Populasi mikroorganisme yang ada di alam sekitar kita ini ssangatlah besar dan cukup kompleks.

Beratus spesies mikroba menguasai setiap bagian tubuh kita. Mereka terdapat dalam jumlah yang cukup basar. Sebagai contoh, sekali kita bersin dapat mnebarkan beribu- ribu mikroorganisme. Satu gram tinja dapat mengandung jutaan bakteri. Alam di sekitar kita, baik itu tanah, air, maupunudara juga dihuni oleh kumpulan mikroorganisme.Penelitian yang layak mengenai mikroorganisme dalam berbagai habitat ini memerlukan teknik untuk memisahkan populasi campuran yang rumit ini, atau yang biasanya dikenal dengan istilah biakan campuran, menjadi spsies yang berbeda- beda yang bikenal dengan istilah biakan murni. Biakan murni in teerdiri dari satu populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel induk (Pelczar, 1986). Mikroorganisme dapat diperoleh dari lingkungan air, tanah, udara, suubstrat yang berupa bahan pangan, tanaman dan hewan. Jenis mikroorganismenya dapat berupa bakteri, khamir, kapng dan sebagainya. Populasi dari mikroba yang ada di linkungan ini sangatlah beraneka ragam sehinga dalam mengisolasi diperlukan beberapa tahap penanaman sehingga berhasil diperoleh koloni yang tunggal. Koloni yang tunggal ini kemudian yang akan diperbanyak untuk suatu tujuan penelitian misalnya untuk menngisolasi DNA mikroba yang dapat mendeteksi mikroba yang telah resisten terhadap suatu antibiotik. Atau untuk mengetahui mikroba yang dipakai untuk bioremediasi holokarbon (Ferdiaz, 1992). P emindahan bakteri dari medium lama ke medium yang baru atau yang dikenal dengan istilah inokulasi bakteri ini memerluakn banyak ketelitian. Terlebih dahulu kita harus mengusahakan agar semua alat- alat yang akan digunakan untuk pengerjaan medium dan pengerjaan inokulasi benarbenar steril. Hal ini untuk menghindari terjadinya kkontaminasi, yaitu masuknya mikrooba lain yang tidak diinginkan sehingga biakan yang tumbuh di dalam medium adalah benar- benar biakan murni (Dwidjoseputro, 1990). Di dalam keadaaan yang sebenarnya dapat dikatakan bahwa tidak ada bakteri yang hidup secara tersendiri terlepas dari spesies yang lainnya. Kerap kali bakteri patogen kedapatan bersama- sama dengan bakteri saprob. Untuk menyendirikan suatu spesies dikenal beberapa cara, yaitu (Dwidjoseputro, 1990) : 1. Degan pengenceran Cara ini pertama kali dilakukan oleh Lister pada tahun 1865. Ia berhasil memelihara Streptococcus lactis dalampiraan murni yang diisolasi dari sampel susu Yang sudah masam. Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam- macam spesies diencerkan dalam suatu tabung yang tersendiri. Dari hasil pengenceran ini kemudian di ambil kira- kira 1 mL untuk diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 mL untuk disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan besar kita akan mendapatkan beberapa koloni yang akan tumbuh dalam mdium tersebut, akan tetapi mungkin juga kita hanya akan memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang demikian ini dapat kita jadikan piaraan murni. Jika kita belum yakin, Bahwa koloni tunggal yang kita peroleh tersebut merupakan koloni yang murni, maka kita dapat mengulang pengenceran dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel. 2. Dengan penuangan Robert Koch (1843- 1905) mempunyai metode yang lain, yaitu dengan mengambil sedikti sampel campuran bakteri yang mudah diencerkan, dan sampel ini kemudian di sebar di dalam suatu

medium yang terbuat dari kaldu dan gelatin encer. Dengan demikian dia memperoleh suatu piaraan adukan. Setelah medium tersebut mengental maka selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni- koloni yang masing- masing dapat dianggap murni. Dengan mengulang pekerjaan di atas, maka akhirnya akan diperoleh piaraan murni yang lebih terjamin. Ada beberapa metode yang biasanya dilakukan untuk menanam biakan di dalam medium diantaranya adalah (Lay, 1994) : 1. Metode cawan gores Metode ini mempunyai dua keuntungan yaitu menghemat bahan dan waktu. Namun untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan yang lumayan yang biasanya diperoleh dari pengalaman. Metode cawan gores yang dilakukan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan. Dua macam kesalahan yang umum sekali dilakukan adalah tidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik- baiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroorganisme menjafi kurang lanjut dan cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel- sel yang digores. 2. Metode cawan tuang Cara lain untuk mempeeroleh biakan koloni murni dari populasi campuran mikroorganisme ialah dengan mengencerkan eksperimen dalam medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan yang kemudian di cawankan. Karena konsentrasi sel- sel mikroba di dalam eksperimen pada umumnya tidak diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap sehingga sekurangkurangnyya satu di antara cawan cawan tersebut mengandung koloni- koloni terpisah baik di atas permukaan maupun di dalam agar. Metode ini memboroskan waktu dan bahan namun tidak memerlukan keterampilan yang terlalu tinggi. Proses pemisahan/pemurnian dari mikroorganisme lain perlu dilakukan karena semua pekerjaan mikrobiologis, misalnya telaah dan identifikasi mikroorganisme, memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari satu macam mikroorganisme saja. Teknik tersebut dikenal dengan Isolasai Mikroba. Terdapat berbagai cara mengisolasi mikroba, yaitu (Admin, 2008) : 1) Isolasi pada agar cawan Prinsip pada metode isolasi pada agar cawan adalah mengencerkan mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lainnya. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal. Terdapat beberapa cara dalam metode isolasi pada agar cawan, yaitu: Metode gores kuadran, dan metode agar cawantuang.Metode gores kuadran. Bila metode ini dilakukan dengan baik akan menghasilkan terisolasinya mikroorganisme, dimana setiap koloni berasal dari satusel. Metode agar tuang. Berbeda dengan metode gores kuadran, cawan tuang menggunakan medium agar yang dicairkan dan didinginkan (50oC), yang kemudian dicawankan. Pengenceran tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir mengandung koloni-koloni yang terpisah di atas permukaan/di dalamcawan. 2) Isolasi pada medium cair Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair. Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa serial pengenceran. Semakin tinggi pengenceran peluang

untuk mendapatkan satu sel semakin besar. 3) Isolasi sel tunggal Metode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme berukuran besar yang tidak dapat diisolasi dengan metode agar cawan/medium cair. Sel mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100 kali. Kemudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang sangat halus ataupun micromanipulator, yang dilakukan secara aseptis. http://firebiology07.wordpress.com/2009/04/19/teknik-isolasi-mikroorganisme/ Isolasi mikroba berarti memisahkan satu jenis mikroba dari biakkan campuran menjadi biakan murni. (populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel individu). (ermila, 2006 : 20). Mikroorganisme dibiakkan dilaboratorium pada bahan nutrien yang disebut medium. Banyak sekali medium yang tersedia, macamnya yang dipakai bergantung pada beberapa faktor salah satu diantaranya ialah macam organisme yang akan ditumbuhkan. (Pelczar, 1986 :85) Tehnik biakkan murni dapat dilakukan dengan : a. Metode piringan goresan (streak-platemetod) Medium agar steril dicairkan, didinginkan pada suhu 450C, dimana dalam cawan petri steril dan dibiarkan sampai menjadi padat. b. Metode piringan tuangan (pour-plate metod) (Volk, 1990 :36) Pertama kali mengadakan piaraan biasanya diperoleh dari piaraan campuran, piaraan pertama disebut primary culture dan sifatnya murni. Piaraan semacam ini dapat disimpan tetapi harus diadakan peremajaan dengan memindahkannya ke medium baru yang disebut piaraan turunan (Sub-culture) yaitu piaraan yang diperoleh dari piaraan pertama. (Dwidjoseptro, 2003 :36) Persyaratan utama bagi isolasi dan kultivasi fage ialah harus adanya kondisi optimum untuk pertumbuhan organisme inangnya. (Pelzcur, 2005 :275).

Sebelum diinokulasi tangan dan tempat kerja disemprot dengan alkohol dengan menggunakan metode aseptik, jarum inokulasi disterilkan dengan membakarnya, dengan api sampai jarum tersebut pijar. (gunawan, 2004 :60). http://makalahdanskripsi.blogspot.com/2008/07/mengisolasi-biakan-murni-makalah.html

69 BAB: VI ISOLASI MIKROBA A. Pengertian Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran berbagai macam sel. Di dalam laboratorium populasi bakteri ini dapat diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya. B. Teknik Pengambilan Sampel Sebelum melakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan pengambilan sampel. Berikut merupakan prosedur pengambilan sampel. 1.

Sampel tanah Jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah, maka cara pengambilannya disesuaikan dengan tujuan dan kebutuhan. Misal jika yang diinginkan mikroorganisma rhizosfer maka sampel diambil dari sekitar perakaran dekat permukaan hingga ujung perakaran. 2. Sampel udara Jika mikroba yang diinginkan adalah berada di udara sekitar, misalnya di kamar mandi, ruangan dan lain-lain, maka caranya hanya dengan membuka tutup cawan petri yang berisi media steril selama 5 menit. 3. Sampel air Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air itu sendiri. Jika beerasal dari air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan bibir botol melawan arus air. Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang, botol dapat dicelupkan dengan tali, jika ingin mengambil sampel dari air keran maka sebelumya keran dialirkan dulu beberapa saat dan mulut kran dibakar. C. Isolasi Dengan Cara Pengenceran (Dilution) 1. Teknik Preparasi Suspensi Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril. Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Macam-macam preparasi bergantung kepada bentuk sampel : 2. Teknik Pengenceran Bertingkat

70 a.S w ab (ulas), dilakukan menggunakan cotton bud steril pada sampel yang memiliki permukaan luas dan pada umumnya sulit dipindahkan atau sesuatu pada benda tersebut. Contohnya adalah meja, batu, batang kayu dll. Caranya dengan mengusapkan cotton bud memutar sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton bud kontak dengan permukaan sampel. Swab akan lebih baik jika cotton bud dicelupkan terlebih dahulu ke dalam larutan atraktan semisal pepton water. b.Rin se (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel pada permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran kecil, misalnya daun bunga dll. Rinse merupakan prosedur kerja dengan mencelupkan sampel ke dalam akuades dengan perbandingan 1 : 9 (w/v). Contohnya sampel daun diambil dan ditimbang 5 g kemudian dibilas dengan akuades 45 ml yang terdapat dalam beaker glass. c.M a sera t io n (pengancuran), sampel yang berbentuk padat dapat ditumbuk dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam air. Contoh sampelnya antara lain bakso, biji, buah dll. Perbandingan antar berat sampel dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9 (w/v). Untuk sampel dari tanah tak perlu dimaserasi 2. Teknik Pengenceran Bertingkat Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung

kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya. Cara Kerja : a. Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran pertama (1/10 atau 10-1) secara aseptis (dari preparasi suspensi). Perbandingan berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9 dan ingat akuades yang digunakan jika memakai teknik rinse dan swab sudah termasuk pengencer 10-1. Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya (pengocokan yang benar dapat dilihat pada gambar disamping) b. Diambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke tabung 10-2 secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung ke telapak tangan sampai homogen. Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir dengan cara yang sama, hal yang perlu diingat bahwa pipet ukur yang digunakan harus selalu diganti, artinya setiap tingkat pengenceran digunakan pipet ukur steril yang berbeda/baru. Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika memindahkan cairan dari sumber yang sama. 3. Teknik Penanaman a. Teknik penanaman dari suspensi Teknik penanaman ini merupakan lanjutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir. a.1. Spread Plate (agar tabur ulas) Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni. Adapun prosedur kerja yang dapat dilakukan adalah sebagai berikut : Ambil suspensi cairan sebanyak 0,1 ml dengan pipet ukur kemudian teteskan di atas permukaan agar yang telah memadat. Batang L atau batang drugal diambil kemudian disemprot alkohol dan dibakar diatas bunsen beberapa saat, kemudian didinginkan dan ditunggu beberapa detik. Kemudian disebarkan dengan menggosokannya pada permukaan agar supaya tetesan suspensi merata, penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar. Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena panas

a.2. Pour Plate (agar tuang) Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen. Adapun prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut : Siapkan cawan steril, tabung pengenceran yang akan ditanam dan media padat yang masih cair (>45oC) Teteskan 1 ml secara aseptis.suspensi sel kedalam cawan kosong Tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar cawan untuk menghomogenkan suspensi bakteri dan media, kemudian diinkubasi

Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0,1 ml untuk spread plate dan 1 ml untuk pour plate karena spread plate ditujukan untuk menumbuhkan dipermukaanya saja, sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate.

b. Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak) Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru. b.1 Goresan Sinambung Cara kerja : Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai setengah permukaan agar. Jangan pijarkan loop, lalu putar cawan 180oC lanjutkan goresan sampai habis. Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal, melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru. b.2 Goresan T Cara kerja : Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan streak zig-zag pada daerah 2 (streak pada gambar). Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna Lakukan hal yang sama pada daerah 3 b.3 Goresan Kuadran (Streak quadrant) Cara kerja : Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel mikroorganisma.Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal. http://www.scribd.com/doc/34520641/Bab-6-Isolasi-Mikroba BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Populasi mikroba di alam sekitar kita sangat besar dan sangat komplek. Beratus-beratus spesies berbagai mikroba biasanya menghuni bermacam-macam bagian tubuh kita, termasuk mulut, saluran pencernaan dan kulit. Sebagai contoh, sekali bersin dapat menyebarkan beribu-ribu mikroorganisme, satu tinja dapat mengandung jutaan bakteri (Pleczar, 1986). Produk pangan jarang sekali steril dan pada umumnya tercemar oleh berbagai jenis mikroorganisme (Buckie, 1978). Oleh karena itu, diperlukan suatu teknik untuk memisahkan suatu mikroba salah satu caranya ialah dengan mengisolasinya. Isolasi merupakan cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba

tertentu dari lingkungan, sehingga diperoleh kultur murni atau biakkan murni. Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal. Beberapa cara yang dilakukan untuk mengisolasi mikrooraganisme antara cara goresan (streak plate), cara taburan/tuang (pour plate), cara sebar (spread plate), cara pengenceran ( dilution plate) serta micromanipulator (Pleczar, 1986). Kultur murni atau biakkan murni sangat berguna didalam mikrobiologi yaitu untuk menelaah dan mengidentifikasi mikroorganisme, termasuk penelaahan ciri-ciri kultural, morfologis, fisiologis maupun serologis, memerlukan suatu populasi yang terdiri dari satu macam mikroorganisme (Hadioetomo, 1993). Ada beberapa metode dalam mengisolasi bakteri, fungi, dan khamir (mikroorganisme) yaitu dengan menggunakan metode gores, metode tuang metode sebar, metode pengenceran serta micromanipulator. Dua diantaranya yang paling sering digunakan adalah teknik cawan dan cawan gores. Kedua metode ini berdasarkan pada prinsip yang sama yaitu mengencerkan mikroorganisme sedemikian rupa sehingga tiap individu spesies dapat dipisahkan dengan lainnya (Hadioetomo, 1993). Pada pengisolasian bakteri dari tanah/benda padat yang mudah tersuspensi atau terlarut atau zat cair, dilakukan serangkaian pengenceran terhadap zat tersebut. Misalnya suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran yang diencerkan dalam suatu tabung tersendiri secara berkelanjutan dari suatu tabung ke tabung lain (Dwidjoseputro, 1994). Beberapa faktor yang perlu diperhatikan dalam melakukan isolasi mikroba yaitu antara lain : a) sifat setiap jenis mikroba yang akan diisolasi; b) tempat hidup atau asal mikroba tersebut; c) medium pertumbuhan yang sesuai; d) cara menginokulasi mikroba; e) cara menginkubasi mikroba; f) cara menguji bahwa mikroba yang diisolasi telah berupa kultur murni dan sesuai dengan yang dimaksud ; g) cara memelihara agar mikrobia yang telah diisolasi tetap merupakan kultur murni. Penggunaan media bukan hanya untuk pertumbuhan dan perkembangbiakkan mikroba, tetapi juga untuk tujuan-tujuan lain, misalnya untuk isolasi, seleksi, evaluasi dan deferensiasi biakkan yang didapatkan. Artinya penggunaan jenis zat tertentu yang mempunyai pengaruh terhadap pertumbuhan dan perkembangbiakkan mikroba banyak dilakukan dan dipergunakan sehingga tiap-tiap media mempunyai sifat (spesifikasi) tersendiri sesuai dengan maksudnya

(Baker, 1986). Medium pertumbuhan mikroba adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran nutrient yang diperlukan mikroba untuk pertumbuhannya. Dengan menggunakan medium pertumbuhan, aktivitas mikroba dapat dipelajari dan dengan medium tumbuh dapat dilakukan isolasi mikroba menjadi kultur murni, perbanyakan, pengujian sifat fisiologis, dan perhitungan jumlah mikroba (Pelczar, 1986). Pengukuran kuantitatif populasi suatu mikroba dapat dilakuakn dengan penetuan jumlah sel dan penentuan sel (Fardiaz, 1992). Ada berbagai macam cara untuk mengukur jumlah sel antara lain dengan hitungan cawan, hitungan mikroskopis langsung atau dengan alat colony counter (Hadioetomo, 1993). Perhitungan massa sel secara langsung maupun tidak langsung jarang digunakan dalam uji mikrobiologi bahan, tetapi sering digunakan untuk mengukur pertumbuhan sel selama proses fermentasi. Dalam perhitungan massa sel secara langsung, jumlah sel jasad renik dapat dihitung jika medium pertumbuhannya tidak menggangu pengukuran. Sedangkan dalam perhitungan tidak langsung, dilakukan dalam mengamati pertumbuhan sel selama proses fermentasi, dimana komposisi subsrat atau bahan yang difermentasi dapat diamati dan diukur dengan teliti (Fardiaz, 1992). Selain mengukur jumlah sel, juga diperlukan diperhatikan pada koloni yang tumbuh dipermukaan medium yaitu besar kecil koloni, bentuk, kenaikan permukaan, halus kasarnya permukaan, wajah permukaan, warna, kesepakatan (Dwidjoseputro, 1994). http://www.scribd.com/doc/43096211/isolasi-mikroba