Fotosintetik
aparatus
(Badan
golgi)
dari
bakteri
fotoheterotropik
Rhodopseudomonas sphaeroides terletak pada suatu sistem membran intrasitoplasmik dimana jika ada gangguan mekanik akan menimbulkan kromatopores. Kromatopores terutama mengandung antena (light-harvesting) dan protein kompleks (Bchl). Untuk memahami lebih rinci mengenai Bchl protein membutuhkan pengisolasian Bchl protein dari membrannya. Dua protein kompleks klorofil baru dapat diisolasi setelah solubilisasi membran dengan litium dodesil sulfat/poliakrilamid gel elektroforesis dengan detergen pada suhu 4o. Dalam percobaan ini menggunakan litium dodesil sulfat karena merupakan garam natrium yang akan mengalami presipitasi dalam suhu dingin dan bahan ini cocok untuk mengisolasi kompleks antena B875 dan juga B850 dari R. sphaeroides kromatofora. Ketika memurnikan membran fotosintetik dari Rhodopseudomonas sphaeroides dengan gel poliakrilamid pada suhu 4o yang menggunakan litium dodesil sulfat, percobaan ini dapat menguraikan hingga 11 pigmen protein kompleks dari membran fotosintetik Rhodopseudomonassphaeroides. Spektrum mengungkapkan bahwa kompleks terkecil membran mengandung pigmen pusat reaksi dan kompleks yang lain mengandung komponen antena B850 dan B875 dalam proporsi yang bervariasi. Dari kompleks antena tersebut, kompleks terbesar hampir seluruhnya adalah B850 dan kompleks terkecil hanya mengandung B875. Setelah solubilisasi pada suhu 100oC dan elektroforesis pada gel poliakrilamid, kompleks B850 memunculkan dua komponen polipeptida yaitu 10.000 dan 8000 Mr yang berpindah dengan jelas, sedangkan kompleks B875, dua komponen yang teramati dengan jelas adalah 12000 dan 8000 Mr. Kompleks dari pigmen pusat reaksi hanya memberikan 24 dan 21 polipeptida subunit kilodalton. Fluoresensi emisi spektrum pada B850 dan B875 masing-masing menunjukkan maksima 872 dan 902 nm. Analisis pada bacteriochlorophyll dan karotenoid mengindikasi bahwa pada kompleks B875 , dua molekul pada pigmen ini terkait dengan dua polipeptida. Keterkaitan antara B850 dan B875 pada kompleks besar dan kompleks kecil yang diperoleh dari litium dodesil sulfat tersebut konsisten dengan struktur bentuknya dalam membran.
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat bemigrasinya molekul-molekul biologi. Media penyangganya bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan yang akan dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai dalam elektroforesis antara lain yaitu kertas, selulose, asetat dan gel. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein yakni: 1. Ukuran molekul protein Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil. 2. Konsentrasi gel Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi. 3. Bufer (penyangga) Bufer dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa protein yang bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik menjadi maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan molekul protein. Kekuatan ion rendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi molekul protein sangat lambat. 4. Medium penyangga Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai migrasi elektron atau penyaringan berdasarkan ukuran molekul seperti gel poliakrilamid.
1. Jika ukuran pori dari medium kira-kira sama dengan molekul, maka molekul yang lebih kecil akan berpindah lebih bebas di dalam medan listrik, sedangkan molekul yang lebih besar akan dibatasi dalam migrasinya. Besarnya pori-pori dapat diatur dengan mengubah konsentrasi penyusun gel poliakrilamidnya yaitu akrilamid dan bisakrilamid. 5. Kekuatan voltase 2. Voltase yang dipakai rendah (100-500) V, kecepatan migrasi molekul sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan. 3. Voltase yang dipakai tinggi (500-10000) V, mobolitas molekul meningkat secara lebih tajam dan digunakan untuk memisahkan senyawa dengan BM rendah serta jenis arus yang dipakai selalu harus searah (bukan bolak balik). 6. Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung. Jika temperatur tinggi akan mempercepat proses bermigrasinya protein dan sebaliknya jika temperatur rendah akan mengurangi kekuatan bermigrasinya protein. Pada saat elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda negatif menuju elektroda positif sampai pada jarak tertentu pada gel poliakrilamid tergantung pada berat molekulnya. Semakin rendah berat molekulnya maka semakin jauh pula protein bergerak atau mobilitasnya tinggi. Sebaliknya protein dengan berat molekul lebih besar akan bergerak pada jarak yang lebih pendek atau mobilitasnya rendah. Hasil elektroforesis akan didapatkan pita-pita protein yang terpisahkan berdasarkan berat molekulnya. Tebal tipisnya pita yang terbentuk dari pita protein menunjukkan kandungan atau banyaknya protein yang mempunyai berat molekul yang sama yang berada pada posisi pita yang sama. Hal ini sejalan dengan prinsip pergerakan molekul bermuatan, yakni molekul bermuatan dapat bergerak bebas di bawah pengaruh medan listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada zona atau pita yang sama atau berdekatan.
BAB III METODE KERJA R. sphaeroides (NCIB 8253) dikembangkan di phototropically 30o dengan 40-W General Electric (lampu pijar pada intensitas cahaya 1800 lux yang diukur pada meteran Model Weston 756 iluminasi). Kromotofora yang dimurnikan dari ekstrak French-press. Semua membran diisolasi pada suhu 4oC; dan menggunakan buffer yang mengandung 1.0 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) yang digunakan untuk menghambat aktivitas protease. Kompleks pigmen-protein diisolasi dengan preparatif gel elektroforesis diatas lempengan poliakrilamid dengan menggunakan 0.1% LiDodSO4 dan 1.0 mM EDTA diatas reservoir buffernya. Sampel mengandung kromatopores (1 mg Bchl per mL), perbandingan LiDodSO4 dengan Bchl 20:1 , 50 mM dithiothreitol, 12% sukrosa, 62.5 mM Tris pada pH 6.8 dan PSMF & benzamidine yang masing-masing pada 1.0 mM dan 5 mM e-aminokaproat sebagai inhibitor protease. Penyusunan dan memisahkan (3 x 120 x 300 mm) gel terdiri dari poliakrilamid 5 dan 7.5%. Rasio poliakrilamid N,N- methylenebisacrylamide adalah 30:0.8. Beberapa potongan kompleks antena B875 dan kompleks reaksi pusat dimurnikan lebih lanjut dengan elektroforesis selanjutnya dimana gel akrilamid memisahkan pada gradien 7.515% lalu distabilkan oleh gradien sukrosa 5-17.5%. Semua proses dilakukan pada suhu 4oC dalam keadaan gelap. Spheroidene diverifikasi setelah pemisahan dengan menggunakan kromatografi lapisan tipis, setelah itu baru dapat diperoleh nilai dari spheroidene. Protein ditentukan dengan metode Bradford yang menggunakan LiDodSO4 0.1% dengan bovine serum albumin. Spektrum yang diserap diperoleh dari Cary 14R spectrophotometer, lalu fluoresensi emisi spektrumnyadicatat. Fluoresensi hasil didasarkan pada nilai 0,1% untuk emisi 900-nm band dari pusat-pusat reaksi pada potensial redoks rendah. LiDodSO4 diperoleh dari Gallard, Schlesinger (Carle Place,NY).
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN Penjelasan pada efek dari perlakuan LiDodSO4 dengan suhu 4o C pada kromatofor R.Spharoides, konsentrasi deterjen dalam kelarutan bufer bermacam-macam sebelum dielektoforesis pada temperatur ini. Ditemukan bahwa rasio 1:20 Bchl/LiDodSO4 melarutkan membran secara efisien dengan hanya melepas sejumlah kecil dari pigmen bebas. Ratio ini digunakan dalam semua eksperimen. Ratio rendah Bchl/LiDodSO4 melepaskan banyak pigmen. Ratio tinggi menyebabkan sampel gagal masuk ke gel. Konsentrasi deterjen yang tinggi juga menghancurkan kompleks antena B875 yang labil. Gambar 1 menunjukkan band yang diwarnai, diamati setelah LiDodSO4/elektroforesis gel poliakrilamid dari kromatofor pada suhu 4o C. Sampai 11 pigmen-kompleks-kompleks protein dideteksi dalam sampel yang dingin. Ketiga penyerapan spektra yaitu B850, B875, dan LM dikarakteristikkan pada spesies-spesies tunggal dari Bchl-kompleks-kompleks protein. Ilustrasi-ilustrasi ini tidak berguna pada prosedur untuk persiapan serentak dan lebih signifikan menunjukkan bahwa komplek B875 sudah diisolasi. Kompleks yang diisolasi menyerap secara maksimal dalam inframerah jarak dekat yaitu 873 nm. Kekosongan penyerapan yang terpisah-pisah maksimum 800 nm menunjukkan kontaminasi minimal dengan reaksi pusat atau B850. Sesudah ekstraksi aseton atau metanol, tidak ada perbedaan yang dapat diamati. Penyerapan spektrum komplek B850 sama dengan komponen murni lauryl dimethylamine oxide/ (Lau(Nme2)O) dan Triton. Spektrum dari band gel LM dibandingkan reaksi pusat setelah perlakuan (Lau(Nme2)O). Oksidasi partikel LM menyebabkan pemutihan band 860 nm, bagaimanapun cahaya yang menginduksi ukuran absorbansi 790 dan 810 nm menunjukkan hanya sekitar 1% yang merupakan fitokimia aktif karena kuinon bertindak sebagai akseptor-akseptor elektron yang direduksi/hilang. Penyerapan karotenoid band dalam sampel LM juga lebih pendek dari B850.
Gbr 1 Pigmen komplek protein dari R.Sphaeroides dalam gel ternoda. Kromatofor diuji dengan LiDdSO4 pada 4 C selama 60 detik, elektroforesis 7,5% gel poliakrilamid pada 4 C. II-IX, komplek dengan level bermacam-macam dari B850 dan B875;LM=reaksi pusat partikel;P=pigmen bebas;Nh=sampel yang tidak dipanaskan;H=sampel yang dipanaskan.
Penyerapan inframerah spektra dari sisa band yang diwarnai menunjukkan bahwa mereka terdiri dari bermacam proporsi dari komplek-komplek B850 dan B875. Floresensi inframerah dari isolasi B850 dan B875 antena juga diuji. Perangsangan potongan gel dengan cahaya monokromatik 590 nm memancarkan maksimal pada 902 dan 872 nm untuk komplek B850 dan B875. Pancaran maksimal ini bergantung dengan pemecahan dari spektrum floresensi kromatofor jenis liar dan dari isolasi B850. Hasil floresensi B850 dan B875 ditemukan pada 23 dan 17% yang disampaikan untuk komplek antena isolasi dari R. Spharoides. Isi Bchl yang diisolasi komplek ditunjukkan dalam Tabel 1. Persiapan B850 menunjukkan nilai dari 3 Bchl. Nilai 2.4 Bchl/LM komplek ditentukan kurang dari 4 dan nilai dari 1.6 Bchl /B875 jatuh pada integer terdekat yaitu 2. Tabel 1 Isi Bchl dari komplek isolasi oleh LiDdSO4 /elektroforesis gel poliakrilamid Bchl, g/mg protein B850 complex B875 complex LM complex B850 complex 162.1 74.6 72.4 178 6 Bchl/complex,tmolar ratio 3.1 0.4 1.64 0.5 2.42 0.8 3.5
Chromatophores
73.3
Beberapa Bchl mungkin dapat hilang selama isolasi dan pengujian kadar logam dan estimasi protein mungkin bisa terjadi kesalahan karena albumin tidak penting pada standart. Dengan hasil pengamatan ini, kami menyarankan dalam minimal komplek B875, 2 molekul Bchl dibatasi 2 polipeptida. Kami menemukan rasio molar 1,18 0,09 molekul karotenoid/Bchl dalam isolasi kompelk B875 ini bergantung dengan nilai 1 oleh Sistrom dari pigmen R. Spharoides Ga membran dengan macam proporsi B859 dan B875. Gbr 2 Penyerapan spektra dari B850 dan B875 kompelk antena dan LM diidolasi oleh LiDdSO4 / elektroforesis gel poliakrilamid. Spektra dihasilkan secara langsung oleh potongan gel. Untuk oksidasi dari 860nm reaksi pusat band, potongan gel direndam dalam 10Mm kalium fericianid selama 15menit.
Molekul rendah bobot polipeptida telah diamati oleh NaDodSO4/ elektroforesis gel poliakrilamid dari komplek antena bermacam-macam spesies Rhodospirillaceae. Apoprotein dari B875 dan B850 komplek diidentifikasi setelah persiapan mengelusi pada 100 C untuk 60 detik dalam 1% LiDdSO4. Pemanasan menghasilkan disosiasi komplit dari isolasi komplek ke dalam molekul rendah bobot polipeptida. Hal ini juga diamati dalam kromatofor oleh intensifikasi dari reaksi pusat band L dan M dan yang dekat dengan gel. Elektroforesis pada suhu 4o C tidak memecah molekul rendah komponen dalam kromatofor yang dipanaskan karena migrasi lambat campuran pigmen, fosfolipid, deterjen pada temeperatur rendah. Dua polipeptida yang bermigrasi ke posisi yang sama sebagai LH1 dan LH3 diamati dengan komplek B875. Sedangkan komplek B850, komponen hasil dengan elektroforesis yang sama dengan LH2 dan LH3.
Gbr 3 Penyerapan spektra inframerah dari komplek II-IX. Spektra dikoreksi untuk penghamburan cahaya oleh potongan gel. Level B850 dan B875 dikalkulasi dari persamaan Crounae et al. Nilai yang dihasilkan dari rasio 875:850 untuk B 850 dan komplek B875 adalah 0,09 dan 4,04.
Gbr
floresensi
B850 dan B875 pigmen-komplek protein. Spektra dikoreksi oleh perbandingan dengan pemancaran spektrum filamen tungsten 2860 K. Penyerapan floresensi kecil 800 nm dalam persiapan B875 dimana yang tampak seharusnya untuk membebaskanBchl.
Gbr 5. Komposisi polipeptida dari kompleks protein Bchl. (Atas) Analisa dengan elektroforesis gel LiDodSO4/poliakrilamid pada 4oC dalam 7,5-15% gel polikrilamid (1,0 x 200 x 300 mm). CHROM, kromatofor (12 g Bchl); RC, pusat reaksi R. sphaeroides R-26 disiapkan seperti yang telah dijelaskan (8); nH, sampel yang tidak dipanaskan; H, dipanaskan pada 100oC selama 60 detik. Gel beri pewarna biru berlian Coomassie seperti yang telah dijelaskan (29). (Bawah) Analisa sampel yang dipanaskan dalam 10-14% gel poliakrilamid (1,5 x 100 x 150 mm) pada suhu kamar. B850: A, disiapkan dengan elektroforesis gel LiDodSO4/poliakrilamid; B, Lau(NMe)2O/perlakuan Triton (11). B875: dimurnikan dengan satu (A) atau dua (B,C) siklus persiapan elektroforesis dengan tidak menggunakan inhibitor protease (A), dengan PMSF (B), atau dengan benzamidine PMSF, dan asam -aminocaproic (C). LM terlihat setelah satu siklus persiapan elektroforesis. H, L, dan M adalah subunit pusat reaksi (RC) [Mrx 28,000, 24,000, dan 21,000 (9)]; LH-1 sampai LH-3, polipeptida kumpulan antenna-Bchl (Mrx 12,000, 10,000, dan 8,000). Gbr. 5 Bawah juga menunjukkan bahwa komponen polipeptida tersebut bukan bagian dari pencernaan proteolitik karena tidak ada perbedaan yang ditemukan ketika inhibitor protease PMSF, benzamidine, dan asam -aminocaproic diikutsertakan dalam semua dapar. Setelah pemanasan, kompleks dengan sifat spectral dari pusat reaksi (LM) didapatkan mengandung unit polipeptida Mrx 24,000 (M) dan Mrx 21,000 (L) (9). Tidak adanya subunit H (Mrx 28,000) adalah hasil dari penelitian sebelumnya (9, 14, 30) bahwa denaturasi pusat reaksi dengan NaDodSO4 dalam kondisi sejuk menyebabkan meningkatnya partikel LM, unit aktif fotokimia terkecil dalam R. sphaeroides (30, 31).
Gel elektroforesis LiDodSO4/poliakrilamid pada 4oC menyediakan prosedur yang cepat dalam pendeteksian dan isolasi kompleks protein berpigmen dalam membrane kromatofor R. sphaeroides. Tiga dari kompleks ini sudah diidentifikasi sebagai komponen 8
antena B859 dan B875dan sebagai persiapan pusat reaksi. Sebelumnya, kompleks protein berpigmen B875 dari tipe liar sudah diteliti kecocokkan spectrum penyerapannya dengan berbagai jenis B850 (6), dan metode Komposisi dan ukuran dari kompleks yang diisolasi tersebut konsisten dengan model yang diusulkan oleh Monger dan Parson (32) untuk pengaturan di dalam membrane, berdasarkan properti yang fluoresens. Sesuai dengan transfer energi dari B850 melalui B875 menuju ke pusat reaksi (20,33), diusulkan bahwa B875 berhubungan dan mengelilingi pusat reaksi dan bahwa luas dari B850 diatur menepi di danau yang lebih besar (32). Asosiasi yang dekat antara pusat reaksi dan B875 telah diungkapkan dengan stokiometri yang tepat dalam sel-sel dari isi pigmen yang bervariasi(6) dan observasi bahwa ini adalah kompleks pertama yang disintesis selama repigmentasi (7). Dari penemuan kami, bahwa kompleks yang lebih luas diperkaya dengan B850 sedangkan yang lebih kecil diperkaya dengan B875 ini cocok dengan model. Kompleks dengan proporsi komponen dua antenna yang bervariasi, diperoleh dari area membran yang di dalamnya mereka bercampur. Ukuran yang jelas dalam bermacam-macam kompleks diisolasi dapat memantulkan yang di dalamnya unit fotosintesis diperluas dengan penambahan (6) dari luar area (32) kompleks B850. Sesuai dengan komposisi polipeptida yang dilaporkan untuk persiapan antenna yang lain (11, 25, 28), tiga polipeptida berikatan dekat dengan gel di depan preparasi kromatofor murni terangkat (29) dari LH-1 ke LH-3 (Mr jelas masing-masing 12,000 , 10,000 , dan 8000). LH-1 dan LH-2 diidentifikasikan sebagai komponen dari B875 dan B850, masingmasing, dan polipeptida dengan pergerakan elektroforetik sesungguhnya identik dengan LH-3 yang ditemukan di kedua kompleks tersebut. Masih belum jelas ketika polipeptida terakhir menampilkan komponen yang sama pada kedua kompleks atau komponen yang berbeda bermigrasi ke posisi yang sama dalam gel. Ini kontras dengan kompleks antenna yang diisolasi dari mutan R.capsulata(28) yang mana di dalam B850 mengandung sebuah komponen polipeptida Mr 14,000, sebagai tambahan komponen Mr 8,000 dan 10,000 yang jelas dan sebuah polipeptida tunggal Mr 12,000 yang diobservasi dengan kompleks B875. Pencernaan proteolitik baru baru ini mengusulkan bahwa Bchl dengan asosiasi dengan polipeptida Mr 10,000 dan 8,000 bertanggung jawab terhadap absorpsi maxima mendekati 850 dan 800 nm, masing-masing (34). Karena kompleks B875 yang diisolasi di sini tidak mengandung B850 dan polipeptida Mr 10,000, ini tidak seperti polipeptida Mr 8,000 di preparasi ini bebas dari kontaminasi B850. Analisis imunodifusi dengan antiserum antikromatofor menunjukkan bahwa kompleks B850 dan B875 murni membagi garis precipitin
tetapi ini masih belum diketahui apabila ini mewakili polipeptida L-3 (hasil yang belum dipublikasikan). Komposisi pigmen dari antena kompleks yang terisolasi di sini, tiga molekul Bchl ditemukan berkaitan dengan persiapan B850, sedangkan dengan B875, sekitar dua Bchls terdeteksi, sesuai dengan pemesanan diungkapkan sebelumnya. Komposisi yang diamati untuk B850 setuju dengan yang dilaporkan untuk persiapan R.sphaeroides lainnya (23,25); pengamatan spektral menunjukkan bahwa pita absorpsi 850-nm berisi dua exciton digabungkan molekul Bchl sedangkan molekul Bchl tunggal dikaitkan dengan band 800-nm (35). Temuan menunjukan hampir dua molekul Bchl berhubungan dengan kompleks B875 setuju dengan nilai yang dilaporkan untuk antena kompleks yang terisolasi dari carotenoidlessR.sphaer-oides mutan R-26 (23). Ada kemungkinan bahwa antena diamati pada mutan ini merupakan B875 yang bermutasi karena tidak ada band B800 yang ditemukan (24). Selanjutnya, rasio antena Bchl bereaksi ke pusat di R-26 adalah sekitar 30:1, independen dari kondisi pertumbuhan seperti yang diamati untuk B875 di dalam jenis liar (6). Temuan kami menunjukkan bahwa komposisi pigmen dari B875 kompleks yang terisolasi sebagian besar mencerminkan bahwa dari B875 di dalam membran. Ini telah diprediksi (24) itu, di B875 kompleks, karotenoid harus bergabung dengan Bchl dalam rasio molar tetap dekat 1.0 ini diamati di sini. Selanjutnya, posisi penyerapan dekat-inframerah dan emisi fluoresensi maksimum yang dekat dengan yang disimpulkan dari pengukuran yang dilakukan pada sediaan membran dengan berbagai B850 dan B875 level (5,20). Akhirnya, posisi maxima penyerapan karotenoid dalam B875 persiapan kami pada panjang gelombang lebih pendek dari maxima sesuai pada B850 setuju dengan spektrum mutan tertentu R: capsulate diisolasi dengan BL Marrs (komunikasi pribadi). Dalam MW442 strain mutan, yang berisi B875 tetapi tidak memiliki B850, penyerapan maxima karotenoid adalah pada panjang gelombang lebih pendek (by7-8nm) dibandingkan dengan strain di mana B850 adalah dominan. Hal ini diantisipasi bahwa teknik solubilisasi ringan diuraikan di sini akan berlaku untuk bakteri fotosintetik lain dan yang tidak sempurna diselesaikan sampai sekarang B890kompleks (36) sekarang dapat diperiksa lebih terinci. Selain itu, kompleks II-IX, yang berisi B875 dan B850 komponen antena, masih terkait dapat memberikan model eksperimental yang berguna untuk studi migrasi energi antara komponen antena yang berbeda.
10
11