Anda di halaman 1dari 6

Laporan Praktikum

Western Blot

Disusun oleh:

Makhyan Jibril Al Farabi

Program Studi Magister Ilmu Biomedik FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

1. PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang

Teknik western blot, atau juga disebut sebagai imunoblot telah sering digunakan untuk menganalisis protein spesifik pada sampel. Western blot menggunakan gel elektroforesis untuk memisahkan protein berdasarkan panjang polipeptida. Protein tersebut akan ditransfer ke nitroselulosa atau PVDF dan diberi antibody spesifik untuk identifikasi protein target (Burnette, 1981). Saat ini, telah banyak reagen antibody baik poliklonal maupun monoklonal untuk 10.000 jenis protein. Sehingga western blot sangat bermanfaat untuk digunakan bersama antibody tersebut. Metode ini awalnya ditemukan oleh George stark pada Universitas Stanford. Nama western blot diberikan pada teknik tersebut oleh Neal Burnette and Sushant Bhat, merupakan nama yang dimiripkan dengan teknik deteksi DNA southern blot yang ditemukan Edwin southern dan Northern blot yang digunakan deteksi RNA (Towbin et al., 1979)

1.2. Tujuan Untuk mengetahui proses pelaksanaan western blot dan cara interpretasinya

2. METODE 2.1 Persiapan Sampel Sampel bisa diambil dari kultur sel maupun bagian dari jaringan. Untuk jaringan yang solid bperlu dilakukan penghancuran menggunakna blender atau homogenizer. Detergen, garam dan buffer juga bisa digunakan untuk melisiskan membrane sel. Protease dan phospatase inhibitor diberikan untuk mencegah terjadinya pemecahan jaringan dengan enzimnya sendiri. Perispan jaringan biasanya dilakukan apda suhu dingin untuk mencegah degradasi protein. Untuk memisahkan komponen sel dengan organel, dilakukan sentrifugasi.

Gambar 1. Langkah dalam persiapan sampel western blot Protein dari sampel diseparasi mengunakan elektoforesis SDS page berdasarkan isoelektrik poin, berat molekul, kelistrikan atau kombinasinya. SDS PAGE akan mempertahankan polipeptida dalam bentuk denaturasi setelah dibersihkan dari struktur sekunder dan tersier sehingga protein dapat dipisah berdasarkan berat molekul.

2.2 Transfer Untuk membuat protein dari SDS page bisa dideteksi oleh antibody, protein tersebut perlu ditransfer dari gel ke membrane nitroselulosa atau polyindylidene difluoride (PVDF). Membrane tersbut diletakkan di atas gel dan ditambahkan buffer. Protein akan masuk pada membrane dan siap dideteksi dengan western blot (Renart et al., 1979)

Gambar 2. Langkah dalam SDS PAGE Untuk mengecek keseragaman dari transfer protein dari gel ke membrane dapat dicek dengan pewarnaan commasie brilliant blue dan ponceau S . 2.3 Blocking Blocking dilakukan untuk mencegah antibody sekunder bereaksi dengan protein non spesifik yang masuk pada sampel. Blocking biasanya menggunakan BSA atau susu skim tanpa lemak pada TBS. pemberian Tween 20 atau Tritonn X-100 dapat memperjelas hasil final dari western blot mengurangi false positif

2.4 Deteksi Dua Langkah Pada saat deteksi membran dengan antibody, untuk deteksi dua langkah dilakukan persiapan antibody primer yang dibentuk dari produksi mandiri. Antibody primer dengan antigen yang di inginkan diberikan sesuai dengan sampelnya. Antibody primer yang

digunakan pada sampel ini ialah antibody poliklonal terhadap protein Shigella 49kDa. Solusi antibody dan membran dapat disimpan setelah itu diberikan antibody sekunder yang

berikatan dengan antibody primer. Sehingga dengan bantuan horseradish peroxidase akan terjadi luminasi sesuai dengan jumlah protein.

Gambar 2. Langkah dalam Western blot


3. HASIL

Gambar 1. Pita Protein yang Terbentuk Regresi Linier


BM MARKER JARAK TRACKING 1 260 5 2 135 8 3 95 10

NO

LOG BM 2.414973 2.130334 1.977724

RF 0.075758 0.121212 0.151515

4 5 6 7 8 9 10

72 52 42 34 26 17 10

12.5 18 22.5 27 33 43.5 60

1.857332 1.716003 1.623249 1.531479 1.414973 1.230449 1

0.189394 0.272727 0.340909 0.409091 0.5 0.659091 0.909091

RF = jarak tracking / jarak total, dimana jarak total yakni 66 mm


1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 -0.2 0.5 1 1.5 2 2.5 3 Series1 Linear (Series1) y = -0.5934x + 1.3655 R = 0.9056

Gambar 2.0 Grafik regresi Linier Kurva Standar Marker


Sampel 1. OMP Shigella JARAK TRACKING 8 12.5 13.5 14.25 34.5 38.5 RF 0.121212 0.189394 0.204545 0.215909 0.522727 0.583333 LOG BM 2.09745 1.982472 1.956922 1.937759 1.420359 1.318156 BM 125.1555 96.04445 90.55692 86.64803 26.32442 20.80445

Sampel 2. Pili Shigella JARAK TRACKING RF LOG BM BM 34.5 0.522727 1.420359 26.32442 38.5 0.583333 1.318156 20.80445

5. KESIMPULAN

Teknik western blot, atau juga disebut sebagai imunoblot telah sering digunakan untuk menganalisis protein spesifik pada sampel. Western blot menggunakan gel elektroforesis yang ditranfer pada nitroselulosa atau PVDF dan diberi antibody spesifik untuk identifikasi protein target. Pada praktikum ini pemberian antibody poliklonal Shigella 49 kDa mengalami kros reaksi pada sampel OMP Shigella dengan BM 125, 96, 90, 86 dan 26 kDa sedangkan pada pili kros reaksi terjadi pada 26 dan 20 kDa.
DAFTAR PUSTAKA

Burnette WN. 1981. "'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A". Analytical Biochemistry 112 (2): 195203. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. 1979. "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications". Proceedings of the National Academy of Sciences USA 76 (9): 435054 Renart J, Reiser J, Stark GR. 1979. "Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethylpaper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure". Proceedings of the National Academy of Sciences USA 76 (7): 311620.