Elektroforesis protein dan Gel Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan l istrik.

Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muata n, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separ asi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang tersepa rasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dila kukan kuantifikasi dengan densitometer. Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah te rjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel pol iakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk sep arasi protein dan asam nukleat. Elektroforesis yang dibahas di bawah ini menggun akan matriks berupa gel poliakrilamida (PAGE = poly-acrilamida gel electrophores is) untuk separasi sampel protein. Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan ko mposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi ke elektr oda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis unt uk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatannya. Didalam elektroforesis tak-penyahaslian (nondenaturing) atau elektroforesis nati f, protein dipisahkan dalam bentuk aslinya berdasarkan cas, saiz, dan bentuk mol ekul tersebut. Satu lagi bentuk elektroforesis yang selalu digunakan bagi pemisa han protein ialah elektroforesis penyahaslian. Elektroforesis gel poliakrilamid (PAGE) dengan suatu detergen anion, sodium dodesil sulfat (SDS) digunakan untuk memisahkan subunit protein mengikut saiz. Protein dilarutkan didalam suatu larut an penimbal yang mengandungi SDS dan agen penurun, merkaptoetanol atau ditiotrei tol, untuk menceraikan protein menjadi subunit dan menurunkan ikatan disulfat (R ajah 1). Protein bergabung dengan SDS lalu bercas negartif, dan dipisahkan hanya berdasarkan saiz. Tatakerja: Sebuah pembekal kuasa dan radas elektroforesis mengandungi matrik gel poliakrila mid dan dua takungan (reservoir) larutan penimbal adalah diperlukan ubtuk menjal ankan satu pemisahan. Contoh gel keping dan unit elektroforesis ditunjukkan dida lam Rajah 2. Sumber kuasa digunakan untuk menwujudkan medan elektrik dengan meny ediakan suatu sumber arus, voltan atau kuasa yang konstan. Penimbal elektrod men gawal pH bagi mengekalkan cas yang sesuai pada protein dan menkonduksikan arus m elalui gel poliakrilamid. Sistem penimbal yang biasa digunakan termasuklah penim bal anionik tris-(hidroksimetil)amino metan dengan gel pelerai (desolving gel) p ada pH 8.8 dan penimbal asetat yang kationik pada pH 4.3. Matrik gel poliakrilamid terbentuk melalui pempolimeran akrilamid dengan sedikit (selalunya 5% atau kurang) reagen pempaut silang (cross-linking) N.N -metilen-bisak rilamid dengan kehadiran satu mangkin, tetrametiletilendiamin (TEMED) dan sumber radikal bebas, amonium persulfat seperti ditunjukkan didalam Rajah 3. Gel boleh disediakan didalam makmal atau dibeli siap diacu (pre-cast). Matrik gel tak selanjar (discontinuous) selalunya digunakan untuk memperbaikki p eleraian (resolution) protein didalam campuran yang kompleks. Matrik tak selanja r terdiri dari satu gel penimbun (stacking gel) dengan saiz liang yang besar (se lalunya 3-4% akrilamid) dan satu gel pelerai (resolving gel) yang mempunyai saiz liang yang kecil. Gel penimbun, seperti yang dimaksudkan dengan namanya, diguna kan untuk menimbunkan atau memekatkan protein menjadi satu jalur yang sempit seb elum protein itu memasukki gel pelerai (Rajah 4). Pada pH 6.8, satu kecerunan voltan terbentuk diantara ion klorid (cas negatif ti nggi) dan glisin (cas negatif rendah) didalam penimbal elektrod yang bertujuan m enimbunkan protein menjadi jalur-jalur sempit diantara ion-ion. Migrasi kedalam gel pelarian (running gel) yang mempunyai pH berlainan (pH 8.9) mengganggu kecer unan voltan ini lalu membenarkan pemisahan protein menjadi jalur-jalur yang disk

rit. Saiz liang gel pelarian dipilih berdasarkan berat molekul protein yang hendak di pisahkan dan boleh diubah dengan cara menukar kepekatan akrilamid didalam laruta n. Protein selalunya boleh dipisahkan pada gel pelarian yang mengandungi 4 ke 15 peratus akrilamid. Kepekatan akrilamid 15 peratus selalunya digunakan untuk mem isahkan protein yang mempunyai berat molekul dibawah 50,000. Protein yang mempun yai berat molekul lebih besar dari 50,000 lazimnya dipisahkan pada gel yang kepe katan akrilamidnya dibawah 7 peratus. Satu gel kecerunan (gradient gel) dimana k epekatan akrilamis meningkat dari atas kebawah gel selalunya digunakan untuk mem isahkan satu campuran protein yang mempunyai banjaran berat molekul yang luas. Bagi menjalankan sesuatu pemisahan, protein didalam penimbal yang sesuai pHnya d imuatkan disebelah atas gel penimbun. Pewarna penjejak (tracking dye) bromofenol biru ditambahkan kedalam larutan protein. Pewarna ini molekul kecil yang migras i terdahulu daripada dan digunakan untuk memonitor kemajuan sesuatu pemisahan. S elepas sesuatu larian (run) elektroforesis, jalur-jalur yang terdapat pada gel u mumnya divisualkan dengan menggunakan pewarna (stain) protein seperti Coomassie Brilliant Blue atau pewarna timah (silver stain). Pewarna enzim spesifik atau an tibodi boleh juga digunakan untuk mengesan sesuatu protein. Kegunaan: Elektroforesis selalunya digunakan untuk menentukan komposisi protein sesuatu pr oduk makanan. Sebagai contohnya, perbezaan yang terdapat didalam komposisi prote in dari protein pekatan kacang soya dan pekatan protein weiyang dihasilkan melal ui teknik pemisahan yang berlainan boleh dikesan. Elektroforesis boleh juga digu nakan untuk menentukan ketulenan sesuatu ekstrak protein. SDS-PAGE digunakan untuk menentukan komposisi subunit sesuatu protein dan untuk menganggar berat molekul subunit sehingga + 5 peratus ralat, walaupun protein ya ng bercas tinggi atau glikoprotein mungkin tertakluk kepada ralat yang besar. Be rat molekul ditentukan dengan membandingkan Rm subunit protein dengan Rm protein piawai yang diketahui berat molekulnya (Rajah 5). Piawai protein yang disediaka n secara komersial boleh didapati dalam beberapa banjaran berat molekul. Untuk m enyediakan satu lengkok piawai, logaritma berat molekul protein piawai diplotkan melawan padanan Rm nya. Maka berat molekul protein tak diketahui ditentukan dar i Rm nya dengan menggunakan lengkok piawai. 2. Pemfokusan Isoelektrik (Isoelectric Focusing) Prinsip: Pemfokusan isoelektrik adalah merupakan satu modifikasi elektroforesis. Dalam ke s ini, protein dipisahkan oleh cas didalam suatu medan elektrik pada matrik gel yang telah diwujudkan kecerunan pH menggunakan amfolit (ampholytes). Protein dif okuskan atau migrasi ke lokasi didalam kecerunan dimana pH sama dengan pI protei n tersebut (Rajah 6). Peleraian yang diperolehi adalah diantara yang paling tert inggi untuk sebarang teknik pemisahan protein dan boleh digunakan untuk memisahk an protein yang mempunyai pI berbeza kurang dari 0.02 unit pH. Tatakerja: Satu kecerunan pH diwujudkan menggunakan amfolit, iaitu polimer kecil (berat mol ekul kira-kira 5000 dalton) yang mengandungi kedua-dua kumpulan bercas positif d an negatif. Suatu campuran amfolit terdiri dari beribu-ribu polimer yang mempami rkan satubanjaran nilai pK. Amfolit ditambahkan kedalam larutan gel sebelum pemp olimeran dijalankan. Selepas gel terbentuk dan arus dialirkan, amfolit ini bermi grasi lalu membentuk kecerunan pH; amfolit yang bercas negatif akan migrasi kear ah anod, manakala yang bercas positif kearah katod. Campuran amfolit boleh diper olehi yang merangkumi banjaran pH yang sempit (2-3 unit) atau satu banjaran yang lebar (pH 3-10) dan perlulah dipilih untuk digunakan berdasarkan ciri-ciri prot ein yang hendak dipisahkan.

Kegunaan: Pemfokusan isoelektrik merupakan kaedah pilihan untuk menentukan titik isoelektr ik sesuatu protein dan sZt. Pemfokusan isoelektrik juga digunakan untuk membedak an spesis ikan yang berhubungan rapat dengan berdasarkan corak proteinnya. ELEKTROFORESIS GEL Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Pr insip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan l aju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindaha n tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasa nya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik p reparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain se perti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yan g merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut. Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dip akai dalam bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini mir ip dengan kromatografi: memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan si fatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap campuran bahan de ngan muatan listrik yang berbeda-beda (menggunakan prinsip dalam elektroforesis Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yan g porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein at au asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digun akan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-be da antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk me misahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), g el yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnika n. Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pa da gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepada nya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah p ergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan as am nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berb entuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natri um dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermu atan negatif. Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) aga r molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna biru Coomassie (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika mol ekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah diwarnai dengan etidiu m bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandun g atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.