Diagnstico de Enfermedades en Plantas: Uso de Herramientas Moleculares

Ins Marlene Rosales V. Unidad de Biotecnologa - INIA-CRI La Platina

Documento de difusin elaborado en el marco del Proyecto ACTUALIZACIN TCNICA Y GENERACIN DE REDES DE COLABORACIN PARA EL DESARROLLO DE PROYECTOS COMUNES EN FITOPATOLOGA (FP-V-2002-1-A -028), financiado por la Fundacin Para la Innovacin Agraria (FIA) y el Instituto de Investigaciones Agropecuarias (INIA).

Diagnstico de Enfermedades en Plantas: Uso de Herramientas Moleculares.

Uno de los requerimientos ms importantes para el manejo adecuado de una enfermedad es la identificacin correcta del agente fitopatgeno, de forma de iniciar un tratamiento adecuado lo ms temprano posible. Algunas enfermedades pueden diagnosticarse fcilmente por medio de una examinacin visual, pero otras requieren pruebas de laboratorio para su diagnstico. Estos procedimientos pueden algunas veces tomar varios das o semanas, y en algunos casos poseer escasa sensibilidad. Afortunadamente, producto del avance de la biotecnologa, existen hoy en da nuevos productos y tcnicas que estn disponibles para complementar o reemplazar los procedimientos de laboratorio, de forma de acelerar la obtencin de resultados y permitir un diagnstico ms temprano. Las enfermedades causadas por microorganismos pueden ser diagnosticadas por medio de la identificacin de una caracterstica nica del organismo, tales como su material gentico o una protena. Las tcnicas moleculares para la deteccin de fitopatgenos han sido impactadas profundamente por dos grandes advenimientos en los ltimos 30 aos. Primero fue la deteccin basada en el uso de anticuerpos, con el desarrollo de los anticuerpos monoclonales (2) y del test de ELISA (Enzyme Linked immunosorbent assay) (1). Estos avances impactaron especialmente a la virologa y bacteriologa, ya que estos agentes patgenos pudieron ser identificados y detectados mucho ms rpidamente (5). Luego vinieron las tcnicas basadas en la deteccin de cidos nucleicos, tales como la reaccin en cadena de la polimerasa y su capacidad de amplificar el ADN blanco millones de veces (6). Se espera que en el futuro cercano el diagnstico de patgenos enfrente una nueva revolucin tecnolgica, la que permitir una deteccin ilimitada de agentes por ensayo, con gran sensibilidad, exactitud y rapidez. Estos avances sern posibles gracias a los actuales esfuerzos que se desarrollan en el rea de la investigacin genmica y de la bioinformtica. A continuacin se detallan algunas caractersticas, limitaciones y virtudes de las principales tcnicas utilizadas en el diagnstico de fitopatgenos. TCNICAS SEROLGICAS Los mtodos inmunolgicos son ampliamente utilizados en la deteccin de patgenos en reas clnicas, agrcolas y ambientales. Un diagnstico inequvoco depende de la afinidad y especificidad del anticuerpo utilizado, lo que permite realizar la deteccin de bajas concentraciones de un patgeno. Las inmunoglobulinas (Ig) son una familia de glicoprotenas que se encuentran en el suero y otros fluidos de los mamferos y otros animales. Ellas forman parte del sistema inmune, son producidas en respuesta a un inmungeno y funcionan como anticuerpos (Figura 1). Estas Ig poseen una estructura bsica de cuatro cadenas polipeptdicas, dos cadenas idnticas livianas y dos cadenas idnticas pesadas, arregladas en una estructura tipo Y. La unin del antgeno al anticuerpo ocurre en el sitio Fab, unin que es de tipo de reversible y mediada por enlaces no covalentes. 2 Ins Marlene Rosales V., PhD. Unidad de Biotecnologa INIA-CRI La Platina

Fab
Figura 1. Estructura de las inmunoglobulinas (IgG).

El test de ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) es una tcnica de laboratorio muy sensible que es usada para detectar la presencia de antgenos o anticuerpos de inters en una amplia variedad de muestras biolgicas. Una aplicacin comn del ELISA es adsorber anticuerpos a las paredes de una placa de plstico (poliestireno), a la que posteriormente se le agregar extractos de savia de la planta problema. Si el antgeno est presente en la muestra, stos sern inmobilizados a las paredes de la placa. Un segundo anticuerpo unido covalentemente a una enzima que reconoce el antgeno inmobilizado es agregado posteriormente. La presencia en cada pocillo de la placa del complejo anticuerpo-antgeno-anticuerpo+enzima es revelado por el cambio de color que ocurre al aplicar un sustrato cromognico que es utilizado por la enzima conjugada al segundo anticuerpo. El cambio de color, y por lo tanto la presencia del antgeno, es cuantificado por medio de la medicin de absorbancia que es efectuado es un lector de placa de ELISA (Figura 2). Existen numerosas variaciones de la metodologa de ELISA que se han descrito desde su desarrollo inicial en los aos 60s, pero el concepto es bsicamente el mismo, la

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Figura 2. Test de ELISA. A. Ilustracin esquemtica de los pasos involucrados en la ejecucin del tets de ELISA. Pasos 1 y 2, produccin y purificacin de la inmunoglobulinas desde un conejo inmunizado. 3, activacin de la placa de poliestireno con el anticuerpo especifico; 4a, inmovilizacin del antgeno, 4b, aplicacin de extracto que no contiene el ant geno de inters; 5a y 5b , adicin del anticuerpo conjugado a la enzima y revelado de la placa con viraje del color de sustrato en caso de presencia del antgeno de inters (5a). B. Fotografa de un lector de ELISA C. Fotografa de una placa de poliestireno revelada con el sustrato cromognico. Los pocillo s que delatan la presencia del antgeno de inters han virado a color amarillo. deteccin inmunolgica de un antgeno o un anticuerpo en una muestra problema. El ELISA Directo (Figura 3) es la forma ms simple de este ensayo. Es usado para detectar un antgeno que se ha unido a una fase slida (placa de poliestireno). Un anticuerpo conjugado con una enzima es incubado con el antgeno capturado y despus de lavar el exceso del conjugado se agrega el substrato cromognico. El viraje a un color determinado indicar una interaccin especfica antgeno-anticuerpo. En el ELISA Indirecto (Figura 3), el antgeno es primero adsorbido a la placa, entonces acta un anticuerpo secundario y posteriormente el anticuerpo conjugado a la enzima. Para que se desarrolle color, el anticuerpo primario que es especfico para el antgeno debe estar presente en el complejo final. En el ELISA sndwich (Figura 3), un anticuerpo es 4 Ins Marlene Rosales V., PhD. Unidad de Biotecnologa INIA-CRI La Platina

DIRECTO

INDIRECTO

SANDIWCH DE ANTICUERPO DOBLE CAPTURA DE ANTIGENO SANDWICH

CAPTURA DE ANTICUERPO

Figura 3. Esquema que ilustra las variaciones de l test de ELISA.

Figura 4. Inmuno-impresin de tejidos. A la izquierda se representan los pasos claves de esta metodologa (ver texto). A la derecha, en A se presenta la impresin de un tallo sano de pomelo que fue incubado con un anticuerpo anti-CTV (Virus de la Tristeza de los ctricos). En B, C y D, impresiones de tejido infectado con CTV, donde se puede ver claramente la localizacin del virus en el tejido floemtico del pomelo en las reas teidas de prpura oscuro (indicadas con una flecha negra). 5 Ins Marlene Rosales V., PhD. Unidad de Biotecnologa INIA-CRI La Platina

adsorbido a la placa con el objetivo de capturar el antgeno. Un segundo anticuerpo conjugado, es utilizado despus de agregar la muestra con el antgeno de inters. De esta forma se obtiene el viraje del color del substrato que indica la presencia del antgeno en la muestra. Esta forma es considerada la ms especfica y sensible de las metodologas de ELISA hasta ahora descritas. Otra tcnica que es tambin utilizada en el diagnstico de fitopatgenos en la inmunoimpresin de tejidos, tcnica que tambin utiliza reacciones especficas antgenoanticuerpo, y que es muy similar al test de ELISA en placas, con la excepcin que en este caso la matriz slida es una pieza especial de papel (membrana). Con esta tcnica, la localizacin del patgeno o agente causal de la enfermedad puede ser determinada dentro del tejido del hospedero. El tejido de la planta es presionado contra una membrana (nitrocelulosa o nylon) a la que despus se le unirn los anticuerpos que se unen especficamente al patgeno. Un cambio de color indicar un r sultado positivo y e mostrar la localizacin del patgeno en el tejido del hospedero (Figura 4). Finalmente, otra de las tcnicas serolgicas disponibles para el diagnostico de agentes fitopatgenos son los test de flujo lateral, que en esencia son muy similares a los test de ELISA tradicionales efectuados en placas. En estas pruebas, la forma ms utilizada es el inmunoensayo en formato sand wich. Un anticuerpo especfico para el antgeno blanco (patgeno) es inmobilizado en una fase slida (membrana de nitrocelulosa). Un segundo anticuerpo conjugado a oro coloidal, que tambin reconoce al antigeno blanco, es depositado sobre esta membrana. Cuando la muestra que contiene el antgeno es aplicada a la membrana, sta migra a travs del conjugado solubilizndolo y formando un complejo que se mueve a travs de la membrana. Este complejo es atrapado al alcanzar el anticuerpo que est inmobilizado en la matriz, formndose un sand wich

Figura 5. Test de Flujo Lateral. A la izquierda una representacin de un a tira de nitrocelulosa usada para este tipo de ensayo. Se describen las reas de aplicacin de la muestra, lnea de prueba y lnea control. Las tres fotos a la derecha muestran los pasos de preparacin de la muestra, aplicacin de la tira en la savia extrada y el resultado final, respectivamente.

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entre los dos anticuerpos y el antgeno. Adems, se desarrolla un color que refleja la concentracin del antgeno en la muestra. La mayora de los test de flujo lateral tambin contienen una lnea control que asegura la ejecucin y funcionamiento correcto de la prueba (Figura 5).

TCNICAS BASADAS EN LA DETECCIN DE CIDOS NUCLEICOS

El diagnostico de fitopatgenos por medio de la identificacin sus cidos nucleicos es un concepto que se ha desarrollado en las ltimas dos dcadas por lo que nuevas aplicaciones, protocolos y modificaciones de las tcnicas descritas estn siendo reportadas cada mes en las revistas de divulgacin cientfica. Estas tcnicas sin embargo no estn siendo utilizadas masivamente en laboratorios de diagnstico debido al alto costo de sus reactivos, el requerimiento de equipamiento especializado y alto nivel de entrenamiento para su ejecucin. Se espera, sin embargo, que la tecnologa de deteccin de cidos nucleicos llegue a ser ms accesible y simplificada en el futuro. Por ahora, el inmunodiagnstico es una alternativa econmica, rpida, sensible y con una sensibilidad satisfactoria para ser usados en forma masiva. Los cidos nuclicos, el cido desoxirribonucleico (ADN) y el cido ribonucleico (RNA), son grandes molculas formadas por la repeticin de una molcula unidad que es el nucletido. Un nucletido est formado por una pentosa: Ribosa o desoxiribosa; una base nitrogenada: prica o pirimidnica y cido fosfrico. La molcula de ADN (Figura 6) est constituida por dos largas cadenas de nucletidos unidas entre s formando una doble hlice. Las dos cadenas de nucletidos que constituyen una molcula de ADN, se mantienen unidas entre s porque se forman enlaces entre las bases nitrogenadas de ambas cadenas que quedan enfrentadas. La unin de las bases se realiza mediante puentes de hidrgeno, y este apareamiento est condicionado qumicamente de forma que la adenina (A) slo se puede unir con la Timina (T) y la Guanina (G) con la Citosina (C). La estructura del ADN se asemejara a una "escalera". El esqueleto de la "escalera" estara formado por el azcar desoxirribosa y un grupo fosfato que hara de puente entre dos molculas de desoxirribosa. Los peldaos de la "escalera" estaran formados por los cuatro tipos de bases nitrogenadas: adenina, guanina, citosina y timina. Hibridacin de cidos nucleicos Una sonda de cidos nucleicos consiste en una hebra simple de ADN ARN marcada, con radioactividad algn mtodo no isotpico, que ha sido construida para complementarse y unirse a hebras de ADN ARN blanco. Para emplear una sonda se debe fijar primero el extracto vegetal cidos nucleicos parcialmente purificados a un

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C D

Figura 6. Estructura del ADN. A. Estructura antiparalela de la doble hlice B y C. Ilustracin de las interacciones (puentes de hidrogeno) que ocurren entre ambas cadenas de nucletidos D. Unidad bsica del ADN (pentosa, base nitrogenada y fosfa to).

soporte slido tales como una membrana de nitrocelulosa de nylon. Los cidos nucleicos blancos son denaturados a hebra simple y posteriormente hibridados a la sonda marcada. Bajo condiciones apropiadas de temperatura y sales, la sonda es capaz de alinearse con el blanco de ADN ARN, para que despus el hbrido de cidos nucleicos de doble hebra sea detectado por medio de la visualizacin de la marca (Figura 7 y 8). Los cidos nucleicos se pueden purificar parcialmente y despus ser aplicados gota a gota a la membrana para un posterior hibridacin, o aplicarlos directamente al presionar el tejido vegetal sobre la membrana, simplificando el proceso de ejecucin de esta tcnica. Todas las posibilidades de aplicacin de los cidos nucleicos a la membrana se pueden apreciar en la figura 8, donde se observa la hibridacin de cidos nucleicos obtenidos desde fracciones semipurificadas como slot-blot o impresin directa desde tallos y hojas a la membrana.

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Figura 7. Hibridacin de cidos nucleicos. El ADN de doble hebra (a) es denaturado por medio de la aplicacin de calor (b). Una sonda ARN (c) puede hibridarse por complementaridad de bases y formar un hibrido ADN/ARN (d) al bajar la temperatura.

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Figura 8. Aplicaciones prcticas de la hibridacin de cidos nucleicos. A la izquierda se muestra una representacin de esta tcnica: aplicacin de los cidos nucleicos a la membrana, hibridacin con una sonda marcada, y visualizacin de la unin especfica de la sonda. A la derecha se observan distintos tipos de aplicacin de los cidos nucleicos al soporte solido (membrana): aplicacin de preparaciones semipurificadas (slot-blot) o impresin directa desde el tejido (tallos y hojas).

Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) La reaccin en cadena de la polimerasa puede ser utilizada para detectar diminutas cantidades de ADN de un fitopatgeno que est presente en el suelo, tejido, savia, etc (7). Esta tcnica permite multiplicar geomtricamente regiones especficas del ADN blanco por medio de ciclos sucesivos de sntesis que ocurren in vitro. Los componentes de reaccin de PCR son el ADN blanco, nucletidos, una enzima llamada ADN polimerasa y partidores. Los partidores son pequeas cadenas de nucletidos que definen la secuencia de ADN que ser amplificada. El proceso es ilustrado en la Figura 9, la primera etapa es la disociacin de la doble hebra de ADN, luego ocurre la hibridacin de los partidores y la incorporacin de los nucletidos de acuerdo a la secuencia presente en el ADN blanco por la polimerasa. El resultado son copias de hebra doble del ADN blanco. Tericamente, una copia nica de ADN puede ser amplificada millones de veces (7). Los productos de la PCR son analizados usualmente por medio de una electroforesis para as determinar si el ADN blanco fue amplificado (Figura 10). 10 Ins Marlene Rosales V., PhD. Unidad de Biotecnologa INIA-CRI La Platina

La PCR ha sido aplicada primariamente a la deteccin e identificacin de fitoplasmas, virus y viroides. Sin embargo, hongos, bacterias y nemtodos pueden tambin ser detectados. En general la aplicacin de esta tcnica al diagnstico de enfermedades en plantas se ha centrado en organismos que no son fcilmente detectados por medio de otros mtodos o en aquellos casos en que la obtencin de resultados es lenta. Entre las ventajas que presenta esta tcnica se destacan su sensibilidad (100 a 1000 veces ms sensible que ELISA), la rapidez en la obtencin de resultados y el potencial para detectar varios patgenos simultneamente. Las desventajas que presenta son el alto costo de sus reactivos y equipos y la necesidad de un entrenamiento adecuado para su ejecucin debido a la posibilidad de contaminacin y la consecuente obtencin de falsos positivos. La posibilidad de utilizar varios partidores en una reacci n de PCR que den origen a productos amplificados de diferentes tamaos abre la posibilidad de detectar varios patgenos en una misma reaccin. Adems, una variacin interesante de esta tcnica ha sido desarrollada recientemente, y ha sido llamado PCR en Tiempo Real. Esta tcnica facilita un monitoreo dinmico (ciclo a ciclo) de la reaccin de PCR permitiendo la cuantificacin del cido nucleico presente en la muestra y de esta forma conocer la concentracin del patgeno de inters (3). El desarrollo de la investigacin en el rea genmica, donde se utilizan microarreglos para establecer qu genes son sobre-expresados o silenciados despus de un determinado tratamiento abre nuevas posibilidades en el rea del diagnstico de fitopatgenos. Recientemente se han desarrollado biochips compuestos de sondas de cidos nucleicos anticuerpos arreglados en pequeas reas de vidrio. Este formato es robusto y flexible y tiene adems el potencial de incrementar la capacidad del diagnstico ya que es posible detectar mltiples patgenos simultneamente (4). Sin duda, el descubrimiento y descripcin de nuevos genes, molculas o secuencias son la base para el desarrollo de nuevas herramientas que permitan realizar un diagnstico rpido y preciso de enfermedades en plantas. Estos resultados sern tambin de vital importancia en la comprensin de las relaciones globales e interacciones existentes entre las plantas y sus patgenos u otros microorganismos asociados.

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Figura 9. Reaccin de la polimerasa en cadena. 1. Disociacin de la doble hebra de ADN. 2. Hibridacin de los partidores 3. Extensin de la hebra de ADN por medio de la incorporacin de nucletidos. 4. Dobles hebras de ADN amplificadas

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(b)
ADN TAQ

(d)

Primers

dATP dGTP dCTP

dTTP

94

72 50-65

20 4

(a)

(c)

(e)

Figura 10. Secuencia explicativa del uso de la PCR en el diagnstico de fitopatgenos. (a) Muestra problema desde donde se hace una extraccin de cidos nucleicos (b) Componentes de la reaccion de PCR en un microtubo. (c) Termociclador donde se efectan los ciclos trmicos de denaturacin, alineamiento de partidores y extensin de la hebra de ADN. (d) Esquema de una electroforesis de ADN. (e) Visualizacion de un producto especfico amplificado por PCR en un gel de agarosa.

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Literatura Citada 1. Clark, M. F., ADN A. N. Adams. 1977. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of plant viruses. Journa l of General Virology 34:475-483. Kohler, G., ADN C. Milstein. 1975. Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256:495-497. Levesque, C. A. 1997. Molecular detection tools in integrated disease management: Overcoming current limitations. Phytoparasitica 25:3-7. Martin, R. R., D. James, ADN C. A. Levesque. 2000. Impacts of molecular diagnostic technologies on plant disease management. Annu. Rev. Phytopathol 38:207-239. Miller, S. A., ADN R. R. Martin. 1988. Molecular diagnosis of plant disease. Annu. Rev. Phytopathol 26:409432. Mullis, K. B., ADN F. A. Faloona. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155:335350. Putnam, M. L. 1995. Eva luation of selected methods of plant disease diagnosis. Crop protection 14:517-525.

2. 3. 4.

5. 6. 7.

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