UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE NICARAGUA UNAN-MANAGUA MINISTERIO DE SALUD MINSA

Aislamiento Viral Dengue Influenza. Autores:

Br. Rivas Solano, Abigail Jocabed Br. Pichardo Luna, Ruth del Socorro Br. Campos Baca, Kathy Francella Br. Garcia Jimenez, Maria Ernestina Br. Quezada Gutierrez, Darlin Maria Br. Barrios Villanueva, Erick Francisco Br. Amador, Renaldy Jos
Carrera: Bioanlisis Clnico V ao Managua, Octubre 2012

Objetivos
1. Destacar Generalidades del aislamiento celular, tipos de celulas y su lineaje.
2. Mencionar aspectos generales de los agentes causales del Dengue e Influenza 3. Mencionar los mtodos tradicionales y actuales de aislamiento viral.

4. Describir los procedimientos tradicionales y actuales de aislamiento e identificacin del virus del dengue e influenza.

Introduccin
Los virus, a diferencia de los que sucede con la mayora de las bacterias, hongos y protozoos, slo pueden multiplicarse en el interior de clulas vivas, no pudiendo hacerlo en un medio nutritivo carente de clulas. Los sistemas celulares utilizados para propagar los virus en el laboratorio son: 1. Animales de experimentacin 2. Embriones animales 3. Cultivos celulares artificiales

Un aislamiento viral es una tcnica de alta sensibilidad y especificidad que utiliza cultivos celulares como biosustratos. Estas lneas celulares son obtenidos de a partir de explantes de rganos o clulas embrionarias.

Tipos de cultivos celulares

Cultivos primarios: Se obtienen mediante la dispersin de tejidos tomados directamente del organismo soportan hasta 3 pases (ej. Clulas de Rin embrionario)

Lneas celulares diploides: Clulas que toleran un nmero mayor de pases (aproximadamente 50) pero presentan un crecimiento normal ya que conservan hasta 75% de su cariotipo original.(ej. Fibroblastos de pulmn)
Lneas celulares continuas: son capaces de crecer indefinidamente, presentan un nmero alterado de cromosomas ya que son de origen maligno o canceroso. Soportan subcultivos mayores a 75 pases. Algunas de estas son:

HEP-2

LLC-MK2

MDCK

MRC5

Cuando se requiere un aislamiento viral? -Ocurren nuevas epidemias -Las pruebas serolgicas se traslapan -Confirmacin de un diagnostico presuntivo realizado al microscopio electrnico -Una misma enfermedad causada por diferentes agentes Se obtiene un aislamiento viral cuando: -Se produce el efecto citoptico -Aparece una protena codificada por el virus -Hemadsorcin -Interferencia -Transformacin -Alteracin especfica o muerte del animal -Aparicin de placas en el huevo embrionario

Dengue
El dengue es una enfermedad viral aguda, producida por el virus del dengue, transmitida por el mosquito Aedes aegypti que se cran en el agua acumulada en recipientes y objetos en desuso. El dengue es causado por cuatro serotipos del virus del dengue: DEN-1, DEN-2, DEN-3 DEN-4. Son miembros de la familia flaviviridae, genero flavivirus y presentan una estructura genmica comn cada uno con antgenos comunes y especficos propios de cada serotipo. Es un ARN de cadena simple de aproximadamente 11kb y polaridad positiva codifica para 3 protenas estructurales (Envoltura cpside y membrana) y 7 no estructurales.

Influenza

Influenza es una enfermedad infecciosa que se propaga por aerosoles y que infecta las vas respiratorias por un tipo devirus de ARNde la familia de los Orthomyxoviridae. Su tiempo de incubacin va entre 1-4 dias. Entre los tipos de virus de la influenza comprenden: Influenza A: Que a su vez se divide en 10 serotipos (H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7) Influenza B Influenza C

Tcnicas de aislamiento viral

Las tcnicas de aislamiento viral se han venido desarrollando a los largo del tiempo desde su uso. An si existen tcnicas, relativamente nuevas, siempre se remontan a tcnicas tradicionales en casos en que las actuales existan un diferimiento o dificultad para su debida deteccin. Las tcnicas directas para demostracin viral se basan en la visualizacin de la partcula viral o su efecto celular especifico como tinciones de microscopia de luz, electrnica y cultivo o aislamiento viral. Existen tcnicas tradicionales tradicionales tenemos: y actuales entre las

Tcnicas tradicionales de aislamiento viral

Inoculacin en animales
La inoculacin de animales de laboratorio con material infeccioso puede constituir el primer paso en la identificacin viral. El animal mas utilizado es el ratn blanco que dependiendo del virus a estudiar se utilizan adultos o recin nacidos. La inoculacin es usualmente intracerebral con un inculo de 0.03 ml o intraperitoneales donde se pueden administrar dosis mayores.

Inoculacin en huevos embrionarios

Puede ser utilizado para el aislamiento y cultivo del virus como fue demostrado en la dcada de los treinta por Goodpasteur y Burnet. Inicialmente se utilizo para trabajo con influenza y luego con otros virus como rubeola, herpes simplex. Estos pueden inocularse en diferentes vas dependiendo del agente a estudiar. El aislamiento viral ser evidenciado por muerte embrionaria y aislamiento del mismo del liquido alantoideo.

Tcnicas tradicionales de aislamiento viral

Cultivo celular Estndar de oro para la deteccin de un virus. Un cultivo celular se deriva del crecimiento de clulas que emigran de un tejido o por clulas que se obtienen por dispersin enzimtica a partir del tejido.

Otras tcnicas semi-tradicionales Se utilizan para descubrir anticuerpo contra determinado agente viral, estos ensayos se clasifican embace a la cuantificacin antgeno-anticuerpo Los que dependen de la capacidad del anticuerpo que se una al antgeno para ejercer funcin no relacionada con el antgeno: fijacin del complemento y hemaglutinacin. Los que miden la capacidad de los anticuerpo para bloquear la funcin viral especifica como la inhibicin de la hemaglutinacin

Tcnicas actuales de aislamiento viral

Tcnicas directas utilizadas actualmente para la demostracin viral. Las pruebas para demostrar antgenos vrales que permiten descubrir y caracterizar un virus en cultivo celular cuando todava no se produce el efecto citoptico o aun no se evidencia o en los casos en que el virus se debe reconocer por otras propiedades o caractersticas en cultivo, entre estas tenemos: La hemadsorcin, Inmunofluorescencia directa, Radioinmunoensayo, ELISA. Las que evidencia o descubren material gentico especfico viral conservadas y replicables ya sea en un fluido, clula o tejido entre estos estn(Biologa Molecula): Reaccin en cadena de la polimerasa(PCR) Reaccin en cadena de la ligasa(LCR) Hibridacin.

Diagnostico Dengue
Las tcnicas ms utilizadas para el aislamiento viral para dengue es el cultivo celular. Procedimiento: En el diagnostico de rutina se recomienda la inoculacin de muestras de sueros diluidas 1/30 e inoculadas en volmenes de 0.1 ml en monocapas de clulas C6-36/HT sembradas en tubos. El aislamiento es identificado con IF Otras Lineas Existen lnea celular de mamferos que se han usado para el aislamiento de estos virus (LLCMK2; y BHK21). Las clulas de mosquito que se han utilizados para el aislamiento viral son mas sensibles, fciles de multiplicar y mantener a temperatura ambiente y pueden estar hasta 14 das sin cambiar de medio de cultivo, se pueden inocular directamente con el suero del paciente. Entre estas lneas celulares del mosquito tenemos: (AP61; C636; Tra284; CLA-1).

Diagnostico Influenza
Los procedimientos de diagnostico del virus influenza se pueden clasificar en: 1. Diagnostico virolgico basados en deteccin del agente viral por: aislamiento en cultivos celulares o huevos embrionados (Posterior se realiza extraccin del liquido amnitico y alantoideo a prueba de hemaglutinina), deteccin de antgeno y amplificacin parcial del genoma viral por RT-PCR. 2. Diagnostico serolgico basados en la deteccin y medida de niveles de anticuerpos en sueros pareados utilizando las tcnicas de inmunodifusin en agar (IDA), ensayo inmunoenzimtico (ELISA) o inhibicin de la hemaglutinacin (IHA).

Cultivo celular en MDCK

200 l de cada espcimen en un frasco de cultivo de clulas dejando adsorber por 30 minutos a 37C y luego incubar a 33C en incubadora de CO2

Cosechar si ECP 3+ 4+ o si no hay ECP en 6-7 y someter a HA e identificar subtipo por IHA o RT-PCR