DIAGNOSTICO POR ELISA El ELISA se basa en el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los

conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica. Al estar uno de los componentes (antgeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccin antgeno-anticuerpo quedar inmovilizada y, por tanto, ser fcilmente revelada mediante la adicin de un substrato especifico que al actuar la enzima producir un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotmetro o un colormetro. Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacin: Anticuerpos marcados: ELISA Directo ELISA Indirecto ELISA sndwich o Doble (DAS) o Heterlogo (HADAS) Antgeno marcado o ELISA competitivo ELISA Directo. Consta de las siguientes etapas: Fijacin al soporte insoluble (tapizado) de antgenos especficos. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados. Adicin de anticuerpos marcados (conjugados) con una enzima; si los anticuerpos reaccionan con los antgenos, el complejo quedar solubilizado. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado. ELISA Indirecto.

Consta de las siguientes etapas: Fijacin al soporte insoluble de antgenos especficos para los anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados. Adicin del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarn especficamente con los antgenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adicin de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos especficos aadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antgenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.

Pasos generales de un ELISA. 1. Tapizado del pocillo con el antgeno o anticuerpo. 2. Adicin de la muestra problema con la mezcla de antgenos o anticuerpos. 3. Unin del antgeno o anticuerpo especfico al anticuerpo o antgeno tapizado en el pocillo 4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antgeno o anticuerpo no unido 5. Adicin del anticuerpo secundario marcado con la enzima 6. Unin del anticuerpo secundario al antgeno o anticuerpo 7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida 8. Adicin del substrato 9. Unin del substrato a la enzima 10. Desarrollo del color ELISA Sndwich DAS (Double Antibody Sandwich).

Consta de las siguientes etapas: Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados. Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si est presente el agente patgeno de diagnstico (antgeno), reaccionar especficamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antgenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados. Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar (deben tener un eptopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los antgenos aadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado. ELISA Sndwich HADAS. Consta de las siguientes etapas: Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados. Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si est presente el agente patgeno de diagnstico (antgeno), reaccionar especficamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antgenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados. Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar (deben tener un eptopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte), los cuales reaccionan con los antgenos aadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionado.

 Adicin de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado. ELISA Competitivo. Consta de las siguientes etapas: Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados. Adicin en concentracin conocida de una mezcla de antgenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior, marcados con una enzima y antgenos desconocidos objeto de estudio. Paralelamente, aadir nicamente antgenos del anticuerpo usado en el paso anterior, marcados con una enzima. Lavar para eliminar los antgenos que no hayan reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados. Si las lecturas de ambas pruebas son anlogas, el antgeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte. Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos, el antgeno objeto de estudio, est relacionado serolgicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad ptica, es proporcional a la concentracin del antgeno problema en la muestra. Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes grupos: ELISAs para detectar antgenos: ELISAs sndwich. ELISAs para detectar anticuerpos: ELISAs indirectos. La fase slida debe ser de un tipo que permita un fcil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unin de antgenos o anticuerpos sobre su superficie. Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350L son especialmente ventajosas para procesar un elevado nmero de

muestras y una vez tapizadas, el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura. Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse estriles y con o sin tapa.

Las tcnicas de ELISA se realizan mediante la adicin secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado. Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micro pipetas o con equipamiento para la automatizacin de todas y cada una de las etapas. Esta completa automatizacin se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran nmero de muestras y necesitar una elevada repetitividad de resultados.

Adsorcin de antgenos y anticuerpos (tapizado). Los mtodos empleados son dos fundamentalmente: Dilucin del antgeno o anticuerpo en tampn carbonato (pH 9,6) e incubacin posterior durante 3h a 37C o 16h a 4C. Tratamiento a 40-50C en tampn fosfato (PBS) o en agua fisiolgica tamponada pH 7,2-7,4 hasta desecacin. Solucin de lavado.

Solucin salina con Tween 20 como agente tensioactivo: ClNa................................................... 8,5gr Tween 20........................................... 0,5mL Agua destilada.................................... 1000mL Conjugados. La enzima escogida como marcador debe unirse fcilmente a antgenos y anticuerpos, encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromognico o fluorognico conveniente y de fcil preparacin. Las enzimas ms utilizadas son fosfatas alcalina, peroxidasa de rbano y galactosidasa; a continuacin se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una as como los substratos que se emplean con cada una de ellas. Las operaciones de marcado o conjugacin, llevan implcitas dos etapas: Purificacin de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacin generalmente salina de las protenas del antisuero, seguida de una dilisis y purificacin de la fraccin de anticuerpos mediante filtracin molecular, cromatografa o separacin en gradiente de densidad mediante ultra centrifugacin. Finalmente, se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mg/mL. Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehdo o el del m-periodato sdico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales).

Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccin de IgGs y es la utilizacin de protena marcadas con peroxidasa. Una vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacin; esta conservacin se suele realizar mediante liofilizacin, congelacin a 70C o filtrado estril y conservacin a -20C mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado estril. La bsqueda de la concentracin ptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado; para cualquier ELISA que utilice anti-anticuerpos conjugados, se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1:100 hasta 1:2000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antgeno a concentracin idnea. Aquella dilucin del conjugado que produzca cualquier reaccin inespecfica (menor color de fondo o background) con muestras negativas e implique una clara distincin de las muestras positivas, ser la ptima. La eleccin de una concentracin de conjugado ptima va completamente ligada a planteamientos econmicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro del conjugado aun acosta de aumentar el tapizado. La eleccin del substrato es de gran importancia para la estandarizacin del mtodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta, como son sensibilidad, especificidad, repetitividad, facilidad de lectura y complejidad de preparacin, as como estabilidad despus de la parada de reaccin. Hoy en da existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y, por lo tanto, el mtodo de deteccin de los complejos antgeno- anticuerpo y as tenemos sistemas de deteccin colorimtricos, fluorescentes y luminiscentes que a continuacin pasamos a desarrollar

Colorimetra. Los ensayos colorimtricos dan un producto de reaccin coloreado que absorbe luz en el espectro visible, siendo la densidad ptica del mismo proporcional a la cantidad de producto medido. Para todos los ensayos enzimticos, la etapa final es la adicin del substrato enzimtico, el cual da lugar a productos de reaccin soluble o insoluble y es elegido por su rendimiento cuantitativo de producto de reaccin. Para ensayos colorimtricos, la tasa de desarrollo de color es proporcional, dentro de un cierto rango, a la cantidad de conjugado enzimtico presente. Tanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina, tienen substratos que dan productos de reaccin coloreados solubles. La decisin de qu substrato es el mejor para cada tipo de ensayo, depende de la sensibilidad deseada, los requerimientos de tiempo y el sistema de deteccin que se vaya a utilizar. Para ensayos que necesitan ser muy sensibles, el substrato ideal debe producir color intenso con una tasa de reaccin muy rpida; sin embargo, para ensayos que requieren un rango dinmico amplio, son deseables substratos que den producto de reaccin en un perodo de tiempo largo (15-30 minutos) y den un rango de intensidad de color amplio, dependiendo de la cantidad de muestra presente. Para ensayos que se vayan a parar (se vaya a aadir a la reaccin, tras una cantidad de tiempo definido, un inhibidor qumico que pare el desarrollo de color y permita la deteccin dentro de un perodo razonable de tiempo), es necesario la utilizacin de un substrato que tenga una tasa de reaccin lenta (15-30 minutos hasta su finalizacin); sin embargo, cuando se vayan a realizar ensayos cinticos de la reaccin, debera usarse un substrato que tenga una tasa de reaccin rpida (5 minutos o menos). Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimtica (temperatura, pH, fuerza inica, composicin del tampn, reduccin del substrato, formacin de productos inhibidores, feed-back por formacin del producto final, desnaturalizacin de la enzima y, en algunos casos, exposicin a la luz), los que ms afectan al ensayo, hoy en da, son el tiempo de reaccin, la temperatura y la exposicin a la luz. Antes de leer la Densidad Optica y/o tras la adicin de la solucin de parada, es importante mezclar completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la reaccin (ensayos de punto final solamente) y la total dispersin del producto de color. La precisin del ensayo puede ser drsticamente mejorada aadiendo este simple paso al protocolo. El efecto fsico que la agitacin de la placa antes de la lectura tiene en la Densidad Optica resultante es muy importante. Los colormetros de microplaca solamente leen el centro exacto del pocillo, lo cual implica que una placa no agitada tendr pocillos que se asemejarn ms al formato A de la figura, ya que, debido a que la disolucin del producto de la reaccin es lenta, si no es mecnicamente agitada o mezclada, el producto

coloreado de la reaccin estar concentrado en la superficie del pocillo (donde la enzima est localizada) y el lector no estar midiendo la verdadera Densidad Optica del pocillo. Cuando s se mezcla, el producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo (formato B de la figura), y el lector detectar la verdadera Densidad Optica del pocillo. Hay varias formas de realizar esta mezcla: hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a la vez, de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser introducidas en el lector; hoy da, muchos, si no la mayora, de los lectores de microplaca llevan incorporados agitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo antes de ser ledas. Ambos mtodos (agitadores internos o externos), cuando son usados correctamente, pueden tener efectos positivos en la precisin del ensayo.

Fluorescencia. Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variacin de los colorimtricos; la enzima convierte el substrato en un producto de reaccin que emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda, siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizado. En comparacin con los mtodos colorimtricos, los ensayos de fluorescencia son ligeramente ms sensibles y, lo que es ms importante, amplan el rango de medida, en oposicin al lmite de 2,0-4,0 Densidad Optica impuesto en los ensayos colorimtricos. Un substrato fluorognico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitacin, la cual debera ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimtico presente. El substrato debera ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz. Asimismo, el producto de la reaccin enzima-substrato debera tener distintas longitudes de onda de emisin y de excitacin, ya que el substrato, por si mismo, no debera ser fluorescente.

Los ensayos fluorimtricos estn sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la seal inespecficamente. La deteccin por fluorescencia es susceptible a cambios en el pH, temperatura, concentracin inica, concentracin de detergente, secado, y a la matriz slida, lo cual puede conducir a distorsin de luz, un elevado background, y fenmenos de apagamiento y/o blanqueamiento. El fenmeno de light scattering (dispersin de luz) est ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con molculas, partculas en suspensin o la superficie de la microplaca. Por esta razn, es importante eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillos y utilizar reactivos qumicos de elevado grado de pureza. Las placas negras opacas y las tiras de la ms alta calidad estn diseadas para reducir esta dispersin de luz, ya que absorben la luz que rebota en la superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detector. El background (fluorescencia de fondo) y/o la autofluorescencia son el principal problema para la realizacin de ensayos en placas de 96 pocillos. Las fuentes de este background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina, bilirrubina, partculas de celulosa, drogas), los componentes de los diluyentes (iones metlicos), el material de la placa (tipo de plstico utilizado) y la contaminacin variable (partculas de polvo, huellas digitales). El background puede ser eliminado de tres formas: mediante el diseo del ensayo (dilucin de la muestra para ensayos homogneos y filtrados de los reactivos a travs de una membrana de 0,45m para ensayos heterogneos), mediante la instrumentacin y mediante una estricta limpieza. El fenmeno de apagamiento (quenching) se caracteriza por una reduccin inespecfica de la seal y es causado por la absorcin de la emisin por el oxgeno disuelto, por lo que los reactivos pueden ser desgasificados antes de su utilizacin para eliminar este efecto. El fenmeno de blanqueamiento (bleaching) o decoloracin (fading) est tambin caracterizado por una reduccin en la seal, pero est causado por un exceso en el tiempo de excitacin. Actualmente, no suele ser un problema debido a la baja energa y corto tiempo de excitacin de los fluormetros actuales. Otras interferencias que pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las variaciones de temperatura, la estabilidad de la fuente de luz y el ancho de la banda de excitacin. La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura, por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos, ya que, pequeas variaciones de un ensayo a otro, pueden ocasionar cambios en la sensibilidad del mismo. Muchos de los plsticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes; por ello, es importante elegir una placa que est fabricada especficamente para fluorescencia. Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda ms altas), ya que se reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz dispersada) y se eliminan, prcticamente, las contaminaciones cruzadas. Estas placas negras pueden tener fondo opaco o transparente. Las de fondo transparente se utilizan normalmente para ensayos

fluorescentes basados en clulas, lo cual permite su visualizacin durante el crecimiento de las mismas, al mismo tiempo que reducen la transmisin de luz lateral o la contaminacin cruzada durante la deteccin. Con la llegada de los fluormetros para placas de 96 pocillos, que son capaces de efectuar lecturas desde el fondo o desde la parte superior del pocillo, estas placas han permitido aumentar la versatilidad asociada con el diseo del experimento, p.e., usando una placa de fondo transparente, se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado con peroxidasa (detectado colorimtricamente con TMB) para la primera parte del ensayo, y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimtricamente con 4-MUP) para la segunda parte. Luminiscencia. Al igual que la fluorescencia, la luminiscencia es una variacin del mtodo estndar de ELISA. Una enzima transforma un substrato en un producto que emite fotones en lugar de dar color visible. La luminiscencia se describe como la emisin de luz por parte de una sustancia, que regresa desde un estado electrnicamente excitado a su estado original. Las diferentes formas de luminiscencia difieren, precisamente, en la forma en que se alcanza dicho estado excitado: Fotoluminiscencia: la excitacin se alcanza mediante luz de una determinada longitud de onda, es decir, igual que en la fluorescencia. Bioluminiscencia: la excitacin se alcanza mediante la utilizacin de un compuesto que emite luz al ser degradado, por ejemplo, luciferina o luciferasa. Quimioluminiscencia: la excitacin se alcanza mediante una reaccin qumica. Actualmente, es el mtodo disponible ms sensible debido a la posibilidad de multiplicacin y amplificacin de la seal. Las reacciones de luminiscencia se miden en RLU (Unidades Relativas de Luz), que son tpicamente proporcionales a la cantidad de muestra presente. El substrato luminiscente debe ser estable a temperatura ambiente durante todo el perodo que dure el ensayo, y debe ser elegido por su baja luminiscencia de fondo en estado basal (background), por su capacidad para producir luz intensa en estado activado, por su capacidad de emitir luz estable durante un perodo prolongado de tiempo (minutos) y por su disponibilidad comercial (calidad y consistencia). Existen dos mtodos de deteccin de luminiscencia: FLASH: es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad mxima de luz en segundos o milisegundos, por lo que es necesario comenzar la reaccin mientras los reactantes estn frente al sistema de deteccin (fotomultiplicador). Es de capital importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adicin de los reactivos y el proceso de deteccin sea siempre constante. GLOW: consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una seal constante. La luz emitida, a diferencia del color o la fluorescencia, no

se acumula, por lo que la sta debe ser intensa y la reaccin enzimtica prolongada para obtener suficiente seal. Los aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son: la reaccin puede ser iniciada fuera del aparato de deteccin, por lo que se elimina la necesidad de dispensacin interna y mezcla dentro del propio lector, la simplicidad del procedimiento, la elevada sensibilidad, la posibilidad de incrementar la seal y que el procedimiento es muy adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos. Adems, este tipo de reaccin luminiscente puede ser medido usando un luminmetro, capturando la imagen en una pelcula fotogrfica o mediante sistemas de anlisis de imagen. Aunque en teora estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos, los resultados entre pocillos y entre diferentes placas son ms homogneos cuando el tiempo de incubacin enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un perodo de estabilizacin de 2 minutos tras la adicin del substrato y entonces leer inmediatamente las placas). Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable, y sta ha de estar diseada especficamente para luminiscencia. Habitualmente son blancas y opacas, con el fondo transparente u opaco; ambas versiones estn diseadas para reducir contaminacin cruzada y el background ocasionado por la composicin de la resina blanca. Las placas con fondo transparente se utilizan habitualmente para ensayos luminiscentes basados en clulas, tales como ensayos de proliferacin celular, ya que permiten la visualizacin de las clulas durante su crecimiento y tambin previenen de la transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de deteccin. Tambin son tiles para ensayos dobles con un producto colorimtrico para un primer anlisis y otro luminiscente para un segundo. Finalmente, se debe optimizar el tiempo de incubacin, realizndose lecturas seriadas hasta encontrar el ptimo, que ser aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color entre positivos y negativos de referencia. Las reacciones enzimticas colorimtricas siguen curvas del tipo del que se muestra en la grfica para muestras positivas y negativas, por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimtrica entre muestras positivas y negativas es mximo.

Lectura e interpretacin de los resultados. La lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimtricamente. A simple vista, pueden ser ledos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacin y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacin de 0,1 de densidad ptica) ya que dicha lectura visual tendr el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos lmite. No obstante, evita la adquisicin de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacas. Una de las grandes ventajas de la tcnica ELISA es la posible automatizacin de la lectura y, por lo tanto, su objetividad. Dicha automatizacin se puede conseguir con un simple colormetro o espectrofotmetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automtica de microplacas. Los resultados finales de la lectura colorimtrica se reflejan numricamente mediante valores de absorbancia o densidad ptica que se obtendrn a la longitud de onda ms adecuada para la coloracin final alcanzada. Prueba de Elisa en new castle En la prueba indirecta de ELISA para anticuerpos, se llenan huecos en placas de poliestireno con una solucin de antgeno. Los antgenos protenicos se unen con firmeza al poliestireno, de modo que despus se pueda extraer el antgeno no unido aplicndole un lavado enrgico. Esto permite que los hoyos de la placa permanezcan cubiertos con el antgeno. Esas placas, as cubiertas, pueden guardarse hasta el momento en que se necesiten. El suero que se va a probar se coloca dentro de los tubos, de manera que los anticuerpos especficos del suero puedan unirse al antgeno que se encuentra colocado en las paredes de los tubos. Despus de la incubacin y de un lavado para extraer el anticuerpo no unido, la presencia de los anticuerpos que se unieron se puede detectar agregando una antiglobulina qumicamente unida a una enzima. Este complejo se une a los anticuerpos y despus de la incubacin y del lavado, se detecta y se mide con slo agregar el sustrato para la enzima correspondiente. La enzima y el sustrato se seleccionan de una manera que en cada tubo se produzca un producto que tenga un cierto color. La intensidad del color ser proporcional a la cantidad de anticuerpos presentes en el suero que se est ensayando. La intensidad del color se estima a simple vista o lo que es preferible, mediante espectrofotometra

Aplicaciones de la prueba ELISA en situaciones de campo. Las aplicaciones ms importantes se enlistan a continuacin: a). Evaluacin de la respuesta a la vacunacin. Esta evaluacin debe hacerse a edad de matadero en pollos de engorde. En caso de aves de vida prolongada la edad ms crtica de evaluacin es 6 semanas despus de la ltima aplicacin de vacuna inactivada. Para estos objetivos la prueba ELISA es generalmente adecuada y suficiente. b). Evaluacin de la respuesta a diferentes vacunas. Si se desea evaluar por ejemplo diferentes vacunas inactivadas se aconseja utilizar pruebas ms especficas, incluyendo IH y seroneutralizacin viral adems de ELISA. Es muy importante incluir antgenos residentes pues los kits y antgenos comerciales podran favorecer algunas vacunas sobre otras, siendo ms importante evaluar la respuesta serolgica contra antgenos o patgenos residentes en la regin de inters. No debe olvidarse que cualquier prueba serolgica podra evaluar principalmente la cantidad de anticuerpos, pero tambin la calidad de anticuerpos es fundamental. La calidad de anticuerpos se refiere a la capacidad de los anticuerpos de neutralizar una mayor diversidad de antgenos (serotipos o variantes). c). Anlisis de tendencias como ayuda diagnstica. Para poder analizar tendencias es fundamental contar con datos organizados por edad y cronolgicamente. Por ejemplo, cuando se presenta alguna enfermedad respiratoria en el campo la tendencia a una mayor seroconversin (ttulos de anticuerpos ms altos con frecuencia con menor coeficiente de variacin) nos puede orientar para lograr un diagnstico ms rpido, y nos puede ayudar a excluir posibilidades, pero para ello debe existir una base de datos importante. d). Vigilancia epidemiolgica para deteccin de enfermedades poco comunes o exticas. El ejemplo clsico es la influenza aviar. Los pases o regiones que no cuentan con un sistema de vigilancia para deteccin de anticuerpos contra influenza aviar son muy vulnerables pues toma tiempo establecer las pruebas serolgicas y afinar su desempeo. e). Investigaciones especficas para determinacin de etiologas mediante diagnstico por exclusin. Existen diversos problemas patolgicos o sndromes que en ocasiones no es fcil diagnosticar etiolgicamente y la serologa convencional no es suficiente.