Bahan kimia dan tanaman Asiaticoside (99,2%, HPLC), madecassoside (97,94%, HPLC), Asiatik acid (99%, HPLC) dan

asam madecassic (95%, HPLC) adalah dibeli dari Extrasynthese (Genay, Perancis). Asetonitril dan metanol HPLC kelas berasal dari Prolabo, VWR (Leuven, Belgia). Daun segar dari C. asiatica (L.) Urban dikumpulkan pada bulan Desember 2007 dan Januari 2008 di daerah Dataran Tinggi Timur dan Tinggi Madagaskar. Daun dipisahkan dari batang, dikeringkan pada 40 C, bubuk dan diayak dengan saringan dari 355 mmeshes. Bubuk daun disimpan pada suhu kamar dan di daerah kering. Satu daun kering bubuk gram diekstraksi dengan Soxhlet selama 8 jam dengan 100 ml metanol. Ekstrak diuapkan sampai kekeringan pada tekanan tereduksi. Ekstrak kasar kering dilarutkan di ofmethanol 10 ml, disaring melalui filter 0,45 (Whatman, New Jersey, USA). 2.2. Aparat HPLCWaters 2.690 pemisahan modul (Waters, Milford, MA, USA) yang digunakan terdiri dari pompa, sebuah autoinjector, yang spektrofotometri UV detektor Kromaton (Angers, Prancis), semuanya dikontrol oleh Borwin software (Borwin, Rostock, Jerman). Untuk penentuan spektrum massa, LCQ Thermo Finnigan (Waltham, MA, USA) dilengkapi oleh X-Calibur software. Tabel 1 Gradien kondisi HPLC. Waktu (Min) Pompa Sebuah air, (%) B Pompa, asetonitril (%) 0 80 20 15 65 35 30 35 65 35 20 80 40 20 80 45 80 20 55 80 20 Pemisahan kromatografi dilakukan dengan terbalik fase RP-18 LiChroCART kolom (250mm 4mm ID; partikel Ukuran: 5 m). Fase gerak adalah gradien asetonitril / air (Tabel 1), laju alir 1ml/min dan deteksi pada 206 nm. 2.3. Standar solusi Stock solusi asiaticoside dan asam Asiatik dipersiapkan dalam metanol pada 5,0 dan 2,5 mg / ml, masing-masing, dan disimpan pada 0 C. Pengenceran dilakukan untuk setiap percobaan. Tiga konsentrasi (m = 3) dari asiaticoside (0,5, 2,5 dan 5,0 mg / ml) dan asam Asiatik (0,25, 1,0 dan 2,5 mg / ml) yang digunakan. Masing-masing konsentrasi dianalisis dua kali (n = 2) selama 3 hari (k = 3). Larutan ekstrak diencerkan dengan metanol (1:5, v / v) untuk penyusunan standar validasi dan dibubuhi tiga diketahui konsentrasi campuran asiaticoside dan Asia acid. Setiap standar validasi dianalisis tiga kali (n = 3) untuk 3 hari (k = 3). 2.4. Evaluasi ekstraksi Ekstraksi kinetik dilakukan dengan mengevaluasi puncak daerah (HPLC analisis) dari masingmasing senyawa setelah 4, 6, 8 dan 10 h (n = 3). Waktu yang paling tepat ekstraksi Soxhlet ditentukan menggunakan data ini.

2,5. Validasi metode Semua senyawa referensi tersedia secara komersial namun asiaticoside dan asam Asiatik yang dipilih untuk mencapai validasi metode untuk mengukur asam dan madecassoside dan madecassic, masing-masing, karena kita mengamati faktor respon yang identik untuk dua osides dan dua aglikon di HPLC-UV (Tabel 2). Akibatnya, memilih hanya dua referensi mengurangi biaya analisis. Seperti C. asiatica adalah matriks biologi, penerimaan relatif besar batas yang ditentukan [23]. Validasi metode dilakukan untuk 3 hari dengan menguji kriteria sebagai berikut: fungsi respon, linearitas, trueness, presisi (pengulangan dan presisi intermediate), akurasi, batas deteksi (LOD) dan kuantifikasi (LOQ), dan kuantifikasi jangkauan. Analisis statistik data dilakukan dengan menggunakan e-noval V2.0 (Arlenda-Lige) software.