A. JUDUL: PERHITUNGAN JUMLAH BAKTERI B. TUJUAN Setelah mengikuti praktikum ini mahasiswa diharapkan: 1.

Mampu melakukan perhitungan jumlah media yang digunakan untuk biakan bakteri 2. Mampu menghitung pengenceran sampel dan mengetahui kegunaan pengenceran 3. Mampu melakukan perhitungan bakteri dengan metode viable count (standard plate count) C. DASAR TEORI Pertumbuhan pada bakteri didefinisikan sebagai pertambahan berat sel. Karena berat sel relatif sama pada setiap siklus sel, maka pertumbuhan dapat didefinisikan sebagai pertambahan jumlah sel. Terdapat berbagai metode dalam mengukur pertumbuhan sel bakteri. Perhitungan sel bakteri terdiri atas dua cara, yaitu perhitungan tidak langsung dan langsung(1). Perhitungan tidak langsung dapat diklasifikasikan menjadi beberapa metode, diantaranya yaitu: 1. Metode Turbidimetri Secara rutin jumlah sel bakteri dapat dihitung dengan cara mengetahui kekeruhan kultur. Semakin keruh kultur, semakin banyak jumlah selnya. Prinsip dasar yaitu jika cahaya mengenai sel, maka sebagian cahaya diserap dan sebagian cahaya diteruskan. Jumlah cahaya yang diserap berbanding lurus dengan jumlah sel bakteri. Semakin banyak jumlah sel, semakin sedikit cahaya yang diteruskan(1). 2. Metode Total Count Total count memerlukan mikroskop dan wadah yang diketahui volumenya. Jika setetes kultur dimasukkan ke dalam wadah yang telah diketahui volumenya, maka jumlah sel dapat dihitung. Akan tetapi, metode ini mempunyai keterbatasan, yaitu tidak dapat membedakan sel hidup dan mati dan tidak dapat digunakan pada sel yang sedikit(1).

3. Metode Berat Kering Cara yang paling cepat mengukur jumlah sel adalah metode berat kering. Metode tersebut relatif mudah dilakukan, yaitu kultur disentrifugasi, kemudian bagian yang tersaring atau yang mengendap dari hasil sentrifugasi dikeringkan(1). Perhitungan langsung dapat diklasifikasikan beberapa metode, diantaranya yaitu: 1. Metode Viable Count Metode viable count sering disebut dengan metode total plate count. Kultur diencerkan sampai batas yang diinginkan. Kultur encer ditumbuhkan kembali pada media, sehingga diharapkan setiap sel tumbuh menjadi 1 koloni beberapa saat berikutnya, biasanya 4-12 jam. Hidup. Perhitungan jumlah mikroorganisme hidup adalah jumlah minimum organisme. Hal ini disebabkan koloni yang tumbuh pada lempengan agar merupakan gambaran mikroorganisme yang dapat tumbuh dan berbiak dalam media dan suhu inkubasi tertentu(1,2). Koloni yang tumbuh tidak selalu berasal dari satu sel mikroorganisme tertentu cenderung untuk berkelompok atau berantai. Bila ditumbuhkan pada media dan lingkungan yang sesuai kelompok bakteri ini hanya akan menghasilkan satu koloni. Berdasarkan hal tersebut sering digunakan istilah Colony Forming Units (CFU/ml) untuk penghitungan jumlah

mikroorganisme hidup. Sebaiknya hanya lempengan agar dengan jumlah koloni yang hidup. Sebaiknya hanya lempengan agar yang mengandung 30300 koloni saja yang digunakan dalam perhitungan. Lempengan agar dengan jumlah koloni yang tinggi (>300 koloni) sulit untuk dihitung sehingga kemungkinan kesalahan perhitungan sangat besar. Pengenceran sampel sangat membantu untuk memperoleh perhitungan jumlah yang benar, namun pengenceran yang terlalu tinggi akan menghasilkan lempengan agar dengan jumlah koloni yang rendah (<30 koloni)> Lempengan demikian tidak abash secara statistik untuk digunakan dalam penghitungan(2). Metode ini merupakan cara paling sensitive untuk menentukan jasad renik, dengan alasan:

a. Hanya sel mikroba hidup yang dapat dihitung b. Beberapa jasad renik dapat dihitung sekaligus c. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba, karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari mikroba yang mempunyai penampakan spesifik(3). Selain keuntungan-keuntungan tersebut di atas, metode ini juga mempunyai kelemahan, yaitu: a. Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya, karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk koloni. b. Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan jumlah yang berbeda pula. c. Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak, jelas, tidak menyebar. d. Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi relatif lama sehingga pertumbuhan koloni dapat dihitung(3). 2. Pengukuran menggunakan bilik hitung (counting chamber) Pada pengukuran ini, untuk bakteri digunakan bilik hitung PetroffHausser, sedangkan untuk mikroorganisme eukariot digunakan

hemositometer. Keuntungan menggunakan metode ini adalah mudah, murah, dan cepat, serta bisa diperoleh informasi tentang ukuran dan morfologi mikroorganisme. Kerugiannya adalah populasi mikroorganisme yang digunakan harus banyak (minimum berkisar 106 CFU/ml), karena pengukuran dengan volume dalam jumlah sedikit tidak dapat membedakan antara sel hidup dan sel mati, serta kesulitan menghitung sel yang motil(4). Bentuk koloni dilukiskan sebagai titik-titik, bulat, berbenang, tak teratur, serupa akar, serupa kumparan. Permukaan koloni dapat datar, timbul mendatar, timbul melengkung, timbul mencembung, timbul membukit, timbul berkawah. Tepi koloni ada yang utuh, ada yang berombak, ada yang berbelah-belah, ada yang bergerigi, ada yang berbenang-benang, ada yang keriting(5).

D. ALAT DAN BAHAN 1. Alat a) Autoclave b) Beaker gelas 100 ml c) Beaker gelas 250 ml d) Erlenmeyer 50 ml e) Gelas ukur 5 ml f) Gelas ukur 25 ml g) Kaca arloji h) Kertas steril i) Lampu spiritus 2. Bahan a) Media cair (nutrient broth) b) Media agar (nutrient agar) c) Sampel air mineral E. CARA KERJA 1. Hari Pertama Dibuat media PCA dengan cara menimbang PCA 2,475 gram dilarutkan aquadest ad 110 ml j) Lampu spiritus k) Laminar Air Flow (LAF) l) Oven m) Pengaduk kaca n) Petridis o) Rak tabung reaksi p) Spatula q) Spreader r) Tabung reaksi

Dibuat larutan NaCl dengan cara menimbang 1,9 gram dilarutkan dalam 200 ml aquadest

Dimasukkan larutan NaCl ke dalam 3 tabung, masing-masing 9,9 ml

Petridis disterilisasi dengan menggunakan oven, sementara media dan larutan NaCl disterilisasi dengan autoklaf

Dituang media ke dalam petridish masing-masinf 20 ml dan dibiarkan sampai membeku

Diambil 0,1 ml sampel ditambahkan pada larutan NaCl no 1 (1:100), dari larutan NaCl no 1 diambil 0,1 ml ditambahan pada larutan NaCl no 2 (1:10000), dan dari larutan NaCl no 2 diambil 0,1 ml ditambahkan pada larutan NaCl no 3.larutan NaCl 3 (1:1000000)

Dipipet cairan sampel dari masing-masing pengenceran . Petridish 1:100= diambil 1 ml sampel dalam NaCl no 1 Petridish 1:1000= diambil 0,1 ml sampel dalam NaCl no 1 Petridish 1:10000= diambil 1 ml sampel dalam NaCl no 2 Petridish 1:100000= diambil 0,1 ml sampel dalam NaCl no 2 Petridish 1:1000000= diambil 1 ml sampel dalam NaCl no 3

Diratakan sampel di atas media tersebut menggunakan spreader/penyebar

Diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam dengan posisi tidak terbalik

2. Hari Kedua Dihitung jumlah koloni pada lempengan agar dengan menggunakan colony counter. Gunakan lempengan agar yang mempunyai 30-300 koloni. Bila tidak ada lempengan yang mempunyai kisaran jumlah koloni tersebut gunakan lempengan agar yang mempunyai koloni sekitar 300 koloni. Ditentukan jumlah mikroorganisme hidup dengan cara mengalikan jumlah koloni dengan factor pengenceran dibagi jumlah sampel F. HASIL PENGAMATAN 1. Jenis/jumlah sampel: Air mineral 2. Perhitungan media a) Media PCA (Plate Count Agar) Diketahui : Konsentrasi PCA = 22.5 g/1 L Media padat yang akan dibuat = 110 ml Ditanya Jawab : Berapa massa nutrient PCA yang ditimbang? : = x/110 ml = 2.475 g

22.5 g/1000 ml x

Jadi, media nutrient agar ditimbang sebanyak 2.475 g kemudian dilarutkan dalam 110 ml aquadest. 3. Hasil percobaan a) Gambar/foto hasil percobaan (Terlampir) b) Perhitungan jumlah bakteri 1) Petridish 1:100 Diketahui: jumlah koloni Faktor pengenceran Volume sampel = 74 CFU = 100 = 1 ml

Jumlah bakteri= jumlah koloni x factor pengenceran Volume sampel = 74 CFU x 100 1 ml = 7400 CFU/ml

2) Petridish 1:1000 Diketahui: jumlah koloni Faktor pengenceran Volume sampel = 50 CFU = 1000 = 0,1 ml

Jumlah bakteri= jumlah koloni x factor pengenceran Volume sampel = 50 CFU x 100 0,1 ml = 50.000 CFU/ml

3) Petridish 1:10000 Diketahui: jumlah koloni Faktor pengenceran Volume sampel = 47 CFU = 10.000 = 1 ml

Jumlah bakteri= jumlah koloni x factor pengenceran Volume sampel

= 47 CFU x 10000 1 ml = 470.000 CFU/ml

4) Petridish 1:100000 Diketahui: jumlah koloni Faktor pengenceran Volume sampel = 67 CFU = 100.000 = 0,1 ml

Jumlah bakteri= jumlah koloni x factor pengenceran Volume sampel = 67 CFU x 10.000 0,1 ml = 6.700.000 CFU/ml

5) Petridish 1:1000000 Diketahui: jumlah koloni Faktor pengenceran Volume sampel = 40 CFU = 1000.000 = 1 ml

Jumlah bakteri= jumlah koloni x factor pengenceran Volume sampel = 40 CFU x 1000.000 1 ml = 40.000.000 CFU/ml

c) Pertanyaan 1) Sebutkan teknik perhitungan bakteri selain dengan menggunakan metode di atas!

2) Jelaskan bagaimana teknik membuat pengenceran 1:10!

G. PEMBAHASAN Pada praktikum kali ini tentang perhitungan jumlah bakteri. Tujuan dari praktikum ini yaitu agar mampu melakukan perhitungan jumlah media yang digunakan untuk biakan bakteri, mampu menghitung pengenceran sampel dan mengetahui kegunaan pengenceran, dan mampu melakukan perhitungan bakteri dengan metode viable count (standard plate count). Metode plate count digunakan dalam perhitungan bakteri ini karena metode ini memiliki beberapa keunggulan dibanding metode lainnya yaitu : a. Hanya sel mikroba hidup yang dapat dihitung b. Beberapa jasad renik dapat dihitung sekaligus c. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba, karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari mikroba yang mempunyai penampakan spesifik(3).

Selain keuntungan-keuntungan tersebut di atas, metode ini juga mempunyai kelemahan, yaitu: a. Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya, karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk koloni. b. Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan jumlah yang berbeda pula. c. Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak, jelas, tidak menyebar. d. Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi relatif lama sehingga pertumbuhan koloni dapat dihitung(3).

Pada perlakuan kerja, NaCl 0,9% ditambahkan pada tabung reaksi pengencaran untuk memberikan suasana yang isotonis yaitu larutan dengan konsentrasi yang sesuai dengan tekanan dalam sitoplasma sel, sehingga bakteri tak mati pada proses pengenceran, hal ini dikarenakan tonisitas merupakan salah satu faktor fisik yang mempengaruhi pertumbuhan bakteri. Sedangkan pengenceran yang dilakukan dengan berbagai ukuran, bertujuan untuk melihat jumlah bakteri yang tumbuh pada media dengan jumah pengenceran tertentu, selain itu
8

pengenceran memilki fungsi utama yaitu agar koloni yang terbentuk sebanyak 30-300 koloni. Kami melakukan perhitungan bakteri dengan sampel air mineral, sehingga diketahui jumlah bakteri yang terkandung dalam air mineral tersebut dan dapat kami bandingkan dengan batas jumlah bakteri yang diperbolehkan untuk dikonsumsi. Dari standar WHO tidak ada sampel air minum yang mengandung Escherichia coli dalam 100ml, tidak ada sampel yang mengandung coliform lebih dari 10 dalam 100ml. Coliform adalah bakteri umum yang terdapat di air mineral(6).

No 1 2 3 4 5

Pengenceran 1 : 100 1 : 1000 1 : 10.000 1 : 100.000 1 : 1000.000

Jumlah bakteri (CFU/ml) 7400 50.000 470.000 6.700.000 40.000.000

Tabel 1. Tabel jumlah bakteri berdasarkan faktor pengenceran

Dari hasil perhitungan, dapat kami analisis bahwa semakin besar jumlah pengenceran maka jumlah bakteri akan semakin banyak dan jumlah bakteri ini meningkat secara signifikan seiring dengan meningkatnya jumlah pengenceran. Namun hal ini tak sesuai dengan teori yang ada dimana semakin banyak pengenceran, bakteri akan yang didapat akan semakin sedikit. Dari pengamatan visual yang kami lakukan dari lima pengenceran tersebut hanya ada satu petri yang benar-benar terlihat seperti bakteri dan itu hanya terdapat tiga koloni. Ternyata kami menemukan suatu teori dimana metode plate count spreader baik digunakan untuk sampel dengan densitas sel yang tinggi dan dengan pengenceran tertentu, dan sebaiknya sampel air mineral dalam kemasan tidak menggunakan analisis dengan metode ini, karena jika terjadi pertumbuhan, maka dikhawatirkan yang mengalami pertumbuhan adalah kontaminan bukan bakteri, kembali kita ingat bahwa air sangat rentan terhadap tumbuhnya kontaminan. Jadi hasil

perhitungan yang kami dapat diatas merupakan jumlah kontaminan dengan luas area 65% dengan sensitifitas + 35. Hal diatas dapat terjadi karena kandungan air mineral dalam kemasan memiliki jumlah bakteri yang sangat kecil, karena air mineral dalam kemasan dibuat sedemikian rupa hingga terbebas dari bakteri, sehingga peluang terambilnya bakteri pada setiap pemipetan semakin kecil. Selain itu, sedikitnya jumlah sel persatuan volum dalam air mineral tersebut, dan jika hanya diambil 0,1 ml saja, maka peluang terambilnya bakteri dalam sampel sangatlah kecil. Dibawah ini merupakan ilustrasi pengambilan sampel pada air minum kemasan.

Gambar 1. peluang pengambilan bakteri pada sampel air mineral dalam kemasan

Dari gambar diatas dapat kami lihat bahwa peluang terambilnya bakteri secara acak akan sangat sulit. Hal inilah yang menyebabkan bakteri yyang kai temukan secara visual hanya tiga koloni pada satu dari lima petri. Untuk itu, sebelum menganalisa sampel sebaiknya kita memperhatikan beberapa hal penting terlebih dahulu, diantaranya: 1. Memperkirakan jumlah mikroorganisme yang ada dalam samper persatuan volume 2. Memilih metode yang cocok sehingga didapat hasil yang akurat 3. Mengetahui jenis atau golongan mikroorganisme yang dihitung 4. Menentukan media pertumbuhan yang cocok 5. Mencari tahu jumlah minimum bakteri dalam sampel

10

6. Memperkirakan jumlah sampel yang harus diambil pada pengambilan sample yang disesuaikan dengan sample size dari metode tertentu(7). Proses perhitungan bakteri air mineral terkendala oleh jumlah bakteri yang sangat kecil dalam volume yang sangat besar, hal ini dapat diatasi dengn memperbesar ukuran sampel, sehingga kemungkinan bakteri yang terambil akan semakin besar. Berdasarkan dari penelitian yang kami lakukan, bahwa saampel air mineral dalam kemasan merk Aqua, memiliki jumlah bakteri dibawah standar minimum bakteri yang diperbolehkan dalam air mineral dalam kemasan, sehingga aqua aman diminum.

e.

KESIMPULAN 1) Jumlah bakteri berada dibawah standar minimum bakteri yang diperbolehkan dalam air mineral dalam kemasan 2) Aqua aman dikonsumsi dimana saja dan kapan saja

f.

DAFTAR PUSTAKA (1) Purwoko, Tjahjadi, 2007, Fisiologi Mikroba, Bumi Aksara, Jakarta, 30. (2) Lay, Bibiana W., 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, Raja Grafindo Perkasa, Jakarta, 48 (3) Waluyo, Lud, 2004, Mikrobiologi Umum, Penerbit Universitas

Muhammadiyah Malang Press, Malang, 103-104. (4) Pratiwi, Sylvia T., 2008, Mikrobiologi Farmasi, Erlangga, Jakarta, 108. (5) Dwidjoseputro, 2010, Dasar-Dasar Mikrobiologi, Djambatan, Jakarta, 52 (6) Association of official Analytical Chemistry (AOAC), 2000. Official Methods of Analysis. Mc Graw Hill Press. Canada Dad. 2000. Bacterial Chemistry and Physiology. Jhon Wiley & Sons, In., New York, p. 426 (7) Prinsip dasar teori menghitung mikroorganisme pada cawan bagian 1

11