de fungicida, foi efetuado um novo ensaio quando foram testadas duas concentraes de benomyl, 0,5 mg/mL e 0,05 mg/mL. Neste ensaio foi utilizada a mesma metodologia anteriormente descrita, porm com o isolado T52 e cinco concentraes diferentes de suspenso de condios, 103 a 107 condios/mL. Em seguida, foi repetido o mesmo procedimento, porm utilizando quatro isolados do grupo A. flavus ( T23, T41, T52 e T63). A fim de selecionar um solvente para a solubilizao dos leos essenciais que fosse incuo para os fungos a serem testados foram comparados quatro tratamentos: DMSO (100 %), Metanol (100 %), DMSO:Metanol (80:20 %), e DMSO:Metanol (50:50 %). Para isto foi utilizada a mesma metologia descrita para os testes com os fungicidas e os isolados do grupo A. flavus (T52 e T63). 3.4.2 Avaliao dos leos essenciais quanto sua toxicidade a Aspergillus flavus Inicialmente, foi avaliada a toxicidade de 17 leos essenciais, extrados das diferentes espcies vegetais anteriormente descritas. Foi utilizado o mtodo de escavao em placa (Morais, 2000) e os isolados T52 e T63 do grupo A. flavus e o mesmo procedimento descrito no item 3.4.1. A concentrao dos diferentes leos essenciais foi ajustada para 2 mg/mL de solvente. Como testemunhas, foram utilizados dois tratamentos, o solvente empregado na solubilizao dos leos essenciais, DMSO+MeOH (50 % v/v), e o fungicida benomyl (0,5 mg/mL de gua destilada), definidos conforme item 3.4.1. O preparo das placas de Petri e demais procedimentos foram semelhantes ao item 3.4.1. A partir dos resultados obtidos no primeiro ensaio, foi realizado um segundo ensaio quando foram testados somente os leos essenciais que proporcionaram halos de inibio maior que 7,0 mm contra pelo menos um dos isolados inicialmente testados. Foi utilizado somente o isolado T52 e a mesma metodologia anteriormente descrita, mtodo de escavao em placa, concentrao de 2 mg de leo por mL de solvente, e as testemunhas compostas pelos dois tratamentos, DMSO+MeOH (50 % v/v) e benomyl (0,5 mg/mL de gua destilada). Aps incubao por sete dias a 20 oC e 12 horas de luz, foi realizada a medio dos halos de inibio formados. A partir do segundo ensaio, foram selecionados dois leos essenciais, o de casca de canela e o de bulbilhos de alho, que foram testados quanto sua toxicidade contra 32 diferentes isolados do grupo A. flavus. Os isolados utilizados foram obtidos a partir de solo, vagem e semente de amendoim cultivado na poca das guas de 2001. Para isto, foi utilizado o mesmo procedimento anteriormente descrito. 3.4.3. Determinao da curva de resposta de Aspergillus flavus a diferentes doses de leos essenciais e de citral

A fim de determinar a concentrao de leo essencial capaz de produzir halo de inibio maior ou igual a 12 mm foram feitos quatro ensaios com diferentes substncias, leo essencial de casca de canela, de Lippia sidoides e de bulbilho de alho, alm do citral. Inicialmente foram testadas diferentes concentraes do leo essencial de casca de canela (2, 4, 6, 8, 10 e 12 mg de leo/mL de solvente) alm de duas testemunhas, DMSO + MeOH (50 % v/v) e benomyl (0,5 mg/mL). Foram utilizados os isolados T18, T52 e T63 do grupo A. flavus e os mesmos procedimentos anteriormente descritos. Neste ensaio, foi avaliada ainda, se a ao do leo essencial era fungicida ou fungisttica. Para tanto, foram retiradas a partir da periferia e do centro de cada halo de inibio, trs amostras de cada, com o auxlio de um estilete flambado. Estas amostras foram transferidas para placas de Petri contendo o meio BDA e em seguida acondicionadas em cmara de crescimento, regulada para 20 oC e 12 horas de luz, por sete dias. Aps este perodo foi realizada observao visual para a presena ou no de crescimento fngico. Em seguida, foram testadas diferentes concentraes do leo essencial de L. sidoides e de citral (2, 4, 6, 8, 10 e 12 mg de leo/mL de solvente) alm de duas testemunhas, DMSO + MeOH (50 % v/v) e benomyl (0,5 mg/mL). Foram utilizados os isolados T2, T24 e T35 do grupo A. flavus e os mesmos procedimentos anteriormente descritos. Posteriormente foram testadas diferentes concentraes dos leos essenciais de casca de canela e de bulbilho de alho (2, 4, 6, 8, 10 e 12 mg de leo/mL de solvente), alm das duas testemunhas, DMSO + MeOH (50 % v/v) e benomyl (0,5 mg/mL). Neste ensaio, foram utilizados os isolados T18, T52 e T63 do grupo A. flavus e os mesmos procedimentos anteriormente descritos. 3.4.4. Avaliao da toxicidade de leo essencial de casca de canela e de bulbilho de alho aps 12 meses de armazenamento. A fim de se verificar a manuteno das propriedades antifngicas com o armazenamento, foi avaliada a toxicidade de leos essenciais de cascas de canela e de bulbilhos de alho armazenados durante 12 meses temperatura de 0 a -3 oC. Para tanto, foi realizado novo ensaio seguindo a mesma metodologia descrita nos itens 3.4.1 e 3.4.2., e os isolados T2, T20, T24, T35 e T55 do grupo A. flavus. Neste ensaio, foi avaliada ainda, se a ao dos leos essenciais era fungicida ou fungisttica. Para tanto, foram retiradas a partir da periferia e do centro de cada halo de inibio, trs amostras de cada, com o auxlio de um estilete flambado. Estas amostras foram transferidas para placas de Petri contendo o meio BDA e em seguida acondicionadas em cmara de crescimento, regulada para 20 oC e 12 horas de luz, por sete dias. Aps este perodo foi realizada observao visual para a presena ou no de crescimento fngico.

3.4.3 Procedimento estatstico Foi adotado para todas as anlises o delineamento inteiramente casualizado com trs repeties. Os dados foram submetidos aos testes de Cochran e Bartlet e de Lilliefors para a homogeneidade da varincia e normalidade. Quando no foi observada a homogeneidade e a normalidade os dados foram transformados em arcseno ( x / 100 ), em x + 0,5 , ou em log (x) e submetidos a anlise de varincia. As mdias foram

comparadas pelo Teste de Tukey e de Scott-Knott, a 5 % de probabilidade ou submetidos ao ajuste por regresso polinominal. A seleo da funo que melhor ajustou os dados foi feita com base no coeficiente de determinao r2. Nas Tabelas esto apresentados os dados originais, sem transformao. 3.5 RESULTADOS E DISCUSSO 3.5.1 Seleo do padro fungicida e do solvente dos leos essenciais Na avaliao da seleo do padro antifngico foi considerado o halo mnimo de inibio de 12 mm de dimetro, de acordo com GUNATILAKA et al. (1994). Assim foram obtidos melhores resultados com benomyl a partir da concentrao de 0,05 mg/mL, ou seja, um halo de 16,8 mm de dimetro (Tabela 10). Tabela 10. Dados mdios de dimetro de halos de inibio (mm) formados pela ao de trs fungicidas em diferentes concentraes sobre isolado do grupo Aspergillus flavus (T23-semente). Seropdica-RJ. 2002. Concentrao (mg/mL) 5.10-1 5.10-2 5.10-3 5.10-4 5.10-5 Fungicidas Chlorothalonyl 10,0 9,7 6,8 0,0 0,0

Benomyl 18,7 16,8 0,0 0,0 0,0

Thiran 10,7 0,0 0,0 0,0 0,0

Na avaliao da eficincia do fungicida selecionado, empregando outro isolado do grupo A. flavus, foi constatado que este apresentou-se mais sensvel ao benomyl, tambm, na concentrao de 0,05 mg/mL, mesmo em sua concentrao (UFC) mais elevada (103 condios/mL), ou seja, um halo de 27,2 mm de dimetro (Tabela 11).

Tabela 11. Dados mdios de dimetros dos halos de inibio (mm) formados pela ao do fungicida benomyl nas duas concentraes testadas sobre isolado do grupo Aspergillus flavus (T52-semente) em diferentes concentraes. Seropdica-RJ. 2002.
Fungo Condios/mL 103 104 105 106 107 Fungicida benomyl 0,5 mg/mL 32,7 34,3 35,2 28,4 26,8 0,05 mg/mL 27,2 23,3 28,8 23,1 23,8

Na avaliao da eficincia do padro selecionado, empregando outros dois isolados, comparados aos isolados anteriores, foi constatado que no houve diferena significativa entre os dimetros dos halos formados e que h possibilidade do emprego da concentrao de 0,05 mg/mL, j que os dimetros dos halos formados nas culturas dos diferentes isolados, no diferiram do apresentado na diluio 0,5 mg/mL e foi sempre acima de 12 mm (Tabelas 12 e 13). Tabela 12. Resumo da anlise de varincia para os dados obtidos pela ao do fungicida benomyl sobre isolados do grupo Aspergillus flavus (T23-semente, T41-solo, T52-semente e T63-semente). Fontes de Variao Isolado (I) Diluio (D) IxD Resduo C.V. (%)
ns = no significativo

GL 3 1 3 16

QM 7,8194ns 18,3750ns 4,3750ns 9,1667ns 11,48

Tabela 13. Dados mdios de dimetros de halos de inibio (mm) formados pela ao do fungicida benomyl sobre diferentes isolados do grupo Aspergillus flavus (T23semente, T41-solo, T52-semente e T63-semente).Seropdica-RJ. 2002.

Concentrao (mg/mL) 5.10 5.10-2 Mdia

-1

Isolados
T23 29,0 27,0 28,0A T41 26,0 25,0 25,0A T52 29,0 25,0 27,0A T63 25,0 24,0 24,0A Mdia 27,0a* 25,0a

*Mdias seguidas pela mesma letra no diferem entre si, a 5 % de probabilidade.

Na avaliao da toxicidade dos solventes em diferentes combinaes sobre dois isolados do grupo A. flavus foi constatado que em ambos isolados no houve formao de halo, indicando que os solventes empregados no foram txicos aos fungos avaliados. No entanto, foi selecionada a combinao DMSO + MeOH (50% v/v), considerando que a mesma tambm foi utilizada por MORAIS (2000), sem apresentar atividade txica para Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici. 3.5.2 Avaliao dos leos essenciais quanto toxicidade Aspergillus flavus Pela Tabela 14 pode-se verificar que no houve interao entre os leos essenciais e os isolados do grupo A. flavus. J pela Tabela 18 fica constatado que houve interao entre os melhores leos essenciais selecionados anteriormente e os isolados do grupo A. flavus. Na seleo dos leos essenciais com poder fungitxico, verificou-se que os leos essenciais de casca de canela e bulbilho de alho, apresentaram maior halo de inibio e por isto, os demais testes foram realizados com os mesmos (Tabelas 15, 16 e 17). Quando foi avaliada a eficincia de inibio do crescimento micelial dos isolados do grupo A. flavus, obtidos de amostras de sementes da cultura do amendoim no cultivo da seca (T52 e T63), atravs da medio do dimetro do halo de inibio, foi constatado que estes fungos tiveram o seu desenvolvimento micelial reduzido pelos leos essenciais de bulbilho de alho e de casca de canela, porm compreendendo valores menores quando comparados com aqueles obtidos pelo fungicida benomyl. Nas

condies em que foram realizados os presentes ensaios, os leos essenciais extrados de pimenta do Reino, louro, noz moscada, organo, tomilho, funcho, cravo da ndia, manjerona e alecrim no apresentaram nenhuma atividade sobre os dois isolados testados, caracterizado pela ausncia de inibio do fungo (Tabela 15). Alm disso, quando foi realizada a segunda avaliao da toxicidade dos leos essenciais selecionados anteriormente, foram confirmados os resultados relacionados a inibio do crescimento do isolado T52 (Tabela 17), podendo inferir que os leos essenciais de alho e de canela contm princpio fungicida, como tambm constatado por BOLKAN et al. (1981), avaliando a toxicidade de extrato de alho sobre Fusarium moniliforme e Rhizoctonia solani. Alm disso, o efeito txico do alho e da canela sobre o crescimento de fungos fitopatognicos tambm tem sido demonstrado em outros trabalhos. Com o emprego de leo essencial de alho, CHALFOUN & CARVALHO (1987) constataram inibio do crescimento micelial de Gibberella seae (Schwl.), Alternaria zinniae Pape e Macrophomina phaseolina (Tass.) Goid. J, com o uso de extrato de alho, foi constatada toxicidade contra Aspergillus flavus (BILGRAMI et al., 1992), Crinipellis perniciosa, Phytophthora palmivora (BASTOS, 1992), Curvularia spp., Alternaria spp. (BARROS et al., 1995) e Colletotrichum gloeosporioides (RIBEIRO & BEDENDO, 1999).

Tabela 14. Resumo da anlise de varincia para os dados obtidos pela ao de leos essenciais sobre isolados do grupo Aspergillus flavus (T52-semente e T63-semente).
Fontes de Variao Substncias (S) Fungos (F) SxF Resduo C.V. (%)
ns = no significativo; ** significativo a 1 %

GL 9 1 9 40

QM 13,5843** 2,9048ns 2,0233ns 1,0222 46,412

Tabela 15. Dimetros dos halos de inibio (mm) formados em isolados do grupo Aspergillus flavus (T52-semente e T63-semente) em funo da atividade de leos essenciais de plantas medicinais (2 mg/mL de solvente), do solvente DMSO+MeOH (50% v/v) e do fungicida benomyl (0,5 mg/mL). Seropdica-RJ. 2003. Nome Vulgar Gengibre Slvia Pimenta da Jamaica Pimenta do Reino Louro Noz moscada Nome Cientfico Zingiber officinale Salviia officinalis Pimenta officinalis Piper nigrum Laurus nobilis Myristica fragans Parte utilizada Rizoma Folha Fruto Fruto Folha Fruto T52 3,7bc* 11,7b 3,3c 0,0c 0,0c 0,0c T63 3,3bc 0,0c 0,0c 0,0c 0,0c 0,0c

Organo Pimenta da Jamaica Alho Tomilho Canela Capim limo Canela Funcho Cravo da ndia Manjerona Alecrim Solvente Benomyl

Origanum vulgare Pimenta officinalis Allium sativum Thymus vulgaris Cinnamomum zeilanicum Cymbopogon citratus Cinnamomum zeilanicum Foeniculum vulgare Eugenia caryophyllata Origanum majorana Rosmarinus officinalis -

Folha Folha Bulbilho Folha Folha Folha Casca Fruto Folha Folha Folha -

0,0c 3,7c 4,3bc 0,0c 7,3bc 3,7c 10,3bc 0,0c 0,0c 0,0c 0,0c 0,0c 35,0a

0,0c 0,0c 11,7bc 0,0c 5,0bc 0,0c 13,0b 0,0c 0,0c 0,0c 0,0c 0,0c 20,3a

*Mdias seguidas da mesma letra no diferem entre si a 5 % de probabilidade.

Tabela 16. Resumo da anlise de varincia para os dados obtidos pela ao de leos essenciais selecionados sobre isolado do grupo Aspergillus flavus (T52-semente), comparados ao solvente e ao fungicida.

Fontes de Variao Substncias Resduo C.V. (%)

ns = no significativo; ** significativo a 1 %

GL 5 30

QM 24,1762** 1,1124 37,050

Tabela 17. Halos mdios obtidos pela ao de leos essenciais com melhores resultados sobre isolado do grupo Aspergillus flavus (T52-semente), comparados ao solvente e ao fungicida. Seropdica-RJ. 2002. Produto Slvia Alho Folha de canela Casca de canela DMSO+MeOH (50% v/v) Benomyl Dosagem (mg/ml) 2,0 2,0 2,0 2,0 1,0 0,5 Mdia 5,2cd* 8,8bc 4,0cd 13,3b 0,0d 40,0a

*Mdias seguidas da mesma letra no diferem entre si a 5 % de probabilidade

Pela Tabela 18 pode ser observado que houve diferena significativa de ao dos leos essenciais de bulbilho de alho e casca de canela sobre 32 diferentes isolados do grupo A. flavus. Tabela 18. Resumo da anlise de varincia obtida pela ao de leos essenciais de alho e de casca de canela sobre 32 isolados do grupo Aspergillus flavus. Fontes de Variao Substncia Isolado SxI Resduo C.V. (%)
** significativo a 1 %

GL 1 31 31 128

QM 0,01405** 0,00030** 0,00017** 0,000016 2,1367

Tabela 19. Dimetros mdios dos halos de inibio (mm) formados em isolados do grupo Aspergillus flavus em funo da atividade dos leos essenciais de alho e de canela. Seropdica-RJ.2003.

Isolados
Y27 Y82 Y62

Origem Semente Semente Solo

leo Essencial Alho 12,0Bc* 12,0Bc 10,0Bd

Canela 22,0Aa 20,0Aa 20,0Aa

Y75 Y11 Y5 Y48 Y10 Y19 Y8 Y43 Y36 Y100 Y67 Y29 Y52 Y59 Y13 Y113 Y12 Y54 Y128 Y66 Y88 Y50 Y65 Y111 Y80 Y73 Y99 Y104 Y130

Vagem Solo Solo Vagem Solo Solo Solo Semente Vagem Vagem Solo Semente Semente Solo Solo Solo Solo Vagem Semente Solo Vagem Vagem Solo Solo Semente Vagem Semente Solo Semente

9,0Bd 7,0Be 13,0Bb 12,0Bc 12,0Bc 12,0Bc 11,0Bc 10,0Bd 10,0Bd 15,0Aa 12,0Bc 11,0Bc 11,0Bc 11,0Bc 10,0Bd 10,0Bd 10,0Bd 10,0Bd 7,0Be 12,0Bc 10,0Bd 10,0Bd 10,0Bd 12,0Ac 12,0Ac 11,0Ac 10,0Ad 10,0Ad 7,0Be

20,0Aa 20,0Aa 19,0Aa 18,0Ab 17,0Ab 17,0Ab 17,0Ab 17,0Ab 17,0Ab 16,0Ab 15,0Ac 15,0Ac 15,0Ac 15,0Ac 15,0Ac 15,0Ac 15,0Ac 15,0Ac 15,0Ac 14,0Ac 14,0Ac 13,0Ac 13,0Ac 12,0Ad 12,0Ad 11,0Ad 10,0Ae 10,0Ae 10,0Ae

*Mdias seguidas da mesma letra no diferem entre si a 5 % de probabilidade, pelo teste de Scott-Knott

Foi observado, em geral, maior toxicidade do leo essencial de casca de canela que do de bulbilhos de alho, expresso pelos significativamente maiores halos de inibio promovido pelo primeiro em relao ao segundo para a maioria dos isolados testados. Foi observado, ainda, resposta diferencial dos isolados quanto sensibilidade aos dois leos essenciais testados, detectada pelo teste de Scott-Knott (Tabela 19). O leo essencial de alho proporcionou halos de inibio que variaram entre 7,0 e 15,0 mm, sendo, porm maior que 12,0 mm, considerado por GUNATILAKA et al. (1994), como ideal para testes in vitro, para 34 % dos isolados. J o leo essencial de canela proporcionou halos de inibio entre 10,0 e 22,0 mm, porm com halos maiores que 12,0 mm para 87 % dos isolados testados. Tambm, WILSON et al. (1997) constataram que o extrato do gnero Allium e o leo essencial de C. zeilanicum demonstraram a maior atividade antifngica sobre B. cinrea, em relao aos demais extratos e leos essenciais testados.

3.5.3 Determinao da curva de resposta de Aspergillus flavus a diferentes doses de leos essenciais e de citral Pela Tabela 20 pode-se verificar que houve interao significativa entre os isolados e substncias, assim como entre isolados e a dose do leo essencial. Houve aumento do dimetro do halo com o aumento da dose testada, nos isolados T52 e T63, o entanto para o isolado T18, a partir de 8 mg/mL de solvente houve reduo no dimetro dos halos. Alm disso, o isolado T63 foi o mais sensvel ao do leo (Figura 5).

Tabela 20. Resumo da anlise de varincia para os dados obtidos pela ao do leo de canela e do fungicida benomyl sobre fungos do grupo Aspergillus flavus (T18-semente, T52-semente e T63-semente).
Fontes de Variao Substncia Isolado Dose Linear r-sqrt = Quadrtico cbico Independente Isolado x Substncia Isolado x Dose Resduo C.V. (%) ns = no significativo; ** significativo a 1% GL 1 2 5 1 1 1 2 2 10 42 QM 533,3360** 158,7960** 98,5070** 373,3730** 115,1120** 0,3860ns 1,8320ns 43,6850** 12,8190** 0,9841

40 35 30 25 20 15 10 5 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
ISOLADO T18 Y = 14,7 + 2,75**X -0,183**X
2

Dimetro do halo (mm)

R2 = 0,85* R2 = 0,99** R2 = 0,99**

ISOLADO T 52 Y = 10,5 +2,87**X -0,124**X

2 2

ISOLADO T 63 Y = 16,3 +2,84**X -0,132**X Benomyl Isolado T 18 Benomyl Isolado T 52 Benomyl Isolado T 63

Concentrao do leo (mg/ml)

Figura 5 Dimetro de halo de inibio formado em isolados do grupo Aspergillus flavus (T18-semente, T52-semente e T63-semente), em mm, em funo de diferentes concentraes de leo essencial de casca de canela e do fungicida benomyl. Pela Tabela 21, pode ser verificado que no houve interao entre o leo essencial de Lippia sidoides e citral e os isolados de A. flavus testados. Avaliando a ao do leo essencial de Lippia sidoides, em doses crescentes, sobre diferentes isolados do grupo A. flavus, foram observadas variaes no comportamento de cada isolado mas todos em torno de uma faixa compreendida entre 5 e 35mm (Figura 6). Tambm, quando foi avaliada a ao do citral, foi constatado que a resposta a esta substncia pelos diferentes isolados foi semelhante ao leo essencial de Lippia sidoides (Figura 7). Tabela 21. Resumo da anlise de varincia para os dados obtidos pela ao do leo essencial de Lippia sidoides e do citral sobre isolados do grupo Aspergillus flavus (T2solo, T24-semente e T35-vagem)
Fontes de Variao Substncia Isolado Dose Substncia x Isolado Substncia x Dose Isolado x Dose Substncia x Isolado x Dose Resduo C.V. (%) ns = no significativo; ** significativo a 1% GL 1 2 5 2 5 10 10 72 QM 996,1481ns 12,5093** 158,3315ns 37,3981ns 148,2370ns 95,8398ns 84,5120ns 1,7083ns 6,33

40 35 30 Isolado T 2 Isolado T 24 Isolado T 35 leo de Lippia sidoides

Dimetro do halo (mm)

25 20 15 10 5 0 2 4 6 8 10 12

Concentrao do leo (mg/ml)

Figura 6 Dimetro de halo de inibio formado em isolados do grupo Aspergillus flavus (T2, T24 e T35), em mm, em funo de diferentes concentraes de leo essencial de Lipia sidoides.

40 35 30 25 20 15 10 5 0 2 4 6 8 10 12 Isolado T 2 Isolado T 24 Isolado T 35 leo de Citral

Dimetro do halo (mm)

Concentrao do leo (mg/ml)

Figura 7 Dimetro de halo de inibio formado em isolados do grupo Aspergillus flavus (T2-solo, T24-semente e T35-vagem), em mm, em funo de diferentes concentraes de citral.

Pela Tabela 22 foi constatado que houve interao entre isolado e substncia, no ocorrendo entre isolado e dose. Quando foi avaliada a curva de resposta dos isolados de A. flavus a diferentes doses do leo essencial de alho, foi verificado que no houve resposta diferenciada dos isolados s diferentes doses e, registrando-se um halo mdio prximo a 10 mm de dimetro (Figura 8). Este resultado sugere que o leo de alho, aps longo tempo de armazenamento, pode ter sua caracterstica fungicida reduzida (pois os isolados foram diferentes). J, ao avaliar a ao do leo de canela, foi constatado que as diferentes doses no alteraram as respostas dos isolados, tendo-se porm observado uma maior sensibiolidade o isolado T63 (Figura 9), constatada pelo maior halo de inibio formado (ao redor de 15,0 mm). Ao se comparar as Figuras 5 e 9 fica constatado que a diferena de ao do leo de canela sobre os mesmos isolados deve estar relacionada ao tempo de armazenamento deste leo ou a diferenas de comportamento dos isolados. Isto ainda pode justificar a baixa atividade fungicida do leo de canela, avaliada nos isolamentos realizados a partir dos halos formados pela ao deste leo sobre os isolados (Tabela 23). Tabela 22. Resumo da anlise de varincia para os dados obtidos pela ao do leo essencial de alho e do fungicida benomyl sobre ilsolados do grupo Aspergillus flavus (T52-semente, T18-sememte e T63-sememte).
Fontes de Variao GL QM

Substncia Isolado Dose Isolado x Substncia Isolado x Dose Substncia x Dose Isolado x Substncia x Dose Resduo C.V. (%) ns = no significativo; ** significativo a 1 %

2 2 5 4 10 5 10 129

4970,5110** 257,1340** 1,2180ns 91,7990** 0,8410ns 2,4240ns 0,2700ns 2,0412

40 35 30 25 20 15 10 5 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Isolado T 52 Isolado T 18 Isolado T 63 Benomyl isolado T52 Benomyl isolado T18 Benomyl isolado T63
leo de Alho

Dimetro do halo (mm)

Concentrao do leo (mg/ml)

Figura 8 Dimetro de halo de inibio formado em isolados do grupo Aspergillus flavus T52-semente, T18-semente e T63-semente), em mm, em funo de diferentes concentraes de leo essencial de alho e do fungicida benomyl.

40 35 30 Isolado T 52 Isolado T 18 Isolado T 63 Benomyl isolado T52 Benomyl isolado T18 Benomyl isolado T63
leo de Canela

Dimetro do halo (mm)

25 20 15 10 5 0 0

10

12

14

16

18

20

Concentrao do leo (mg/ml)

Figura 9 Dimetro de halo de inibio formado em isolados do grupo Aspergillus flavus (T52-semente, T18-semente e T63-semente), em mm, em funo de diferentes concentraes de leo essencial de canela e do fungicida benomyl.

Tabela 23. Avaliao da atividade do leo essencial de casca de canela nas concentraes de 2, 4, 6, 8, 10 e 12 mg/mL do solvente sobre fungos do grupo Aspergillus flavus (T18-semente, T52-semente e T63-semente), na concentrao de 107 condios/mL. Seropdica-RJ. 2003. Extrato T18 T52 T63

(mg) 2 4 6 8 10 12

1 + -

2 + -

3 + -

4 + -

1 + -

2 -

3 -

4 -

1 + + -

2 -

3 -

4 -

+ crescimento fngico; - no houve crescimento fngico

3.5.4 Avaliao da toxicidade de leo essencial de casca de canela e de bulbilho de alho aps 12 meses de armazenamento Pela Tabela 24 pode ser verificado que aps 12 meses de armazenamento dos leos essenciais de bulbilho de alho e casca de canela, ainda houve interao significativa entre a ao destes leos e os isolados do grupo A. flavus. Aps 12 meses de armazenamento dos leos essenciais, foi constatado maior dimetro dos halos de inibio do desenvolvimento micelial dos fungos do grupo A. flavus isolados da cultura do amendoim do cultivo da seca, de amostras de solo (T2), de sementes (T20) e do pericarpo dos frutos (T55), quando foi empregado o leo de casca de canela do que o de bulbilho de alho (Tabela 25). Alm disso, quando foi aplicado o leo de casca de canela foi observado maior dimetro de halo na cultura dos fungos do grupo A. flavus, isolado de solo (T2). J, quando foi empregado o leo de alho, no foi constatada diferena estatstica entre os halos formados nas culturas dos fungos. Quando foi realizado o isolamento, foi observado que dos pontos retirados prximos ao centro dos halos, somente no houve crescimento de fungo do grupo A. flavus, isolado de amostras de solo (T2) quando foi empregado o leo de casca de canela. Para os demais, houve crescimento micelial dos fungos, isolados da cultura do amendoim no cultivo da seca, inclusive nos pontos perifricos dos halos (Tabela 26). Estes resultados demonstram que nas condies em que os experimentos foram conduzidos, os extratos podem estar perdendo sua validade como fungicida aps 12 meses de armazenamento, embora os isolados tenham sido diferentes (Tabela 27). Ou ainda, que no houve reduo da produo de condios, com o emprego dos leos essenciais, como constatado por RIBEIRO & BEDENDO (1999). Para MISHRA & DUBEY (1994), o potencial antifngico por longa durao facilita o isolamento futuro dos componentes dos leos. Pelos resultados obtidos, pode-se concluir que a maior inibio relativa in vitro do desenvolvimento micelial de A. flavus foi obtida com o emprego dos leos essenciais de casca de canela e de bulbilho de alho, na dose de 2,0 mg/mL de solvente (DMSO+MeOH), podendo ser apontado como alternativa potencial no controle destes fungos. O efeito inibitrio dos leos essenciais sobre o crescimento micelial foi varivel conforme o fungo testado. Tabela 24. Resumo da anlise de varincia para os dados obtidos pela ao dos leos essenciais de alho e casca de canela sobre isolados do grupo Aspergillus flavus (T2-solo, T20-semente, T24-semente, T35-vagem e T55-vagem) aps 12 meses de armazenamento. Fontes de Variao GL QM

Isolado 4 0,3494ns Substncia 1 8,1640** IxS 4 0,7819* Resduo 30 0,2313 C.V. (%) 13,865 ns = no significativo; * significativo a 5 %; ** significativo a 1 %

Tabela 25. Dimetros dos halos mdios de inibio (mm) formados em isolados do grupo Aspergillus flavus (T2, T20, T24, T35 e T55), em funo da atividade dos leos essenciais de alho e casca de canela, aps 12 meses de armazenamento. SeropdicaRJ.2003. Culturas T2 T20 T24 T35 T55 Origem solo semente semente vagem vagem leo de alho 8,0Ba* 8,3Ba 9,5Aa 12,0Aa 8,0Ba leo de casca de canela 20,0Aa 15,8Aab 9,5Ab 14,6Aab 15,0Aab

*Mdias seguidas da mesma letra no diferem entre si a 5 % de probabilidade

Tabela 26. Avaliao da atividade dos leos essenciais de alho e de casca de canela sobre isolados do grupo Aspergillus flavus (T2, T20. T24, T35 e T55), aps 12 meses de armazenamento destes leos. Seropdica-RJ. 2003. Isolados T2 T20 T24 T35 T55 leo de alho Centro halo Periferia halo fungisttico fungisttico fungisttico fungisttico fungisttico fungisttico fungisttico fungisttico fungisttico fungisttico leo de casca de canela Centro halo Periferia halo fungicida fungisttico fungisttico fungisttico fungisttico fungisttico fungisttico fungisttico fungisttico fungisttico

Tabela 27. Avaliao comparativa em porcentagem da atividade do leo essencial de casca de canela, sobre a ocorrncia de isolados do grupo Aspergillus flavus (T18, T52, T63), avaliadas em 10/2002, e isolados (T2, T20, T24, T35, T55), avaliadas em 07/2003, aps 12 meses de armazenamento do leo essencial. Seropdica-RJ. 2003.

Local de isolamento
Centro do halo Periferia do halo

T18 58 100

T52 17 100

T63 8 100

T2 0 100

Culturas T20 100 100

T24 100 100

T35 100 100

T55 100 100

3.6 CONCLUSES 1. A maior inibio do desenvolvimento miceliano de Aspergillus flavus foi obtida com o emprego dos leos essenciais de casca de canela e de bulbilho de alho. 2. O efeito inibitrio dos leos essenciais sobre o crescimento micelial foi varivel conforme o isolado testado.

3.7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ALBUQUERQUE, C. de C.; CMARA, T.R.; MENEZES, M.; SILVA, S.I.; CARVALHO, J.S.B.; ULISSES, C. Avaliao da ao antifngica dos leos essenciais de Lippia gracillis e Lippia thymoides. In: Congresso Nacional de Botnica, 53, Reunio Nordestina de Botnica, 25, 2002, Recife. Resumos. Recife-PE: UFRP/UFP, 2002. p. 39. ANDERSON, H.W.; NEHRING, E.W.; WICHSER, W.R. Aflatoxin contamination of corn in the field. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Washington, v. 23, n. 4, p. 775-782, 1975. APPLETON, J.A. & TANSEY, M.R. Inhibition of growth of zoopathogenic fungi by garlic extract. Mycologia, Lawrence, v.67, p. 882-885, 1975. BANKOLE, S.A. & ADEBANJO, A. Inhibition of growth of some plant pathogenic fungi using some Nigerian plants. International Journal of Tropical Plant Deseases, Nova Delhi, v. 13, n. 1, p. 91-95, 1995. BARROS, S.T.; OLIVEIRA, N.T.; MAIA, L.C. Efeito do extrato de alho (Allium sativum) sobre o crescimento micelial e germinao de condios de Curvularia spp. e Alternaria spp. Summa Phytopathologica, Piracicaba, v. 21, n. 2, p. 168-170, 1995. BASTOS, C.N. Inibio do crescimento micelial e germinao de esporos de Crinipellis perniciosa e Phytophthora palmivora por extrato de bulbo de alho (Allium sativum). Fitopatologia Brasileira, Braslia, v. 17, n. 4, p. 454-456, 1992. BELM, L.F.; ARAJO, E.; LIMA, E.O. Estudo da atividade in vitro de produtos vegetais contra fungos de armazenamento isolados de sementes de Vigna unguiculata, Zea mays e Arachis hipogaea. In: Simpsio de Plantas Medicinais do Brasil, 14, 1996, Florianpolis. Resumos. Florianpolis-SC: UFSC, 1996. p. 32.

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4 CAPTLO III QUALIDADE FISIOLGICA DE SEMENTES DE AMENDOIM INFLUENCIADAS PELOS PRODUTOS DE ORIGEM VEGETAL

4.1 RESUMO O objetivo do presente trabalho foi avaliar a qualidade fisiolgica das sementes de amendoim da cultivar Tatu, tratadas com fungicidas sintticos e leos essenciais de plantas. Utilizou-se os fungicidas captan e benomyl alm dos leos essenciais de bulbilho de alho e casca de canela, dissolvidos em solventes orgnicos, bem como estes produtos naturais na forma de p e o leo essencial do capim limo. Foi verificado que as sementes embebidas em metanol, etanol e DMSO+MeOH apresentaram reduo acentuada da germinao e do vigor.Os produtos a base de p de alho e de canela e o fungicida captan favoreceram a germinao e o vigor das sementes e reduziram as plntulas infeccionadas. Palavras chaves: tratamento de sementes, fungicidas, leos essenciais, germinao, vigor.

4.2 ABSTRACT Physiological quality of peanut seeds as influenced by plant essential oils.

The objective of this work was to evaluate the effects of the synthetic fungicide and essential oils on the physiological quality of peanut (Arachis hypogaea L.) seeds cv. Tatu, that were stored for 12 months in drought chamber. There were comparator of the synthetic fungicide (captan and benomyl) and the garlic (Allium sativa L.) and the cinnamon (Cinnamomun zeilanicum Breyn.) essential oil, that were dissolved in the solvents and the powder products. It can conclude by the result that the seeds that were embebed in methanol, ethanol and DMSO+MeOH shawed reductuor the peanut seeds germination and vigour. The garlic and cinnamon powder and captan favored the peanut seeds germination and the vigor, as promoted the infected seedlings reduction. Key words: seed treatment, fungicides, essential oils, germination, vigor.

4.3 INTRODUO

OS DANOS DECORRENTES DA ASSOCIAO DE PATGENOS COM SEMENTES NO SE LIMITAM APENAS A PERDAS DIRETAS DE POPULAES DE PLANTAS NO CAMPO. PARA GRANDE NMERO DE DOENAS DE NATUREZA DEVASTADORA, AS SEMENTES PORTADORAS DE SEUS AGENTES CAUSAIS CONSTITUEM-SE A NICA FORMA DE DISSEMINAO E DE PERPETUAO NA NATUREZA. DENTRE OS AGENTES PATOGNICOS QUE PODEM ASSOCIAR-SE S SEMENTES DE PLANTAS, OS FUNGOS FORMAM O MAIOR GRUPO (MACHADO, 2000).

EM SEMENTES DE AMENDOIM, O TRATAMENTO QUMICO CONSTITUI UMA MANEIRA EFICIENTE NO CONTROLE DE INMEROS PATGENOS PRESENTES NA SEMENTE E NO SOLO (MORAES & MARIOTTO, 1985; BANSAL & SOBTI, 1988; RAO ET AL., 1996; VANZOLINI ET AL., 2000). OS PRODUTOS THIRAN, CAPTAN, CHLORONEB, CARBOXIN, CAPTAFOL E BENOMYL, APLICADOS EM FORMULAES E DOSAGENS DIVERSAS, REDUZIRAM DE FORMA VARIVEL E EFICIENTE A INCIDNCIA DE FUNGOS NESTAS SEMENTES (MORAES & MARIOTTO, 1985). ALM DISSO, A APLICAO DE FUNGICIDAS SINTTICOS RESULTOU TAMBM NA ELEVAO DA GERMINAO, CONFORME FOI VERIFICADO PARA OS PRODUTOS CAPTAN, CARBENDAZIN E CAPTAFOL (TANAKA & CORRA, 1981; RAO ET AL., 1996). NO ENTANTO, TAMBM TM SIDO CONDUZIDAS PESQUISAS COM RESULTADOS PROMISSORES EMPREGANDO PRODUTOS NATURAIS PARA CONTROLE DE PATGENOS ASSOCIADOS S SEMENTES (MORAES & MARIOTTO, 1985). ASSIM SENDO, BANSAL & SOBTI (1990) OBTIVERAM RESULTADOS FAVORVEIS NO CONTROLE DE ASPERGILLUS NIGER E A. FLAVUS EM SEMENTES DE AMENDOIM, COM O USO DE EXTRATO DE FOLHA DE NEEM (AZADIRACHTA INDICA A. JUSS), NO DIFERINDO DOS OBTIDOS COM OS FUNGICIDAS THIRAN E DITHANE M-45, ALM DE AUMENTAR A GERMINAO E REDUZIR A PORCENTAGEM DE SEMENTES DETERIORADAS. Foi verificado por FERRACINI et al. (1990) que extratos de erva-de-Santa Maria (Chenopodium ambrosioides L.), Cimaba cedron, simaruba (Simarouba amara Aube.), qussia (Quassia spp.), Pterocaulon balansae e cinamomo (Melia azedarach L.), inibiram, in vitro, os fungos Fusarium solani f. sp. phaseoli, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum e Sclerotium rolfsii. Alm disso, a incorporao de folhas de C. ambrosioides no solo promoveu o controle do tombamento de plntulas de feijoeiro causado por R. solani. Aps a verificao, in vitro, da eficincia do leo essencial de capim limo [Cymbopogon citratus (DC) Stapf.] no controle (100 %) de Aspergillus flavus, MISHRA & DUBEY (1994) avaliaram a fitotoxicidade do citral, componente presente em maior concentrao no leo essencial do capim limo. Para estes autores, no houve efeito deste na germinao de sementes e no crescimento das plntulas de trigo e arroz. Gros de trigo tratados por 24 horas com os leos essenciais de organo (Origanum vulgare L.) (2,0 L/litro) e de tomilho (Thymus vulgaris L.) (4,0 L/litro) apresentaram inibio do crescimento de Aspergillus spp. (PASTER et al., 1995). Estes mesmos autores verificaram, entretanto, que perodos superiores a 24 horas, proporcionaram reduo da capacidade germinativa, quando foi avaliada ao no material a ser utilizado como semente. Tambm em sementes de feijo e de milho tratadas com leo essencial ou com o p do capim limo [Cymbopogon citratus (DC) Stapf.] e armazenados por 10 dias, ADEGOKE & ODESOLA (1996) observaram que estas sementes no apresentaram deteriorao fsica, alterao no odor e na colorao, assim como crescimento de Aspergillus flavus, enquanto o mesmo no foi observado na amostra controle (no tratadas). Os leos essenciais de onze plantas foram estudados para controle de A. flavus em milho, tendo sido alcanada a inibio total de desenvolvimento do fungo por canela (Cinnamomum zeilanicum Breyn.), hortel pimenta (Mentha piperita L.), manjerico (Ocimum basilicum L.), organo (Origanum vulgare L.), Teloxys ambrosioides, cravo da ndia [Syzygium aromaticum (l.) Nerril.] e tomilho (Thymus vulgaris L.), alm de no haver efeito fitotxico na germinao e desenvolvimento das plntulas (MONTESBELMONT & CARVAJAL, 1998). Tambm COUTINHO et al. (1999) verificaram que extratos hidroalcolicos de cascas secas de cajueiro (Anacardium occidentale L.) e de aroeira (Astronium urundeuva Engl.) utilizados no tratamento de sementes de feijo carioca, exerceram um controle parcial dos fungos encontrados. Entretanto, para Aspergillus flavus, o extrato de aroeira promoveu acima de 90 % de controle. Todavia, interferiram negativamente no processo de germinao das sementes, provavelmente, pela ao do solvente etanol, conforme verificado por PURCHIO & MUCHOVEJ (1990). Foi observada por MORAIS (2000) atividade fungisttica de leo de copaba (Copaifera spp.) e de leo de sucupira (Pterodon ermaginatus Vogel) sobre Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, ao tratar sementes de tomate, sem causar efeito txico s mesmas. J, GABRIEL et al. (2002), usando um novo anlogo do estrigol, derivado do safrol, constataram que alm de no afetar a germinao de sementes de alface, ainda estimulou a germinao das invasoras corriola [Ipomoea grandifolia (Dammer) O' Don sinnimo de I. triloba L.] e pico preto (Bidens pilosa L.), demonstrando potencial para seu uso no estmulo germinao precoce das invasoras antes do plantio. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a qualidade fisiolgica das sementes de amendoim, da cultivar Tatu, tratadas com leos essenciais de bulbilho de alho e de casca de canela com comprovada ao fungisttica, comparado com fungicidas sintticos e o p das mesmas partes destas plantas.

4.4 MATERIAL E MTODOS Foram conduzidos seis experimentos no Laboratrio de Anlise de Sementes da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, em 2003, utilizando sementes de amendoim do cultivar Tatu, fornecidas pela COPLANA, situada no municpio de Guaba/SP. Primeiramente, testou-se o efeito dos leos de canela e de alho sobre a germinao e o vigor das sementes de amendoim. Para tanto, as sementes foram imersas ou no em leos essenciais de bulbilho de alho (2 mg/mL de solvente) e de casca de canela (2 mg/mL de solvente) e em gua destilada. Em seguida, amostras de 25 sementes foram distribudas em caixas plsticas tipo gerbox, sobre trs folhas de papel germitest umedecidas com gua destilada e esterilizadas. A incubao foi realizada a 25 0 C por 7 dias, sob 12 horas de luz.

Para testar o efeito dos tratamentos a base de leo mineral extrado de alho e de canela e diludo em solvente (DMSO+MeOH 50 % v/v) sobre a germinao e o vigor das sementes de amendoim, realizou-se o primeiro experimento. Foram comparados captan (3 kg de p.a./kg de sementes) e benomyl diludo em gua (0,2 g/20 mL) e benomyl diludo em solvente (0,2 g/20 mL) e leo essencial de alho e leo essencial de casca de canela, ambos em duas doses (1 e 2 mg/mL de solvente), alm de duas testemunhas com embebio em gua destilada e em solvente (DMSO + MeOH 50 % v/v). O procedimento de embebio foi realizado por cinco minutos, usando 20 mL de cada soluo ou gua destilada para cada lote de 25 sementes. Em seguida, estas sementes foram submetidas ao teste de germinao, em substrato de papel. Para isto, subamostras de 25 sementes foram distribudas sobre trs folhas de papel germitest umedecido com gua destilada e esterilizada no volume de 2,5 vezes o peso do substrato. Aps a confeco dos rolos, estes foram mantidos a 25 0C. As avaliaes foram realizadas aps 5 e 10 dias da instalao, com base em BRASIL (1992). Das plntulas normais foram removidos os cotildones, e em seguida estas foram colocadas para secar por 24 horas, a 80 0C, com base em NAKAGAWA (1999). O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, com quatro repeties. Para verificar as causas de queda de germinao, realizou-se o segundo experimento, no qual as sementes foram submetidas aos seguintes tratamentos: leos essenciais de alho e de casca de canela (2 mg/mL de solvente), duas testemunhas com embebio em gua destilada e em solvente (DMSO + MeOH 50 % v/v) e uma testemunha sem embebio. O procedimento de embebio foi realizado conforme anterior. Em seguida, estas sementes foram submetidas ao teste de germinao, em substrato de areia. Para isto, subamostras de 10 sementes foram distribudas em caixas plsticas contendo areia, umedecidas com 17 mL de gua/100 g de areia. As caixas foram mantidas em ambiente com temperatura de 253 0C. A avaliao foi realizada aos 10 dias aps a instalao. Os demais procedimentos foram semelhantes ao experimento anterior. O delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado, com quatro repeties. Para verificar a influncia dos solventes sobre a baixa germinao e o desempenho das plntulas, realizou-se o terceiro experimento, no qual as sementes foram submetidas aos seguintes tratamentos: embebio em soluo comercial de hipoclorito de sdio (2 % por 3 minutos) e secas por 24 horas, sendo que posteriormente, as no tratadas com hipoclorito, foram submetidas a embebio em DMSO+MeOH (50 % v/v), metanol (25 % de MeOH+75 % de gua estril), etanol (25 % de etanol + 75 % de gua estril) e em gua destilada e, uma testemunha sem embebio. O procedimento de embebio foi realizado conforme anterior. Estas sementes foram distribudas em rolos de papel germitest, que foram mantidos em germinador a 250C. As avaliaes foram realizadas aos 5 e 10 dias aps a instalao. Os demais procedimentos foram semelhantes ao experimento anterior. Para verificar a eficincia dos princpios ativos encontrados no bulbilho de alho e na casca de canela numa forma alternativa ao leo sobre a germinao e o vigor, realizou-se o quarto experimento, no qual as sementes foram submetidas aos seguintes tratamentos: soluo comercial de hipoclorito de sdio (2 % por 3 minutos), p de alho (0,15 g/100 sementes), p de casca de canela (0,15 g/100 sementes), leo essencial de alho (2 mg/mL do solvente) e leo essencial de casca de canela (2 mg/mL do solvente). O solvente dos leos essenciais foi o DMSO+MeOH 50 % v/v. O procedimento de embebio foi realizado conforme anterior. Posteriormente, as sementes foram instaladas em caixas plsticas tipo gerbox, contendo papel germitest, previamente esterilizadas, que foram mantidas a 25 0C. As avaliaes foram realizadas aos 5 e 10 dias aps a instalao. Os demais procedimentos foram semelhantes ao experimento 1. Para verificar a possvel vantagem da associao do hipoclorito de sdio aos ps de alho e canela, realizou-se o quinto experimento, no qual as sementes foram

submetidas aos seguintes tratamentos: embebio com hipoclorito de sdio (2 % por 3 minutos) e secagem por trs horas, sendo que as sementes tratadas com hipoclorito foram submetidas a aplicao de p de alho (0,15 g/100 de sementes), p de casca de canela (0,15 g/100 sementes) e p de capim-limo (0,15 g/100 sementes). Tambm foi realizado o tratamento com captan (0,15 g/100 sementes) e uma testemunha sem tratamento. O procedimento de embebio foi realizado conforme anterior. Posteriormente, as sementes foram distribudas em rolos de papel germitest, previamente esterilizados, que foram mantidos em germinador a 25 0C. As avaliaes foram realizadas aos 5 e 10 dias aps a instalao. Para verificar a eficincia do tratamento com p, por ser o mais prtico para o produtor, realizou-se o sexto experimento, no qual as sementes foram submetidas aos seguintes tratamentos: embebio com hipoclorito de sdio (2 % por 3 minutos), e secagem por 24 horas, sendo que as sementes tratadas ou no previamente com hipoclorito de sdio, foram submetidas a aplicao de p de alho (0,15 g/100 sementes), p de casca de canela (0,15 g/100 sementes) e p de capim-limo (0,15 g/100 sementes). Tambm, foi realizado o tratamento com captan (0,15 g/100 sementes e uma testemunha sem tratamento). O procedimento de embebio foi realizado conforme anterior. Posteriormente, as sementes foram distribudas em rolos de papel germitest, previamente esterilizados, que foram mantidos em germinador a 25 0C. As avaliaes foram realizadas aos 5 e 10 dias aps a instalao. Os dados foram submetidos aos testes de Cochran e Bartlet e de Lilliefors para a homogeneidade da varincia e normalidade. Quando no foi observada a homogeneidade e normalidade, os dados foram transformados em arcseno x / 100 e submetidos a anlise de varincia. As medias foram comparadas pelo Teste de Tukey, a 5 % de probabilidade. Nas tabelas esto apresentados os dados originais, sem transformao. 4.5 RESULTADOS E DISCUSSO No teste de sanidade de sementes de amendoim, quando foi empregado o leo essencial de alho, foi verificado aumento da contaminao por Rhyzopus spp. e Penicillium spp., provavelmente, devido a intensa liberao de exsudatos das sementes provocada pela ao do solvente, enquanto houve reduo da contaminao por fungos do grupo Aspergillus flavus (Tabela 28). Em testes realizados in vitro foi constatado que os leos essenciais no promoveram ao inibidora ou restritiva no crescimento de Rhyzopus spp. e de Penicillium spp. Observao semelhante foi feita por APLETON & TANSEY (1975) para Penicillium spp., quando conseguiram, no mximo, crescimento dos fungos tratados com extrato aquoso de bulbos frescos de alho, igual ao controle. Pelas Tabelas 29, 31 e 33 pode ser verificado que houve diferena significativa entre os tratamentos qumicos. Ao ser verificado que o benomyl e os leos essenciais de alho e canela dissolvidos em solvente (DMSO+MeOH) provocaram reduo acentuada na germinao bem como aumento significativo de plantas anormais infeccionadas (Tabela 30), instalou-se o segundo experimento para avaliar o efeito deste solvente sobre o desempenho das sementes, sendo que na avaliao do mesmo, foi constatado que a testemunha e o tratamento somente com gua esterilizada foram superiores queles em que o solvente estava presente (Tabela 32). Quando foi aplicado o fungicida captan s sementes de amendoim, foi constatado maior germinao, menor porcentagem de plntulas anormais infeccionadas, principalmente, por fungos dos gneros Aspergillus, Penicillium e Rhizopus e maior vigor avaliado pela porcentagem de plntulas normais na primeira contagem e pela massa de plntulas (Tabela 30), embora no tenha diferido do benomyl. Alm disso,

houve reduo da germinao com o uso de leos essenciais de alho e de canela. No entanto, quando as sementes de amendoim foram tratadas com extrato aquoso de folhas de nim (Azadirachta indica L.), BANSAL & SOBTI (1990) verificaram reduo de fungos do gnero Aspergillus, principalmente, os do grupo A.flavus, sem causar danos germinao. De acordo com LIMA & ARAJ0 (1999), sementes de amendoim infectadas principalmente por Aspegillus flavus tm sua qualidade fisiolgica reduzida mais rapidamente do que outras espcies. Alm disso, este fungo, assim como Rhizopus spp. e Penicillium spp. so considerados tpicos de armazenamento (NEERGAARD, 1979) e, freqente nas sementes desta espcie (VANZOLINI et al., 2000). Na avaliao da emergncia em areia (Tabela 32), quando as sementes foram tratadas com leo de canela e de alho, solubilizados em DMSO+MeOH, tambm foi verificado que houve reduo da porcentagem de emergncia e aumento da porcentagem de plntulas anormais infeccionadas, sendo que estes valores foram menores que os constatados na avaliao da germinao, em substrato de papel (Tabela 30), provavelmente, devido a limitao dos fungos ao tegumento das sementes, por ocasio da emergncia das plntulas. Alm disso, na avaliao in vitro, com o emprego de extrato aquoso de bulbilho de alho, foi constatada reduo significativa no crescimento micelial de Curvularia spp. e Alternaria spp. (BARROS et al., 1995) e de Colletotrichum gloeospoioides (RIBEIRO & BEDENDO, 1999), embora no tenha afetado a produo de condios.

Tabela 28. Dados de porcentagem de fungos em sementes de amendoim, cultivar Tatu, tratadas com leos essenciais. Seropdica-RJ. 2003. leos essenciais Fungos Testemunha Alho 21 37 6 Casca de canela 4 44 14 3 8 28

Rhyzopus spp.
Penicillium spp. Grupo Aspergillus flavus

Tabela 29. Quadrado mdio para os dados de plntulas normais de primeira contagem, germinao, plntulas anormais infeccionadas (PAI), sementes mortas (SM) e massa seca de plntulas (g), submetidas ao uso de fungicidas sintticos e naturais (1 experimento). Fontes de G.L PN-PC Variao . 20,0278** Tratamentos 8 27 67435,9 Resduo 28,42 C.V. (%) Germinao PAI SM
3,3706* 1,1229 63,35

Massa plntula
0,010513** 0,001946 41,37

24,7077** 2353,0000** 1,5812 198,0741 25,73 21,43 *- significativo a 5 % de probabilidade; **- significativo a 1 %

Tabela 30. Dados mdios de porcentagem de plntulas normais de primeira contagem, germinao, de plntulas anormais infeccionadas (PAI) e de sementes mortas (SM), e massa seca de plntulas (g) obtidas no primeiro experimento de sementes de amendoim cv. Tatu. Seropdica-RJ. 2003. Tratamentos PN-PC
Germinao

PAI

SM

Massa/plntula

Embebida em gua 10,0ab* 51,0bc 46,0bc 2,0b 0,183a esterilizada Alho 9,0ab 9,0de 89,0a 2,0b 0,051b (1 mg/mL solv.) Alho 13,0ab 25,0bcd 73,0ab 2,0b 0,121ab (2 mg/mL solv.) Canela 5,0ab 8,0de 80,0a 12,0a 0,036b (1 mg/mL solv.) Canela 1,0b 2,0e 92,0a 6,0b 0,047b (2 mg/mL solv.) Benomyl 22,0a 53,0ab 44,0bc 2,0b 0,131ab (0,2 g/20mL gua) Benomyl 6,0ab 26,0bcd 65,0ab 9,0b 0,131ab (0,2 g/20mL solv.) Captan 22,0a 78,0a 20,0c 0,0b 0,156a (3 g/kg semente) Solvente 6,0ab 18,0cd 82,0a 0,0b 0,117ab (DMSO+MeOH) C.V. (%) 28,42 25,73 21,43 63,35 41,37 *Mdias seguidas por letras iguais, no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade.

Tabela 31. Quadrado mdio para os dados de germinao, plntulas anormais infeccionadas (PAI), sementes mortas (SM) e massa seca de plntulas, submetidas ao uso de fungicidas naturais (2 experimento). Fontes de Variao Tratamentos Resduo C.V. (%) G.L. 5 44 Germinao 1863,120** 225,1387 24,360 PAI 1889,596** 232,4812 40,984 SM 14,7282* 2,7212 69,26 Massa/plntula 0,0176** 0,004238 31,504

*- Significativo a 5 % de probabilidade; **- significativo a 1 %

Tabela 32. Dados mdios de porcentagens de emergncia, plntulas anormais infeccionadas (PAI) e sementes mortas (SM) e de massa seca de plntulas (g), obtidos no (2 experimento) de amendoim cv. Tatu. Seropdica-RJ. 2003. Tratamento Emergncia PAI SM Massa/plntula

No embebida 77,0a* 17,0c 6,0b 0,215ab em gua Embebida em 63,0ab 29,0bc 8,0b 0,197ab gua esterilizada Alho (2mg/ml 47,0c 50,0a 3,0b 0,187b solvente) Canela (2mg/ml 49,0bc 47,0b 4,0b 0,272a solvente) Solvente 47,0c 30,0bc 23,0a 0,141b (DMSO+MeOH) C.V. (%) 24,36 40,98 69,26 31,50 * Mdias seguidas por letras iguais, no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade.

Tabela 33. Quadrado mdio para os dados de plntulas normais de primeira contagem, germinao, plntulas anormais infeccionadas (PAI) e sementes mortas, submetidas ao uso de solventes (3 experimento). Fontes de G.L. Variao Tratamentos 5 Resduo 18 C.V. (%) PN-PC 132,6417** 16,7083 74,887 Germinao 2829,467** 471,7778 77,114 PAI 2378,8000** 461,5556 58,860 SM 6429,867** 119,111 30,888

**- significativo a 1 % de probabilidade

Sementes que foram embebidas em metanol e em DMSO+MeOH apresentaram reduo acentuada da germinao e do vigor, avaliado pela porcentagem de plntulas normais na primeira contagem, assim como as sementes que foram embebidas em etanol no germinaram (Tabela 34). Estes resultados permitem inferir que a reduo da germinao das sementes embebidas em leos (Tabelas 30 e 32), provavelmente, foi devido ao solvente utilizado. PURCHIO & MUCHOVEJ (1990), avaliando a ao do etanol como veculo dos fungicidas benomyl e captan no tratamento de sementes de trigo, constataram que esse solvente prejudicou a germinao das sementes desta

espcie. Tambm, COUTINHO et al. (1999) verificaram que os extratos vegetais hidroalcolicos de cascas de cajueiro (Anacardium occidentale L.) e de aroeira (Astronium urundeuva Engl.), quando aplicados em mistura ao benomyl e captan, reduziram a ocorrncia de Aspergillus flavus, porm com reduo da germinao das sementes, possivelmente, em funo destes extratos terem sido solubilizados em etanol, conforme explicao anterior. Considerando que as sementes utilizadas (testemunha) apresentavam-se contaminadas (Tabela 34), optou-se por tratar as mesmas com soluo comercial de hipoclorito de sdio, sendo que pelos resultados foi constatado que no houve diferena significativa entre os tratamentos (Tabela 36).

Tabela 34. Dados mdios de porcentagens de plntulas normais na primeira contagem, germinao, plntulas anormais infeccionadas (PAI) e sementes mortas (SM), obtidos no 3 experimento de amendoim cv. Tatu, tratadas com solventes. Seropdica-RJ. 2003. Tratamentos DMSO+MeOH Methanol Etanol Hipoclorito Embebida gua Testemunha em PN-PC 22,0bc* 2,0c 0,0c 44,0ab 55,0a 8,0bc Germinao 38,0ab 2,0b 0,0b 53,0a 62,0a 14,0ab PAI 37,0ab 26,0b 2,0b 42,0ab 35,0ab 77,0a SM 25,0c 71,0b 96,0a 5,0c 3,0c 9,0c

C.V. (%) 74,88 77,11 58,86 30,88 *Medias seguidas por letras iguais no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade.

Tabela 35. Quadrado mdio para os dados de plntulas normais de primeira contagem, germinao, plntulas anormais infeccionadas (PAI) e sementes mortas, submetidas ao uso de fungicidas naturais (4 experimento). Seropdica-RJ. 2004. Fontes de G.L. Variao Tratamentos 4 Resduo 15 C.V. (%)
ns- no significativo

PN-PC 13,8000ns 14,1167 35,954

Germinao 369,2000ns 322,6667 36,216

PAI 344,0000ns 287,7333 58,492

SM 44,8000ns 62,9333 73,454

Tabela 36. Dados mdios de porcentagens de plntulas normais na primeira contagem, germinao, plntulas anormais infeccionadas (PAI) e sementes mortas (SM), obtidos no 4 experimento de amendoim cv. Tatu. Seropdica-RJ. 2003. Tratamentos Hipoclorito P de alho P de canela PN-PC 34,0a* 42,0a 54,0a Germinao 41,0a 45,0a 66,0a PAI 42,0a 31,0a 22,0a SM 9,0a 11,0a 7,0a

leo de alho + 40,0a 48,0a 28,0a 16,0a solvente leo de canela 39,0a 48,0a 19,0a 11,0a + solvente C.V. (%) 35,95 5 6,22 58,49 73,45 *Mdias seguidas por letras iguais no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade.

Devido ao prejuzo causado pelos solventes na germinao de sementes de amendoim, foi avaliado o emprego dos produtos na forma de p (Tabela 37). Sendo que as sementes tratadas com os produtos na forma de p (canela, alho e capim limo) no diferiram do fungicida captan (Tabela 38), quanto germinao e plntulas anormais infeccionadas.

Tabela 37. Quadrado mdio para os dados de plntulas normais de primeira contagem, germinao, plntulas anormais infeccionadas (PAI) e sementes mortas, submetidas ao uso de fungicidas sintticos e naturais (5 experimento). Fontes de G.L. Variao Tratamentos 5 Resduo 18 C.V. (%) PN-PC 33,0417ns 13,5417 21,594 Germinao 882,2667** 66,0000 9,928 PAI 447,4667** 28,0000 61,056 SM 64,6667ns 60,2222 245,062

ns- no significativo; **- significativo a 1 % de probabilidade

Tabela 38. Dados mdios de porcentagens de plntulas normais na primeira contagem, germinao, plntulas anormais infeccionadas (PAI) e sementes mortas (SM), obtidos no 5 experimento de amendoim cv. Tatu. Seropdica-RJ. 2003. Tratamentos Testemunha Hipoclorito (H) Captan H+p canela de PN-PC 63,0a* 49,0a 65,0a 79,0a 76,0a Germinao 66,0b 60,0b 95,0a 91,0a 89,0a PAI 25,0a 19,0a 0,0b 2,0b 4,0b SM 6,0a 10,0a 0,0a 0,0a 2,0a

H+p de alho

H+p de 77,0a 90,0a 2,0b 1,0a capim-limo C.V. (%) 21,59 9,92 61,05 245,06 *Mdias seguidas por letras iguais no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade.

Alm disso, na Tabela 39 pode ser constatado que somente no houve diferena entre os tratamentos para sementes mortas. Tabela 39. Quadrado mdio para os dados de plntulas normais de primeira contagem, germinao, plntulas anormais infeccionadas (PAI), sementes mortas (SM) e massa seca de plntulas, submetidas ao uso de fungicidas sintticos e naturais (6 experimento). Fontes de G.L. PN-PC Germinao Variao Tratamentos 8 98,98** 113,88** Resduo 27 12,48 12,49 C.V. (%) 22,87 21,89 PAI 79,34** 10,53 48,289 SM 3,62ns 1,25 96,18 Massa/Plntula 1,02** 0,12 39,209

ns- no significativo; **- significativo a 1 % de probabilidade

O emprego de produtos em p (canela e alho) e de captan favoreceu a germinao e o vigor das sementes de amendoim, avaliados pelos testes de primeira contagem e de massa seca das plntulas normais, assim como propiciou diminuio da porcentagem de plntulas anormais infeccionadas (Tabela 40). Assim, considerando-se 70% como valor mnimo de germinao aceitvel para a semeadura do amendoim e o estabelecimento adequado de plantas no campo (BRASIL, 1999), verificou-se que estas sementes poderiam ser comercializadas, aps a aplicao destes produtos, assim como tambm constatado por VANZOLINI et al. (2000), que verificaram comportamento semelhante com o uso de captan. Alm disso, ADEGOKE & ODESOLA (1996),

avaliando a ao de leo e de p de capim limo, no observaram efeito favorvel do uso de p de capim limo (Cymbopogon citratus) no controle da deteriorao das sementes de milho e de caupi. No entanto, os autores sugerem que seja avaliada a possibilidade de utilizao destes produtos, em maiores doses ou no procedimento de encapsulao, devido apresentar os mesmos componentes ativos do leo essencial. Alm disso, na Tabela 40, foi verificado que o tratamento com hipoclorito de sdio propiciou reduo da germinao e do vigor das sementes. No entanto, estes valores no diferiram do apresentado pelas sementes no tratadas (controle). Estes resultados podem estar relacionados eficincia do hipoclorito de sdio no controle da eliminao de patgenos, como constatado por ARAJO (2004), que somente houve eliminao de fungos do grupo Aspergillus flavus, quando foi empregada uma soluo comercial a 3% por dez minutos, como tambm podem estar relacionados ao grau de suscetibilidade das sementes de amendoim injria provocada pela rpida embebio das sementes por meio da imerso em gua destilada. De acordo com KRAFT (1977), as alteraes na permeabilidade das membranas celulares, promovidas pela embebio, podem propiciar a eliminao de substncias para o substrato e favorecer a atividade de microrganismos, como tambm constatado por VERTUCCI (1989), que observaram que a eficincia da reorganizao dos constituintes celular depende da velocidade de hidratao. Assim, deve haver compatibilidade entre os resultados da aplicao dos produtos para permitir o controle de patgenos e ao mesmo tempo no prejudicar ou at mesmo melhorar o desempenho das sementes, como tambm constatado por COUTINHO et al. (1999).

Tabela 40. Dados mdios de porcentagens de plntulas normais na primeira contagem, germinao, plntulas anormais infeccionadas (PAI), sementes mortas (SM) e massa seca de plntulas, obtidos no 6 experimento de amendoim cv. Tatu. Seropdica-RJ. 2003. Tratamentos Testemunha Hipoclorito (H) H.+ p de canela H.+ p de alho P de canela P de alho Captan PN-PC 66,0bc* 57,0bc 38,0d 64,0b 83,0a 89,0a 80,0a Germinao 68,0abc 60,0c 42,0d 66,0c 83,0ab 89,0ab 93,0a PAI 22,0cd 28,0bcd 42,0ab 21,0cd 14,0cd 11,0d 2,0d SM 7,0a 8,0a 10,0a 8,0a 3,0a 0,0a 0,0a Massa Seca (g) 0,184bc 0,216ab 0,188bc 0,188bc 0,244ab 0,240ab 0,300a

H.+ p de 35,0d 35,0e 56,0a 5,0a 0,080d capim-limo P de capim44,0cd 44,0d 46,0ab 1,0a 0,148bcd limo C.V. (%) 22,87 21,89 48,28 96,18 39,20 *Mdias seguidas por letras iguais no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade.

4.6 CONCLUSES 1. As sementes embebidas em solventes orgnicos apresentaram reduo acentuada da germinao e do vigor. 2. Os produtos a base de p de alho e de canela favoreceram a germinao e o vigor das sementes e reduziram a porcentagem de plntulas infeccionadas. 4.7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS centralizar ADEGOKE, G.O. & ODESOLA, B.A. Storage of maize and cowpea and inhibition of microbial agents of biodeterioration using the powder and essential oil of lemon grass (Cymbopogon citratus). International Biodeterioration & Biodegradation, Essex, v. 37, n. 1/2, p. 81-84, 1996. APPLETON, J.A. & TANSEY, M.R. Inhibition of growth of zoopathogenic fungi by garlic extract. Mycologia, Lawrence, v.67, p. 882-885, 1975. ARAJO, A.E.S. Avaliao da qualidade sanitria e fisiolgica em sementes de amendoim (Arachis hypogaea L.), 2004, 64p. (dissertao-Mestrado CPGF/UFRRJ). BANSAL, R.K. & SOBTI, A.K. Control of Aspergillus flavus associated with groundnut seeds. Indian Phytopathology, Nova Delhi, v. 41, n. 4, p. 643-644, 1988. BANSAL, R.K. & SOBTI, A.K. Na economic remedy for the control of two species of Aspergillus on groundnut. Indian Phytopathology, Nova Delhi, v. 43, p. 451-452, 1990. BARROS, S.T.; OLIVEIRA, N.T.; MAIA, C.C. Efeito do extrato de alho (Allium sativum) sobre o crescimento micelial e germinao de condios de Curvularia spp. Summa Phytopathologica, Jaguarina, v. 21, n. 2, p. 168-170, 1995. BRASIL, Ministrio da Agricultura. Regras para anlise de sementes. Braslia: SNAD/DNPV/CLAV, 1992. 365 p. BRASIL, Ministrio da Agricultura. Comisso Estadual de Sementes e Mudas. Padres de sementes para safra 99/2000. Campinas: Secretaria de Agricultura do Estado de So Paulo. 1999. 1p. COUTINHO, W.M.; ARAJO, E.; MAGALHES, F.H.L. Cincia e Agrotecnologia, Lavras, v.23, n. 3, p. 560-568, jul./set., 1999. FERRACINI, V.L.; MELO, I.S.; FRIGHETO, R.T.S. Influncia de Chenopodium ambrosioides L. no crescimento micelial e germinao de esclerdios de Sclerotium rolfsii. Fitopatologia Brasileira, Braslia, v. 15, n. 2, p. 176-, 1990. GABRIEL, A.J.A.; LIMA, M.F.F.; SOUZA, M.A.A.; SOUZA, S.R. Germinao de sementes de alface e de duas ervas invasoras com a aplicao de um novo anlogo do estrigol, sintetizado a partir do safrol. Horticultura Brasileira, Braslia, v. 20, n. 4, p. 544-546, dezembro 2002.

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