PRACTICAS DE BIOQUIMICA

Licenciatura en Ciencias Ambientales

Cuaderno de Laboratorio

Nombre y Apellidos:
Alumno 1: Alumno 2: Alumno 3:

Fecha: Turno (Maana/Tarde):

Universidad Rey Juan Carlos

Prcticas de Bioqumica

PRACTICA N 1: PRECIPITADO Y CUANTIFICACIN DE PROTEINAS. 1.1 OBJETIVO DE LA PRCTICA Y DESARROLLO.

1.2 INCIDENCIAS DURANTE LA REALIZACIN DE LA PRCTICA.

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1.3 CLCULOS, RESULTADOS Y CUESTIONES DE LA PRCTICA 2.

Precipitacin fraccionada con sulfato de amonio 1. Clculo de la dilucin 1/5 del Suero de Ternera (ST) en H2O destilada. Ci Ci Vi ml
x

Vi = Cf

Vf. Cf Vf ml

.......... ml ST + .......... ml H2O = 6 ml ST 1/5.

2. Clculo de los volmenes de solucin saturada de sal [(NH4)2SO4] necesarios para obtener fracciones al 30%, 40% y 60% de sal. Vsal=V [(S2-S1)/1-S2]
% Sal (peso/volumen) S2 (tanto por uno) S1 (tanto por uno) Volumen solucin saturada de sal (Vsal)

30 % 40% 60%

ml ml ml

Determinacin cuantitativa de protenas 1. Inserta aqu los resultados de los clculos de cada dilucin de BSA
Dilucin Volumen inicial BSA 1mg/ml Volumen de agua

100 g/ml 75 g/ml 50 g/ml 25 g/ml 10 g/ml 5 g/ml Blanco

l l l l l l 0 l

l l l l l l 1000 l

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2. Inserta aqu los resultados de los clculos de cada dilucin de las fracciones.
Fraccin Dilucin Volumen de fraccin Volumen de agua

ST (diluido 1/5)

dilucin 1/450 dilucin 1/900

l l l l l l l l 0 l

l l l l l l l l 900 l

Fraccin 1

dilucin 1/12 dilucin 1/24

Fraccin 2

dilucin 1/90 dilucin 1/180

Fraccin 3

dilucin 1/90 dilucin 1/180

Blanco

----------

3. Inserta aqu las medidas colorimtricas obtenidas. Diluciones de BSA

100 g/ml 75 g/ml 50 g/ml 25 g/ml 10 g/ml 5 g/ml Blanco (ltima)

Densidad ptica (u.a.)

u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a.

Diluciones de fracciones
Fr1. dilucin 1/24 Fr1 dilucin 1/12 Fr2 dilucin 1/180 Fr2 dilucin 1/90 Fr3 dilucin 1/180 Fr3 dilucin 1/90 St(1/5) dilucin 1/900 St(1/5) dilucin 1/450 Blanco (ltima)

Densidad ptica (u.a.)

u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a.

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4.- Representa grficamente SOBRE PAPEL MILIMETRADO ORIGINAL la recta patrn de sero albumina bovina poniendo en abscisas concentracin de protena y en ordenadas el valor de absorbancia a 595 nm. Una vez obtenida la recta patrn interpolar los resultados de absorbancia obtenidos para cada dilucin de las fracciones. Reflejar en la grfica TODAS las interpolaciones realizadas. Calcular la concentracin de protena que tiene cada dilucin.

Diluciones de fracciones Fr1 dilucin 1/24 Fr1 dilucin 1/12 Fr2 dilucin 1/180 Fr2 dilucin 1/90 Fr3 dilucin 1/180 Fr3 dilucin 1/90 St(1/5) dilucin 1/900 St(1/5) dilucin 1/450

Densidad ptica (u.a.) u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a.

Concentracin de la dilucin (g/ml) g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml

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ESPACIO PARA INSERTAR LA GRFICA EN PAPEL MILIMETRADO ORIGINAL (Nota: las grficas deben estar hechas en tinta y no a lpiz)

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5. A partir de la concentracin de cada dilucin, calcular la concentracin real de protenas del ST (1/5) y de todas las fracciones obtenidas multiplicando la concentracin de cada dilucin por su valor de dilucin. Calcular el valor de concentracin real de la fraccin como el valor medio de concentracin obtenido a partir de cada dilucin. Calcula la cantidad (masa) de protena en ST, ST(1/5) y en las tres fracciones, teniendo en cuenta la concentracin real y el volumen de cada fraccin.

Factor de dilucin

Concentracin de la fraccin (g/ml)

Concentracin media de la fraccin (g/ml)

Masa de protena de la fraccin (en g)

[Fr1. dilucin 1/24] x 24 [Fr1 dilucin 1/12] x 12 [Fr2 dilucin 1/180] x 180 [Fr2 dilucin 1/90] x 90 [Fr3 dilucin 1/180] x 180 [Fr3 dilucin 1/90] x 90 [St1/5 dilucin 1/900] x 900 [St1/5 dilucin 1/450] x 450 [St 1/5] media x 5

g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml

Fr1

g/ml

Fr2

g/ml

Fr3

g/ml

St1/5

g/ml g/ml

g g

St

6. Ordenar entre s las fracciones obtenidas en funcin de su masa (de menor cantidad a mayor cantidad), y justificar si el orden obtenido es lgico o no y por qu.

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Determinacin del peso molecular de las cadenas ligera y pesada de las inmunoglobulinas. Resultado de la Electroforesis: Presentacin.

Se observan las bandas correspondientes a las cadenas pesadas en las tres fracciones. En la ST1/5, debido a la gran cantidad de protena, aparece una mancha en la que no se puede distinguir la banda correspondiente a la cadena pesada. Las cadenas ligeras en la fraccin I y II no se detectan debido a la baja concentracin de protenas. En la fraccin II comienza a detectarse una banda muy tenue, mientras que en la ST1/5 se observa ntidamente pero en forma de mancha en lugar de en forma de banda.

Resultado de la Electroforesis: Ejercicio.

Se mide la distancia migrada en milmetros. Medir la distancia entre el inicio del gel resolutivo y el centro de cada banda, tanto para las bandas del marcador de peso molecular de protenas como para las bandas correspondientes a las cadenas pesadas y ligeras.

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1.- Inserta aqu las medidas de migracin de las bandas del marcador de peso molecular y de las cadenas ligera (Cl) y pesada (Cp) de las inmunoglobulinas.
Bandas del Marcador Miosina -galactosidasa Albmina de suero bovino Ovoalbmina Anhidrasa carbnica
Inhibidor de tripsina de soja

Peso molecular 207.000 Daltons 118.000 Daltons 81.000 Daltons 52.500 Daltons 36.200 Daltons 29.900 Daltons 20.700 Daltons 7.100 Daltons

Distancia Migrada mm mm mm mm mm mm mm mm

Lisozima Aprotinina

Fracciones Fraccin 1 Fraccin 2 Fraccin 3 ST 1/5 Dilisis Intercambio 1 Intercambio 2 Intercambio 3 Distancia Media Migrada

Distancia migrada Cadena Pesada mm mm mm mm mm mm mm mm CP = mm

Distancia Migrada Cadena Ligera mm mm mm mm mm mm mm mm CL = mm

2.- Construir SOBRE PAPEL MILIMETRADO ORIGINAL la recta patrn que relaciona el logaritmo decimal de la distancia migrada (en mm) DE CADA BANDA DEL MARCADOR con su peso molecular. Sobre esta recta INTERPOLAR la distancia media de migracin de la cadena ligera y la cadena pesada de las inmunoglobulinas para deducir su peso molecular. Representar sobre la grfica ambas interpolaciones. Presentar los pesos moleculares de ambas cadenas.
Peso molecular Cadena Pesada Peso molecular Cadena Ligera

Daltons

Daltons

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ESPACIO PARA INSERTAR LA GRFICA EN PAPEL MILIMETRADO ORIGINAL (Nota: las grficas deben estar hechas en tinta y no a lpiz)

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3.- Qu utilidad tiene la parte concentradora del gel de protenas?

4.- Qu ocurrira si no hubisemos aadido SDS (cargado negativamente) a la muestra de protenas y las sometiramos a electroforesis?

PREGUNTA.- Explica razonadamente la siguiente cuestin. Las inmunoglobulinas estn compuestas por dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras unidas entre s por puentes disulfuro. Este dato nos indicara que la inmunoglobulina migrara como una nica protena, detectando una sola banda. Sin embargo, en el gel de electroforesis observamos que aparecen dos bandas diferenciadas (cadenas pesada y ligera), y no una nica protena. A qu se debe este hecho?

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PRACTICA N 2. DETERMINACION DE LA Km DE LA FOSFATASA ACIDA

PARA EL p-NITROFENILFOSFATO Y DE LA Ki PARA LA INHIBICION POR FOSFATO. 2.1 OBJETIVO DE LA PRCTICA Y DESARROLLO.

2.2 INCIDENCIAS DURANTE LA REALIZACIN DE LA PRCTICA.

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2.3 CLCULOS, RESULTADOS Y CUESTIONES DE LA PRCTICA 4.

Inserta aqu los resultados de los clculos de cada dilucin del banco.
Dilucin de PNPP Volumen inicial Volumen de Tampn Citrato pH 4.0

50 mM 40 mM 30 mM 20 mM 10 mM 8 mM 4 mM 2 mM

2000 l l del 50 mM l del 40 mM l del 30 mM l del 20 mM l del 10 mM l del 8 mM l del 4 mM

l l l l l l l

Inserta aqu las medidas colorimtricas obtenidas. Nmero de reaccin

1 2 3 4 5 6 7 8 Blanco s (ltima) 9 10 11 12 13 14 15 16 Blanco i (ltima)

Densidad ptica (u.a.)

u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a.

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Inserta aqu los valores de concentracin de sustrato e inhibidor INICIALES en cada reaccin (volumen final de la reaccin: 1 ml).
Nmero de reaccin Volumen de sustrato usado en la reaccin [S] inicial en la reaccin Volumen de Inhibidor usado en la reaccin [I] inicial en la reaccin

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

0.2 ml del 2 mM 0.2 ml del 4 mM 0.2 ml del 8 mM 0.2 ml del 10 mM 0.2 ml del 20 mM 0.2 ml del 30 mM 0.2 ml del 40 mM 0.2 ml del 50 mM 0.2 ml del 2 mM 0.2 ml del 4 mM 0.2 ml del 8 mM 0.2 ml del 10 mM 0.2 ml del 20 mM 0.2 ml del 30 mM 0.2 ml del 40 mM 0.2 ml del 50 mM

mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM

------------------------------------------------------------------------0.2 ml del 15 mM 0.2 ml del 15 mM 0.2 ml del 15 mM 0.2 ml del 15 mM 0.2 ml del 15 mM 0.2 ml del 15 mM 0.2 ml del 15 mM 0.2 ml del 15 mM

------------------------------------------------------------------------mM mM mM mM mM mM mM mM

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Inserta aqu los valores de concentracin de sustrato INICIALES y absorbancia en cada reaccin y sus correspondientes inversos. Nmero de reaccin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 [S] inicial mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM 1/[S] inicial 1/mM 1/mM 1/mM 1/mM 1/mM 1/mM 1/mM 1/mM 1/mM 1/mM 1/mM 1/mM 1/mM 1/mM 1/mM 1/mM Vmax (Abs) u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. 1/ Vmax (Abs) 1/u.a. 1/u.a. 1/u.a. 1/u.a. 1/u.a. 1/u.a. 1/u.a. 1/u.a. 1/u.a. 1/u.a. 1/u.a. 1/u.a. 1/u.a. 1/u.a. 1/u.a. 1/u.a.

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1.- Representa grficamente SOBRE PAPEL MILIMETRADO ORIGINAL las grficas hiperblica y de inversos correspondientes a las reacciones en ausencia y en presencia del inhibidor. La representacin se construye relacionando la absorbancia obtenida para cada reaccin con la concentracin INICIAL de sustrato en esa reaccin. (en abscisas, concentraciones INICIALES de pnitrofenilfosfato ensayadas; en ordenadas, absorbancias a 400 nm). Deducir grficamente Km, Vmx, Kap y Vmx-ap tanto en la representacin hiperblica como en la de inversos.

Inserta aqu los valores de Km, Vmx, Kap y Vmx-ap obtenidos. Grfica Hiperblica Km mM Vmax (Abs) u.a. Kap mM Vmax-ap (Abs) u.a.

Grfica Inversos

-1/Km (mM)-1
Km

1/Vmax (Abs) (u.a.)-1

Vmax (Abs)

-1/Kap (mM)-1
Kap

1/Vmax-ap (Abs) (u.a.)-1

Vmax-ap (Abs)

mM

u.a.

mM

u.a.

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ESPACIO PARA INSERTAR LA REPRESENTACIN GRFICA HIPERBLICA DE ACTIVIDAD E INHIBICIN DE LA FOSFATASA, EN PAPEL MILIMETRADO ORIGINAL (Nota: las grficas deben estar hechas en tinta y no a lpiz)

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ESPACIO PARA INSERTAR LA REPRESENTACIN GRFICA DE TIPO LINEWEAVER-BURK (INVERSOS) DE ACTIVIDAD E INHIBICIN DE LA FOSFATASA, EN PAPEL MILIMETRADO ORIGINAL (Nota: las grficas deben estar hechas en tinta y no a lpiz)

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Prcticas de Bioqumica

ESPACIO PARA INSERTAR EN PAPEL MILIMETRADO ORIGINAL LA REPRESENTACIN GRFICA DEL PORCENTAJE DE ACTIVIDAD DE LA FOSFATASA EN PRESENCIA DEL INHIBIDOR RESPECTO A LA CONCENTRACIN INICIAL DE SUSTRATO. (Nota: las grficas deben estar hechas en tinta y no a lpiz)

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2.- Calcular el % de actividad e inhibicin producido por el fosfato monopotsico para cada concentracin de sustrato INICIAL utilizada. % actividad = (Abs con inhibidor/ Abs sin inhibidor) x 100. % inhibicin = 1- % actividad.

Nmero de reaccin 9 10 11 12 13 14 15 16

[S] inicial mM mM mM mM mM mM mM mM

% actividad % % % % % % % %

% inhibicin % % % % % % % %

3.- Determinar el tipo de inhibicin reversible (competitiva o no competitiva) ejercida por el fosfato monopotsico sobre la fosfatasa cida, considerando: 1) los porcentajes de inhibicin obtenidos; 2) las variaciones entre Kap y Km y entre Vmx ap y Vmx observados en la representacin de inversos. Razona tu respuesta.

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4.- En el caso de resultar que el fosfato monopotsico ejerce sobre la fosfatasa cida una inhibicin reversible competitiva, calcular el valor de Ki de la fosfatasa cida. Utilizar los valores de Km y Kap obtenidos mediante la representacin de inversos.

Km mM

Kap mM

[I] inicial mM

Ki mM

Espacio para clculos:

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PRCTICA N 3: PURIFICACION VIRTUAL DE PROTEINAS CON ACTIVIDAD ENZIMATICA 3.1 OBJETIVO DE LA PRCTICA Y DESARROLLO.

3.2 INCIDENCIAS DURANTE LA REALIZACIN DE LA PRCTICA.

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3.3 CLCULOS, RESULTADOS Y CUESTIONES DE LA PRCTICA 3. Purificacin virtual de dos muestras.

El profesor la profesora de prcticas asignarn a cada grupo de trabajo el nmero de dos muestras que deben procesar. Se anotarn todos los pasos dados durante la purificacin en su orden correspondiente y las condiciones de cada uno de stos, as como su rendimiento. El resultado final de cada purificacin virtual debe ser una sola mancha en un gel bidimensional (homogeneidad), alcanzar un rendimiento lo ms prximo al 100 % (mnima prdida de actividad enzimtica) y un enriquecimiento lo ms alto posible (alto grado de pureza). Cada purificacin debe ser realizada con el mnimo nmero de pasos posible.

Nmero de la primera protena asignada

Nmero de la segunda protena asignada

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ESPACIO PARA INSERTAR EL INFORME DE PURIFICACIN DE LA PRIMERA PROTENA.

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ESPACIO PARA INSERTAR EL INFORME DE PURIFICACIN DE LA SEGUNDA PROTENA.

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Problema Se dispone de una mezcla de tres protenas A, B y C que deseamos purificar. La protena A es una enzima, por lo que utilizaremos la medida de su actividad enzimtica para seguir su separacin. En primer lugar, realizamos precipitacin con sulfato amnico hasta saturacin final del 45% y conservamos la fraccin soluble. Teniendo en cuenta los resultados de valorar la mezcla inicial y la fraccin soluble presentados en la tabla, calcular la actividad total y el enriquecimiento de esta fraccin. Como segundo paso del proceso de purificacin, realizamos cromatografa de intercambio de iones en DEAE-Celulosa a pH 8,5 y elucin en un gradiente de Cl Na. Los resultados de valorar la actividad enzimtica y la cantidad de protena en cada una de las fracciones obtenidas se muestran en el siguiente grfico, mientras que las mismas medidas realizadas en una mezcla de las fracciones 4 a 9 se presentan en la tabla. Calcular el rendimiento y el enriquecimiento para este paso.
PROTEINA MG INICIAL Sulfato amnico DEAE-CELULOSA 511 121 19 5.600 ACTIV ENZ UI 6.000 RENDIMIENTO % 100 94 ENRIQUECIMIENTO N 1

0.5

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Nmero de fraccin

_________________Cantidad de protena . . . . . . . . . . . . . . . . . . Actividad enzimtica de A

--------------------Concentracin molar

de Cl Na

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Para purificar las protenas B y C, se juntan las fracciones 35 a 43 y el pool resultante se analiza por electroforesis bidimensional. La separacin en la dimensin horizontal es por isoelectroenfoque. La separacin en la dimensin vertical es por electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes y reductoras (SDS-PAGE). El resultado es:
5 kDa 94 68 B 45 C 6 7 pH

Si se sabe que la protena B es un homotrmero cuyas tres cadenas polipeptdicas idnticas estn unidas por puentes disulfuro y la C es un monmero, qu tcnica usaras para separar la protena B de la C? Por qu?

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PRACTICA N 4: TCNICAS CROMATOGRFICAS. 4.1 OBJETIVO DE LA PRCTICA Y DESARROLLO.

4.2 INCIDENCIAS DURANTE LA REALIZACIN DE LA PRCTICA.

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4.3 CLCULOS, RESULTADOS Y CUESTIONES DE LA PRCTICA 4.

Cromatografa en papel. 1.-En la cromatografa en papel, identifica qu mancha se corresponde con cada pigmento en el ensayo realizado. Completa el cuadro y calcula la Rf media para cada pigmento. Ordena los pigmentos entre s de mayor a menor hidrofobicidad.

Pigmento Verde Luz

Muestra aplicada Muestra 1 Muestra 2

Valor DA mm mm mm mm mm mm

Valor Rf mm mm mm mm mm mm

Valor medio Rf mm

Azul dextrano

Muestra 1 Muestra 2

mm

Hemoglobina

Muestra 1 Muestra 2

mm

Valor Ds:______________mm 1er Pigmento ms hidroffico: 2do Pigmento ms hidroffico: 3er Pigmento ms hidroffico:

2.- Razona en funcin de la prctica realizada qu factores pueden afectar al Rf. Justifica la incidencia de cada factor propuesto.

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