Anda di halaman 1dari 22

A.

Prinsip Dasar HPLC Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut : dengan bantuan pompa fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detector. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solute-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solute-solut tersebut akan keluar kolom dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram kromatografi gas. Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Computer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC. B. Instrumentasi Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi Instrumentasi Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi, yaitu: 1. Fasa Gerak Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelariut. Berbeda dengan kromatografi gas, HPLC mempunyai lebih banyak pilihan fasa gerak, dibandingkan dengan fasa gerak untuk kromatografi gas. Dalam kromatografi gas, fasa gerak hanya sebagai pembawa solute melewati kolom menuju detector. Sebaliknya dalam HPLC, fasa gerak selain berfungsi membawa komponen-komponen campuran menuju detector, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solute-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan. Persyaratan fasa gerak HPLC Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhi beberapa persyaratan berikut: 1. zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan di analisis. 2. zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat menganggu interpretasi kromatogram. 3. zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom. 4. zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun. 5. zat cair tidak kental. 6. sesuai dengan detektor. Jenis fasa gerak Fasa gerak untuk kromatografi partisi, adsorpsi, dan penukar ion bersifat interaktif dalam arti fasa gerak berinteraksi dengan komponen-komponen cuplikan. Akibatnya, waktu retensi sangat dipengaruhi oleh jenis pelarut. Sebaliknya fasa gerak untuk kromatografi eksklusi bersifat non interaktif. Oleh karena itu, waktu retensi dengan kromatografi ini tidak bergantung pada komposisi fasa gerak.

2. Pompa Pompa dalam HPLC dapat dianalogikan dengan jantung pada manusia yang berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus. Pompa yang dapat digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan : 1. Menghasilkan tekanan sampai 600 psi (pons/in2) 2. Keluaran bebas pulsa 3. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit 4. Bahan tahan korosi Dikenal tiga jenis pompa yang masing-masing memiliki kenutungan dan kekurangannya yaitu pompa reciprocating, displacement dan pneumatic. Pompa reciprocating Jenis pompa ini sekarang banyak dipakai. Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa batang gelas dan berkontak langsung dengan pelarut. Pompa displacement Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang digerakan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung tekanan baik kolom dan viskositas pelarut. Selain itu, keluaran pompa ini bebas pulsa. Akan tetapi pompa ini keterbatasan kapasitas pelarut (~250 mL) dan tidak mudah untuk melakukan pergantian pelarut. Pompa pneumatic Dalam pompa ini pelarut di dorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunyai keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan tekanan balik kolom. 3. Unit Sistem Penyuntikan atau Penginjeksian Sampel Kadang kala, faktor ketidaktepatan pengukuran HPLC terletak pada keterulangan pemasukan cuplikan ke dalam peking kolom. Masalahnya, kebanyakan memasukan cuplikan ke dalam kolom dapat menyebabkan band broadening. Oleh karena itu, cuplikan yang dimasukkan harus sekecil mungkin, beberapa puluh mikroliter. Selain itu, perlu diusahakan tekanan tidak menurun ketika memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak. Berikut beberapa teknik pemasukan cuplikan ke dalam sistem HPLC : 1. Injeksi Syringe Alat yang paling dulu dan paling mudah untuk memasukkan cuplikan adalah syringe. Syringe disuntikkan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan tekanan sampai 1500 psi. akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikit lebih baik dari 2-3 % dan sering lebih jelek. 2. Injeksi stop-flow Injeksi stop-floe adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliran pelarut dihentikan sementara, sambungan pada ujung kolom dibuka dan cuplikan disuntikan langsung ke dalam ujung kolom. Setelah menyambungkan kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali. 3. Kran Cuplikan Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak digunakan. Untuk memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dua langkah: (a) sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi load, cuplikan masih berada dalam loop, (b) kran diputar untuk mengubah posisi load menjadi posisi injeksi dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom. Loop dapat diganti-ganti dan tersedia berbagai ukuran volume dari 5 hingga 500L. Dengan sistem pemasukan cuplikan ini memungkinkan memasukkan cuplikan pada tekanan 7000 psi dengan ketelitian tinggi. Juga loop mikro tersedia dengan volume 0,5 hingga 5 L.

4. Kolom Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada juga yang terbuat dari gelas berdinding tebal. Kolom utama berisi fas diam, tempat terjadinya pemisahan campuran menjadi komponen-komponennya. 5. Detector Berbagai detector untuk HPLC telah tersedia, walaupun demikian detector harus memenuhi persyaratan berikut: (1) cukup sensitive; (2)stabilitas dan keterulangan tinggi;(3) respon linear terhadap solute; (4) waktu respon pendek sehinggatidak bergantung kecepatan alir ;(5)realibilitas tinggi dan mudah digunakan; (6) tidak merusak cuplikan. Detector HPLC dikelompokan ke dalam tiga jenis, yaitu: detector umum memberi respon terhadap fasa gerak yang dimodulasi dengan adanaya solute. Sebaliknya, detector sepesifik memberi respon terhadap beberapa sifat solute yang tidak dimiliki oleh fasa gerak. Terakhir, detectoe yang bersifat umum terhadap solute setelah fasa gerak dihilangkan dengan penguapan. Detector berdasarkan absorpsi UV merupakan detector HPLC yang paling banyak di pake. Detector elektrokimia paling banyak dipakai terutama dalam HPLC penukar ion. C. Cara Kerja HPLC Mula-mula solven diambil melalui pompa. Solven ini dikemudian masuk ke dalam katup injeksi berbutar, yang dipasang tepat pada sampel loop. Dengan pertolongan mikrosiring, sampel dimasukan ke dalam sampel loop yang kemudian bersama-sama dengan solven masuk ke dalam kolom. Hasil pemisahan dideteksi oleh detector, yang penampakannya ditunjukan oleh perekam (pencatat = recorder). Tekanan solven di atur dengan pengatur dan pengukur tekanan. Pompa pemasuk solven pada tekanan konstan hingga tekanan kurang lebih 4500 psi dengan laju alir rendah, yakni beberapa milliliter per menit. Rekorder menghasilkan kromatogram zat-zat yang dipisahkan dari suatu sampel. Tahap pemekatan dengan ekstraksi solven dan penguapan untuk memperkecil volum sering kali diperlukan sebelum pengerjaan sampel dengan HPLC. Hal ini terutama sering dilakukan untuk analisis senyawa-senyawa hidrokarbon aromatic polisiklik (PAH) atau residu pestisida dalam makanan. Sebagai alternative lain, sampel air dapat di absorpsi oleh suatu adsorben padat (C8 atau C18 yang terikat pada silica gel), diikuti dengan desorpsi dalam suatu solven yang kemudian langsung dimasukan kedalam kolom. Suatu solven dengan polaritas rendah, misalnya CH3 berair yang secara bertingkat mengalami perubahan menjadi CH3OH murni, menjamin pemisahan yang baik pada C-18 yang terikat pada silica gel. D. Kelebihan HPLC Dibandingkan dengan kromatografi gas, kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT atau HPLC = High Performance Liquid Chromatography) mempunyai beberapa kelebihan. Beberapa kelebihan KCKT diantaranya ialah 1. dapat dilaksanakan pada suhu kamar. 2. cepat dan mudah melaksanakannya. 3. peka, detektor HPLC dapat divariasi dan unik. 4. pelarut pengembang bisa dipakai berulang kali demikian juga dengan kolomnya. 5. ideal untuk molekul besar dan ion. 6. mudah memperoleh cuplikan. 7. daya pisahnya baik. 8. dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang di analisis. 9. HPLC juga dapat menganalisis senyawa yang tidak mudah menguap dan termolabil.

E. Aplikasi HPLC Dalam Kehidupan HPLC juga cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. Minyak atsiri terdiri atas campuran yang sangat rumit dan oleh karena itu HPLC berguna untuk memisahkan campuran rumit menjadi golongan-golongan senyawa atau memisahkan golongan senyawa menjadi komponen-komponennya. HPLC digunakan untuk memisahkan golongan minyak, misalnya terpenoid tinggi, segala senyawa jenis fenol, alkaloid, lipid dan gula. HPLC baik digunakan untuk senyawa yang dapat dideteksi di daerah spekrum UV atau spectrum sinar tampak. Kolom yang tersedia mempunyai banyak sekali pelat teori (lebih dari 100.000 untuk kolom 100 cm), dan kromatografi dilakukan dalam kondisi mendekati kondisi ideal demikian rupa sehingga dapat diperoleh dalam beberapa menit dan ditafsirkan secara kuantitatif dengan ketepatan yang lumayan. Cuplikan dapat dipisahkan secara preparative. IV. KESIMPULAN Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan analit berdasarkan kepolarannya, dengan fase diam berupa kolom dan larutan tertentu sebagai fase geraknya Instrumentasi HPLC yaitu: 1. Fasa Gerak 2. Pompa 3. Unit Sistem Penyuntikan atau Penginjeksian Sampel 4. Kolom 5. Detector Dibandingkan dengan kromatografi gas, kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT atau HPLC = High Performance Liquid Chromatography) mempunyai beberapa kelebihan. HPLC digunakan untuk memisahkan golongan minyak, misalnya terpenoid tinggi, segala senyawa jenis fenol, alkaloid, lipid dan gula.

DAFTAR KEPUSTAKAAN Drs. Soebagio dkk, 2002, KIMIA ANALITIK II, Malang: JICA FMIPA UNM Sumar Hendrayana, 2006, KIMIA PEMISAHAN, Bandung : Rosdakarya Hostettmann, K dkk, 1995, Cara Kromatografi Preparatif, Bandung: ITB

HPLC/KCKT
HPLC / KCKT Kromatografi cair tingkat tinggi: metoda kimia & fisikokimia. Pada KG yg dianalisis harus menguap, berbeda dg KCKT analit dalam cairan (fase gerak) HPLC teori: Prinsip HPLC terlibat dalam pengujian adalah pemisahan senyawa dalam campuran yang lebih efisien dan juga cepat dari pada kromatografi kolomtradisional. Kromatografi cair kinerja tinggi pada dasarnya adalah bentuk peningkatan dari kromatografi kolom. Alih-alih pelarut diizinkan menetes melalui kolom di bawahgravitasi, itu adalah dipaksa melalui tekanan tinggi (> 400 atmosfer) yang membuat jauh lebih cepat. Pada KCKT diperkenalkan penggunaan fase diam yang berdiameter kecil dalam kolom yang efisien. Teknologi kolom partikel kecil (3-5 m) ini memerlukan sistem pompa bertekanan tinggi yang mampu mengalirkan fase gerak dengan tekanan tinggi agar tercapai laju aliran 1-2 mL/menit. Oleh karena sampel yang digunakan sangat kecil (< 20 g) maka diperlukan detector yang sangat peka. Kelebihan: memisahkan molekul2 dr suatu campuran mudah melaksanakannya kecepatan analisis n kepekaan tinggi menghindari dekomposisi resolusi yg baik mnggunakan berbagai macam detector dapat dgnakan kmbali mudah mlkukan sample recovery Kekurangan : -Ini adalah teknik yang mahal karena memerlukan instrumentasi mahal HPLC, kolom dan juga menggunakan kemurnian nilai tertinggi dari pelarut, buffer, dll -Bekerja pada HPLC membutuhkan proses berat sebelum estimasi seperti filtrasi,degassing, dll derivatisasi -Sistem operasi membutuhkan pelatihan sebelum HPLC dan efektif HPLCpemecahan masalah keterampilan. -Data yang diperoleh HPLC adalah non-homogen dan tidak pernah tanpa kebisingan (fluktuasi) dan kesalahan selama estimasi. Sistem dan Instrumen KCKT Sistem KCKT terdiri dari dua sub sistem yaitu sub sistem pemisahan dan sub sistem pendeteksian (detektor).

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

1. Sistem pemisahan : sistem pemasok pelarut dengan bagian utamanya a. pompa yang mengalirkan pelarut b. sampel (yang diinjeksikan melalui injektor) kedalam kolom. 2. Sistem pendeteksian terdiri dari detektor yang dihubungkan pada ujung akhir kolom. System KCKT Pemisahan n Pemasok pelarut sampel detektor pendeteksia

Skema PompapelarutkolomdetektorkoleksiKCKT preparatif Suntikan sample integrator limbah 1. Pompa Sistem pompa bertekanan tinggi mengalirkan pelarut / fase gerak dari bejana pelarut ke kolom melalui pipa tekanan tinggi. Jenis pompa yang dipakai : pompa pneumatik, pompa endesakan tetap dan pompa torak. Laju aliran pelarut = 1-3 mL/menit, tekanan = 500-6000 psi. 2. Sistem injektor sampel sampel diinjeksikan langsung kedalam aliran pelarut dalam kolom dengan semprit mikro melalui septum injektor menggunakan diafragma atau tanpa diafragma. yang banyak dipakai adalah sistem suntik katup kitar (loop valve).. Volume suntik biasanya 10-50 L dengan keterulangan 0,1%. 3. Kolom Kolom KCKT terbuat dari pipa baja tahan karat. Panjang kolom antara 1030 cm , diameter dalam 4,5-5,0 mm. dua jenis kolom: kolom preparatif dan kolom analitik. Kolom untuk pemisahan analitik: diameter dalam yang kecil (2-4 mm). Kolom dapat dipanaskan sampai 60oC agar dihasilkan pemisahan yang lebih efisien. Ujung-ujung kolom dihubungkan dengan pipa baja tahan karat melalui fiting dan terminator dari pompa/injektor di ujung yang satu dan pada ujung yang lain dihubungkan dengan detektor. Arah pengaliran fase gerak harus selalu sama. 4. Detektor Detektor dihubungkan dengan pipa baja tahan karat atau pipa jenis lainnya dengan ujung keluaran kolom. memantau aliran pelarut yang keluar dari kolom dalam waktu yang sebenarnya. Jenis detektor untuk deteksi adalah detektor indeks bias, ultraviolet sinar tampak, fluoresensi, elektrokimia dan spektrometri massa.

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)


MAKALAH KROMATOGRAFI PENDAHULUAN Kromatografi merupakan pemisahan fisiko kimiawi. Pemisahan ini dapat terjadi kalau interaksinya berulang. Kita dapat mengetahuinya dengan kuantitas ulangan yang dinyatakan dengan teori plate (terjadi pada setiap lempeng, banyaknya lempeng dinyatakan dengan N). N = Makin banyak N, pemisahan akan mengalami peningkatan dengan kesetimbangan interaksi. Makin banyak N terjadi pelebaran puncak, karena : Senyawa tersebut berjalan ke bawah mengalami difusi kalau dibawa fase gerak. Persamaan Van Deemter : H = Dasar yang digunakan dalam pemisahan adalah : 1. Pemisahan secara fisiko - kimiawi yang melibatkan interaksi antar fase gerak, fase diam, dan sampel. 2. Fase diam dan fase gerak yang digunakan. Solute CAIR KINERJA TINGGI KROMATOGRAFI (KCKT)

fase Kalau Solute fase

gerak geraknya

fase gas

diam :

fase

gerak pada melihat dengan dengan berdasrkan KINERJA

fase

diam

Interaksi yang terjadi 1. Adsorbsi, dengan 2. Partisi, 3. Afinitas, 4. Ion Exchange, KROMATOGRAFI CAIR

kromatografi, yaitu : perbedaan stereochemistry melihat kelarutan melihat BM perbedaan muatan TINGGI (KCKT)

Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. KCKT paling sering digunakan untuk : menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam- asam nukleat, dan proteinprotein dalam cairan fisiologis; menetukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi. Pada HPLC terdapat kolom terbuka yaitu : 1. Low pressure (tekanan rendah) 2. High pressure (tekanan tinggi 76 bar biasanya memakai satuan kpa/kilo paskal).

Pada HPLC terdapat oven untuk pemanas karena pada partikel kecil, cairan ditekan terjadi gesekan maka digunakan pendingin dan tekanan tinggi (cairan ditekan menggunakan pompa kemudian didorong, jika ditarik cairan masuk). Tekanan harus 76 bar, antara fase diam dan fase gerak terjadi gesekan sehingga temperatur meningkat maka harus diturunkan (dengan pendingin liebig/ ion exchange) karena ikatannya bisa lepas dan bisa juga terjadi bleeding. Temperatur pada HPLC digunakan untuk menjaga temperatur dalam kolom konstan sehingga KD tetap. A. Prinsip kerja Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah. Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alkohol < golongan asam. B. Instrumentasi 1. Pompa Pompa pendesakan tetap dapat dibedakan menjadi pompa torak dan pompa semprit. Pompa torak menghasilkan aliran yang berdenyut jadi memerlukan peredam denyut atau peredam elektronik untuk menghasilkan garis alas detektor yang stabil jika detektor peka terhadap aliran. Pompa semprit menghasilkan aliran yang tak berdenyut, tetapi tandonnya terbatas. 2. Injektor Cuplikan harus dimasukkan ke dalam pangkal kolom (kepala kolom), diusahakan agar sesedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Ada dua ragam utama aliran henti dan pelarut mengalir. Ada 3 macam system injector, yaitu : a. stop flow : aliran dihentikan, injeksi dilakukan padakinerja atmosfir, system tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil dan resolusi tidak diperngaruhi. b. Septum : septum yang digunakan pada kckt sama dengan yang digunakan pada kromatografi gas. Injector ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injector) dapat menyebabkan penyumbatan. c. Loop valve : tipe injector ini umumnya digunakan unutk menginjeksi volume lebih besar dari 10 dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunkan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi load, sampel diisi ke dalam loop pada kinerja atmosfir, bila valve difungsikan, maka sampel akan masuk dalam kolom. 3. Kolom Kolom merupakan jantung kromatograf. Keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung pada pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi menjadi kolom analitik dan kolom preparatif. 4. Detektor Detektor diperlukan untuk mengindera adanya komponen cuplikan di dalam eluen kolom dan mengukur jumlahnya. Detektor yang baik sangat peka, tidak banyak berderau, rentang tanggapan liniernya lebar dan menanggapi semua jenis senyawa.

Jenis-jenis UV Retraktif

indeks konduktifitas Elektrokimia

detektor / (RI)

MS

: Vis Detector detector Detector PDA ELSD Detector gerak : cemaran kemasan detektor cuplikan rendah diperlukan wajar :

5. Fase Fase gerak memiliki murni, tidak bereaksi sesuai dapat mempunyai memungkinkan memperoleh dengan harganya Gambar

syarat-syarat tanpa dengan dengan melarutkan viskositas mudah cuplikan

jika

Instrumentasi

C. Macam Macam Optimasi 1,5.Tujuan Optimasi : Memisahkan sampai baseline dengan waktu seminimal mungkin. Rs yang bagus 1. Optimasi Efisiensi Kolom Adalah jumlah keterulangan interaksi. Efisiensi kolom dapat diukur N, yaitu kemampuan memberikan small bath. N akan maximal bila H minimal. Efisiensi kolom dapat dilakukan dengan Van Deemter equation : N = L / HETP N = 5,54 ( tR / W)2 N dapat diperoleh dari hasil kromatogram dengan menginjeksikan suatu senyawa sehingga mendapatkan puncak. Cara meminimalkan HETP : 1. difusi eddy ( A ) o supaya cairan tidak kemana-mana perlu memperkecil partikel o kerapatannya diperbesar 2. difusi longitudinal (B) o memperkecil diameter partikel, kerapatan diperkecil o u dipercepat, u = kecepatan alir fase gerak o temperatur kolom diturunkan untuk mengatasi difusi laminer 3. non equilibrium mass transfer ( C ) terjadi karena fase gerak ditambah terus sebelum terjadi keseimbangan o partikel diperkecil, luas area makin besar o ketebalan fase diam cair makin tipis o kerapatan diperbesar, u diperlambat supaya terjadi kesetimbangan o temperatur dinaikkan 2. Optimasi Selektivitas

Untuk menentukan kemampuan kolom memisahkan. Tergantung dari sifat-sifat senyawa dan memilih berbagai interaksi yang ada dalam kolom. adsorpsi perbedaan pada stereokimia ( orto : lebih cepat dilepaskan ke fase gerak sedangkan para : paling lama dilepaskan 2 tangan terikat) partisi perbedaan pada kelarutan senyawa-senyawa yang akan dipisahkan ion exchange pada muatan senyawa-senyawa 3. K ns = nm = dengan mengubah tersebut Optimasi ns / molekul dalam fase molekul dalam fase fase gerak kelarutan dalam fase gerak akan Kapasitas nm diam gerak senyawa berbeda.

= jumlah jumlah komposisi

D. Jenis-jenis KCKT Dilihat dari jenis fase diam dan fase gerak, KCKT (kolomnya) dibedakan menjadi: a. Kromatografi fase normal Kromatografi dengan kolom konvensional dimana Fase diam : normal (bersifat polar), misalnya Silika gel Fase gerak : bersifat non polar b. Kromatografi fase terbalik Fase diam : sifatnya non polar, misalnya Silika gel direaksikan dengan klorosilan Fase gerak : bersifat polar Keuntungan kromatografi fase terbalik : Senyawa yang polar akan lebih baik pemisahannya Senyawa ionic dapat dipisahkan Air dapat digunakan sebagi pelarut E. a. Keuntungan dan Kerugian Keuntungan

Cepat : Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai Selektif : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan. Peka : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT.

Kolom dapat dipakai lagi : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan. Ideal untuk molekul besar dan ion : zat zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat zat tersebut. Mudah memperoleh kembali sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah sikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus.

b.

Sampel Perlu

yang tenaga

digunakan ahli

Kerugian Mahal jumlahnya sedikit untuk mengoperasikan

Daftar

Pustaka

A. Shafaati and B.J.Clark.J Pharm. Biomed. 1996 Anal.14,1547-1554 Christian G.D., 2003, Analytical Chemistry, Sixth, John Wiley & Sons Inc,New York Mulja.Muhammad, Suharman,1995, Analisis Instrumental, Airlangga University Press, Surabaya Sastrohamidjojo,Harjono, 2005, Kromatografi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta Skoog,DA,Holler,FJ,and West DM,1994,Analytical Chemistry, Six Edition, Hardcourt Grace College,Florida Underwood,A.L, 1996, Analisis Kimia Kuantitatif, 554, Penerbit Erlangga, Jakarta Watson, D.G.,1999,Pharmaceutical Analysis, Churchill Livingstone,Edinburg

HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini menjelaskan bagaimana pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom. HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat. HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran. Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini sangat otomatis dan sangat peka. Diagram alir HPLC

Pada umumnya windows program HPLC menampilkan urutan dari proses kerja HPLC, terlihat pada gambar (warna hijau) dimulai dari injeksi sampel-pompa(flow eluent)-kolom (terdapat dalam termostat)-detector-proses perhitungan hasil (kromatogram). Gambar di atas sebagai contohnya. Mari bro kita pelajari tiap bagiannya Injeksi sampel (port injection) Bagian ini ada yang manual dan otomatis. Tapi disini saya tunjukkan port injection manual. Pada proses ini meliputi tekanan dan flow eluent. Dimana besarnya volume sampel yang diinjeksi hanya sekitar 10 l, dengan alat penginjeksi yang disebutsyringe. Kolom dan pelarut Membingungkan!! (ya benar, itu kesan pertama kali saat kita mempelajari fase dalam kromatografi, untuk itu mari kita mempelajari secara bertahap).

Pada gambar diterangkan bahwa pada analisa kali ini menggunakan perlarut polar. Dimana tiap pelarut dapat diatur perbandingannya secara otomatis. Ex: perbandingan water : acetonitril = 40 : 60 dan setiap analisa, tiap senyawa menggunakan perbandingan yang berbeda. Flow dan preasure dikerjakan oleh pompa, dari mengambil pelarut dalam botol hingga menyalurkan pelarut ke dalam kolom. Ada dua perbedaan dalam HPLC, yang mana tergantung pada polaritas relatif dari pelarut dan fase diam. Fase normal HPLC Ini secara esensial sama dengan apa yang sudah kita baca tentang kromatografi lapis tipis (KLT) atau kromatografi kolom. Walaupun disebut normal, tapi ini bukan merupakan bentuk yang biasa dari HPLC. Dari bagian inilah suatu zat dapat terdeteksi. Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang/lebih dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm. Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom. Fase balik HPLC Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air, methanol dan acetonitril. (ingat bukan air, methanol dan acetonitril biasa, tapi ini khusus untuk HPLC solvent). Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut. Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawasenyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawasenyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom. Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom. Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC. Ini adalah dasar HPLC like disolve liketolong dipahami lebih dalam! Termostat Thermostat dikenal sebagai alat pengatur suhu kolom, di dalamnya terdapat kolom.

Waktu retensi Mengapa pembahasan waktu retensi saya letakkan di bagian kolom? Karena dari kolom inilah senyawa terpisah pada waktu tertentu (waktu retensi). Waktu retensi didefinisikan sebagai waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:

tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut) flow pelarut (berpengaruh pada banyaknya pelarut yang melewati kolom) kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel) komposisi yang tepat dari pelarut

temperatur pada kolom Itu berarti bahwa kondisi harus dikontrol secara hati-hati, jika kita menggunakan waktu retensi sebagai sarana untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa. Detektor Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.

Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika kita menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, kita akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu. Kita akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan menyerap dengan sangat kuat bagianbagian yang berbeda dari specktrum UV. Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada gelombang dibawah 190 nm. Jika kita menggunakan campuran metanol-air sebagai pelarut, kita sebaiknya menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut. Interpretasi output dari detektor Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang kita mengontrol kondisi kolom, kita dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya, kita (atau orang lain) sudah mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.

Kita juga dapat menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur kuantitas dari senyawa yang dihasilkan. Mari beranggapan bahwa tertarik dalam senyawa tertentu, X. Jika kita menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui jumlahnya pada instrumen, kita tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa tersebut, tetapi kita juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).

Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan sama. Misalnya,

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk mengetahu berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil. Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika kita mempunyai dua substansi yang berbeda dalam sebuah campuran (X dan Y), dapatkah kita mengatakan jumlah relatifnya? Kita tidak dapat mengatakannya jika kita menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya.

Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi dapat sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit dibanding dengan X. Ini mungkin ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi jika diserap lemah, ini akan hanya memberikan puncak yang kecil. Rangkaian HPLC pada spektrometer massa Ini menunjukkan hal yang sangat menakjubkan! Pada saat detektor menunjukkan puncak, beberapa senyawa sementara melewati detektor dan pada waktu yang sama dapat dialihkan pada spektrometer massa. Pengalihan ini akan memberikan pola fragmentasi yang dapat dibandingkan pada data komputer dari senyawa yang polanya telah diketahui. Ini berarti bahwa identifikasi senyawa dalam jumlah besar dapat ditemukan tanpa harus mengetahui waktu retensinya. 085696397628 nhanang

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)


00:49 LANSIDA 9 comments

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga disebut dengan Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik. SISTEM PERALATAN HPLC

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut(1). Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.4) Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.2) 2. Pompa

Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.6) 3. Tempat penyuntikan sampel Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.

Posisi pada saat memuat sampel


4. Kolom dan Fase diam

Posisi pada saat menyuntik sampel

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:

Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 l/menit). Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.3] Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan. 5. Detektor HPLC Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia. Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil. Stabil dalam pengopersiannya. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier). Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak. 2)

Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik detektor seperti berikut : Detektor Sensitifitas Kisaran Karakteristik (g/ml) linier Absorbansi Uv-vis -10 4 Fotometer filter 5 x 10 10 Sensitivitas bagus, paling sering -10 5 Spektrofotometer 5 x 10 10 digunakan, selektif terhadap -10 5 spektrometerphoto> 2 x 10 10 gugus-gugus dan struktur-struktur diode array yang tidak jenuh. -12 4 Fluoresensi 10 10 Sensitifitas sangat bagus, selektif, Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak. -7 4 Indeks bias 5 x 10 10 Hampir bersifat universal akan tetapi sensitivitasnya sedang. Sangat sensitif terhadap suhu, dan tidak dapat digunakan pada elusi bergradien Elektrokimia -8 4 Konduktimetri 10 10 Peka terhadap perubahan suhu -12 5 Amperometri 10 10 dan kecepatan alir fase gerak, tidak dapat digunakan pada elusi bergradien. Hanya mendeteksi solut-solut ionik. Sensitifitas sangat bagus, selektif tetapi timbul masalah dengan adanya kontaminasi elektroda. JENIS HPLC Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC

fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut: 1. Kromatografi Adsorbsi Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.3) 2. Kromatografi fase terikat Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat. 3) 3. Kromatografi penukar ion KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin. 4. Kromatografi Pasangan ion Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.2) 5. Kromatografi Eksklusi Ukuran Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.2) DERIVATISASI PADA HPLC Derivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu analit dengan suatu reagen untuk mengubah sifat fisika-kimia suatu analit. Tujuan utama penggunaan derivatisasi pada HPLC adalah untuk: 1. 2. 3. 4. Meningkatkan deteksi Merubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan menghasilkan puncak kromatografi yang lebih baik Merubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik Menstabilkan analit yang sensitif.5)

Detektor yang paling banyak digunakan dalam HPLC adalah detektor UV-Vis sehingga banyak metode yang dikembangkan untuk memasang atau menambahkan gugus kromofor yang akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu. Di samping itu, juga dikembangkan suatu metode untuk menghasilkan fluorofor (senyawa yang mamapu berfluoresensi) sehingga dapat dideteksi dengan fluorometri. 7) Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut, yakni: produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau sinar tampak atau dapat membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri; proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin (100 %); produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi; serta sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidakmenganggu pemisahan kromatografi. 7) Berbagai macam bahan penderivat telah tersedia antara lain : Gugus fungsional Reagen untuk dapat dideteksi Reagen untuk dapat dengan UV-Vis dideteksi dengan Fluoresen Asam-asam p-nitrobenzil-N,N4-bromometil-7kaboksilat; asamdiisopropilisourea (PNBDI); 3,5asetoksikumarin; asam lemak;asamdinitrobenzil-N,N4-bromometil-7asam fosfat diisopropilisourea (DNBDI); pmetoksikumarin; bromofenasil bromida (PBPB) Alkohol 3,5-dinitrobenzil klorida (DNBC); 4dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil (Dabsyl-Cl); 1-naftilisosianat (NIC-1). Aldehid; keton p-nitrobenziloksiamin hidroklorida Dansil hidrazin (PNBA); 3,5-dinitrobenziloksiamin hidroklorida (DNBA); Amin primer Fluoresamin o-ftalaldehid (OPA) o Amin primer (1 ) dan 3,5-dinitrobenzil klorida (DNBC);N7-kloro-4-nitrobenzo-2-oksao sekunder (2 ) suksinimidil-p-nitrofenilasetat 1,3-diazol (NBD-Cl); 7-fluoro(SNPA);N-suksinimidil-3,54-nitrobenzo-2-oksa-1,3dinitrofenilasetat (SDNPA); 4diazol (NBD-F); Dansil klorida dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil (Dabsyl-Cl); 1-naftilisosianat (NIC-1). Asam-asam amino 4-dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil Fluoresamin

(peptida)

(Dabsil-Cl)

o-ftalaldehid (OPA) 7-kloro-4-nitrobenzo-2-oksa1,3-diazol (NBD-Cl); 7-fluoro4-nitrobenzo-2-oksa-1,3diazol (NBD-F);

Derivatisasi ini dapat dilakukan sebelum analit memasuki kolom (pre-column derivatization) atau setelah analit keluar dari kolom (post-column derivatization).