IMUNOHEMATOLOGI DASAR

Oleh: dr. Widya Astriyani UNIT DONOR DARAH PEMBINA PMI PROPINSI LAMPUNG

IMUNOHEMATOLOGI
Cabang Ilmu Patologi Klinik yg mempelajari penggunaan teknik imunologik untuk mendeteksi kelainan-kelainan hematologik, al:
1. Reaksi transfusi hemolitik 2. Reaksi hemolitik pd bayi yang baru lahir (HDN=Hemolytic Disease of the Newborn) 3. Reaksi hemolitik pd AIHA (Auto Immuno Hemolytic Anemia)
2

 Pemeriksaan

laboratorium yg sering dilakukan untuk kepentingan klinis adalah :

1. Deteksi Antigen (Ag) gol darah ABO & Rhesus (Rh) 2. Tes pretransfusi : Cross matching test reaksi silang Mayor & Minor 3. Deteksi antibodi (Ab) Coombs test (Test Anti Globulin)

Reaksi transfusi hemolitik HDN AIHA

Gol drh ABO Gol drh Rh

Coombs test

Reaksi silang

Pendahuluan

Normal:

mengalami hemolisis

Jutaan eritrosit diproduksi tiap menit, umur 120 hari Eritrosit tua, mati: dibersihkan dan dihancurkan oleh SRE (limpa)

Abnormal: hemolisis
Penyebab hemolisis: sebagian besar krn adanya antibodi Tipe hemolisis : destruksi/kerusakan imun Tjd pd reaksi transfusi, hemolytic disease of the newborn (HDN), autoimmune hemolytic disease (AIHA)

Pendahuluan

>> reaksi transfusi hemolitik disebabkan krn kerja antibodi (dlm serum pasien) spesifik berinteraksi dg antigen donor

Dasar-dasar imunologi

Pendahuluan

Dasar imunologi

Eritrosit mengekspresikan antigen (Ag) (glikoprotein) di permukaan sel eritrosit, Ag tsb disebut Aglutinogen Aglutinogen bersifat imunogenik Antigen A : golongan darah A Antigen B : golongan darah B Tidak mengekspresikan Ag A & B : gol O Normal seseorang membentuk aglutinin thd Antigen yg tidak dimiliki oleh eritrosit didlm tubuhnya sendiri Antibodi (Ab) dlm serum (Aglutinin): anti A, Anti B

ANTIGEN

Antigen adalah unsur yang dapat dikenal oleh imunoglobulin/antibody atau reseptor sel T Imunogen adalah unsur asing yang dapat merangsang respon imun, sehingga dapat menghasilkn zat-zat imun yang dapt dideteksi.

Antigenesitas adalah kemampuan unsur asing tersebut untuk bereaksi dengan zat imun
Imunogenisitas adalah kemampuan unsur asing untuk menimbulkan respon imun.

Antigen Sel Darah Merah

Terdapat 29 sistem golongan darah dengan lebih dari 250 antigen sel darah merah yang telah ditemukan. Glycoprotein dan glycolipids yang menonjol keluar dari membrn SDM yang memungkinkan terjadi ikatan dengan antibodi(aglutinasi) hemaglutinasi

Golongan A

Golongan B

H H

A
B

Anti B

Anti A

Antigen/aglutinogen A
Antigen/aglutinogen B

Anti/aglutinin A Anti/aglutinin B

Golongan AB
A

Golongan O

AB

O
-

Anti B Anti A

Antigen/aglutinogen A
Antigen/aglutinogen B

Anti/aglutinin A Anti/aglutinin B

Human Leukosit Antigen (HLA) Platelet Antigen

Antibodi (Ab)
1. Ab natural dan Ab imun Ab natural :
merupakan IgM, timbul sbg akibat rangsangan bahan alami yg menyerupai Ag A/B (berasal dr bakteri/makanan atau produk bakteri) yg masuk tubuh, terbentuk ssdh umur 6 bln.

Ab imun (Allo Ab) :

merupakan IgG thd Ag pada individu dgn genetik berbeda ttp spesies sama, o.k masuknya Ag A dan/atau B kedlm tubuh melalui sirkulasi darah (transfusi, placenta) atau pemaparan thd produk darah

2. Complete Ab dan incomplete Ab Complete Antibody : Antibodi yg mampu menyebabkan aglutinasi langsung ( direk ) eritrosit-eritrosit yg tersuspensi di dalam salin (Ig M) Incomplete Antibody : Antibodi yg tidak mempunyai kemampuan untuk menyebabkan aglutinasi secara langsung dari eritrosit-eritrosit tsb tanpa penambahan fase antiglobulin (Ig G)

3. Ab tipe hangat ( Warm ) & Ab tipe dingin ( Cold )

Ab tipe warm : bereaksi lebih cepat pd 370 C (IgG) Ab tipe cold : bereaksi lebih cepat pd 200C (IgM)

Reaksi Antigen-Antibody IN VIVO

Transfusi, kehamilan, respon imun
Selama tranfusi darah, pasien akan terpapar banyak sekali antigen pada sel-sel darah dengan derajat imunogenisitas tertentu. Antibodi yang dhasilkan akibat transfusi termasuk dalam alloantibodi Pemeriksaan skrining antibodi dapat dilakukan sebelum dilakukan transfusi untuk mendeteksi adanya alloantibody.

Reaksi Antigen-Antibody IN VITRO

Merupakan reaksi Ag-Ab yang terjadi diluar tubuh manusia(pemeriksaan laboratorium) Aglutinasi atau hemolisis Hemaglutinasi terjadi dalam 2 tahap yaitu:
Tahap sensitisasi Lattice formation

FAKTOR-FAKTOR YANG MEMPENGARUHI REAKSI Ag-Ab IN VITRO

Sensitization Stage (Antibody Binding to Red Blood Cells)

Temperatur Reaksi Masa Inkubasi pH Ionic Strenght
Pada fase ini memerlukan pengenalan antigen terhadap antibodi. Selama masa ini determinan antigenik pada sel darah merah akan berikatan dengan antigen-binding site pada molekul antibodi aglutinasi tidak dapat dilihat pada fase ini.

Serum-to-cell ratio

 Temperatur
Sebagian antibodi (Ig G) bereaksi pada suhu 370C Inkubasi Ig M lebih reaktif pada suhu yang lebih rendah 220C

Masa Inkubasi
Memberikan waktu yang cukup untuk reaksi AgAb Bervariasi tergantung prosedur atau reagen.

 pH pH optimal 7,00

Ionic Strenght
Pada lingkungan yang isotonic, misalnya dengan saline fisiologic, Na+ dan Cl-

Lattice formation Stage (Cells-Cells Interaction)

Jarak antara sel darah merah satu dengan yang lain
(zeta potensial) gaya tolak menolak antara SDM satu dengan yang lain akan mempengaruhi reaksi aglutinasi. SDM memiliki muatan negatif pada permukaan sel, muatan positif yang berasal dari larutan salin akan mengikat muatan negatif pada permukaan SDM sehingga membentuk muatan positif yang menyebabkan gaya tolak-menolak.

 Karena bentuknya IgM mampu mengikat SDMSDM yang berdekatan sehingga dapat terjadi aglutinasi Sementara IgG, karena bentuknya , tidak mampu mengikat SDM-SDM yang berdekatan sehingga aglutinasi terjadi namun tidak dapat terlihat.

 Konsentrasi optimal Ag-Ab

Aglutinasi maksimal akan terjadi bila konsentrasi Ag-Ab berada dalam zona ekuivalen. SDM diencerkan menjadi suspensi 2%-5%, Bila suspensi melebihi 5% dapat menyebabkan reaksi negatif.

Grading Reaksi Aglutinasi

Hemolysis sebagai Reaksi Ag-Ab

Hemolisis juga merupakan indikator terjadinya reaksi Ag-Ab Hemolisis terjad bila jalur komplemen teraktivasi yang akan merusak permukaan membran SDM sehingga cairan intersellular keluar hemoglobin menyebabkan warna kemerahan pada supernatan dalam tabung. Grading +H

Alur uji laboratorium pre-transfusi

Pasien a. Serum b. Eritrosit

Buat suspensi eritosit 1. 5% dlm salin 2. 10% dlm salin 3. 40% dlm salin a/ serum

a. Serum b. Eritrosit Donor

Reaksi silang ABO Rh

Buat suspensi eritosit 1. 5% dlm salin 2. 10% dlm salin 3. 40% dlm salin a/ serum

c. Pem gol ABO, Rh metode slide, jika hasil OK: d. Reaksi silang
MAYOR Fase I Fase II Fase III MINOR Fase I Fase II Fase III
Minor + : sebab? - Ab donor ? - Ab melapisi eritr pasien ?

Merup tes Coombs indirek

e. CCC

Cek dg tes Coombs Direk

Golongan darah

Tipe gol drh ditentukan oleh ekspresi antigen di permukaan eritrosit (Antigen A, B, H) Ditemukan I x oleh Landsteiner th 1900 (Golongan A, B, O) Golongan AB ditemukan oleh Von Decastello & Sturli (1902) Identifikasi gol drh ditentukan dg melihat reaksi aglutinasi antara Ag & Ab

Karakteristik Umum ABO Antigen

Antigen didistribusikan secara luas pada sel darah merah, limfosit, platelet, sel epitel dan endotel organ seperti ginjal. Terdapat bentuk terlarut dalam cairan tubuh kec. pada CSF Dapat dideteksi pada umur 5-6 minggu dalam uterus. Gen yang berperan: ABO, H, Se.

ABO White(%) phenotypes A 40 B 11 AB 4 O 45

Black(%) 27 20 4 49

Asian(%) 28 27 5 40

Distribusi Frequensi Golonan Darah ABO Phenotypes (US Population)

Substansi H

Constantoulakis menemukan substansi H pd sel fetus dari semua golongan ABO (ada sejak lahir) Substansi H berguna untuk pembentukan antigen A, B dan H pd eritrosit Pembentukan Ag A, B dan H tsb ditentukan oleh interaksi gen ABO dan Hh Substansi H merup struktur dasar Ag A & B Bila tdp gen H pd prekursor substance mk akan diubah mjd substansi H bila ada gen A / B mk akan mjd Ag A atau B

Substansi H

Shg seseorang dg gol A akan memp Ag A & H Gol B : memp Ag B & H Gen O, tak ada produk yg dpt dideteksi pd sel Gol O, tak ada substansi H yg diubah, hanya ditemukan substansi H saja Substansi H pada gol A & B < gol O Pd subgrup A, tak banyak substansi H yg diubah mjd Ag A bila reaksi thd Ag A menurun pd subgrup A yg lemah mk reaksi dg H mjd meningkat

Formasi antigen ABH

Gen ABH tdk langsung nyata mengkode produksi antigen ABH, tp memproduksi ensim spesifik glycosyltransferase yg bertugas menambahkan gula-gula ke substansi prekursor (PS) dasar pd eritrosit Ag ABH dibentuk dr material prekursor dasar yg sama yang memp gycolipid backbone Tdp satu struktur molekul karbohidrat (KH) yang melekat pd backbone tsb paragloboside/rantai oligosakarida/substansi prekursor Formasi Ag ABH tergantung pd gula-gula yg ditambahkan Monosakarida terakhir (nukleotida) / gula-gula yg menempel pada rantai KH menentukan spesifisitas molekul

Ensim & gula-gula yang berperan dlm penyusunan antigen ABH Gene Glycosyltransferase (enzyme) Immunodominant Sugar Antigen

-2-L-fucosyltransferase -3-Nacetylgalactosaminyl transferase -3-Dgalactocylltransferase

L-fucose N-acetyl-Dgalactosamin

D-galactose

menent spesifisitas

Material dasar: Galactose (GAL) N-Acetylglucosamine (GLNAC) Galactose (GAL) Glucose (GL)

Menyusun : Paragloboside a/ Oligosaccharide chain a/ Precursor substance

Red blood cell precursor structure (which represents a paragloboside)

Gen H mengkode produkasi ensim L-fucocyltransferase

Ensim tsb menempelkan Gula FUCOSE ke GAL

Menyusun Antigen H

Diekspresikan di permukaan eritrosit

Gol O

Formasi antigen A Gen A mengkode produksi ensim N-Acetylgalactosaminyl transferase

Ensim tsb menempelkan Gula N-acetyl-D-galactosamine (GALNAC) ke struktur H

Menyusun Antigen A

Diekspresikan di permukaan eritrosit

Gol A

Formasi antigen B Gen B mengkode produksi ensim D-galactocyl transferase

Ensim tsb menempelkan Gula D-galactose (GAL) ke struktur H

Menyusun Antigen B

Diekspresikan di permukaan eritrosit

Gol B

Golongan A

Golongan B

H H

A
B

Anti B

Anti A

Antigen/aglutinogen A
Antigen/aglutinogen B

Anti/aglutinin A Anti/aglutinin B

Golongan AB
A

Golongan O

AB

O
-

Anti B Anti A

Antigen/aglutinogen A
Antigen/aglutinogen B

Anti/aglutinin A Anti/aglutinin B

Golongan darah

Genotipe

Gen

Imunologi

AA atau AO
BB Atau BO AB OO

Homozygot
Heterozygot Homozygot Heterozygot Heterozygot Homozygot

Memp Ag A & H Memp Anti B

Memp Ag B & H Memp Anti A Memp Ag A, Ag B, Ag H Tidak punya anti Memp Ag H Tdk punya Ag A & B Memp Anti A Memp Anti B Tdk memp Ag H, A & B Memp anti A, anti B, & anti H

AB O

Bombay

hh

Homozygot

Phenotype A dpt dibagi menjadi sub group : Sub grup dlm sistem ABO : 80 % group A : ph A1 20 % group A : ph A2 A2 : bereaksi lemah, kdg2 terdeteksi sbg Gol O A2B : bereaksi lemah, kdg2 terdeteksi sbg Gol B Antigen (Ag) yg termasuk sistem gol AB terdapat dlm : - eritrosit, endotel & epitel - cairan tubuh (mis : saliva) : glikoprotein A1 & A2
Kualitatif dan Kuantitatif berbeda

Suami istri homozygot Suami

Suami istri heterozygot Suami Istri B A AB O BO Anak Bisa A, B, O, AB Prob ms 25%

A
AB AB

A
AB AB

Anak
Semua Gol AB 100%

Istri B
B

AO

OO

Suami heterozygot A Istri homozygot B

Suami Istri B A AB O BO Anak Bisa B a/ AB Prob. 50:50

Suami homozygot A Istri heterozygot B Suami A A Anak

Istri B O AB AO AB AO Bisa A a/ AB Prob. 50:50

AB

BO

Suami heterozygot A Istri heterozygot A Suami Istri A O A AA AO O AO OO A 75% O 25% Anak

Suami homozygot B Istri homozygot O Suami Istri O O B BO BO B BO BO 100% B Anak

Suami homozygot O Istri homozygot O

Suami Istri O O OO O OO Anak

Suami heterozygot AB Istri homozygot O Suami A B Anak

Istri O AO AO BO BO 50% A 50% B

OO

OO

100% O

Golongan darah Bombay

Darah Bombay adalah homozygot hh Jarang >> 99,9% individu : HH atau Hh Pertama kali ditemukan oleh Bhende di Bombay (1952) Dicurigai adanya darah yg tidak diaglutinasi oleh anti-A, anti-B, anti-AB dan anti-H Dituliskan sebagai golongan darah Oh untuk menunjukkan tidak adanya substansi H Gen h tidak memproduksi L-fucocyltransferase Memp Anti-A, anti-B, & anti-H

Seorang yang tidak mengekspresikan gen H (disbt juga genotype-nya hh)

memp phenotype
Bombay (Oh)

tidak memproduksi substrat H

gen A & B juga tdk bisa diekspresikan shg juga tidak mampu memproduksi Ag A dan Ag B

Perbedaan gol drh Oh dan O biasa

Gol Anti A Anti B Anti AB Anti H Sel A1 Sel A2 Sel B Sel O

Oh/ Bombay

+ +

+ +

+ +

+ -

Golongan BOMBAY

h
BOMBAY

Anti B

Anti A

Anti/aglutinin H

Aglutinasi eritrosit oleh adanya reaksi antigen-antibodi ada 2 tahap :

1. Tahap Sensitisasi 2. Tahap Hemaglutinasi

Lisis eritrosit terjadi bila seluruh rangkaian sistem komplemen teraktifkan menyertai interaksi Ag-Ab Aglutinasi terjadi bila Ab yg terikat menghubungkan eritrositeritrosit yg berdekatan membentuk gumpalan

Reaksi aglutinasi
Golongan B
Anti-B
B

B B
B

Anti A B Anti-B Anti-B

+
Anti-B

Hemaglutinasi = reaksi positif

Reaksi aglutinasi
Golongan O
Anti-A
Anti A

O
-

Anti B

O O

Anti A

Anti A

Anti B

Anti B
Anti-B

+
Anti-A Anti-B Anti-AB

O
Tdk tjd hemaglutinasi = reaksi negatif

Reaksi penggolongan darah

Eritrosit pasien 1 2 3 Reaksi Reaksi dg anti-A dg anti-B Negatif + Negatif Negatif Negatif + Reaksi dg anti-AB Negatif + + Interpretasi O A B

AB

Sistim Rhesus

Sampai saat ini dikenal 6 Ag: C & c, D & d, E & e Kombinasi: CDe, cDE, cDe, CDE, cdE, CdE, cde, Cde (terbanyak CDE, cDE, cde) Hasil: Rhesus + & Rhesus Yang menentukan + a/ - adalah: ada tidaknya antigen D Berguna dalam klinik Rhesus - : >> orang kulit putih Indonesia: <<

Golongan Darah Rhesus ( Rh )

D + : gol darah Rh +, mempunyai Ag D D - : gol darah Rh - , genotipe cde/cde, tdk mempunyai Ag D, mampu membentuk Anti D bila terjadi pemaparan dg eritrosit Rh + Du : Rh + lemah, bereaksi lambat, sering keliru dengan D