UNIVERSIDAD SALVADOREA ALBERTO MASFERRER FACULTAD DE QUMICA Y FARMACIA

FORMULACIN DE UNA BEBIDA FUNCIONAL CON PROPIEDADES ANTIOXIDANTES A BASE DE TORONJA (Citrus paradasi, variedad Ruby Red) QUE CUMPLA CON LA NORMA SALVADOREA NSO 67.18.01:01 PRODUCTOS ALIMENTICIOS. BEBIDA NO CARBONATADA SIN ALCOHOL

PRESENTADO POR: BR. JULIA GUADALUPE PREZ CALDERN. BR. CLAUDIA STEFANY SANDOVAL CALDERN. PARA OPTAR AL TTULO DE LICENCIADO EN QUMICA Y FARMACIA ASESOR: LIC. JORGE ALBERTO SALOMN HERNNDEZ.

JULIO 2012 SAN SALVADOR, EL SALVADOR, CENTRO AMRICA.

NDICE

INTRODUCCIN. .................................................................................................................................. 6 1. 1.1. 1.1.1. 1.1.2. 1.2. 1.3. 1.4. 1.5. CAPITULO I: FUNDAMENTACIN ................................................................................................ 9 OBJETIVOS ............................................................................................................................... 9 Objetivo general .................................................................................................................. 9 Objetivo especifico .............................................................................................................. 9 ANTECEDENTES DEL PROBLEMA ........................................................................................... 10 JUSTIFICACIN DE LA INVESTIGACIN.................................................................................. 14 HIPTESIS GENERAL .............................................................................................................. 15 DELIMITACION Y ALCANCE .................................................................................................... 16

CAPITULO II. MARCO REFERENCIAL. ................................................................................................. 18 2. 2.1. 2.2. 2.3. 2.3.1. 2.3.1.1. 2.3.1.2. 2.3.1.3. 2.3.2. 2.3.2.1. 2.3.2.1.1. 2.3.3. 2.4. MARCO HISTRICO ................................................................................................................... 18 Toronja .................................................................................................................................. 18 Antioxidantes ........................................................................................................................ 18 MARCO TERICO................................................................................................................... 19 Toronja .............................................................................................................................. 19 Monografa de la Toronja.............................................................................................. 19 Composicin qumica .................................................................................................... 20 Composicin nutricional ............................................................................................... 21 Antioxidantes .................................................................................................................... 22 Flavanonas..................................................................................................................... 22 Narangina ...................................................................................................................... 25 Bebida funcional................................................................................................................ 25 MARCO NORMATIVO ............................................................................................................ 28

CAPTULO III: DISEO METODOLGICO. .......................................................................................... 31 3.1. 3.2. 3.2.1. METODOLOGA DE LA INVESTIGACIN................................................................................. 31 METODOLOGA ANALTICA ................................................................................................... 32 Material y Cristalera ......................................................................................................... 32 2

3.2.2. 3.2.3. 3.2.4. 3.2.5. 3.2.5.1. 3.2.5.2. 3.2.5.2.1. 3.2.5.2.2. 3.2.5.3. 3.2.5.4. 3.2.5.4.1. 3.2.5.5. 3.2.5.5.1.

Reactivos ........................................................................................................................... 33 Medios de Cultivo ............................................................................................................. 34 Equipos .............................................................................................................................. 34 Tcnicas e instrumentos ................................................................................................... 36 Formulacin de la bebida .............................................................................................. 36 Normalizacin de la bebida ........................................................................................... 37 Frmula prototipo ......................................................................................................... 37 Ensayos .......................................................................................................................... 37 Prueba de palatabilidad ................................................................................................ 39 Metodologa para la identificacin de antioxidantes ................................................... 40 Identificacin de Narangina por cromografa capa fina................................................ 40 Anlisis Qumico Proximal ............................................................................................. 41 Determinacin de carbohidratos .................................................................................. 41

3.2.5.5.2. Determinacin de protenas (Mtodo de Microkjeldahl). Mtodo Oficial de AOAC 2.057, 14 Edicin ............................................................................................................................. 42 3.2.5.5.3. 3.2.5.5.4. 3.2.5.5.4.1. 3.2.5.5.4.2. 3.2.5.5.4.3. 3.2.5.6. 3.2.5.6.1. 3.2.5.6.2. 3.2.5.6.3. 3.2.5.7. 3.2.5.8. 3.2.5.8.1. 3.2.5.8.2. 3.2.5.8.3. 3.2.5.8.3.1. 3.2.5.8.3.2. Determinacin de cenizas. Mtodo Oficial de AOAC 923.03, 16. Edicin................... 45 Determinacin de microelementos: calcio, fsforo y potasio ...................................... 46 Determinacin de calcio............................................................................................ 47 Determinacin de fsforo ......................................................................................... 50 Determinacin de potasio ......................................................................................... 53 Anlisis Fisicoqumico.................................................................................................... 56 Determinacin de la fuerza del dulzor .......................................................................... 56 Determinacin de Acidez titulable ................................................................................ 57 Determinacin de pH .................................................................................................... 58 Caractersticas organolpticas de la bebida a base de jugo toronja............................. 59 Anlisis microbiolgico.................................................................................................. 60 Recuento de bacterias mesfilas, mtodo de placa vertida (Mtodo USP 29) ............ 60 Recuento de hongos y levaduras, mtodo por placa vertida (Mtodo Oficial USP 29) 61 Determinacin de patgenos ........................................................................................ 62 Determinacin de Salmonella Sp .............................................................................. 62 Determinacin de Echerichia coli.............................................................................. 64 3

3.2.5.8.3.3. 3.2.5.8.3.4. 3.2.5.8.4. 4. 4.1. 4.1.1. 4.1.1.1. 4.1.2. 4.1.3. 4.2. 4.2.1. 4.3. 4.3.1. 4.3.2. 4.3.3. 4.3.4. 4.3.4.1. 4.3.4.2. 4.3.4.3. 4.4. 4.4.1. 4.4.2. 4.4.3. 4.4.4. 4.4.5. 4.5. 4.5.1. 4.5.2. 4.5.4. 4.5.5.

Determinacin de Staphylococcus aureus ................................................................ 65 Determinacin de Pseudomona aeruginosa ............................................................. 65 Determinacin de Coliformes totales y fecales por mtodo placas 3M petrifilm ........ 67

CAPITULO IV: RESULTADOS ....................................................................................................... 70 Normalizacin de la bebida................................................................................................... 70 Frmula de la bebida ........................................................................................................ 70 Ensayos .......................................................................................................................... 70 Prueba de palatabilidad .................................................................................................... 71 Material de empaque de la bebida terminada ................................................................. 74 Metodologa para la identificacin de antioxidantes ........................................................... 75 Identificacin de Narangina por cromografa capa fina.................................................... 75 Anlisis Qumico Proximal ..................................................................................................... 77 Determinacin de carbohidratos ...................................................................................... 77 Determinacin de protenas (Mtodo de Microkjeldahl) ................................................. 78 Determinacin de cenizas ................................................................................................. 80 Determinacin de micro elementos: calcio, fsforo y potasio ......................................... 82 Determinacin de calcio................................................................................................ 82 Determinacin de fsforo ............................................................................................. 84 Determinacin de potasio ............................................................................................. 86

Anlisis Fisicoqumico............................................................................................................ 88 Determinacin de la fuerza del dulzor .............................................................................. 88 Determinacin de Acidez titulable .................................................................................... 89 Determinacin de pH ........................................................................................................ 91 Humedad ........................................................................................................................... 92 Caractersticas organolpticas de la bebida a base de jugo toronja................................. 94 Anlisis microbiolgico.......................................................................................................... 95 Recuento de bacterias mesfilas, mtodo de placa vertida (Mtodo USP 29) ................ 95 Recuento de hongos y levaduras, mtodo por placa vertida (Mtodo Oficial USP 29).... 96 Coliformes totales por mtodo petrifilm 3M .................................................................... 97 Determinacin de patgenos ............................................................................................ 98 4

4.5.6. 4.6.

Estabilidad Microbiolgica ................................................................................................ 99 Composicin de bebida funcional de Toronja .................................................................... 100

CONCLUSIONES ............................................................................................................................... 103 FUENTES CONSULTADAS ................................................................................................................. 117

INTRODUCCIN.
La toronja (Citrus paradasi, variedad Ruby Red) es una fruta que mediante estudios realizados en ella ha presentado una infinidad de propiedades que dan beneficio al ser humano entre ellas la propiedad antioxidante, en El Salvador se cuenta con la riqueza tropical para promover el cultivo de toronja como un nuevo sector productivo en la agro-industria, dando a conocer los beneficios de esta fruta tropical por lo consiguiente surge el desarrollo de un producto para el aprovechamiento de la toronja, dicha especie vegetal la cual fue proporcionada en el Centro Nacional de Tecnologa Agropecuaria y Forestal (CENTA), San Andrs, Departamento de La Libertad para estudiar las propiedades que esta posee siendo cultivado en El Salvador ya que el fruto no es nativo del pas.

Las bebidas funcionales son bebidas sin alcohol, que contienen en su formulacin uno o ms ingredientes funcionales que demuestran mejorar el estado de salud y reducir el riesgo de enfermedades. La investigacin est dirigida en aprovechar las propiedades teraputicas de la toronja. Por lo que se elaboro una bebida funcional a base del jugo o zumo de toronja (Citrus paradasi, variedad Ruby Red); a la cual se le atribuye propiedades antioxidantes, derivadas del metabolito secundario que posee la toronja el cual es la Narangina. Los antioxidantes son sustancias que reaccionan qumicamente capturando el hidrogeno de otras conocidas como radicales libres; los cuales evitan el envejecimiento de las clulas que afectan deteriorndolas. Los antioxidantes son molculas capaces de retardar o prevenir la oxidacin de otras molculas. La oxidacin es una reaccin qumica de transferencia de electrones de una sustancia a un agente oxidante.

Para lograr una bebida estable fue necesario realizar pruebas importantes que cumplan con los requisitos que la Norma Salvadorea Obligatoria NSO N 67.18.01: 01 Productos Alimenticios. Bebida No Carbonatada Sin Alcohol, en donde establece los siguientes parmetros fsico qumicos como: Brix, acidez
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titulable, pH; tambin parmetros microbiolgicos que definieron la estabilidad del producto siendo estos: Recuento total de hongos y levaduras, Recuento de Organismos Aerbicos y Coliformes Totales y Fecales; y para detallar el aporte nutricional de la bebida se desarroll un anlisis qumico proximal que abarca pruebas de: Protenas, carbohidratos tambin: Calcio, Fsforo y Potasio, todo esto con el fin de garantizar que la bebida puede ser producida para el consumo humano y as ser aprovechada. Una prueba muy importante en la investigacin se basa en la identificacin de Narangina por medio del mtodo de cromatografa en capa fina componente que no ha sido estudiado en el pas. La aceptacin de cualquier producto es fundamental por lo que una prueba de palatabilidad con un panel no estrenado de 100 personas es necesaria para decidir que ensayo cumple, no solo con todos los requisitos fisicoqumicos, de estabilidad y nutricionales, sino tambin con las caractersticas organolpticas que el pblico desee para seleccionarla como la frmula normalizada de ah donde el

edulcorante que fue seleccionado para la bebida fue sacarosa ya que esta proporciona un sabor ms agradable segn los encuestados.

ii

CAPITULO I
FUNDAMENTACIN.

1. CAPITULO I: FUNDAMENTACIN.

1.1.

OBJETIVOS.

1.1.1. Objetivo general. Formular una bebida funcional a base de toronja (Citrus paradasi, variedad Ruby Red) con actividad antioxidante determinando su aporte nutricional y determinando la presencia Narangina en la bebida funcional por medio del mtodo de cromatografa de capa fina.

1.1.2. Objetivo especifico. Normalizar y estabilizar una bebida funcional a base jugo de toronja (Citrus paradasi, variedad Ruby Red), cultivada en El Salvador. Realizar un anlisis qumico proximal de la bebida funcional, a base de extracto puro, del fruto del rbol de toronja (Citrus paradasi, variedad Ruby Red). Realizar un anlisis fisicoqumico de acuerdo a lo establecido en la Norma Salvadorea Obligatoria NSO N 67.18.01: 01 Cualificar el contenido de Narangina presente en el jugo de toronja por el mtodo de cromatografa en capa fina. Realizar la prueba de estabilidad de acuerdo a la Norma Salvadorea Obligatoria NSO N 67.18.01: 01. Realizar un estudio de palatabilidad de la bebida funcional mediante un panel no profesional de 100 personas.

1.2.

ANTECEDENTES DEL PROBLEMA.

Para realizar el presente trabajo de investigacin se realiz una revisin de tesis, en las que los procedimientos utilizados son similares a los que se llevarn a cabo con respecto a la composicin nutricional de la Toronja. La revisin se llev a cabo en las bibliotecas de: Universidad de El Salvador (UES), Universidad Salvadorea Alberto Masferrer (USAM) y Universidad Dr. Jos Matas Delgado. No se encontr informacin sobre la toronja o la Narangina pero en la Universidad Salvadorea Alberto Masferrer (USAM) se encontr la informacin requerida en esta parte de la investigacin que eran los mtodos a utilizar, consultando los siguientes documentos: Tesis: Anlisis Qumico Nutricional del Fruto del Noni (Morinda citrifolia L.) que se cultiva en El Salvador Universidad Salvadorea Alberto Masferrer, Facultad de Qumica y Farmacia, Agosto 2009 Presentado por: Deisi Maricela Chirino Maldonado, Mara del Roco Snchez Cabezas Consiste en el anlisis nutricional del fruto de Noni, basndose que este fruto tiene una gran aplicacin en El Salvador en el sector de la medicina natural. Segn la investigacin es importante dar a conocer por los diferentes mtodos analticos como lo son: humedad, Protenas (mtodo de microkjeldahl), ceniza, grasa, fibra cruda, carbohidratos tomados de mtodos oficiales Association of Official Analytical Chemists (AOAC). Todo esto con el fin de presentar la composicin nutricional del fruto que en El Salvador era cultivado en grandes extensiones territoriales por su gran demanda.

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 Tesis: Formulacin de una mezcla de polvo a base de aislado de soya para elaborar un postre similar al yogurt Universidad Salvadorea Alberto Masferrer, Facultad de Qumica y Farmacia; El Salvador; Septiembre de 2009. Presentado por: Guillermo Tomas Galn Pacas; Jorge Alberto Marroqun Palacios Esta investigacin se basa en un producto innovador, una leche en polvo a base de aislado de soya para elaborar un postre similar al yogurt, que ofrece un importante aporte como opcin nutricional ya que la soya es considerada un alimento completo que aporta nutrientes esenciales para el organismo, realizando anlisis de estabilidad y proximal que respaldara el producto se formulo el polvo. Tesis: Elaboracin de una bebida proteica a partir de extracto acuoso de achiote (Bixa orellana) y aislado proteico de soya (Glycine max.L) Universidad Salvadorea Alberto Masferrer, Facultad de Qumica y Farmacia; El Salvador; Agosto del 2008 Presentado por: Karla Patricia Chevez Melgar; Ana Gladis Robles Moreno. La investigacin de bebidas que aporten ms beneficios nutricionales a las personas ha tomado mucha importancia, y usar componentes naturales en su mayora le da un agregado muy importante, esta investigacin se basa en agregar un colorante de origen natura como lo es un extracto acuoso de achiote (Bixa orellana) para vendr una coloracin a la bebida proteica de soya, estabilizando la bebida para que cumpliera con las propiedades fisicoqumicas, de estabilidad que demanda una bebida de este tipo. Formulacin de una bebida baja en caloras a partir de jugo de zanahoria y jugo de naranja. Universidad Salvadorea Alberto Masferrer, Facultad de Qumica y Farmacia; El Salvador; Marzo de 2004.
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Presentado por: Idalia Grissel Leiva Barrera, Irma Carolina Echeverra de Sandoval. La combinacin de diferentes frutas forma bebidas con mayores beneficios a la salud, y buscar opciones que ofrezcan menos caloras al organismo es demandado por las personas, por lo que la formulacin de una bebida con la combinacin de frutas con gran cantidad de vitaminas como la zanahoria y la naranja es una aporte significativo, por lo que encontrar la estabilidad, tanto organolptica como microbiolgica es esencial, pero es necesario la adicin de otros componente por lo que la interaccin de estos debe ser medida para no alterar las propiedades de las frutas.

Basndose en las propiedades de la toronja en El Salvador no existe ningn antecedente sobre esta fruta y los beneficios que aporta, por lo s que realiz una investigacin de diferentes artculos cientficos internacionales donde se han enfocado en la investigacin de la propiedad antioxidante que brinda el jugo de toronja; estos artculos son: Artculo: El jugo de toronja tiene efectos para reducir mutaciones en el cido desoxirribonucleico (ADN) y lesiones precancerosas en el colon de modelos animales. Investigacin realizada por el Instituto Politcnico Nacional. Mxico, Agosto 2008. Proyecto de investigacin multidisciplinario presentado por: Eduardo Madrigal Bujaidar, Dra. Isela lvarez Gonzlez, Javier Espinosa Aguirre. Esta investigacin ha sido un aporte cientfico muy importante a la medicina, basada en la propiedad antioxidante que el jugo de extracto fruto ofrece se realizaron pruebas en ratones con un mutgeno como referencia comprando con otro grupo de ratones que eran alterados y tratados con el juego de toronja recin extrado presentando mejoras en un 50 porciento de
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de las criptas aberrantes (lesiones precancerosas) presentes en los animales a los que se administr el jugo. Dados los resultados en los animales en anlisis se presenta la prxima prueba en humanos teniendo referencia sustentable que permite dar aciertos de efectos satisfactorios positivos en esta enfermedad degenerativa. Artculo: Oxidantes-Antioxidantes en Reumatologa Rev. Per Reum. 1997; 3 (1): 35-40 Presentado por: Dr. Carlos Huanqui Guerra Este articulo aborda ampliamente los diferentes mecanismos de las sustancias antioxidantes enfocndose principalmente en las que se encuentra en frutas y vegetales presentando equivalencias en porciones necesarias que el ser humano necesita consumir para obtener el efecto antioxidante que se desea, tambin habla de la clasificacin de antioxidantes y cmo interactan con los radicales libres, previniendo de esta forma la patologa reumtica ayudando a evitar la degeneracin de las clulas daadas por el aumento de radicales libres en el cuerpo.

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1.3.

JUSTIFICACIN DE LA INVESTIGACIN.

Las bebidas funcionales han tomado mucha importancia hoy en da, las personas buscan mejorar su salud de una forma rpida y el consumir productos que contribuyan a mejorarla es demandado en gran medida, ya que las bebidas funcionales son aquellas que demuestran mejorar el estado de salud de las personas que las consumen como tambin el riesgo de padecer enfermedades, ya que siempre estn constituidas por frutas y verduras con propiedades beneficiosas que en las cantidades adecuadas potencializan mecanismos importantes en el organismos como es los antioxidantes, el sector mdico exige un mayor consumo de alimentos que posean antioxidantes ya que estos retienen el envejecimiento de las clulas evitando de esta forma daos irreversibles para dar inicio a enfermedades por lo que es necesario la bsqueda de alternativas en la medicina tradicional llevando as la necesidad de desarrollar diversos mtodos basndonos en las propiedades, que en este caso poseen las frutas y vegetales, por lo tanto surge la propuesta de la formulacin, normalizacin de una bebida funcional a base de toronja (Citrus paradasi, variedad Ruby Red) con propiedad antioxidante formulndose as una bebida funcional, de la cual se identifico si la toronja cultivada en El Salvador poseen los metabolitos secundarios en este caso la Narangina que ejercen el efecto antioxidante deseado. Por otra parte se garantiza el aporte nutricional de la bebida por medio de un anlisis qumico proximal, anlisis fisicoqumico, anlisis de estabilidad donde se obtuvieron resultados favorables donde determina el aporte nutricional que proporciona la bebida sumndole el agregado de su beneficio antioxidante confirmado la presencia del metabolito a diferentes concentraciones, como tambin se elaboro un instrumento de evolucin de la aceptabilidad de la bebida formulada.1

http://www.saludymedicinas.com.mx/articulos/1576/toronja-refrescante-bienestar-para-el-

organismo/5

14

1.4.

HIPTESIS GENERAL.

La bebida funcional a base de toronja (Citrus paradasi, variedad Ruby Red) contiene el antioxidante necesario para inhibir la accin de los radicales libres.

15

1.5.

DELIMITACION Y ALCANCE.

La fruta utilizada en esta investigacin, fue proporcionada por el Centro Nacional de Tecnologa Agropecuaria y Forestal (CENTA) San Andrs, Departamento de La Libertad, que poseen un cultivo del fruto en estudio. A la bebida se le realiz diferentes pruebas que se detallan a continuacin con los lugares donde fueron sometidas: Pruebas Fisicoqumicas y Anlisis Proximal fueron desarrollados en el Laboratorio de Qumica Agrcola (CENTA) Cromatografa de capa fina en la Universidad de San Carlos Guatemala. Prueba de estabilidad Microbiolgica en Laboratorio de Control de Calidad en la Universidad Salvadorea Alberto Masferrer (USAM) Prueba de Palatabilidad en la Universidad Salvadorea Alberto Masferrer (USAM) con un panel no profesional de 100 personas.

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CAPTULO II
MARCO REFERENCIAL

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CAPITULO II. MARCO REFERENCIAL. 2. MARCO HISTRICO. 2.1. Toronja.2 El origen de la toronja causa alguna polmica, ya que algunos investigadores consideran que proviene de la India, mientras que otros sealan que es originaria del archipilago malayo y hay incluso quienes afirman que pudo haber tenido un origen americano.3 En lo que s estn de acuerdo es que es el resultado de una mutacin natural del ctrico llamado shaddock, conocido tambin como pomelo. Otras literaturas relatan que la toronja es probablemente una cruza entre el pomelo (citrus grandis, cscara gruesa y numerosas pepitas) y el limn. La toronja es un hbrido cultivado desde principios del siglo XIX. El fruto es muy perfumado, casi sin pepitas, con una cscara muy fina. La primera descripcin de la toronja data de los aos 1750, donde fue descrita como la "fruta prohibida" de Barbados. En los aos 1820 fue llevada a la Florida, lugar de los Estados Unidos donde an hoy se le cultiva mayormente. El jugo de toronja se ha utilizado en la medicina popular para el tratamiento de la diabetes as como para fortalecer el sistema inmunolgico. 2.2. Antioxidantes.4 El trmino antioxidante fue utilizado originalmente para referirse especficamente a un producto qumico que previniera el consumo de oxigeno. A finales del siglo XIX y a principios del siglo XX, extensos estudios, fueron dedicados a las aplicaciones de antioxidantes en importantes procesos industriales, tales como la prevencin de la corrosin del metal, la vulcanizacin del caucho, y la polimerizacin de combustibles en la formacin de escoria en motores de combustin interna.
2

http://es.osmoz.com/Enciclopedia/Materias-primas/Hesperide/Toronja-Citrus-Paradisi#)

3 4

http://www.atcitrus.com/noticia.asp?seccion=izquierda&id=136 Wolf G (2005). The discovery of the antioxidant function of vitamin E: the Contribution of Henry A. Mattill". J Nutr 135 (3): 3636. 18

2.3. MARCO TERICO. 2.3.1. Toronja. 2.3.1.1. Monografa de la Toronja. Toronja 5 6 Nombre cientfico: Citrus paradisi. Familia: Rutaceae. Gnero: Citrus. Variedad: Ruby Red Reino: Vegetal. Etimologa: conocido como el fruto prohibido. El nombre citrus paradasi, el cual deriva del griego latn, respectivamente: citrus del vocablo kitron, significa limn y paradasi, perteneciente al paraso. Descripcin botnica: Es un rbol que mide de 5 a 15 metros de altura, con el fuste retorcido y ramaje irregular y denso. A veces espinoso en los brotes nuevos y muestra una distintiva porosidad. Son frutos amarillos globosos que miden entre 10 y 15 cm de dimetro y encierran una pulpa jugosa, cida; la pulpa suele ser amarilla clara, pero se han obtenido algunas variedades de endocarpio sonrosado. Su tronco es cort y de copa compacta. Brotes color prpura. Escasa espinosidad. Hojas: Medianasgrandes, algo vellosas, nerviaciones muy marcadas y olor tpico. Flores: Grandes de color verdoso y estambres reducidos. Fruto: Hesperidio el cual consta de: exocarpo (flavedo: presenta vesculas que contienen aceites esenciales), mesocarpo (albedo: pomposo y de color blanco) grueso y endocarpo (pulpa:
5

Montiel, Olga Matha; Pool, Amy; Ulloa Ulloa, Carmen; Stevens, W.D.; Flora de Nicaragua; 85 edicin; 2001;Tomo III, capitulo Rutaceae, pagina consultada: 2291; Nicaragua. 6 Morton, Julia f.; The Atlas of central american Medical plants; 1 edicin; 1982; editorial CCTHOMSON.

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presenta tricomas con jugo) blanco, rosa o rojo. De tamao grande y forma redonda y algo aplastada. Superficie con glndulas prominentes con aceites esenciales. Posee races profundas que requieren de suelos frescos, sueltos y bien drenados. Partes usadas de la planta: Fruto y hojas Posologa: Es suficiente un vaso de 250 mL de zumo o jugo de toronja para que se desarrolle una actividad antienzimtica significativa. Efectos secundarios: hipersensibilidad a cualquier componente qumico de la fruta. 2.3.1.2. Composicin qumica.7 (Ver Tabla No. 1) Tabla No. 1 Composicin qumica. En los frutos verdes. En los pericarpios del fruto Aceite esencial. Aceite esencial. 2, 5% en la cscara desecada. hasta un 2 a 5%. cido d - limoneno. 92%. citral. citronelal. ctrico. steres del linalilo. steres del nerilo. cido mlico. steres del geranilo. 2, 1%. Hetersidos flavnicos amargos. hesperidsido. limonina. narangina. auranciamarina. Neohesperidina

http://www.hipernatural.com/es/plttoronja.html

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2.3.1.3.

Composicin nutricional.

Valores nutricionales: Cada 100 g de toronja contiene: Tabla No. 2 Valores nutricionales de la toronja.8 VALOR NUTRICIONAL DE LA TORONJA EN 100 G DE SUSTANCIA COMESTIBLE Agua 88.4 g Protenas 0.6 g Lpidos 0.1 g Carbohidratos 9.8 g Caloras 39 kcal Vitamina A 80 U.I. Vitamina B1 0.04 mg Vitamina B2 0.02 mg Vitamina B6 0.02 mg cido nicotnico 0.2 mg cido pantotnico 0.25 mg Vitamina C 40 mg cido mlico 80 mg cido ctrico 1460 mg Sodio 2 mg Potasio 198 mg Calcio 17 mg Magnesio 10 mg Manganeso 0.01 mg Hierro 0.3 mg Cobre 0.02 mg Fsforo 16 mg Azufre 5 mg Cloro 3 mg

Monografa de toronja, Comisin Veracruzana de Comercializacin Agropecuaria

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2.3.2. Antioxidantes. Los antioxidantes son compuestos cuya funcin primordial en nuestro organismo es protegernos del dao oxidativo que causan molculas conocidas como entre otras. Dicho dao oxidativo es el responsable de carcter degenerativo del sistema circulatorio,

radicales libres,

importantes enfermedades de

enfermedades cardiovasculares, cataratas, envejecimiento precoz y cncer, todas las cuales hoy son la principal causa de muerte en nuestra sociedad. 9,10 Los radicales libres alteran el buen funcionamiento de las clulas de nuestro organismo, atacando a componentes estructurales claves de las mismas, tales como lpidos y protenas de la membrana celular, enzimas e incluso al ADN, responsable del funcionamiento y renovacin celular.11,12 2.3.2.1. Flavanonas.13

La palabra flavonoide viene del latn "flavus", que significa "amarillo". Son los pigmentos responsables del color otoal de las hojas y de muchas gamas del amarillo, naranja, rojo y azul en flores. Se pueden encontrar en forma libre o unida a azcares formando hetersidos. Las geninas son insolubles en agua pero en forma de hetersido se vuelven hidrosolubles.

Garry G. Duthiea, Susan J. Duthiea and Janet A. M. Kylea. Plant polyphenols in cancer and heart disease: implications as nutritional antioxidants. Nutrition Research Reviews (2000), paginas consultadas:79-106. 10 Francesco Visioli , Andrea Poli, Claudio Gall. Antioxidant and other biological activities of phenols from olives and olive oil. Medicinal Research Reviews. Volume 22, Issue 1 , Pages 65 75. 11 J. R, Gad G. Yousef, Ramon A. Martnez-Peniche and Mary Ann Lila. Antioxidant Capacity of Fruit Extracts of Blackberry (Rubus sp.) Produced in Different Climatic Regions. Journal of Food Science, Volume 70 Issue 7 Pages 497-503, September 2005. 12 http://www.nuestrosninos.com/PDFs/57-antioxidantes.pdf 13 http://books.google.com.sv/books?id=HtNVSa2KWc0C&pg=PT46&dq=accion+terapeutica+de+la +pi%C3%B1a&hl=es&ei=FBNeTILcLcT48AbTr9zHDQ&sa=X&oi=book_result&ct=book thumbnail&resnum=2&ved=0CC4Q6wEwAQ#v=onepage&q&f=false

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En el grupo flavonoides se incluyen todos los compuestos fenlicos cuyo esqueleto est formado por quince carbonos, distribuidos en tres anillos: dos anillos bencnicos de 6 carbonos (A y B), conectados mediante un anillo heterocclico C que puede ser pirano o pirona (si tiene un doble enlace en la posicin 4). En plantas se han descrito ms de 5000 flavonoides naturales y en funcin de su estructura qumica se han clasificado en 6 grupos los cuales son: 1. Flavonas. 2. Flavonoles. 3. Isoflavonas. 4. Flavanoles. 5. Flavanonas. 6. Antocianidinas. Sus efectos principales Se sitan a nivel de las pequeas venas o de los capilares: disminuyen la permeabilidad y aumentan la resistencia (accin vitamnica P). Algunos son diurticos, antiespasmdicos, antiulcerosos, antiinflamatorios, antialrgicos,

antihepatotxicos, antitrombticos, etc. Tambin se les atribuyen propiedades antibacterianas y antifngicas. Algunos se utilizan como colorantes. En general son molculas prcticamente atxicas de buena tolerancia, pero de accin lenta. La naringina pertenece al grupo de las flavanonas.

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Flavanonas. Algunos de los compuestos del grupo de las flavanonas ms importantes son el liquiritsido e isoliquiritsido, que se encuentran en las races y rizomas del regaliz (Glycyrrhiza glabra), y los denominados citroflavonoides, que proceden del pericarpo de diversos ctricos (Citrus sp.).

En general, los citroflavonoides son subproductos de la industria de zumos de frutas, emplendose en especialidades citroflavonoides ms significativos son vasoprotectoras. el Algunos de los (hesperetn-7-

hespersido

hesperidsido), el neohesperidsido (hesperetn-7- neohesperidsido) y el naringsido (naringetn-7-neohesperidsido). Regaliz (Glycyrrhiza glabra) Adems de liquiritsido e isoliquiritsido (flavanonas), contiene saponinas, cumarinas, aceite esencial, esteroles, glcidos y vitaminas del grupo B.

24

2.3.2.1.1. Narangina. IUPAC: 7-2-O-(6-Deoxi--Lmanopiranosil)--D- glucopiranosiloxi 2,3-dihidro-5-hidroxi- 2-(4-hidroxifenil) 4H-1-benzopyran-4-one Formula molecular: C27H32O14 Peso molecular: 580.53 g/mol

Punto de fusin: 165,85 C Usos y aplicaciones Reduce los niveles de colesterol, se le atribuyen propiedades antioxidantes, antiinflamatorias y anticancergenas. En el intestino, la naringina interfiere con la actividad de ciertas enzimas involucradas en la ruptura de ciertos medicamentos, lo que se traduce en un aumento de la concentracin del frmaco en la sangre.

Contraindicacin: aumenta la eficacia del medicamento pero por otro lado puede hacer que sus dosis sean demasiado elevadas.

2.3.3. Bebida funcional.

Bebida funcional. Son bebidas sin alcohol, que contienen en su formulacin uno o ms ingredientes funcionales que demuestran mejorar el estado de salud y reducir el riesgo de enfermedades. Las bebidas funcionales son aquellas que ofrecen beneficios para la salud y el autocuidado; pueden ser funcionales naturalmente como el t (contiene antioxidantes en forma natural) o pueden adicionarse Nutracuticos como el Calcio de Leche, Omegas, Protena aislada de Soya, Fibras, Prebiticos,

25

Probiticos, L. carnitina, Polifenoles, vitaminas, minerales y otros ingredientes que le confieren beneficios especficos que pueden ser declarados en el producto.14 Las bebidas funcionales crecen en todo el mundo dado que los consumidores saben apreciar los beneficios adicionales para la salud prometidos en las mismas y los consideran un valor aadido. Se prev que la demanda general de bebidas funcionales aumentar en toda Europa en un 23% hasta el ao 2009. Se caracterizan por un aporte de componentes funcionales como vitaminas, minerales, fibras, extractos naturales, nutrientes importantes en los procesos fisiolgicos. La variedad es inmensa. El contenido de jugo, aroma, color, viscosidad y sabor se combinan arbitrariamente, aadindose los

correspondientes componentes favorables para la salud. De esta forma se puede crear la bebida especfica de un grupo meta. Cuando hablamos de innovacin en bebidas, todo es posible.15 Tambin es posible en las bebidas basadas en zumos de fruta no carbnicas, el enriquecimiento con ingredientes funcionales. stos pueden ser los conocidos como "Classic Functionals(p. ej. las vitaminas A, C, E, o los minerales como calcio o magnesio), "New Age Functionals(como p. ej. ginseng, ginkgo, t verde) o los llamados "True Functionals como soja y cidos grasos omega-3, cuya repercusin positiva en la salud puede certificarse cientficamente. El componente ms importante para el xito de las bebidas funcionales es el sabor, este es decisivo para que se repita la compra de un producto.16 Existen diferentes conceptos de bebida funcional, muy innovadores, algunos poco o nada desarrollados los cuales son:

14

http://www.revistaialimentos.com.co/ediciones/edicion4/bebidas/bebidas-funcionales-unanecesidad-saludable.htm 15 http://www.alimentacion.org.ar/index.php?option=com_content&view=article&id=1339:bebidasfuncionales-sabor-y-buena-salud&catid=38:publicaciones-especializadas&Itemid=56 16 http://www.wild.de/wild/opencms/es/markets_trends/beverage/growth_categories/functional.html

26

Bebidas con fibras: Las numerosas pruebas realizadas han demostrado claramente que la fibra favorece una digestin ms rpida y eficaz, y que adems, optimiza la eliminacin de las grasas ingeridas. Bebidas enriquecidas: Enriquecida con las vitaminas A, C y E creando una autntica barrera vitamnica. Refuerza el sistema inmunolgico y estimula el crecimiento. Son consideradas bebidas contra el stress oxidativo dado que las sustancias antioxidantes funcionan como una barrera frente al efecto nocivo de los radicales libres sobre el ADN (los genes), las protenas y los lpidos de nuestro cuerpo. Bebidas energticas: El concepto de productos energticos est basado en la cafena como estimulador de cuerpo y mente. Otros ingredientes innovadores en esta rea son el t verde, extracto de yerba mate, revitalizantes como vitamina C y extractos como guaran, nuez cola, etc. Bebidas isotnicas: El empleo de una bebida que contenga disueltas las sales minerales que se pierden durante el ejercicio ser beneficioso para mejorar el rendimiento deportivo. La ventaja de este tipo de preparados es la reposicin rpida de los electrolitos perdidos.

27

2.4. MARCO NORMATIVO. Segn la Norma Salvadorea Obligatoria NSO N 67.18.01:01 Productos Alimenticios. Bebidas No Carbonatadas Sin Alcohol. Especificaciones, toda bebida que sea presentada al pblico debe cumplir con las siguientes especificaciones: Tabla N 3 Requisitos fsicos y qumicos de las bebidas no carbonatadas sin alcohol. CARACTERSTICAS Slidos totales, en porcentaje de masa (m/m)
10

REQUISITOS Mnimo Mximo 11 -

Slidos Solubles por lectura refractomtrica a 20C. Sin corregir la cidez, en porcentaje en masa (Grados Brix).
-

0.5

Acidez titulable, expresada como cido ctrico anhidro, en porcentaje (m/v)

2.4

4.4

pH

Tomando como referencia los lmites permitidos en la tabla N3 esas son las pruebas fsicas y qumicas realizadas a la bebida. Para determinar la estabilidad de la bebida se toma como base los parmetros microbiolgicos que debe cumplir bebidas del tipo 2 detallados en CRITERIOS MICROBIOLOGICOS, que segn la norma son aquellas que cumplen con el almacenamiento adecuado por lo que deben estar ausentes de cualquier hongo o patgeno que cause dao, todo estos requisitos estn detallados en la tabla N 4

28

Tabla N 4. Criterios microbiolgicos para bebidas no carbonatadas sin alcohol del tipo 2. Microorganismos Recuento mximo permitido <1000

Recuento de microorganismos aerobios (mesfilos) en placa, en unidades formadoras de colonias (UFC), por milmetro. <20 Recuento de hongos y levaduras en unidades formadoras de colonias (UFC/mL). <1.11) Bacterias coliformes, en nmero ms probable (NMP) por 100 mL Ausencia Bacterias patgenas
1) Tomado de la norma NSO 13.07.01:97 Agua Potable.

Para la estabilidad segn el numeral 8.1.1. Los envases de los ensayos debern ser incubados a 28 2 C por un periodo de 14 das y luego se examinan.

29

CAPTULO III
DISEO METODOLGICO
.

30

CAPTULO III: DISEO METODOLGICO. 3.1. METODOLOGA DE LA INVESTIGACIN.

La investigacin est enfocada en la formulacin de una bebida funcional que posea las caractersticas que el public demanda para ser consumida, dando un aporte garantizado de ser antioxidante, el artculo publicado por Eduardo Madrigal Bujaidar detalla su investigacin con esta fruta que el jugo de toronja reduce las mutaciones en el ADN como tambin tipos de lesiones precancerosas todo gracias al componente esencial que es la Narangina. Tomando como base lo anterior, fue necesario determinar la metodologa que sera aplicada para desarrollar el estudio tomando como referencia tesis que aporte mtodos que han sido trabajados como el trabajo realizado por : Deisi Maricela Chirino Maldonado, Mara del Roci Snchez Cabezas Anlisis Qumico Nutricional del Fruto del Noni (Morinda citrifolia L.) que se cultiva en El Salvador; Universidad Salvadorea Alberto Masferrer, Agosto 2009 que aporta los mtodos fisicoqumicos aplicados en la investigacin. Para el mtodo cromatografco en capa fina la investigacin realizada por Vielman Cuyun Nancy Judith "Estudio Farmacolgico de los Extractos etanlico, hexnico, clorofrmico, acetato de etilo y acuoso de las hojas de Catopheria chiapensis (Linimento) como analgsico. Fase II." Universidad de San Carlos; paginas 22-23; Guatemala, septiembre 2004 detalla en las condiciones y resultados para identificar la presencia de narangina en el fruto

31

3.2.

METODOLOGA ANALTICA. 3.2.1. Material y Cristalera.

Microesptula. Probetas de 10mL, 25mL,100mL Baln de microkjeldahl 30mL Baln de fondo plano de 250mL Erlenmeyer 125mL, 250mL, 2000mL Gotero Desecador Dedal de cartn de asbesto. Refrigerante. Termmetro. Extractor de grasa. Esptula. Filtro de vidrio. Frasco lavador. Papel filtro Whatman No.40. Embudos plsticos tallo corto. Beaker de 10mL, 50mL, 100mL, 400mL, 600mL Balones volumtricos de 50.0mL y 100.0mL Pipetas volumtricas de 1.0mL, 2.0mL, 5.0mL, y 10.0mL Bureta 25.0mL Cubeta metlica. Tubo de ensayo de 150x16mm Crisol. Placas petri descartables Placas petri de vidrio Gradilla para tubos de ensayo Pipetas Morh 10.0mL, 5.0mL, 2.0mL, 1.0mL

32

3.2.2. Reactivos. Sulfato de cobre AR. Sulfato de potasio AR. Acido sulfrico concentrado. Perxido de hidrogeno 30% Solucin de acido brico al 4% Indicador rojo de metilo y verde de bromocresol. Agua destilada. Agua desmineralizada. Hidrxido de sodio 50% Acido sulfrico 0.025N ter de petrleo AR al 70% Solucin de acido sulfrico 0.0255N Solucin de hidrxido de sodio 0.313N Solucin de cloruro de bario 10%. Fenolftalena 1%. Isopropanol. Acido clorhdrico concentrado. Solucin de lantano al 5% Solucin patrn de carbonato de calcio 1000ppm. Solucin de molibdato de amonio al 5% Solucin de vanadatode amonio al 0.25% Solucin patrn de cloruro de potasio 1000ppm. Acido sulfrico 10N. Solucin buffer pH=4 Solucin buffer pH=7 Solucin de hidrxido de sodio 0.01N. cido Tartrico al 5% Alcohol 70% Fenol al 5%
33

 Solucin Desinfectante 3M Fosfato monobsico de potasio: 34 gramos en 1000mL de agua purificada (madre) y para su uso se diluye 1 mL en 800mL de agua, esterilice y refrigere para usar en las preparaciones.

3.2.3. Medios de Cultivo. Buffer Fosfato pH 7.2 Tripticasa Soya Agar (TSA) Agar papa dextrosa (PD) Caldo Tripticada Soya Agar salmonella.shigella. (S.S) Agar Sulfato de Bismuto (ASUBI) Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) Caldo Rappaport Agar Eosina Azul de Metileno (EMB) Agar Cetrimide Agar Sal manitol (Rojo fenol)

3.2.4. Equipos. Mufla Estufa Cmara de extraccin de vapores Balanza analtica Espectrofotmetro UV Espectrofotmetro de absorcin atmica. Colormetro Autoclave Incubadora 32.5 2.5 C Incubadora 22.5 2.5C
34

 Cuenta Colonias Balanza Semi-Analtica Hot Plate Asa Bacteriolgica Perillas Mecheros Bao de Mara a temperatura controlada pHmetro Micropipetas.

35

3.2.5. Tcnicas e instrumentos.

3.2.5.1.

Formulacin de la bebida.

1. Obtener la fruta 2. Seleccionar la toronja obtenida, cuidando que este en trmino intermedio, que no est muy verde, que no tenga golpes, que no posea partes oscuras y que no est mordida por cualquier animal. 3. Lavar la fruta con agua previamente tratada con cloro dejndola en reposo 5 minutos; (agregar 3 gotas de leja a 1 litro de agua). 4. Cortar la fruta por mitad y por consiguiente extraer las semillas del fruto. 5. Pesar la fruta obtenida en el paso 4. 6. Extraer con un extractor elctrico el jugo o zumo de la fruta con todo y pulpa para obtener la bebida funcional a base de jugo de toronja.

36

3.2.5.2.

Normalizacin de la bebida. 3.2.5.2.1. Frmula prototipo. Tabla N 5. Componentes de la formula prototipo. Componentes generales Jugo de toronja Sacarosa Agua purificada 3.2.5.2.2. Ensayos.

Tabla N 6. Ensayos de Formulacin usando como edulcorante Sacarosa y Miel Natural. Bebida edulcorada con Sacarosa Proporciones 20*/80 30*/70 40*/60 50*/50 60*/40 70*/30 80*/20 Componentes Jugo de 200mL 300mL 400mL 500mL 600mL 700mL 800mL Toronja Sacarosa 10.0g 10.0g 10.0g 10.0g 10.0g 10.0g 10.0g Agua 790 mL 690mL 590mL 490mL 390mL 290mL 190mL Purificada Bebida edulcorada con Miel natural Proporciones 20*/80 30*/70 40*/60 50*/50 60*/40 70*/30 80*/20 Componentes Jugo de 200mL 300mL 400mL 500mL 600mL 700mL 800mL Toronja Miel 10mL 10mL 10mL 10mL 10mL 10mL 10mL Agua 790mL 690mL 590mL 490mL 390mL 290mL 190mL Purificada
Diluciones del extracto, para formular y diluir hasta 1 litro de la bebida funcional.

37

Proporciones Componentes Jugo de Toronja Sacarosa Agua Purificada Proporciones Componentes Jugo de Toronja Miel Agua Purificada

20*/80 200mL 26.5g 773.5mL

Bebida edulcorada con Sacarosa 30*/70 40*/60 50*/50 60*/40 300mL 26.5g 673.4mL 400mL 26.5g 573.5mL 500mL 26.5g 473.5mL 600mL 26.5g 373.4mL

70*/30 700mL 26.5g 273.5mL

80*/20 800mL 26.5g 173.4mL

20*/80 200mL 50mL 750mL

Bebida edulcorada con Miel natural 30*/70 40*/60 50*/50 60*/40 300mL 50mL 650mL 400mL 50mL 550mL 500mL 50mL 450mL 600mL 50mL 350mL

70*/30 700mL 50mL 250mL

80*/20 800mL 50mL 150mL

Diluciones del extracto, para formular y diluir hasta 1 litro de la bebida funcion

38

3.2.5.3.

Prueba de palatabilidad.

Encuesta de la prueba hednica del producto elaborado como una bebida funcional a base de jugo de toronja con accin antioxidante en: Universidad Salvadorea Alberto Masferrer. UNIVERSIDAD SALVADORA ALBERTO MASFERRER FACULTAD DE QUMICA Y FARMACIA Evaluacin de palatabilidad de una bebida funcional con propiedades antioxidantes a base de toronja (Citrus paradasi) Indicaciones: Marque con una x segn sea su respuesta. Sexo: F ________ Preguntas: 1. Le gusto la bebida? S _____ No _____ Mas o Menos _____ M _______ Edad:

2. Qu bebida le gusto ms? Bebida # 1 __________ Bebida # 2 __________

3. Qu es lo que ms le gusto de la bebida? Color: ___________ Olor: ___________ Sabor: __________

4. Qu opina del sabor? Agradable _______ Desagradable _______

39

3.2.5.4.

Metodologa para la identificacin de antioxidantes.

3.2.5.4.1. Identificacin de Narangina por cromografa capa fina. Fundamento Se basa en la separacin, identificacin y determinacin de los componentes qumicos en mezclas complejas. Procedimiento 1. Tomar una alcuota de 1.0mL de extracto en las siguientes

concentraciones: Puro (no presento ninguna dilucin). 60/40 con edulcorante de miel 60/40 con edulcorante de sacarosa 80/20 con edulcorante de miel 80/20 con edulcorante de sacarosa.

2. Cada alcuota ser digerida con 10mL de metanol. 3. Aplicar de 25-40 microlitros, en una placa de silica gel 60F254. 4. Estndar: artemisa al 1% en metanol, (20 microlitros) 5. Fase Mvil: acetato de etilo, metanol, agua (77:15:8) 6. Deteccin: 6.1. Sin tratamiento qumico: UV-365 nm: sustancias con doble enlace conjugado muestran fluorescencia. 6.2. Vainillina acido sulfrico: Visualizacin despus de calentar 10 minutos a 100 C: La Narangina presenta coloracin rojo-violeta.

40

3.2.5.5. Anlisis Qumico Proximal.

3.2.5.5.1. Fundamento

Determinacin de carbohidratos.

El porcentaje de carbohidratos en un alimento se determina por diferencia despus que se han completado los anlisis por la suma de porcentaje de cenizas, porcentaje de grasa, porcentaje de protenas, porcentaje de fibra cruda. Clculos Frmula: % de carbohidratos = 100 (% cenizas + % grasa + % protena + % fibra cruda)

41

3.2.5.5.2.

Determinacin de protenas (Mtodo de Microkjeldahl).

Mtodo Oficial de AOAC 2.057, 14 Edicin. Fundamento El principio bsico de este mtodo consiste en la destruccin oxidativa de los componentes de la muestra, por calentamiento con acido sulfrico concentrado. El material orgnico se oxida a anhdrido carbnico (CO 2) y anhdrido sulfuroso (SO2), mientras que el nitrgeno queda retenido como sulfato de amonio SO4(NH4)2. Luego al ser calentado el sulfato de amonio en presencia de un exceso de hidrxido de sodio es transformado en amoniaco el cual destila sobre un cido estndar dbil para formar la respectiva sal amoniacal, que es titulada con una solucin acida estandarizada. El proceso se acelera mediante catalizadores como: sulfato de cobre. El sulfato de potasio anhidro se agrega para elevar la temperatura de ebullicin del acido sulfrico. Procedimiento Pesar aproximadamente 0.1g de muestra y transferir a baln de Microkjedahl de 30mL y colocar en bao de hielo. Digestin: 1. Adicionar aproximadamente 1 g de catalizador (15g de Sulfato de Potasio + 0.6g de Sulfato de Cobre) a la muestra. 2. Agregar lentamente 2mL de cido Sulfrico Concentrado y dejar reposar durante 15 minutos. 3. Adicionar 2mL de Perxido de Hidrogeno al 30%, previamente enfriado. 4. Calentar la muestra de manera suave al inicio, luego aumentar la temperatura hasta obtener un lquido cristalino color verde - aqua y que no se desprendan humos blancos.

42

5. Enfriar la muestra a temperatura ambiente. Destilacin: 1. Colocar en Erlenmeyer de 250mL la muestra, realizando mltiples lavados con agua a baln de microkjeldahl hasta obtener un volumen de aproximadamente 50mL. 2. Adicionar 10mL de Hidrxido de Sodio al 50 %. 3. Al otro extremo del aparato de destilacin, en Erlenmeyer de 125mL, colocar 8mL de solucin de Acido Brico al 4 % y 3 gotas de indicador de rojo de metilo y verde de bromocresol (0.06 g y 0.099 g respectivamente en 100mL de alcohol). 4. Calentar, cuidando que punta de manguera quede sumergida en la solucin de cido brico (la solucin de cido brico se torna verde con el nitrgeno, al formarse borato de amonio). 5. La destilacin dura de 15-20 minutos y se recolectan de 75mL a 100mL. Titulacin: Titular con solucin de cido Sulfrico 0.025 N hasta que se del vire de verde a rosado claro. Nota: Para el procedimiento anterior analizar muestras por duplicado.

43

Clculos: Frmula:

Donde: N = Normalidad del cido. 0.014 = Miliequivalente del nitrgeno % de protenas = (% de nitrgeno) (Factor de conversin) Factor de conversin: 6.25

44

3.2.5.5.3.

Determinacin de cenizas. Mtodo Oficial de AOAC

923.03, 16. Edicin. Fundamento Las cenizas de los productos alimenticios, esta constituidas por el residuo inorgnico que queda, despus de que la materia orgnica de ha quemado, las cenizas obtenidas no tienen necesariamente la misma composicin que la materia mineral presente en el alimento original, porque puede haber existido perdida por volatilizacin o alguna interaccin entre los constituyentes. Procedimiento 1. Colocar crisoles limpios en mufla a 600 C durante una hora. 2. Secar y pesar crisoles 3. Pesar en crisol aproximadamente 10g de muestra y mantener en mufla a 550 C durante una noche. 4. Enfriar en desecador. 5. Pesar. Nota: Repetir todo el procedimiento anterior con la muestra del fruto seco por duplicado. Clculos Frmulas:

45

3.2.5.5.4. potasio.

Determinacin de microelementos: calcio, fsforo y

Tratamiento de Cenizas para Determinacin de Minerales 1. Humedecer las cenizas (obtenidas en procedimiento para determinacin de cenizas) con agua destilada agregar 5mL de Acido Clorhdrico concentrado. 2. Calentar en Hot Plate hasta sequedad. 3. Agregar 3mL de Acido Clorhdrico concentrado y 10mL de agua. Calentar hasta desprendimiento de humos blancos. 4. Filtrar utilizando papel filtro N 40 a baln de 100.0mL 5. Con agua caliente lavar el crisol para asegurar el arrastre de los minerales y realizar tambin lavados al papel filtro. 6. Enfriar en bao de hielo a 20C y aforar a la marca, obtenindose la Solucin Madre de la Muestra.

46

3.2.5.5.4.1. Determinacin de calcio. Determinacin de Calcio por el mtodo Espectrofotomtrico de Absorcin Atmica. Fundamento El principio de la espectrofotometra de absorcin atmica es medir la energa que absorben los tomos. El elemento de inters en la muestra, no se excita, sino simplemente se disocia de sus enlaces qumicos y se coloca en un estado no excitado y en su estado mnimo de energa. En estas condiciones el elemento es capaz de absorber radiacin externa que es la que se mide. La radiacin con longitud de onda donde ocurre absorcin, se conoce como Lnea de Resonancia. Las seales que se obtienen de los detectores se pueden expandir como porcentajes de absorcin, o en unidades de de absorbancia, utilizando un directamente registrador. en La

concentraciones

forma

picos

espectrofotometra de absorcin atmica se ha considerado libre de interferencia. Tabla N 7.Condiciones del Equipo. Lmpara de ctodo hueco de calcio Longitud de onda Abertura (SLIT) Gas Soporte Condicin de la llama Rango optimo en ppm 422.7 nm 0.7 nm Acetileno Aire Oxidante Hasta 5.0

47

Determinacin Procedimiento: 1. En baln volumtrico de 50.0mL, colocar alcuota de 1.0mL de solucin madre de la muestra, adicionar 2.5mL de Cloruro de Lantano al 5% t aforar con agua desmineralizada. 2. Leer en aparato, absorcin atmica llevando estndares de calcio de las siguientes concentraciones: 1,2 y 4 ppm. 3. Realizar procedimiento por duplicado. Preparacin Estndar 100 ppm 1. Tomar 10.0mL de Estndar de Carbonato de Calcio de 1000 ppm y llevar a baln volumtrico de 100.0mL 2. Aforar utilizando agua desmineralizada. Preparacin de estndares partiendo del estndar de 100 ppm de Calcio. 1. Pipetear la alcuota indicada en la tabla a continuacin del estndar de 100 ppm y llevar a baln de 100.0mL 2. Adicionar a cada baln, 5mL de Cloruro de Lantano al 5% 3. Llevar a volumen con agua desmineralizada.

Tabla N 8. Preparacin de estndares de Ca. Concentracin Estndar Alcuota tomada Volumen de aforo con agua desmineralizada 1 ppm 1.0mL 100.0mL 2 ppm 4 ppm 2.0mL 4.0mL 100.0mL 100.0mL

48

Clculos Frmula:

Donde: W = Peso de muestra Ppm = Lectura de equipo o curva V1 = Volumen inicial V2 = Volumen final A = Alcuota tomada

49

3.2.5.5.4.2. Determinacin de fsforo. Determinacin de Fosforo por el Mtodo Colorimtrico Fundamento El mtodo de Vanadato-Molibdato se basa en la reaccin de Misson. La solucin acida que contiene ortofosfato se trata con un reactivo acido que contiene acido molibdico y acido vandico que da la formacin de un complejo estable de color amarillo encendido de cido vanadomolibdofosforico (H3PO4, VO3M, 11MoO3, NH2O). El desarrollo del color no es afectado marcadamente por la presencia de HCl, H2SO4, Acido actico o ctrico, ni por fluoruros si no estn en cantidades grandes. Este mtodo se considera rpido y sin problemas para ser introducido como oficial. Preparacin de soluciones: Solucin de Vanadato de Amonio al 0.25% 1. Disolver 2.5 g de vanadato de amonio en 500mL de agua caliente y enfriar. 2. Adicionar 350mL de HNO3 concentrado, enfriar, diluir a 1000mL con agua destilada. Solucin de Molidbato de Amonio al 5% 1. Pesar 50 g de Molidbato de Amonio y disolverlos en 700mL de agua caliente, enfriar. 2. Llevar a volumen de 1000.0mL Solucin de Vanadato y Molibdato de Amonio: 1. Preparar minutos antes de ser utilizada. 2. Colocar partes iguales de solucin de Molibdato y Vanadato de Amonio y filtrar.

50

Solucin Stock Patrn de Fsforo: 1. Disolver 0.3509 g de fosfato monopotasico (KH2PO4, el cual ha sido previamente desecado en una estufa durante 2 horas a 105 C en 300mL de agua destilada. Aadir 10mL de H2SO4 10 N aforar a 1000.0mL con agua destilada. 2. Cada mililitro contiene 80 ppm de fosforo. Calculo: 0.3509g KH2PO4 30.97g Potasio = 79.86 g Potasio aprox. 80 g 136,074

Solucin Estndar de Fsforo: 1. Pipetear a balones volumtricos de 100.0mL la solucin patrn (como se indica en la tabla a continuacin).

Tabla N 9. Preparacin de estndares de P. Concentracin Estndar de Fosforo Alcuota de la Solucin Stock 0 ppm 0mL 2.5 ppm 3.1mL 5 ppm 10 ppm 15 ppm 20 ppm 6.2mL 12.4mL 18.6mL 24.8mL

2. Aadir 4.0mL de cido sulfrico 10 N a cada baln de 100.0mL y aforar con agua destilada.

51

Procedimiento: 1. Preparacin de soluciones estndar 0, 2.5, 5, 10, 15 y 20 ppm de fsforo. 2. Pipetear 5.0mL de cada solucin estndar de fsforo (cuyas

concentraciones se indican en el numeral anterior) en diferentes tubos. 3. Pipetear 5.0mL de muestra en diferentes tubos. 4. Adicionar 2mL solucin de molibdato y vanadato de amonio (1:1) a cada tubo (150 x 16mm). 5. Agitar tubos por 15 segundos y dejar desarrollar color por 15 minutos. 6. Leer en colormetro a una longitud de 420 nm. 7. Realizar procedimiento por duplicado.

Clculos Frmula:

Donde: ppm = lectura leda en curva V1 = volumen inicial V2 = volumen final W = peso de muestra A = Alcuota tomada

52

3.2.5.5.4.3. Determinacin de potasio. Determinacin de Potasio por el Mtodo Espectroscpico de Emisin Atmica Fundamento: En la emisin atmica la muestra es sometida a una alta energa y temperatura con el objeto de producir tomos al estado excitado, que luego pasan al estado fundamental y son capaces de emitir luz. El espectro de emisin del elemento puede usarse como caracterstica nica para su identificacin cualitativa. Tabla N 10. Condiciones del Equipo. Lmpara de ctodo hueco de potasio Longitud de onda 776.5 nm Abertura (SLIT) 0.2/0.4 nm Gas Soporte Condicin de la llama Rango optimo en ppm Acetileno Aire Oxidante 0.5 2.0

Determinacin: Procedimiento 1. En balo volumtrico de 50.0mL, colocar alcuota de 5.0mL de solucin madre, adicionar 2.5mL de Cloruro de Lantano al 5% y aforar con agua desmineralizada 2. Leer en aparato por emisin atmica llevando estndares de potasio de diferentes concentraciones. 3. Realizar procedimiento por duplicado.

53

Preparacin estndar 100 ppm de Potasio 1. Tomar 10.0mL de Estndar de Cloruro de Potasio de 1000 ppm y llevar a baln volumtrico de 100.0mL 2. Aforar utilizando agua desmineralizada. Preparacin de estndares partiendo del estndar de 100 ppm 1. Pipetear la alcuota indicada en la tabla a continuacin del estndar de 100 ppm y llevar a baln de 100.0mL 2. Adicionar a cada baln, 5mL de Cloruros de Lantano al 5% 3. Llevar a volumen con agua desmineralizada.

Tabla N 11. Preparacin de estndares de K. Concentracin estndar Alcuota tomada Volumen de aforo con agua desmineralizada 10 ppm 10.0mL 100.0mL 20 ppm 40 ppm 20.0mL 40.0mL 100.0mL 100.0mL

Nota: Repetir el procedimiento anterior con la muestra de fruto seco, preparando una solucin a partir de este. Clculos Frmula:

54

Donde: ppm = Lectura leda en curva V1 = Volumen inicial V2 = Volumen final W = Peso de muestra A = Alcuota tomada

55

3.2.5.6.

Anlisis Fisicoqumico.

3.2.5.6.1. Determinacin de la fuerza del dulzor.

Fundamento. Consiste en determinar el contenido de azcar de la bebida, esta evaluacin se realizara utilizando un sacarmetro comnmente llamado Brixometro, ya que los resultados se expresan en Brix a 20C. Esta determinacin en grados Brix tiene relacin con la densidad de la solucin por tanto lo grados Brix determinado a 20C representa el % en peso de sacarosa en agua. Procedimiento. Colocar una o dos gotas de la muestra en este caso la bebida a base de zumo o jugo de toronja, en el prisma del Brixometro y leer directamente lo grados Brix.

56

3.2.5.6.2. Fundamento

Determinacin de Acidez titulable.

La acidez titulable con un lcali generalmente se expresa en trminos de un acido e particular para los refrescos se expresa en trminos de acido ctrico en porcentaje. El mximo permitido en refrescos es de 0.5% Procedimiento. 1. Filtrar 100ml de la bebida a base jugo o zumo de toronja con papel filtro. 2. Pipetear las siguientes alcuotas y llevar a un volumen de 25.0mL Alcuota de 25.0mL Alcuota de 15.0mL Y hacer una de forma directa tomando 25.0mL de muestra.

3. Aadir 2 gotas de fenolftalena. 4. Titular con NaOH 0.1N hasta un vire de color rosado.

Clculo Frmula:

57

3.2.5.6.3. Fundamento.

Determinacin de pH.

Con esta determinacin se evala la concentracin de iones hidrogeno sin importar la procedencia (acido dbil o fuerte). Este e determina directamente con la ayuda de un potencimetro, e valor de pH para la bebida debe estar entre el 2.4 y 4.4. Procedimiento. 1. Colocar aproximadamente 50mL de muestra en un beaker. 2. Introducir el electrodo y leer el pH directamente.

58

3.2.5.7. Caractersticas organolpticas de la bebida a base de jugo toronja. Color. Tomar una pequea cantidad de la muestra, colocarla en un beaker de 100mL y verificar el color de la bebida. Este debe presentar un color propio. Olor. Tomar una pequea cantidad de muestra, colocarla en un beaker de 100mL y percibir el olor, este debe ser propio o caracterstico. Sabor. Tomar una pequea cantidad de muestra a degustar, este tiene que presentar un sabor dulce y caracterstico.

59

3.2.5.8.

Anlisis microbiolgico.

Aplicando la siguiente metodologa de recuento total de bacterias mesfilas, recuento total de hongos y levaduras, Coliformes totales y ausencia de patgenos fue aplicada para determinar la estabilidad microbiolgica por un periodo de catorce das segn lo demanda la NORMA SALVADOREA NSO 67.18.01:01 PRODUCTOS ALIMENTICIOS. BEBIDA NO CARBONATADA SIN ALCOHOL. 3.2.5.8.1. Recuento de bacterias mesfilas, mtodo de placa vertida (Mtodo USP 29). Fundamento. Enriquecer la muestra con Agar Tripticasa soya, que es un medio universal de cultivo que indica la cantidad de bacterias aerobias presentes. Procedimiento. 1. Suspender 10.0mL de refresco en un frasco de dilucin que contenga 90mL de la solucin Buffer Fosfato pH=7.2 (dilucin 1:10) 2. De este frasco tomar una alcuota de 1mL y colocar en un tubo de ensayo que contenga Buffer Fosfato pH=7.2 (dilucin 1:100) 3. De la dilucin 1:10 tomar 2 alcuotas de 1mL respectivamente y colocarlas en dos placas de petri. Con movimiento oscilatorio agregar 18mL a 20mL de Tripticasa Soya dentro de un rea estril. 4. De la dilucin 1:100 tomar 2 alcuotas de 1mL respectivamente colocarlas en 2 cajas de petri con movimiento oscilatorio agregar 18mL a 20mL de Tripticasa Soya. (realizado en rea estril). 5. Incubar la caja de petri a una temperatura de 30 a 35C por 24 a 48 horas. 6. Proceder a efectuar el recuento de bacterias mediante el uso de cuenta colonias, multiplicar por su factor. 7. Reportar como numero de colonias por mL de muestra.
60

Frmula para calcular numero de bacterias

3.2.5.8.2. Recuento de hongos y levaduras, mtodo por placa vertida (Mtodo Oficial USP 29). Fundamento. Los hongos y levaduras crecen y predominan sobre la flora bacteriana en alimentos cidos y de baja humedad; su desarrollo de jugos, fruta frescas, cereales, productos salados, congelados, deshidratados, salsa y aderezos. Procedimiento. 1. Supender 10.0mL de refresco y se colocan en 90mL de Buffer fosfato pH=7.2 y obtendremos la dilucin 1:10. 2. Tomar 1.0mL de la dilucin 1:10 colocarlo en 2 placas petri, agregar medio de Papa Dextrosa entre 18mL a 20mL con movimiento (realizado en rea estril). 3. Tomar por duplicado 1.0 mL de bebida sin diluir y colocarlo en placas petri, agregar medio de Papa Dextrosa entre 18mL a 20mL con movimiento (realizado en rea estril). Esta es considerada una dilucin directa (< 1 UFC/mL). 4. Solidificar e incubar la placa de forma invertida a 22.2 2.5C por 7 das.

5. Reportar como: numero de colonias por mL de muestras UFC/mL

Frmula para calcular el nmero de hongos y levaduras

61

3.2.5.8.3.

Determinacin de patgenos.

Inocular 1.0 mL de muestra en un tubo de Caldo Tripticasa de Soya e incubar a una temperatura de 32.5 2.5 C de 24 a 48 horas. Este tubo sirve para poder trabajar los cuatro patgenos en estudio, como se describe a continuacin.

3.2.5.8.3.1. Determinacin de Salmonella Sp. 1. Medir 0.1mL del caldo tripticasa soya con pipeta estril incubado anteriormente, y transferirlo a un tubo conteniendo 10mL de caldo Rappaport, mezclar e incubar por 24 horas a 32.5 2.5 C. 2. Transcurrido el tiempo de incubacin, estriar del caldo a placas vertidas con los agares selectivos para Salmonella sp. e incubar las placas invertidas, de 24 horas a 32.5 2.5 C. 3. Examinar las placas y ver si algunas de las colonias corresponden a la descripcin escrita en la tabla No.12. el espcimen corresponde a los requerimientos de la prueba para presencia del gnero Salmonella.

Tabla N 12. Caractersticas Morfolgicas de Salmonella sp sobre agares Selectivos. MEDIO SELECTIVO MORFOLOGIA CARACTERISTICAS DE LA COLONIAS MEDIO AGAR CON Colonias rojas con o sin centro negro, muchas colonias XLD de salmonella pueden producir colonias con grandes y brillantes centros negros , la mayora pueden ser colonias negras completas MEDIO AGAR CON Colonias negras, cafs o grises, algunas veces tienen SULFITO DE brillo metlico, alrededor del medio es usualmente al BISMUTO principio caf pero pueden cambiar a negro si el tiempo de incubacin aumenta. AGAR HIERRO TRES AZUCARES (TSI) Fondo amarillo (positivo), fondo rojo negativo.Con o sin produccin de gas. Bisel rojo= Negativo Bisel amarillo= Positivo

62

SIMONS CITRATE

Salmonella Shigella

Presencia de crecimiento y cambio de color de verde-azul (prueba positiva) No hay crecimiento o poco crecimiento y no hay cambio de color. (Prueba negativa) Incoloras, Translucidas

Cuando sea necesario realizar la tincin de Gram a las colonias sospechosas. Si las colonias son bastones Gram negativos y cumplen con las caractersticas de la tabla No.12, proceder a la identificacin de las colonias representativas transfiriendo colonias individuales al agar inclinado de Hierro tres azcares,

mediante puncin en el fondo del medio, y estriando en el bisel. Incubar por 24 2 horas a 32.5 2.5C.. Y Agar Simons Citrate mediante puncin en el fondo del medio, y estriando en el bisel. Incubar por 96 2 horas a 32.5 2.5C. El espcimen cumple los requerimientos del test para presencia del gnero Salmonella sp.

63

3.2.5.8.3.2.

Determinacin de Echerichia coli.

Para la inoculacin, estriar una porcin del remanente de caldo tripticasa soya en la superficie de Medio Agar Eosina Azul de Metileno, cubrir e invertir la placa e incubar de 24 a 48 horas a 32.5 2.5C, examinar las placas y ver si algunas de las colonias corresponden a la descripcin descrita en la tabla No.13. El

espcimen corresponde a los requerimientos de la prueba para presencia del gnero Escherichia coli.

Tabla N 13. Caractersticas morfolgicas de Escherichia coli sobre selectivo. MEDIO SELECTIVO AGAR EMB MORFOLOGIA, CARACTERISTICAS Brillo metlico caracterstico bajo luz reflejada, apariencia negro azulado bajo luz transmitida.

64

3.2.5.8.3.3. Determinacin de Staphylococcus aureus. Tomar una asada del caldo tripticasa soya y resembrarla mediante estriado en placas conteniendo medio Sal Manitol Rojo fenol. Cubrir e invertir las placas e incubar a 32.5 2.5C de 24 a 48 horas. Examinar las placas, y ver si algunas de las colonias corresponden a la descripcin de la tabla 14. Si aparecen colonias con las caractersticas

morfolgicas descritas en la tabla, continuar con las pruebas bioqumicas para confirmar Staphylococcus aureus. Tabla N 14. Caractersticas morfolgicas de Staphylococcus aureus sobre agar selectivo. MEDIO SELECTIVO MORFOLOGIA CARACTERISTICAS DE LAS COLONIAS Colonias amarillas con zonas amarillas MEDIO MANITOL AGAR SALADO

Prueba

bioqumica:

Tomar

una

asada

de

la

colonia

sospechosa

de

Staphylococcus aureus y colocarla dentro de un tubo que contenga de 0.2 a 0.3mL de Infusin Cerebro corazn (BHI), incubar de 18 a 24 horas 32.5 2.5C. Luego de ese periodo de tiempo sacar y adicionar 0.5mL de Plasma de conejo con EDTA y mezclar, incubar por 6 horas a 32.5 2.5C la formacin de un coagulo es la confirmacin de la prueba, sino se forma el coagulo la prueba es negativa. Si es necesario realizar la tincin al Gram en la que se obtienen Cocos positivos (en grupos). 3.2.5.8.3.4. Determinacin de Pseudomona aeruginosa. Tomar una asada del caldo tripticasa soya y resembrarla en placas conteniendo Agar Cetrimide. Cubrir e invertir las placas e incubar a 32.5 2.5 C de 24 a 48 horas.
65

Examinar las placas y ver si algunas de las colonias corresponden a la descripcin descrita en la tabla 15. Si aparecen colonias con las caractersticas morfolgicas descritas en la tabla 15, continuar con las pruebas bioqumicas para confirmar Pseudomona aeruginosa. Tabla N 15. Caractersticas morfolgicas de Pseudomona aeruginosa sobre agar selectivo. MEDIO SELECTIVO MORFOLOGIA CARACTERISTICAS DE LAS COLONIAS Generalmente verdosa PRUEBA DE OXIDASA

MEDIO AGAR CETRIMIDE

Positivo

Prueba confirmativa para pseudomona aeruginosa. Test de oxidasa Poner sobre la tira reactiva una asada de la colonia sospechosa, si cambia a color morado, la prueba es positiva para Pseudomona aeruginosa. Si es necesario realizar la tincin al Gram donde se observan Bastones negativos

Cuando por alguna razn, no se puedan realizar los pases a los medios selectivos de manera inmediata se puede proceder a refrigerar los caldos de los tubos por un periodo no mayor a 48 horas.

66

3.2.5.8.4. Determinacin de Coliformes totales y fecales por mtodo placas 3M petrifilm. Fundamento. Las bacterias Coliformes son microorganismos aerobios y anaerobios que fermentan la lactosa con produccin de acido y gas a 32C cuando se realiza el anlisis. La determinacin de Coliformes fecales se obtiene a partir de un examen especfico, aplicado paralelamente a la prueba de confirmacin de Coliformes totales. El mtodo de placas 3M petri film proporciona de forma ms rpida la confirmacin de Coliformes en una muestra ya que en ellas igual se da una produccin de gas al ser positiva. Permitiendo determinar Coliformes totales en una muestra. Cuando se dice de forma ms rpida est en la direccin que se reducen los recursos a utilizar. ANALISIS DE LAS MUESTRAS Preparacin de la muestra: Si es necesario, efectuar una dilucin pertinente de la muestra a manera de logar recuentos bajos. 1. colocar las placas en una superficie plana y nivelada. 2. Rotular con el nmero de muestra correspondiente las placas petrifilm. 3. Luego agitar la muestra vigorosamente por lo menos 25 veces a manera de homogenizar el contenido del frasco. 4. levantar con Sumo cuidado la pelcula superior y colocar perpendicularmente 1mL de la muestra con micropipeta cerca del centro de la pelcula inferior. 5. bajar con cuidado la pelcula superior para evitar que atrape burbujas de aire, no dejar caer.
67

6. con el lado liso hacia abajo coloque el dispersor en la pelcula superior sobre el inoculo. 7. presione suavemente el dispersor para distribuir el inoculo sobre el rea circular antes que solidifique el gel, no gire ni deslice el dispersor. 8. levante el dispersor y espere por lo menos un minuto a que solidifique el gel.

Incubacin e interpretacin de resultados 1. incubar las placas cara arriba en grupos de no ms de 20 placas por un periodo de 24-48 horas a 35C 2. Leer las placas en un cuenta colonias. 3. Las pruebas positivas corresponden a aquellas colonias que presenten una coloracin de ocre a morado con la presencia de burbujas de gas. 4. No se deben contar aquellas colonias que crecieron cobre la barrera de espuma ya que han sido removidas de la influencia del medio selectivo.

68

CAPTULO IV
DICUSION DE RESULTADOS

69

4. CAPITULO IV: RESULTADOS. 4.1. Normalizacin de la bebida. 4.1.1. Frmula de la bebida. Componentes generales Jugo de toronja Sacarosa Agua purificada

4.1.1.1. Ensayos. Para seleccionar una concentracin de extracto aceptable se realizaron siete ensayos con edulcorante de sacarosa y siete ensayos con edulcorante de miel natural; de los cuales se fueron descantando las formulaciones mas diluidas ya que no presentaban un sabor apropiado, luego al incrementar la concentracin de extracto presentaba un sabor amargo y en las formulaciones que contenan miel se perciba un aroma muy fuerte a esta. Las concentracin de 80% de extracto de toronja lograron las caractersticas deseada para el estudio por lo que fueron las seleccionadas.

70

4.1.2.

Prueba de palatabilidad.

Para realizar esta parte de la investigacion solo se trabaj directamente con las formulaciones de bebida con mayor concentracion de extracto, que son las que estan en proporciones del 80% de extracto natural, evaluando de esta forma que edulcorante tenia mejor aceptabilidad para la poblacion muestra seleccionada. Cabe destacar que fue una poblacion al azar con una variable de edad muy significativa permitiendo establecer cual formulacion presenta la mejor aceptacion, partiendo de esa seleccin se analizo la que presento mayor porcentaje para poder determinar los requisitos que segn la norma establece. La cantidad de poblacion tomada fue de 100 personas para que fuera una muestra significativa. Tomando las diferentes variables que se tomaron en cuenta se presenta a continuacion la tendencia de cada una de ellas, considerando que la bebida 1 posee como edulcorante miel y la bebida 2 posee como edulcorante sacarosa.

Grfico N 1. Aceptabilidad de bebida 1 y 2.

100 80 60 40 20 0 Bebida 1 Bebida 2 No Si Si No Talvez

Talvez

71

En el grfico se puede apreciar como la poblacin se inclin ms al edulcorante de sacarosa. Enfocandose en esa decisin se presentan las caracteristicas que mas captaron la atencion de los participantes, esto lo podemos apreciar en los siguientes grficos.

Grfico N 2. Caracteristicas de la bebida 2.

100 90 80 70 Participantes 60

50
40 30 20 10

0 Olor
Color Sabor Poco Aceptable Aceptable Aceptable Poco Aceptable No aceptable Olor 95 4 Color 100 0 Sabor 95 5 No aceptable

72

Con los datos obtenidos podemos determinar que la bebida que contenia sacarosa como edulcorante, proporciona las caracteristicas que la mayoria de la poblacin demanda. Es importante dar a conocer que las edades promedios fuern entre los 8 a 30 aos de edad. Como dato muy importante es que los nios se inclinarn completamente por esta opcin dando una idea del tipo de mercado que se podria aprovechar proporcionando un valor nutricional muy importante a la poblacin.

73

4.1.3.

Material de empaque de la bebida terminada.

74

4.2. Metodologa para la identificacin de antioxidantes. 4.2.1. Identificacin de Narangina por cromografa capa fina. FORMULA.

Tabla N 16. Datos y Resultados para cromatoplaca # 1. Datos y Resultados para Placa # 1 (Medidas realizadas a 365 nm para los mximo de absorbancia de Narangina) Nombre de la Dilucin de la Distancia del Distancia del Rf muestra o estndar. STD muestra o estndar. Artemisina 1.0% Mo Extracto Puro. M1 Dilucin con azcar 60/40 M2 Dilucin con azcar 80/20 M3 Dilucin con miel 60/40 M4 Dilucin con miel 80/20 FORMULA. 7.0 cm 6.5 cm 0.93 7.0 cm 6.5 cm 0.93 7.0 cm 6.5 cm 0.93 7.0 cm 6.5 cm 0.93 7.0 cm 6.5 cm 0.93 Frente del solvente.(cm) 7.0 cm Frente de la mancha. (cm) 6.5 cm 0.93

75

Tabla N 17. Datos y Resultados para cromatoplaca # 2. Datos y Resultados para Placa # 2 (Medidas realizadas a 365 nm para los mximo de absorbancia de naringina) Nombre de la muestra o estndar. STD1 Dilucin de la muestra o estndar. Artemisina 0.1% STD2 Artemisina 1.0% STD3 Artemisinina 1.0% Promedio de las mediciones de los diversos estndares Mo Extracto Puro. M1 Dilucin con azcar 60/40 M2 Dilucin con azcar 80/20 M3 Dilucin con miel 60/40 M4 Dilucin con miel 80/20 7.0 cm 6.5 cm 0.93 7.0 cm 6.5 cm 0.93 7.0 cm 6.5 cm 0.93 7.0 cm 6.5 cm 0.93 7.0 cm 6.5 cm 0.93 0.93 7.0 cm 6.5 cm 0.93 7.0 cm 6.5 cm 0.93 Distancia del Frente del solvente.(cm) 7.0 cm Distancia del Frente de la mancha. (cm) 6.5 cm 0.93 Rf

76

4.3.

Anlisis Qumico Proximal. 4.3.1. Determinacin de carbohidratos.

FORMULA.

DATOS. Tabla N 18. Datos para la determinacin de % de Carbohidratos Protenas. 0.69 Grasa. Ceniza. 0.10 0.29

% Carbohidratos = 100 (98.92%+ 0.1% + 0.29%) % Carbohidratos = 9.02g /100g (Base hmeda)

77

4.3.2.

Determinacin de protenas (Mtodo de Microkjeldahl).

FORMULAS.

En donde: N = Normalidad del cido. 0.014 = Miliequivalente del nitrgeno Factor de conversin: 6.25 DATOS. Tabla N 19. Pesos y volmenes gastados en la titulacin para determinar protenas. Muestras Muestra #1 Muestra #2 Pesos 0.1381 g 0.1319 g Volumen 0.45 mL 0.40 mL gastado en la titulacin. MUESTRA #1.

78

MUESTRA #2.

MEDIA DEL PORCENTAJE DE PROTEINAS.

79

4.3.3. FORMULA:

Determinacin de cenizas.

DATOS: Tabla N 20. Datos para la determinacin de cenizas. MUESTRAS Peso de crisol Peso del crisol + muestra Peso del crisol +muestra + incinerar 600C Peso del crisol + muestra + despus de incinerar 600C 46.1156g Peso de la muestra inicial.

Muestra #1

45.9959g

87.2295g

50.1563g

41.2336g

Muestra #2

47.9865g

87.0559g

51.9140g

48.0985g

39.0694g

Muestra #3

42.7960g

83.0124g

46.8980g

42.9102g

40.2964g

Muestra #1.

Muestra #2.

80

Muestra #3.

Promedio del porcentaje de ceniza.

81

4.3.4. Determinacin de micro elementos: calcio, fsforo y potasio.

4.3.4.1. Determinacin de calcio. Determinacin de Calcio por el mtodo Espectrofotomtrico de Absorcin Atmica. FORMULA:

En donde: W = Peso de muestra Ppm = Lectura de equipo o curva V1 = Volumen inicial V2 = Volumen final A = Alcuota tomada DATOS. Tabla N 21. Lecturas de ppm en la determinacin de Ca. Muestra 4mL / 50mL Muestra #1 1.899 Muestra #2 1.977 Dilucin 4mL / 50 mL Muestra #1.

82

Muestra #2.

Promedio del % Calcio en la dilucin 1mL/ 50mL

83

4.3.4.2. Determinacin de fsforo. Determinacin de Fosforo por el Mtodo Colorimtrico FORMULA:

En Donde: Ppm = lectura leda en curva V1 = volumen inicial V2 = volumen final W = peso de muestra A = Alcuota tomada

Tabla N 22. Lecturas de absorbancias en la determinacin de P.

Datos de la Curva 0.0 2.5 5.0 10.0 15.0 20.0 0.000 0.097 0.194 0.377 0.580 0.740 0.999048 R

84

25 20 15 10 5 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 y = 26.750171x - 0.113223 R = 0.999048

Tabla N 23. Determinacin del porcentaje de fosforo.

N A B Absorbancia 0.594 0.209 ppm Ledas 15.776 5.478 W muestra 39.0694 40.2164 Volumen Final 100 100 Alcuota %Fsforo (P) 15 5 134.60 136.20

135.4%

Muestra #A.

Muestra #B.

Promedio del % Potasio.

85

4.3.4.3. Determinacin de potasio. Determinacin de Potasio por el Mtodo Espectroscpico de Emisin Atmica FRMULA:

En Donde: ppm = Lectura leda en curva V1 = Volumen inicial V2 = Volumen final W = Peso de muestra A = Alcuota tomada. DATOS: Tabla N 24. Lecturas de ppm en la determinacin de K. Muestra 1 mL / 50mL 4 mL / 50 mL Muestra #1 8.571 29.84 Muestra #2 9.188 28.63 Dilucin 4mL / 50 mL Muestra #1.

86

Muestra #2.

Promedio del % Potasio en la dilucin 1mL/ 50mL

87

4.4. Anlisis Fisicoqumico.

4.4.1. Determinacin de la fuerza del dulzor. Tabla N 25. Lecturas de grados Brix. Numero de toma de la Brix Temperatura. Muestra Toma #1 11 23.5 C Toma #2 Toma #3 11 11 24C 24C

Toma #1 Toma #2 Toma #3 Promedio del Brix

88

4.4.2. Determinacin de Acidez titulable.

FORMULA:

DATOS: Tabla N 26. Datos para determinar acides titulable. NUMERO DE MUESTRA. 1 2 3 Muestra #1. NORMALIDAD DEL VALORANTE. 1.0 N 1.0 N 1.0 N DILUCION VOLUMEN DEL VALORANTE GASTADO. 2.8mL 2.8mL 1.7mL

25/50 25/50 15/50

Muestra #2.

Muestra #3.

89

Promedio del porcentaje de la acidez titulable.

90

4.4.3. Determinacin de pH.

Tabla N 27. Lecturas de pH por muestra analizada. Numero de toma de la Muestra. Toma #1 pH.

3.13

Toma #2

3.12

Toma #3

3.13

Toma #4

3.13

Promedio del pH

91

4.4.4. Humedad.

FORMULA:

En Dnde: Wc + mx= Peso del crisol + muestra Wc + mxs= Peso del crisol + muestra seca Wcv= Peso del crisol vacio. DATOS: Tabla N 28. Datos para la determinacin de la Humedad.
MUESTRAS Peso de crisol Peso del crisol + muestra Peso del crisol +muestra + incinerar 600C Peso del crisol + muestra + despus de incinerar 600C Peso de la muestra inicial.

Muestra #1 Muestra #2 Muestra #3 Muestra#1

45.9959g 47.9865g 42.7960g

87.2295g 87.0559g 83.0124g

50.1563g 51.9140g 46.8980g

46.1156g 48.0985g 42.9102g

41.2336g 39.0694g 40.2964g

Muestra#2

92

Muestra#3

Promedio de Humedad.

93

4.4.5. Caractersticas organolpticas de la bebida a base de jugo toronja. La toronja Salvadorea tiene muy buen aspecto como se puede observar en la imagen 1. Su color, textura, aroma y contenido de zumo brinda un buen rendimiento para poder ser aprovechado.

Imagen 1. Toronja Salvadorea, (Citrus paradasi, variedad Ruby Red)

Color: La bebida presenta un color rosa intenso Olor: Caracterstico a Toronja Sabor: Dulce con sabor caracterstico a Toronja. Consistencia: Bebida con pulpa de Toronja Natural.

94

4.5. Anlisis microbiolgico. A continuacin se presentan los resultados del anlisis microbiolgico en conjunto con la estabilidad que se realiz por el periodo de catorce das. 4.5.1. Recuento de bacterias mesfilas, mtodo de placa vertida (Mtodo USP 29). Segn la Norma Salvadorea NSO 67.18.01:01 productos alimenticios. Bebida no carbonatada sin alcohol, el limite que demanda es no mayor a 1000 UFC. Para el desarrollo del Recuento de bacterias se llevaron a cabo las siguientes diluciones: 1. De forma directa inoculando 1mL de bebida sin diluir por duplicado en placas petri. 2. Dilucin 1:10 3. Dilucin 1:100 4. Dilucin 1:1000, esta ltima es el lmite superior que declara la norma. Cabe destacar que el da cero se realiz las 4 diferentes diluciones, con el fin de determinar en qu rango se podra encontrar mejor la presencia de algn tipo de batera, obteniendo resultados por debajo de la dilucin 1:1000, por lo que en el punto 7 y 14 se trabajo hasta dilucin 1:100.

Recuento Total de Bacterias

6 UFC/mL 4 2 0 Dia 0 Dia 7 Dia 14 Dia 0 0 0 Dia 7 0 5 Dia 14 0 5 Dilucion 2, UFC/mL Dilucion 1, UFC/ mL

Dilucion 1, UFC/ mL
Dilucion 2, UFC/mL

95

4.5.2. Recuento de hongos y levaduras, mtodo por placa vertida (Mtodo Oficial USP 29). Para la prueba se llego a una dilucin de 10-2 o sea 1:100, tomando en cuenta que el lmite es inferior a esta dilucin y en el da cero no se encontr nada a esta concentracin se estableci estar en un rango de diluciones de: 1. Dilucin directa 1mL de muestra es inoculada directamente. 2. Dilucin 1:10. Obteniendo los siguientes resultados presentados en el siguiente grafico.

Recuento de hongos y levaduras.

2 1.5 UFC/ mL 1 0.5 0 Dia 0 Dia 7

Dilucion 2, UFC/mL
Dilucion 1, UFC/mL Dia 14

Dilucion 1, UFC/mL Dilucion 2, UFC/mL

Dia 0 0 0

Dia 7 1 0

Dia 14 2 0

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4.5.4. Coliformes totales por mtodo petrifilm 3M. El mtodo petrifilm fue seleccionado como primera parte para poder determinar los Coliformes totales, ya que un positivo de Coliformes por este mtodo es cuantificable, pero al aplicar la prueba a la bebida no se encontraron Coliformes por lo que se reporta 0 UFC.

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4.5.5. Determinacin de patgenos. La bebida cumple segn los requisitos de la norma ya que tiene ausencia de los cuatro patgenos: Echerichia coli, Salmonella sp, Stapylococcus aureus, Pseudomona aeruginosa.

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4.5.6. Estabilidad Microbiolgica. Determinacin Limite Resultado Da 0: <10UFC/mL Da 7: 5 UFC/mL Da 14: 5 UFC/mL Recuento Total de No ms de 20 UFC/mL Da 0: 0 UFC/mL Da 7: 1 UFC/mL Da 14: 2 UFC/mL Bacterias Coliformes No ms 1.1 Da 0: 0 UFC/mL Da 7: 0 UFC/mL Da 14: 0 UFC/mL Patgenos Ausencia Ausencia total.

Recuento de bacterias No ms 1000 UFC/mL mesfilas

Hogos y Levaduras

La estabilidad microbiolgica de la bebida a una temperatura de 8 C por un periodo de 14 das que demanda la Norma, en un envase de de HDPE nmero 2 que ayuda a controlar productos en estantera, donde bajo dichas condiciones cumple satisfactoriamente desglosndolo a continuacin: Para el recuento total de bateras meso filas podemos observar un crecimiento a partir del da siete, en donde an se encuentra en el lmite permitido por la Norma Salvadorea esto nos quiere decir que la bebida a estas condiciones puede ser consumida por el ser humano, como tambin esta prueba determina que el nivel de sanitisacin del rea y equipo de produccin fue efectiva. En el Recuento Total de Hogos y levaduras en dilucin directa (1 mL de muestra directo a placa) no presento crecimiento inicial pero si en los das posteriores de anlisis pero no excedi el lmite establecido por lo que para dicha prueba cumple con la especificacin, en donde podemos destacar que la calidad de materias primas como la sacarosa era adecuada. Para Bacterias Coliformes hubo ausencia reportndose en los 3 puntos 0 UFC/mL, donde se puede destacar que la calidad del agua utilizada fue la ideal.

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La ausencia total de patgenos tales como Echerichia coli., Salmonella sp., Stapylococcus aureus, Pseudomona aeruginosa, hace apta para el consumo de la bebida. 4.6. Composicin de bebida funcional de Toronja.

Con todos los anlisis concretados se logra obtener lo que es en primer punto la tabla nutricional de la Toronja cultivada en El Salvador Citrus paradasi, variedad Ruby Red. Como tambin una comparacin de los datos tomados como referencia de la Monografa de toronja, Comisin Veracruzana de Comercializacin Agropecuaria. Tabla N 29. Composicin nutricional de la toronja. VALOR NUTRICIONAL DE LA TORONJA EN 100 G DE SUSTANCIA COMESTIBLE Agua 88.4 g Protenas 0.6 g Lpidos 0.1 g Carbohidratos 9.8 g Caloras 39 kcal Vitamina A 80 U.I. Vitamina B1 0.04 mg Vitamina B2 0.02 mg Vitamina B6 0.02 mg cido nicotnico 0.2 mg cido pantotnico 0.25 mg cido ctrico 1460 mg Sodio 2 mg Potasio 198 mg Calcio 17 mg Fsforo 16 mg

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Tabla 30. Tabla nutricional de la Bebida de Toronja Cultivada en El Salvador. Informacin Nutricional Tamao de la proporcin 100 mL Porciones por envase: 1 Cantidad por proporcin Caloras: Carbohidratos Calcio Fosforo Potasio Protenas cido Ctrico Agua 9.02 g 6.1 mg 13.54 mg 92.2 mg 0.69 g 1440 mg 89.9g

Informacin Nutricional Bebida al 80% de extracto de Toronja Porciones por envase: 1 Cantidad por proporcin Caloras: Carbohidratos Calcio Fosforo Potasio Protenas cido Ctrico Agua 10.84g 7.32mg 16.25mg 110.64mg 0.83g 1728mg 107.88g

Al hacer una comparacin con tablas internacionales de pases donde ha sido estudiada la toronja, podemos destacar que el cultivo de toronja en El Salvador presenta concentraciones mil similares a las declaradas Aunque no se comparara directamente una concentracin del 100% de extracto se puede evaluar en una dilucin del 80% en donde podemos reflejar que la toronja cultivada en El Salvador brinda un aporte nutricional comparable y aceptable.
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CONCLUSIONES

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CONCLUSIONES.

La formulacin de la bebida funcional a base de jugo de toronja se llev a cabo realizando 7 ensayos con edulcorante de sacarosa y 7 ensayos con edulcorante de miel natural, cada uno de los ensayos contempla una porcin de jugo puro de toronja y la otra porcin de edulcorante (para el caso miel de abejas o sacarosa) ms el diluyente (para el caso agua) respectivamente.

Segn los datos mostrados en el grfico 1 que la bebida en proporcin 80% jugo de toronja present una alta aceptabilidad aquella edulcorada con sacarosa, fue seleccionada por un panel no entrenado de 100 personas con un 95% de aceptacin respecto a su olor, un 100% de aceptacin en el color y un 95% de aceptacin en el sabor. En base a lo anterior y a los diversos resultados develados en los ensayos qumicos proximales, fisicoqumicos y microbiolgicos, podemos inferir que si es posible formular una bebida funcional a base de toronja que sea estable y aceptada por el pblico, ya que los resultados obtenidos cumplen con lo estipulado en la NSO 67.18.01:01.

Segn los anlisis cualitativos desarrollados para la identificacin de narangina en la bebida funcional se puede destacar que los ensayos 2 (60/40) y 3 (80/20) as como el extracto puro presentaron un Rf de 0.93 en contraste con el del estndar de artemisina (1%) y artemisinina (1%) que presentaron un Rf de 0.93, de lo que podemos inferir dos cosas: 1) que el Rf de los ensayos as como del extracto puro corresponde al Rf del estndar de referencia, de tal manera que la presencia de la flavonona narangina es confirmada. 2) la presencia de este flavonoide le confiere a la bebida funcional (especficamente el ensayo 3 80/20) las propiedades antioxidantes. En relacin a la Estabilidad Microbiolgica ensayada que tuvo una duracin de 14 das a una temperatura de 8 C en un envase HDPE numero 2, podemos decir que
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la bebida puede ser manipulada y consumida sin necesidad de que est presente algn tipo de persevante ya que las caractersticas propias del extracto natural proporciona un pH 3.13 condicin en la que bacterias mesfilas muy difcilmente puede sobrevivir y aunque los hongos tienden a crecer en medios cidos la elaboracin de la bebida a nivel de sanitizacin como tambin calidad del agua fue la indicada por lo que no hubo una carga bacteriana ni de hongos significativa.

La determinacin de Coliformes Totales no se realizo por medio del mtodo de Numero ms probable que la norma declara, si no que se aplico un mtodo alternativo que es placa de petri film donde dicho mtodo permite la cuantificacin de coliformes y al tener una respuesta negativa de esta prueba presuntiva se pudo determinar la ausencia de Coliformes en la muestra de Bebida.

En cuanto a la acidez titulable el valor obtenido fue de 1.44%, y la norma establece no mayor de 0.5% referida como cido Ctrico, pero al hacer la comparacin con tablas nutricionales internacionales el contenido de cido Ctrico presente en la Toronja es de 1460mg por cada 100g; por lo tanto el contenido de cido Ctrico en la Toronja cultivada en El Salvador es similar al valor reportado.

La toronja cultivada en El Salvador, presenta nutrientes con cantidades significativas en comparacin a tablas de referencia internacionales, destacando la importancia de poder impulsar este cultivo en el pas, ya que cumplimos con los requisitos climticos que el rbol demanda.

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RECOMENDACIONES

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RECOMENDACIONES.

Se recomienda darle continuidad a este estudio y verificar la posibilidad de adicionar otro(s) componente(s) a la frmula propuesta (ensayo 80%) ya sea fortificndola con vitaminas que podran dar un aporte mayor o potenciar la accin antioxidante de la bebida, enriquecindola o simplemente mejorndola con el objetivo de una vida ms larga en anaquel podra adicionarse preservantes como el Sorbato de Potasio o tal vez Benzoato de Sodio; siempre y cuando no se pierda el fin natural de la bebida, como tambin el uso de otro mtodo de para evitar una contaminacin a futuro.

Es recomendable que se realicen estudios de estabilidad acelerada en anaquel para determinar el tiempo mximo de caducidad de la bebida funcional en ambientes estresados (frio, calor entre otros).

Dar a conocer el uso de la toronja en el pas para que pueda ser aprovechada, ya que en la mayora de los casos es desperdiciado por no tener conocimiento del gran aporte nutricional que brinda al ser humano, impulsando un nuevo sector de desarrollo comercial, tomando en cuenta las condiciones estudiadas como lo es la temperatura y el tipo de envase al que fue sometida la bebida a estabilidad.

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ANEXO

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ANEXO. Anexo N1. Identificacin de Narangina por Cromatografa de capa fina.

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Anexo N2. Anlisis Proximal Determinacin de Protenas

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Anexo N3. Anlisis Fisicoqumico. Determinacin de los Brix.

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Anexo N4. Anlisis Microbiolgicos.

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