MANUAL

DE

PRCTICAS

BIOLOGA CELULAR Y MOLECULAR II

DR. MIGUEL MARTINEZ TRUJILLO M.C. HUGO ALEJANDRO FARIAS CHAGOYA DRA. LOURDES BALLESTEROS A. MC. JOSE LUIS ABREGO ARANDA

AGOSTO 2011

INTRODUCCIN

La Biologa Celular y Molecular en la actualidad ha tenido un avance muy notable, ya que se ha dado la aplicacin de nuevos mtodos para el anlisis de la clula en todos sus niveles. Para tener un mayor conocimiento acerca de la organizacin molecular de la clula es necesario que sea a partir del estudio de las diferentes molculas que la conforman. Esto nos permite enfocar cada uno de los fenmenos celulares que se llevan a cabo en aquella. Este curso pretende analizar al ncleo y los distintos mecanismos moleculares que se llevan a cabo durante el ciclo celular, tales como la formacin y asociacin de los cidos nucleicos que constituyen el material gentico de los organismos.

Objetivos:

1.- Comprender la duplicacin del material gentico por medio de la observacin y anlisis de las diferentes etapas celulares.

2.- Aprender diferentes tcnicas de estudio en Biologa Celular.

Lineamientos en el laboratorio: Se recomienda que se lea cada prctica antes de presentarse a la sesin de laboratorio, ya que este curso est dirigido hacia la aplicacin de tcnicas de estudio de la Biologa Celular. Para lo cual se pide el diseo y control sobre los experimentos que se estn realizando. El alumno deber contar como mnimo en cada sesin de prcticas con el siguiente material: 1.- Manual de prcticas de Biologa Celular y Molecular II. El alumno deber observar buena conducta dentro del laboratorio y cumplir con los Lineamientos que marca el Reglamento interno de los Laboratorios de Docencia:

1.- El uso de la bata en el laboratorio es obligatorio, NO permitiendo el acceso al mismo a ningn alumno si no se trae en ese momento. 2.- El alumno deber tener limpio su lugar de trabajo, por tal motivo deber depositar la basura en los cestos y no en el suelo y no se permite la ingesta de bebidas ni alimentos dentro del laboratorio. 3.- Al trmino de la prctica todo el material de cristalera utilizado debe estar perfectamente bien lavado y sus mesas de trabajo limpias. 4.- Trabaje en orden, evitando distraer a sus compaeros cuando estn realizando sus experimentos. El alumno desordenado ser suspendido de la sesin en curso. 5.- Esta prohibido el huso de celulares dentro del laboratorio como medio de comunicacin. Solo podrn ser utilizados para la toma de fotografas de las preparaciones cuando as lo requieran, para una mayor calidad en el reporte. EVALUACION DEL CURSO Se pasar lista de asistencia dentro de los primeros 15 minutos, despus de este tiempo se contar como falta y no se le permitir la entrada al laboratorio. La evaluacin final de la parte prctica tendr un puntaje mximo de 3.0 (30 % de la calificacin final) la cual ser sumado a la calificacin terica correspondiente. Ambas calificaciones (terica y practica), debern ser aprobatorias de lo contrario automticamente tendrn que presentar el examen extraordinario. El curso tendr un examen de evaluacin final. Sistema de Evaluacin 1.- Se requiere el 80 % de asistencia a las sesiones de laboratorio lo cual representar el 5% del curso prctico y el derecho a examen final. 2.- Los reportes de laboratorio que representan el 10% 3.- El examen final que tendr un valor del 15%

REPORTE 1).- Referencias: Citar cuando menos una fuente bibliogrfica, la cual Deber incluir: Autor, Ttulo, Editorial, Pas y Ao. No se aceptarn pginas de internet 2) El informe ser evaluado POR EQUIPO y al trmino del semestre, todos entregaran sus manuales debidamente contestados. 3) Solo se reportarn los resultados y el cuestionario en el mismo manual, en caso de requerir ms hojas se anexaran. No se aceptarn hojas sueltas.

CONTENIDO

PRCTICA No. 1

MITOSIS EN CELULAS VEGETALES

PRCTICA No. 2 CARIOTIPOS EN RAICES DE HABA ( Vicia faba )

PRCTICA No. 3 MEIOSIS (Chlorophytum comosum).

EN

CELULAS

DE

Listoncillo

PRCTICA No. 4

PURIFICACIN DE ADN EN PLANTAS

PRCTICA No. 5

AISLAMIENTO DE ADN PLASMDICO EN BACTERIAS

PRCTICA No. 6 ELECTROFORESIS DE ADN EN GELES DE AGAROSA

PRCTICA No.

7 CODIGO GENETICO Y TRADUCCIN

PRCTICA No. 8

EJERCICIOS DE BIOLOGA MOLECULAR

PRCTICA NMERO 1 MITOSIS EN CELULAS VEGETALES Introduccin: La mitosis es el proceso celular por el cual las clulas somticas se dividen para originar nuevas clulas hijas, son las encargadas de provocar el crecimiento y desarrollo de un organismo, esto es, las clulas aumentan en nmero por divisin, como resultado de la mitosis. Los ncleos resultantes mantienen el mismo nmero e identidad de los cromosomas de la clula de la cual derivan. La mitosis es un proceso bajo control gentico, el cual ha sido dividido en cuatro fases: PROFASE, METAFASE, ANAFASE y TELOFASE. Teniendo cada una de estas sus etapas intermedias correspondiente. Adems de la etapa terminal de la divisin celular llamada CITOCINESIS Este proceso celular ocurre en todas las regiones meristemticas puntos de crecimiento de una planta.

Objetivo: Observar las diferentes etapas de la mitosis en clulas vegetales.

Parte Experimental: Material por equipo: Microscopio compuesto Navajas de afeitar Toallas Sanitas Aguja de diseccin (recta) Portaobjetos y cubreobjetos Vidrios de Reloj Lmpara de alcohol Reactivos: Acetocarmin HCl 1N Aceite de inmersin Material biolgico: 20 Semillas de haba germinadas de 8 das de edad.
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Procedimiento: 1.- Realice cortes transversales lo mas delgado posible en los pices Radicales de las habas. 2.- Coloque los tejidos un vidrio de reloj o en un portaobjetos limpio y cbralos con gotas de HCl 1 N durante 15 minutos. 3.- Transcurrido el tiempo anterior, quite el exceso de cido y adicione Acetocarmin tambin por espacio de 15 minutos. 4.- Posteriormente proceda a observar las diferentes etapas de mitosis al Microscopio. Presentacin de resultados: I).- Esquematice cada fase de mitosis observada colocando el aumento, la etapa mittica y su correspondiente explicacin. II).- Usted deber ubicar como mnimo 9 fases celulares, estas son: Profase temprana, Profase media, Profase tarda, Prometafase, Anafase temprana, Anafase tarda, Telofase temprana, y Telofase tarda. III).-Para realizar lo anterior, auxliese de las fotografas que se anexan en esta prctica.

Cuestionario: 1.- Explique en que consisten cada una de las etapas de la mitosis. 2.- Por qu se utilizan pices radicales en estudios celulares, que ventaja representa su utilizacin. 3.- Describa y esquematice la cariocinesis y la citocinesis, asimismo defina lo que es eucromatina y heterocromatina.

PRCTICA NMERO 2 CARIOTIPOS EN RAICES DE HABA Introduccin: En 1931, Levintsky llam cariotipo al complemento cromosmico particular de un individuo grupo afn de individuos. Las caractersticas del cariotipo son constantes para las especies y pueden utilizarse, al igual que la morfologa externa, para su clasificacin taxonmica. Su anlisis comparativo nos permite inferir relaciones filogenticas entre los diferentes taxa. Definido tanto por el nmero como la forma de los cromosomas, es posible mediante el anlisis de estas caractersticas detectar la diversidad de mecanismos citolgicos surgidos en el curso de la evolucin de los seres vivos. Con base en el cariotipo es posible observar si existen nmeros anormales de cromosomas e identificar el sexo de los organismos. Los cariotipos se definen con respecto a las siguientes caractersticas: 1).- Nmero de cromosomas 2).- Tamao absoluto y relativo de cada cromosoma 3).- Relacin de brazos cromosmicos 4).- Posicin centromrica 5).- Constricciones secundarias Objetivo: Manejar las tcnicas de obtencin de cariotipos en plantas Material por equipo: Microscopio compuesto Porta y cubreobjetos Aguja de diseccin (recta) Toallas Sanitas Navajas de afeitar o bisturi Reactivos: HCl 1 N Alcohol al 70% Acido actico al 45 % Solucin de acetocarmin Aceite de inmersin
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Colorante Feulgen 8 Hidroxiquinoleina o Ortho-Para dicloro benceno. Farmer Material biolgico: *Semillas de haba germinadas de 10 das de edad o races recin cortadas de plantas jvenes. ( Material preparado por el alumno) Procedimiento: 1.- Se deben seleccionar los pices radicales de las habas que presenten mejores condiciones, es decir que no tengan lesiones manchas cafs. 2.- Se ponen a pretratar en 8 Hidroxiquinoleina o Ortho-Para dicloro benceno durante 2 a 3 horas a 4 C. 3.- Se colocan en fijador Farmer (Alcohol etlico absoluto: cido actico glacial en proporcin 3:1) durante 24 horas y se cambian a Alcohol 70% hasta su utilizacin. 4.- Despus de la fijacin de las races se lleva a cabo una hidrlisis colocando las mismas en HCl 1N durante 16 min a 60C. 5.- Inmediatamente se pasan al colorante Feulgen pera la tincin de los cromosomas por lo menos una hora. 6.- Se realizan cortes muy finos del pice y se colocan estos cortes en un portaobjetos limpio y seco con gotas de Acetocarmn o acetorceina, las suficientes para cubrir totalmente los tejidos. Se calientan brevemente en la lmpara de alcohol evitando que llegue a ebullicin. 7.- Posteriormente se coloca el cubreobjetos y se presiona con la goma de un lpiz cuidando de no romper el cubreobjetos, se puede presionar con el pulgar poniendo encima papel filtro o toalla sanita para quitar exceso de colorante. Nota: Tenga cuidado de no dejar deshidratar los tejidos, esto es, deber de agregar un reactivo enseguida del otro, teniendo un breve espacio para secarlo. 8.- Despus se pueden adicionar gotas de cido actico al 45 % , colocando el cubreobjetos y observando al microscopio.
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Presentacin de resultados: I).- Deber ubicar distintos campos celulares, teniendo especial atencin en aquellas clulas que presenten los cromosomas bien separados.

Cuestionario:

1.- Por qu cree usted que se observan mejor los cromosomas en metafase Mittica y no en otra fase celular? 2.- Podra trabajar con semillas sin germinar para poder observar los cromosomas? 3.- Explique por qu los cromosomas se pueden teir con acetorcena. 4.- Describa al menos 4 cariotipos en plantas, colocando en una tabla comparativa el nmero de cromosomas, tamao, forma y posicin del centrmero.

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PRCTICA NMERO 3 MEIOSIS EN CELULAS DE LISTONCILLO

Introduccin: En eucariontes la reproduccin sexual est asociada a un proceso especial de divisin del ncleo llamado MEIOSIS. En este fenmeno de divisin celular existe una profase larga, durante la cual los cromosomas homlogos se aparean longitudinalmente (sinapsis) e intercambian segmentos de cromatina o material gentico por un proceso llamado entrecruzamiento. La meiosis es un mecanismo que distribuye las unidades hereditarias ( Genes ) permitiendo tambin su recombinacin aleatoria independiente en grado variable. Objetivo: Observar e identificar las distintas etapas de la meiosis. Parte Experimental: Material por equipo: Microscopio compuesto Pipetas pasteur Navajas de afeitar Porta y cubreobjetos Lmpara de alcohol Agujas y pinzas de diseccin Cajas de petri Reactivos: Acido actico al 45 % Acetocarmn al 1 % Etanol al 70 % Material biolgico: Inflorescencias de listoncillo

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Procedimiento: 1.- Fije con anticipacin inflorescencias de listoncillo en solucin Farmer. 2.- El da de la prctica transfiera las inflorescencias a una caja de petri que contenga Etanol al 70 %. 3.- Utilice sus pinzas para tomar 3 florecillas. 4.- De cada florecilla separe las anteras y colquelas en un portaobjetos limpio, cubrindolas con gotas de acetocarmn al 1 % durante 15 minutos. 5.- Corte con su navaja las anteras transversalmente, y presinelas para exprimir su contenido. 6.- Posteriormente remueva las anteras y cubra los granos de polen con gotas de colorante y cido actico al 45 % . 7.- Enseguida coloque el cubreobjetos sin presionar y caliente la preparacin levemente utilizando su lmpara de alcohol evitando que el lquido hierva. 8.- Observe sus preparaciones al microscopio.

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Presentacin de resultados: Realice esquemas de las diferentes fases de la meiosis, el aumento correspondiente, las estructuras y la explicacin de la fase meitica que est usted observando. Cuestionario: 1.- Por qu puede observar la meiosis en las inflorescencias y no en otros tejidos? 2.- Durante la primera profase de la meiosis ocurre un evento de gran relevancia desde el punto de vista gentico. Descrbalo. 3.- Explique en detalle las etapas de la meiosis. Esquematice.

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PRCTICA NMERO 4 PURIFICACIN DE ADN EN PLANTAS Introduccin: Una de las herramientas ms importantes en la biologa molecular es precisamente la extraccin y purificacin de cidos nucleicos la cual se puede realizar de diferentes organismos, tales como virus, bacterias, humanos, plantas, entre otros. Para este propsito existe una gran cantidad de mtodos, muchos de los cuales resultan lentos y costosos, actualmente ya se cuenta con mtodos ms rpidos y muy eficientes tal es el caso de los kits comerciales especficos para ciertos tipos de tejidos. En esta ocasin DNAZOL. se utilizar un Kit comercial llamado Plant

Objetivo: Analizar la importancia que tiene la extraccin y purificacin del ADN en la biologa molecular. Material biolgico: Hojas de plantas herbceas sin cutcula gruesa y glabras. Reactivos: Agua desionizada estril Isopropanol Etanol Nitrgeno lquido (precaucin 200 C) TE buffer (pH 8.0) NaOH 8 mM cloroformo. EDTA 1 mM Cristalera: Mortero y pistilo previamente enfriados (-20 C) 15 minutos antes de iniciar el experimento 2 tubos Eppendorf de polipropileno de 1.5 ml fros 1 esptula Papel Aluminio

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Parte Experimental: Descripcin: Plant DNAZOL es un reactivo especficamente formulado para el aislamiento de ADN genmico de plantas. Y el procedimiento se basa en el uso de una nueva solucin ltica de un detergente de guanidina, la cual hidroliza al RNA y permite la precipitacin selectiva del DNA del lizado. El procedimiento de extraccin es rpido y permite el aislamiento de ADN de distintos tejidos de plantas. El ADN extrado permite ser usado en anlisis de Southern blot, hibridacin, clonacin molecular, PCR, etc. Nota: el reactivo Plant DNAZOL contiene irritantes por lo que es necesario evitar el contacto con la piel y ojos, en caso de contacto lavar copiosamente con agua, es necesaria atencin mdica. Procedimiento: Extraccin: 1.- Pesar 1 g. de tejido de planta, lavarlo con detergente y enjuagarlo con agua fra estril y secarlo con una toalla de papel. 2.- Colocar el tejido ya seco en un mortero y congelar lo ms pronto posible en nitrgeno liquido. 3.- Moler el tejido en un mortero con nitrgeno lquido hasta obtener un polvo muy fino; colocando aproximadamente 0.2 g. en un tubo eppendorf de 1.5 ml fro. 4.- Adicionar 0.6 ml del reactivo Plant DNAZOL y agitar suavemente por unos segundos . 5.- se incuba en agitacin a 25C durante 5 min. 6.- Se adicionan 0.6 ml de cloroformo mezclando vigorosamente y se incuba en agitacin a 25C durante otros 5 min. 7.- El extracto se centrifuga a 12,000 rpm por 10 min. y se transfiere el sobrenadante (fase acuosa) resultante a un tubo Eppendorf limpio y estril

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Precipitacin: 8.- Despus de la centrifugacin, el ADN resultante en la fase acuosa del extracto, se precipita con 0.5 ml de alcohol etlico absoluto (etanol). Se mezcla por inversin durante 6 a 8 veces y se almacena a temperatura ambiente por 5 min. 9.- Para sedimentar el precipitado de ADN se centrifuga a 5000 rpm por 4 min. y se remueve el etanol. (En ocasiones el ADN precipitado no se observa antes de la precipitacin). 10.- en ocasiones es necesario lavar el ADN utilizando 0.3 ml de plant DNAZOL y 0.3 ml de etanol al 75%, volviendo a centrifugar a 12,000 rpm por 4 min. Eliminando el sobrenadante. 11.- Por ultimo la pastilla se seca a temperatura ambiente y se solubiliza el ADN en 500 l. de Buffer TE pH 8 agua desionizada estril. 12.- Se analiza la integridad del ADN en un gel de agarosa al 0.8%.

Cuestionario: 1.- Explica la importancia que tiene el purificar ADN. 2.- Con qu finalidad se emplearon los siguientes reactivos, etanol, cloroformo, EDTA, Plant DNAsol. Durante el proceso de extraccin y purificacin del ADN: 3.- Que es un agente caotropico

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PRCTICA NMERO 5 AISLAMIENTO DE ADN PLASMDICO EN BACTERIAS Introduccin: El trmino plsmido fue presentado por primera vez por el bilogo molecular norteamericano Joshua Lederberg en 1952, Los plsmidos son molculas de ADN extracromosmico circular o lineal que se replican y transcriben independientes del ADN cromosmico. Estn presentes normalmente en bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras. Su tamao vara desde 1 a 250 kb. El nmero de plsmidos puede variar, dependiendo de su tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos por clula. Los plsmidos a menudo contienen genes o paquetes de genes que le confieren una ventaja selectiva lo cual les da la habilidad de hacer a la bacteria, resistente a los antibiticos y permiten seleccionar clones recombinantes. Los plsmidos se utilizan en ingeniera gentica por que es relativamente fcil manipularlos e insertar nuevas secuencias genticas. Cada plsmido contiene al menos una secuencia de ADN que sirve como un origen de replicacin u ORI (un punto inicial para la replicacin del ADN,

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Objetivo: Aislar el ADN bacteriano mediante la tcnica de Mini-Prep (Sambrook y Col., 1989). Material biolgico: Bacterias de la cepa E. coli que contiene el plasmido pRBCS Material: tubo eppendorf 1.5 ml frios centrifuga Vortex micropipeta Reactivos: Medio LB Solucin fra Birboin 1 (Glucosa 50 mM, Tris-HCl 25 mM pH 8.0, EDTA 10 mM pH 8.0) Solucin Birboin 2 (NaOH 0.2N, SDS 1%) Solucin Birboin 3 (Acetato de potasio 3M, cido actico glacial 5M) Isopropanol Agua desionizada estril Hielo

La tcnica se describe a continuacin: a) Inocular una colonia en medio LB con el antibitico especfico, de ser necesario de 2 a 4 ml de medio. b) Incubar toda la noche a 37C con agitacin. c) Vaciar en un tubo eppendorf 1.5 ml y centrifugar a 12 000 rpm a por 2 minutos. d) Eliminar el sobrenadante.( En agua con cloro) e) Resuspender la pastilla en 150 l de solucin fra Birboin 1 (Glucosa 50 mM, Tris-HCl 25 mM pH 8.0, EDTA 10 mM pH 8.0). Agitar en Vortex o resuspender con pipeta. f) Adicionar 300 l de solucin Birboin 2 (NaOH 0.2N, SDS 1%)(se prepara al momento), mezclar suavemente con la mano (no usar Vortex) y dejar en hielo por 5 minutos. g) Adicionar 225 l de solucin Birboin 3 (Acetato de potasio 3M, cido actico glacial 5M), agitar suavemente (no usar Vortex) para
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disgregar los restos celulares. Si se usa Vortex se libera el ADN. cromosomal a la solucin y se mezcla con el ADN plasmdico, lo cual no es conveniente. Dejar 10 minutos en hielo. h) Centrifugar a 12 000 rpm por 10 minutos a 4C. i) Tomar 600l de sobrenadante limpio sin precipitado. j) Adicionar 600l de isopropanol. Refrigerar durante al menos una hora. k) Centrifugar a 12 000 rpm por 20 minutos. l) Retirar el etanol con la pipeta evitando arrastrar la pastilla. Dejar secar a temperatura ambiente. m) Resuspender en 40 l de agua desionizada estril. n) Correr 2 l en un gel de agarosa para corroborar la presencia del plsmido. Cuestionario: 1.- Que ventajas le representa el ADN plasmdico a la bacteria que lo posee

2.- Describe el proceso de transformacin gentica por Agrobacterium tumefaciens.

3.- Describe la estructura completa de un plasmido.

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PRCTICA NMERO 6 ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA Introduccin: La electrofresis es una tcnica comnmente utilizada en biologa molecular para separar molculas de ADN de una mezcla, utilizando la aplicacin de un campo elctrico. Las molculas de ADN en un campo elctrico se mueven migran en direccin determinada por su carga elctrica. El ADN se encuentra cargado negativamente y migra del ctodo (- ) al nodo (+) con una movilidad que depende primeramente del tamao de la molcula. Por ejemplo: Un fragmento grande de ADN lineal migra a travs de una matriz de gel (agarosa acrilamida) ms lentamente que uno pequeo. Objetivo: Conocer la electroforesis como una tcnica de separacin de molculas de ADN. Parte Experimental: Material: Cmara de electroforsis horizontal Fuente de poder Reactivos: Agarosa TAE ( Buffer de electroforesis ) Tris-Base Acido actico glacial EDTA 0.5 M ( pH 8.0 ) Colorante de carga 6X Naranja G o azul de bromofenol Solucin de Bromuro de Etidio (10 mg/ml) (EtBr)

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Procedimiento: Preparacin del gel Preparar 500 ml. de gel de agarosa al 0.8% en un matraz Erlen meyer de 750 ml. pesando 4.0 gramos de agarosa y disolvindola en los 500 ml de buffer TAE 1X (Tris-Base 0.04M, EDTA 0.01M, cido Actico 0.04M). Para disolver completamente caliente la muestra en un horno de microondas. Posteriormente vaca 100 ml. en otro matraz de 250 ml. y adiciona 0.5l de colorante GelRed GelGreen TM. (Figuras1-3).

Fig.1 Fig.2 Fig. 3 Vace la solucin de agarosa en la base de la cmara de electroforesis, ensamblndola previamente o sellndola con cinta adhesiva (Figura izquierda). Coloque el peine del tamao de dientes adecuado para que se formen los pozos. Deje enfriar aproximadamente 30 minutos hasta que el gel se endurezca y adquiera un aspecto blanquecino. Retire el peine (Figura derecha) y coloque el gel en la orientacin adecuada para que los pozos queden hacia el polo negativo (negro). Llene la cmara con buffer TAE 1X hasta que se cubra el gel, aproximadamente 1.0 mm por encima de l.

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Para colocar las muestras en el gel mezcle 3 l de solucin del ADN con 3 l de buffer de carga (Azul de bromofenol 0.25%, glicerol 30%). Para esto se puede auxiliar con papel Parafilm. (Figura izquierda) Tome el contenido y descrguelo en un pozo teniendo cuidado de no derramar la muestra (Figura derecha).

Como control se cargar una muestra con fragmentos de ADN de tamao conocido (marcadores moleculares) (Figura izquierda) Coloque los cables de corriente y corra el gel a 90 voltios, aproximadamente, hasta que el primer colorante migre unas partes del tamao del gel (Figura derecha).

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Observe el gel al transiluminador de luz ultravioleta (Figura izquierda) y capture la imagen con una cmara digital. En la figura derecha se observan productos de ADN.

Cuestionario: 1.- Describa en que se basa el principio de electroforesis 2.- Para qu se utiliza el reactivo GelRed 3.- Explique para qu sirve la agarosa y de donde se obtiene.

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PRACTICA No. 7 CODIGO GENETICO Y TRADUCCIN

Introduccin El cdigo gentico es el conjunto de normas por las que la informacin codificada en el material gentico (secuencias de ADN o ARN) se traduce en protenas (secuencias de aminocidos) en las clulas vivas. El cdigo define la relacin entre secuencias de tres nucletidos, llamadas codones, y aminocidos. Un codn se corresponde con un aminocido especfico. La secuencia del material gentico se compone de cuatro bases nitrogenadas distintas, que tienen una funcin equivalente a letras en el cdigo gentico: adenina (A), timina (T), guanina (G) y citosina (C) en el ADN y adenina (A), uracilo (U), guanina (G) y citosina (C) en el ARN. Debido a esto, el nmero de codones posibles es 64, de los cuales 61 codifican aminocidos (siendo adems uno de ellos el codn de inicio, AUG) y los tres restantes son sitios de parada (UAA, llamado ocre; UAG, llamado mbar; UGA, llamado palo). La secuencia de codones determina la secuencia aminoacdica de una protena en concreto, que tendr una estructura y una funcin especficas.

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Traduccin del ARN La informacin gentica llevada por el ARNm deber ser traducida en el citoplasma por los ribosoma (ste est compuesto por varios tipos de protenas ms una forma de ARN, denominado ARN ribosmico). En el ribosoma no se podr comenzar la lectura de un mensajero ms que por una secuencia particular, distinta en las clulas eucariontes y en las procariontas. Asido el ARNm en el ribosoma, el tercer tipo de ARN -ARN de transferencia (ARNt)- entra en accin. Existen muchos tipos de ARNt y cada uno es capaz de reconocer determinados grupos de tres bases (codones) del ARNm. A cada triplete de nucletidos, los ARN de transferencia hacen corresponder uno de los veinte aminocidos que constituyen las cadenas polipeptidicas, las protenas. La informacin es inscrita de un trazo en el ADN bacteriano, pero en los organismos superiores se ha descubierto hace una decena de aos que la informacin gentica constituye un mosaico en los que la informacin til es interrumpida por secuencias no codificantes, aparentemente intiles, llamadas intrones (las secuencias codificantes son llamadas exones).En la clula eucarionte, en principio, el ARNm transcribe todo, intrones incluidos.

Los objetivo de este laboratorio son los siguientes: 1.-Estudiar la relacin entre la secuencia de nucletidos de una molcula del mRNA y la sntesis de protenas. 2.- Demostrar cmo una mutacin en la secuencia de nucletidos de una molcula de ARNm modifica los resultados en la secuencia de aminocidos de una protena.

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El cdigo gentico Un paso importante fue el descubrimiento del cdigo gentico por Nirenberg en 1961. El observo que al agregar ARN a un extracto libre de clulas de E. coli este era capaz de traducirlo en protenas, la composicin de las nuevas protenas sintetizadas pudieron ser cuantificadas por la incorporacin radiactiva de aminocidos dentro de las protenas traducidas. Para iniciar Laboratorio de TranslationLab primero haz click en el botn de Start Experiment

1. Selecciona cada uno de los nucletidos haciendo click en las flechas de cada botella, 2. Trata primero con AU, haz click en make ARN para que veas la secuencia del mensajero que creaste y gurdala en tus notas, 3. Para traducir tu secuencia a aminocidos haz click en el botn de Translation Mix y adicinalos a tus notas. 4. Luego contina con AAU, y AUU. Notaste algn cambio?, Cmo puedes explicar este resultado? 5. Ahora intenta con GGG, GGA, GGC, y GGU. Qu aminocido sobresali en los 4 experimentos?

Mutaciones en el cdigo gentico

Esta simulacin te permitir estudiar los efectos de mutaciones en un gen de globina y aprender como una sola mutacin afecta la secuencia de la estructura de una protena. Escalofros, fiebre, dolor de cabeza y vmito son algunos sntomas de la enfermedad llamada Malaria. La Malaria es causada por un protozoario, Plasmodium vivax, que se reproduce en un mosquito llamado Anopheles y vive en pases tropicales.

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Primero selecciona de la Web la Pagina HemoglobinLab. Y Presiona el botn de Start lab y posteriormente selecciona de la lista de caso a la paciente Miriam Dembele.

Lee el caso de Miriam. Ella es un caso consistente con aumento en resistencia a la enfermedad de Malaria. Compara la muestra de sangre de Miriam con la muestra del control sano. Hay deferencias obvias? Selecciona la vista de microscopio y toma nota de las diferencias que hay en la estructura de las clulas rojas. La sangre muestra caractersticas fenotpicas de la enfermedad de clulas falciformes? Selecciona la vista de secuencia del pptido y haz click en el botn de diferencias para identificar el aminocido cambiado en la hemoglobina de Miriam comparada con el control de hemoglobina normal. Qu aminocido ha sido sustituido para el gen de Miriam?, Anota la posicin del aminocido, es importante para identificar el cambio en la secuencia de nucletidos del gen de la globina. Selecciona Edit DNA Sequence view. Y va a aparecer la secuencia del gen de la hemoglobina de Miriam comparado con la secuencia del gen normal, localiza el triplete o codn con la secuencia ATG del ADN que indica la posicin del codn de inicio que debera aparecer en el ARNm producido por la transcripcin de este gen. Puedes teclear la secuencia ATG en la ventana de Search.

Esta accin te colocar en el nucletido 87con un delineado rojo, haz click en Bracket Codons y te delinea los tripletes de cada codn, usando las flechas avanza hasta el codn 6 (nucletidos 105-107). Haz click en el nucletido 106 y cambia la A por una T y selecciona traducir para que compares la protena que usaste para mutar, la protena de Miriam y la protena normal.

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Esta simple mutacin en una base, provoca la alteracin en el gen de la hemoglobina? Explica los resultados. Se han identificado muchas posiciones invariables en el grupo Hemo de la hemoglobina de vertebrados e invertebrados, cambios en esos aminocidos dan como resultado un gran nmero de serias enfermedades en la sangre, incluyendo una gran variedad de anemias. La anemia es una condicin que involucra una anormalidad en la capacidad para acarrear oxigeno en los glbulos rojos ya sea por la baja produccin de glbulos rojos en el individuo o por la produccin anormal de hemoglobina en las clulas, (Anemia o Talasemia) lo que se manifiesta por fatiga, palidez y baja de temperatura corporal. Una de estas variantes en los aminocidos de la beta globina es la Hemoglobina Hammersmith, localizada en el aminocido nmero 42 del polipptido de la globina, la mutacin da como resultado una hemoglobina inestable que no puede asir ni mantener la posicin del grupo Hemo en la orientacin adecuada para la unin de oxigeno. Selecciona la vista de las secuencias de los pptidos en Hemoglobin lab y compara las secuencias de cada una de las mujeres de la lista de pacientes presionando el botn de Find Difference hasta que encuentres a la paciente con la hemoglobina Hammersmith. (Asegura que la secuencia del pptido inicie desde el primer aminocido) Qu aminocido esta sustituido para esta paciente? Usa edit DNA Sequence para que identifiques el codn para este aminocido, altera el codn cambiando las posiciones hasta que reproduzcas la mutacin Hammersmith. Puedes guiarte en la tabla de codones para confirmes la mutacin creada.

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CUESTIONARIO 1.- Describe como se lleva a cabo la traduccin en el ribosoma. 2.- Investiga que es un ORF (Marco de Lectura Abierto) y cul es su importancia. 3.- Describe los tipos de mutaciones que existen en la naturaleza

PRCTICA No. 8
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EJERCICIOS DE BIOLOGA MOLECULAR

Diagnstico de infeccin por papiloma virus humano (VPH) en cncer de cuello uterino mediante PCR
A. Introduccin Corre el ao 1971. Susana Jimnez, una mujer de 31 aos de Colima, Colima, est enferma. Ella visita a su mdico, quien la explora y le extrae algunas clulas de su crvix uterino. Estas clulas fueron enviadas a un laboratorio para determinar si ella tena un cncer de cuello uterino. Las clulas eran increblemente malignas con Virus del Papiloma Humano y Susana Jimnez muere ocho meses ms tarde. Las clulas de Susana Jimnez permanecen vivas 30 aos despus de su muerte en los laboratorios de todo el mundo. B. Planteamiento prctico Se trata de efectuar un diagnstico de laboratorio de la presencia del VPH (Virus del Papiloma Humano) mediante PCR (Reaccin en Cadena de la Polimerasa) en 5 muestras de clulas: 2 obtenidas de lneas celulares utilizadas en los laboratorios de virologa para el cultivo de los virus (HeLa y MRC5) y 3 obtenidas del crvix uterino de 3 pacientes (1, 2 y 3) . 1. PCR en VPH La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una de las ms recientes y ms nuevas tcnicas disponibles y que presenta enormes ventajas para el diagnstico de enfermedades infecciosas. Una de ellas es la tremenda sensibilidad. En una reaccin de PCR con 30 ciclos aunque exista en el tubo una sola copia del ADN molde puede potencialmente hacer 1 + 21 + 22 + 229 = 1.061.109.567 copias del ADN molde Aunque la reaccin no presenta una efectividad del 100%, el PCR es una tcnica tremendamente sensible pues consigue muchos millones de copias a partir de una sola.

2. VPH y Cncer. La mayora (80-90 %) de los carcinomas cervicales (cnceres) contienen el Virus del Papiloma Humano (VPH) bien el tipo 18 (VPH18, el ms frecuente) o bien de tipo 16 (VPH16). La relacin entre la infeccin por VPH (que es frecuente) y la transformacin en clulas malignas (que es rara) es compleja y todava no bien comprendida. Sin embargo el cncer cervical es uno de los cnceres ms frecuentes en las mujeres alcanzando la cifra del 6-8

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% del total. Por otro lado, los estudios epidemiolgicos han demostrado que el mayor riesgo para el desarrollo de un carcinoma cervical es la infeccin por VPH.

3. Diagnstico de infeccin con VPH. Las infecciones por Virus del Papiloma Humano (VPH) no pueden ser diagnosticadas por los mtodos tradicionales utilizados en los laboratorios de diagnstico virolgico, pero el PCR permite la deteccin de estos virus.

4. Tcnica. La tcnica a utilizar en este protocolo experimental es la deteccin del ADN del VPH18 que se realiza en dos fases: -Amplificacin del ADN mediante la PCR y dos iniciadores (primers) especficos para el VPH18 -Comprobacin mediante electroforesis en gel que la zona amplificada en la PCR con esos primers tiene un tamao molecular de 270 bp (pares de bases) C. Protocolo experimental 1.- Reactivos

Agua destilada estril Muestras de ADN celular o HeLa o MRC-5 (una lnea celular de clulas diploides humanas) Primers especficos sintticos (2) para el Virus del Papiloma Humano tipo 18 (VPH18 o HPV18) Buffer para PCR 10X Taq ADN polimerasa

Aceite mineral

2.- Preparacin de muestras

N ( control negativo) H (HeLa) M (MRC-5) 1 (paciente 1) 2 (paciente 2) 3 (paciente 3)

Marque 6 pequeos tubos de Eppendorf de la siguiente manera:

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Cuidadosamente y sin contaminacin cruzada de los reactivos (cambio de las puntas de la micropipeta) aada a cada tubo y en este orden lo siguiente: 9l de destilada agua estril

2l del buffer para PCR 10X 2l de la pareja de primers 5l del correspondiente ADN para cada tubo (agua para el control negativo) 2l de polimerasa Taq

3.- Amplificacin del ADN en Termociclador

Este es un modelo de termociclador o equipo de PCR donde se procesan las muestras

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Colocar las muestras ya preparadas en el termociclador En este protocolo experimental el termociclador se ajusta para que las muestras se incuben en las siguientes condiciones: Fase o paso T y T Accin Desnaturaliza el ADN molde Los primers se unen especficamente a las regiones x 30 complemetarias del ADN molde La Taq polimerasa incorpora (30 nucletidos entre los dos dos "ciclos") primers utilizando como molde las cadena de ADN previamente desnaturalizada y elaborando 2 cadenas complementarias del ADN Las muestras ya se han procesado durante los 30 ciclos

30 Desnaturalizacin segundos a 95C Hibridacin 30 segundos a 65C

Extensin

60 segundos a 72C

He aqu las muestras procesadas:

4.- Colocacin de muestras amplificadas en gel de agarosa

Extraer 10 l de cada reaccin y colquela en un nuevo tubo Eppendorf.

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Colocar las muestras sobre el gel de agarosa al 2 % Colocar tambin la muestra suministrada del marcador de tamaos moleculares. Anotar en que carril se coloca cada muestra

5.- Separacin de los fragmentos amplificados mediante electroforesis en gel de agarosa

Realizar la electroforesis

Esperar hasta que el colorante control azul de bromofenol haya emigrado hasta la mitad del gel

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6.- Visualizacin de las bandas en luz ultravioleta

Examinar el gel a la luz ultravioleta (UV) para revelar al ADN teido con el bromuro de etidio (PRECAUCION: No exponer directamente los ojos a la luz UV) Este son los resultados o el aspecto que presenta el gel:

7.- Interpretacin de los resultados: N Banda Tamao molecular Marcador (bp) 1 100 2 200 3 300 4 400 5 500 6 600

Tener en cuenta si las muestras problemas dan alguna banda. En caso positivo tener en cuenta la posicin de la banda para estimar el tamao molecular La posicin indica el tamao molecular del fragmento de ADN amplificado teniendo en cuenta la posicin de las bandas del marcador de tamao molecular

Qu muestras tienen el Virus del Papiloma Humano tipo18?

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Interpretacin: Control Negativo : negativo HeLa : banda amplificada de 270 bp MRC-5 : negativo Paciente 1 : negativo Paciente 2 : banda amplificada de 150 bp Paciente 3 : banda amplificada de 270 bp

D.

Cuestionario

1.- La tcnica de la PCR es tremendamente sensible aunque no sea eficiente al 100 %. Si la PCR fuese efectiva al 100 % en 30 ciclos se obtendran un mnimo de copias del ADN molde de: a) Menos de 10 millones de copias b) Unos 100 millones de copias c) mas de 1.000 millones de copias 2.- La amplificacin ha sido negativa en las siguientes muestras: a) b) c) HeLa, paciente 2 y paciente 3 Control negativo, MRC-5 y paciente 1 Control negativo, MRC-5, paciente 1 y paciente 2

3.- La amplificacin ha sido positiva en las siguientes muestras: a) b) c) HeLa, paciente 2 y paciente 3 HeLa paciente 2 En ninguna de las muestras

4.- El tamao de los polinucletidos amplificados en las diversas muestras han sido de aproximadamente: a) b) c) Solo de 270 bp Solo de 150 bp de 150 y 270 bp

5.- Mediante esta tcnica se ha podido detectar el ADN del VPH18 en las clulas:

a) b) c)

Paciente 2 Paciente 3 y HeLa Paciente 2, paciente 3 y HeLa 37

DIAGNSTICO DE ANEMIA FALCIFORME

A. Objetivos del ejercicio Se trata de interpretar los resultados de laboratorio para detectar una enfermedad gentica mediante el estudio de los polimorfismos de ADN. Los cambios en el gen defectivo pueden ser detectados aunque nicamente afecten a los nucletidos que codifican un slo aminocido, si se utiliza la adecuada enzima de restriccin que acte precisamente aL nivel de esa secuencia bien sea sobre la normal o sobre la alterada. Tambin se trata de familiarizarse en la utilizacin de pipetas, puntas, tubos y equipo de electroforesis para tener una idea, aunque sea de forma virtual, de los protocolos o procedimientos de la tcnica en el laboratorio. Este ltimo objetivo se refiere nicamente al ejercicio realizado en la modalidad alta de dificultad que utiliza los simuladores.

B. Planteamiento prctico Se intenta diagnosticar en 4 pacientes (Pt1, Pt2, Pt3 y Pt4) la presencia en su ADN del gen codificador de la hemoglobina S comparndolo con el ADN de anemia falciforme (SS) (homocigtico de hemoglobina S) y el ADN de hemoglobina normal (WW) (homocigtico de hemoglobina normal). La hemoglobulina S es una protena anormal que se encuentra en los pacientes con la enfermedad de anemia falciforme. Consta de 2 cadenas alfa normales y dos cadenas beta mutantes en las que el aminocido en posicin 6 ha cambiado de glutamato a valina. El diagnstico se fundamenta en el aislamiento del ADN codificador de la cadenas betas de las hemoglobinas y la deteccin de la mutacin mediante la enzima de restriccin Bsu36I, que fragmenta la hemoglobina normal pero no la hemoglobina S por la mutacin. La hemoglobina S tiene una solubilidad baja y precipita formando largos filamentos que son los responsables de la deformacin de los eritrocitos que se observa en la enfermedad. Esta enfermedad solo la padecen los individuos homocigticos para el gen de la hemoglobina S. Los glbulos rojos que contienen hemoglobina normal son redondos y flexibles. Pero cuando los glbulos rojos de las personas afectadas con esta enfermedad (homocigticos de hemoglobina S) liberan el oxgeno, la anomala de la hemoglobina hace que las clulas se endurezcan y se deformen, a menudo hasta tener la forma de una letra C, como una hoz (falciformes). Los glbulos falciformes tienden a quedar atrapados y a ser destruidos en el hgado y en el bazo. Como consecuencia, se produce una falta de glbulos rojos, o anemia, la cual, en casos graves, puede provocar palidez, dificultades respiratorias y cansancio. Hay otros factores, como el agrandamiento del bazo y algunas infecciones, que pueden empeorar la anemia al acelerar el proceso de

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destruccin de glbulos rojos. Los nios que padecen anemia falciforme son especialmente propensos a contraer graves infecciones bacterianas como las que causan la meningitis y las infecciones de la sangre (septicemia). Las infecciones son la principal causa de muerte entre los nios que padecen esta enfermedad. C. Protocolo experimental 1.-Reactivos virtuales Muestras de ADN: ADN de anemia falciforme (SS) de individuo homocigtico para hemoglobina S ADN de individuo homocigtico de hemoglobina normal (WW) ADN de 4 pacientes para ser genotipados (Pt1, Pt2, Pt3, Pt4) Enzima de restriccin Bsu36I Marcador de pesos moleculares Agua Solucin tampn universal 10X para enzimas de restriccin

2.-Digestin de ADN por enzima de restriccin

En unos tubos marcados con los nmeros 1 al 12 se han puesto los siguientes reactivos

Reactivos 4 l de solucin tampn 10X 25 l de agua

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ++++++++++ + + ++++++++++ + + + + + + + + + + + + + + ++++ + +

11 l de ADN de anemia falciforme (SS) 11 l de ADN de individuo normal (WW) 11 l de ADN de paciente problema Pt1 11 l de ADN de paciente problema Pt2 11 l de ADN de paciente problema Pt3 11 l de ADN de paciente problema Pt4
1 l de la enzima de restriccin Bsu36I

Los tubos 1 a 6 no llevan enzimas de restriccin

Se han incubado los tubos a 37C durante 10 segundos

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3.- Electroforesis en gel de agarosa

Mediante micropipeta se han transferido muestras de los 12 tubos a un gel de agarosa colocndolos en los primeros 12 carriles (muestra de tubo 1 en carril 1, muestra de tubo 2 en carril 2, etc. En el carril 13 se ha colocado el control del tamao molecular o marcador de pesos moleculares Se ha efectuado la electroforesis a 300 voltios durante 2 horas Finalizada la electroforesis y apagadas las luces de la habitacin con el transiluminador ultravioleta se han observado las bandas con fluorescencia

4.- Interpretacin de los resultados Tener en cuenta lo que se ha Los tubos 1 a 6 no llevan enzimas de restriccin puesto en cada carril

N Banda
Tener en cuenta el tamao molecular de las bandas del marcador

1 2 3 4 5 6

Tamao molecular (bp) 150 300 450 600 750 900

Considerar los genotipos posibles teniendo en cuenta el carcter homocigtico o heterocigtico: WW=homocigtico hemoglobina normal SS=homocigtico hemoglobina WS=heterocigtico

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Los resultados que se han obtenido despus de la electroferesis en gel de agarosa han sido los que se recogen en la imagen de la derecha

D.

Cuestionario

1.- Las muestras de los 6 primeros tubos con ADN sin digerir con la enzima de restriccin: han dado todas. a) han dado toda una nica banda de unos 150 bp. b) han dado toda una nica banda de unos 430 bp. c) han dado toda una nica banda de unos 810 bp. 2.- En las muestras de ADN se han encontrado el siguiente nmero de genotipos a) Uno. b) Dos. c) Tres.

3.- La banda especfica del gen mutado de la hemoglobina S tiene un tamao aproximado de: a) 210 bp. b) 280 bp. c) 430 bp.

4.- El genotipo homocigtico de la hemoglobina S se han encontrado en las siguientes muestras: a) Pt2. b) Pt3. c) Pt2 y Pt4.

5.- El genotipo heterocigtico de la hemoglobina S se han encontrado en las siguientes muestras: a) Pt2. b) Pt3. c) Pt2 y Pt4.

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Huellas dactilares del ADN

A. Objetivos del ejercicio Comprender como las enzimas de restriccin se utilizan para cortar las molculas de ADN en fragmentos. Comprender como las molculas de ADN son separadas durante la electroforesis en gel de agarosa segn su tamao. Comprender como los polimorfismos de ADN o la tcnica de los RFLPs (Fragmentos Polimrficos de diferente Longitud originados por enzimas de Restriccin) se utilizan para identificar secuencias de ADN. Familiarizarse mediante el laboratorio virtual con la tcnica de la digestin con enzimas de restriccin. Familiarizarse mediante el laboratorio virtual con la tcnica de separacin de los fragmentos obtenidos en la digestin por medio de una electroforesis en gel de agarosa. Ser capaz de determinar los tamaos de los fragmentos de ADN por sus movilidades electroforticas. B. Planteamiento prctico Tpico caso de medicina legal o forense, en la que se han encontrado clulas sobre la victima que permite identificar al sospechoso. Sobre el ADN de espermatocitos recogidos en la victima de un asesinato con violacin (Perp) se efecta un anlisis del polimorfismo del ADN para compararlo con los resultados obtenidos con el ADN de clulas de 5 sospechosos (S1, S2, S3, S4 y S5)

C. Protocolo experimental 1.- Material y equipo virtual Micropipeta y puntas amarillas 0-100 l Equipo de electroforesis horizontal en gel de agarosa Transiluminador UV 2.- Reactivos virtuales Muestras de ADN: ADN de espermatocitos recogidos en la victima de un asesinato con violacin (Perp) ADN de clulas de 5 sospechosos (S1, S2, S3, S4 y S5) Enzima de restriccin BamHI y EcoRI Marcador de pesos moleculares Agua Buffer universal 10X para enzimas de restriccin Agarosa

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Buffer para electroforesis 0.5X TBE (Tris/Borato/EDTA) Colorante fluorescente de Bromuro de etidio Dos colorantes con diferentes movilidades (azul de bromofenol y xilencianol). 3.-Digestin de ADN por enzima de restriccin

En unos tubos marcados con los nmeros 1 al 12 se han puesto los siguientes reactivos

Reactivos 4 l de solucin tampn 10X 25 l de agua victima (Perp) S1

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ++++++++++ + + ++++++++++ + + + + + + + + + + + + + ++++ + + ++++ + +

11 l de ADN de espermatocitos sobre + 11 l de ADN de clulas de sospechoso 11 l de ADN de clulas de sospechoso

S2

11 l de ADN de clulas de sospechoso

S3

11 l de ADN de clulas de sospechoso

S4

11 l de ADN de clulas de sospechoso

S5 1 l de la enzima de restriccin BamHI 1 l de la enzima de restriccin EcoRI

Los tubos 1 a 6 no llevan enzimas de restriccin

Se han incubado los tubos a 37C durante 10 segundos

4.- Electroforesis en gel de agarosa

Mediante micropipeta se han transferido muestras de los 12 tubos a un gel de agarosa colocndolos en los primeras 12 carriles (muestra de tubo 1 en carril 1, muestra de tubo 2 en carril 2, etc. En la carril 13 se ha colocado el control del tamao molecular o marcador de pesos moleculares Se ha efectuado la electroforesis a 300 voltios durante 2 horas Finalizada la electroforesis y apagadas las luces de la habitacin con el transiluminador ultravioleta se han observado las bandas con fluorescencia

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5.- Interpretacin de los resultados: Tener en cuenta los patrones electroforticos obtenidos : nmero de bandas y su posicin para determinar si alguno de los ADN de los sospechosos (S1,S2, S3, S4 y S5) da el mismo polimorfismo que el ADN de la evidencia (Perp) La posicin indica el tamao molecular del fragmento teniendo en cuenta la posicin de las bandas del marcador de tamao molecular

N Banda Tamao Marcador molecular (bp) 1 150 2 300 3 450 4 600 5 750 6 900

En la prctica real se efecta con ms enzimas de restriccin para que la probabilidad de encontrar dos ADN con iguales patrones electroforticos sea menor de 1/1 billn, de all el nombre de 'huellas dactilares del ADN'

D. Cuestionario 1.- Las bandas con un

encontraron: a) Solamente en las 6 muestras no tratadas con enzimas b) En las 6 muestras no tratadas con enzimas y en la S1 y S3 tratadas con enzimas c) Solamente en las muestras tratadas con enzimas Perp, S2, S4 y S5 tamao molecular superior a 750 pb se

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2.- Las bandas con un tamao molecular ms bajo (inferior a 130 bp) se
encontraron en las muestras digeridas con enzimas a) Perp y S4 b) S1 y S2 c) S3 y S4

3.- Los patrones electroforticos o polimorfismos o genotipos

presentados en las 6 muestras digeridas con enzimas de restriccin: a) b) c) Son todos ellos (los 6) diferentes Existen dos de ellos idnticos (Perp y S4) Existen dos parejas de idnticos (Perp-S4 y S2-S5)

4.- Los polimorfismos detectados con solo 2 enzimas de restriccin

BamHI y EcoRI, permiten descartar a los siguientes sospechosos por presentar ADN diferente a) S1 b) S1 y S3 c) S1, S2, S3 y S5

5.- Aunque los ensayos se realizan con ms enzimas de restriccin, la

presentacin de un polimorfismo idntico significa que el ADN de la evidencia 'Perp' es el mismo que el ADN del sospechoso: a) S2 b) S4 c) S5

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Secuenciacin de ADN
A. Objetivos del ejercicio Se trata de determinar la secuencia de nucletidos de un fragmento de ADN para poder conocer o identificar a que ADN pertenece ese ADN problema y poder realizar un diagnstico o identificacin. Se utiliza una zona del ADN conocida y de la que se conocen las variaciones (de lo que se trate: individuos, especies o gneros). Para llegar a esa zona del ADN conocida se utiliza un 'primer' o cebador que se una a una parte inmediata de ese ADN variable conocido, parte inmediata que tiene que ser comn a todos ellos (los individuos, las especies, los gneros segn sea el caso). El objetivo concreto de este ejercicio es conseguir leer una secuencia en un gel de secuenciacin y por lo tanto conocer o determinar la secuencia de nucletidos de esa zona de ADN variable conocida. Tambin se trata de familiarizarse en la utilizacin de pipetas, puntas, tubos y equipo de electroforesis de alto voltaje para la separacin de nucletidos en el gel de secuenciacin para tener una idea, aunque sea de forma virtual, de los protocolos o procedimientos de la tcnica en el laboratorio. B. Planteamiento prctico Se intenta conocer la secuencia de nucletidos de una zona del ADN de 2 microorganismos aislados del suelo para poderlos identificar, es decir, para poder determinar a que gneros pertenecen. El diagnstico se fundamenta en el aislamiento del ADN ribosmico 16S que presenta secuencias diferentes especficas y conocidas para cada gnero. De ese ADN ribosmico 16S se selecciona una zona que varia en cada gnero y una zona inmediata constante en todos los gneros para el primer o cebador. Determinando la secuencia de ese fragmento variable de ADN se puede identificar el gnero a que pertenece las bacterias aisladas o problemas. Se trata, pues, de determinar la secuencia de ADN para poder diagnosticar al gnero al que pertenecen. C. Protocolo experimental 1.- La tcnica de la secuenciacin Consiste en la sntesis de ADN mediante la ADN polimerasa, a partir de la unin con el primer o cebador. La diferencia con una sntesis de ADN normal es que adems de los nuclesidos trifosfato normales (dNTP) se aaden una pequea cantidad de unos didesoxinucletidos trifosfato (ddNTP). Estos ddNTP son molculas que parecen nucletidos normales excepto por carecer de un grupo hidroxilo en posicin 3'. Se aaden a una cadena de ADN en crecimiento, pero finalizan o interrumpen la sntesis de ADN porque no se pueden aadir ms nucletidos para ampliar la cadena debido a esa carencia. En la reaccin se mezcla la cadena sencilla del ADN que se quiere secuenciar junto con el primer o cebador, la ADN polimerasa, los nuclesidos normales y una pequea cantidad de uno de estos ddNTP marcados (con istopos o

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colorantes fluorescentes). La sntesis de ADN se inicia con el cebador y finaliza cuando se incorpora un ddNTP en lugar de un dNTP normal. El resultado es una serie de fragmentos de longitudes diferentes. Se producen cuatro reacciones, cada una de ellas con un ddNTP diferente: La reaccin terminal La reaccin terminal La reaccin terminal La reaccin terminal con ddATP produce fragmentos con A con ddCTP produce fragmentos con C con ddGTP produce fragmentos con G con ddTTP produce fragmentos con T

Los fragmentos se someten a electroforesis en gel de poliacrilamida, para separar unos fragmentos de otros segn su tamao. Los fragmentos ms pequeos, presentan un desplazamiento ms veloz y dan lugar a bandas ms desplazadas.

2.- Material y reactivos virtuales ADN problemas.

ADNr1= ADN ribosmico de la bacteria problema n 1. ADNr2= ADN ribosmico de la bacteria problema n 2.

Primer para el ADN ribosmico agagtttgat ADN polimerasa. Buffer. dNTP/ddNTP para las reacciones A, C, G, T. Radionclido (a32PdATP).

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Pelcula sensible a rayos X. Equipo de secuenciacin en gel. Poliacrilamida/bisacrilamida/TMED. Urea (7 M de concentracin final en gel). Buffer TBE 0.5X. 3. Secuenciacin

En las 4 primeras carriles del gel de secuenciacin se colocan los resultados de las reacciones A, C, G, T del ADN ribosmico de la bacteria problema n 1 (ADNr1). Para llevar a cabo estas reacciones se utilizado el primer para el ADN ribosmico agagtttgat, ADN polimerasa, el dNTP/ddNTP para cada una de dichas reacciones A, C, G, T y el radionclido (a32PdATP). En las 4 ltimas carriles del gel de secuenciacin se colocan los resultados de las reacciones A, C, G, T del ADN ribosmico de la bacteria problema n 2 (ADNr2). Se efecta la electroforesis a 1.000 voltios durante 40 minutos Una vez finalizada la separacin electrofortica se realiza el auto-radiograma para visualizar las bandas de secuenciacin

4. Interpretacin de los resultados

Tener en cuenta que la 4 primeros carriles corresponden a la muestra ADNr1 y las 4 ltimas a la muestra ADNr2 Tener en cuenta que en cada muestra el orden de las reacciones de izquierda a derecha es de A C G T Empezar la determinacin por las bandas ms desplazadas (1, 2, 3...) segn el carril en la que aparecen (CCT) Leer unos doce nucletidos o ms si son necesarios

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Conociendo la secuencia determinar el gnero al que pertenece la muestra problema Secuencia cctggctcag caagtcgagc cctggctcag caagtcgagc cctggctcag caagtcgaac cctggctcag caagtcgaac catggctcaa caagtcgaac gagagtttga cctaatacat catggctcag caagtcgagc cccggctcag caagtcgaac catggctcag caagtcgaac aacgaacgct gacgaacgct agcgaacgct attgaacgct attgaacgct tcctggctca attgaacgct agtgaacgct attgaacgct ggcggcaggc ggcggcgtgc ggcggcaggc ggcggcatgc ggcggcaggc gagtgaacgc ggcggcaggc ggcggtaggc ggcggcaggc ttaacacatg ctaatacatg ctaacacatg cttacacatg ctaacacatg tggcggcgtg ctaacacatg ctaacacatg ctaacacatg Gnero Bacteria Agrobacterium Bacillus Brevundimonas Burkholderia Escherichia Helicobacter Pseudomonas Stenotrophomonas Xanthomonas

Auto-radiograma obtenido :

D.

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Cuestionario 1.- En las dos muestras ADNr1 y ADNr2 el primer nucletido obtenido despus
del primer es: a) A. b) C. c) G.

2.- En la muestra ADNr1 los 10 primeros nucletidos obtenidos son:

a) CAGAGTTTGA. b) CCTGGCTCAG. c) CATGGCTCAA.

3.- En la muestra ADNr2 los 10 primeros nucletidos obtenidos son:

a) CAGAGTTTGA. b) CCTGGCTCAG. c) CATGGCTCAA.

4.- La secuenciacin obtenida indica que la muestra ADNr1 pertenece a una

bacteria del gnero: a) Bacillus. b) Pseudomonas. c) Helicobacter.

5.- La secuenciacin obtenida indica que la muestra ADNr2 pertenece a una

bacteria del gnero: a) Rhizobium. b) Escherichia. c) Agrobacterium.

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