MEIOS DE CULTURA

Prof. Sidney T. G. Bastos Dept. de Micologia/CCB/UFPE

O objetivo principal bsico em estudos na rea de micologia, particularmente, no campo da fisiologia de fungos, reside na determinao, tanto quanto possvel, de como o fungo vive em seu habitat. Uma das ferramentas de trabalho para atingir este objetivo conhecer quais as relaes nutricionais e fisiolgicas existentes entre o fungo e seu ambiente. Os ambientes nos quais os fungos vivem so, contudo, extremamente complexos, o que torna quase impossvel desenvolver estudos sobre os efeitos de diversos fatores (temperatura, pH, disponibilidade de nutrientes, relaes entre fungos, etc.) sobre o crescimento de um determinado fungo. A necessidade de investigar as relaes fungo-ambiente levou ao desenvolvimento de uma srie de meios de cultura. A partir da elaborao destes meios foi tambm possvel estudar as reaes de um fungo em um ambiente controlado. H necessidade de ressaltar que as condies experimentais em laboratrio (temperatura, pH, nutrientes, etc.) so diferentes das naturais, isto , no refletem precisamente as condies do habitat natural dos fungos. O meio de cultura pode ser definido como o substrato no qual os fungos so cultivados em laboratrio. Embora os meios de cultura contenham uma srie de substncias nutritivas essenciais para o crescimento fngico, tais como: carboidratos, protenas, aminocidos, sais minerais, cidos graxos e vitaminas, nenhum deles pode ser considerado um substrato ideal. A deficincia do meios de cultura pode ser evidenciada pelo fato de que, at atualmente, no se conseguiu cultivar determinados fungos fitopatgenos denominados de carves (ordem Ustilaginales), ferrugens (ordem Uredinales) ou mildios (ordens Peronosporales e Erysiphales) (Tabela 1). Fungos parasitas obrigatrios no crescem em meios de cultura pois necessitam de uma clula viva (hospedeiro) para o seu crescimento. Por outro lado, os fungos parasitas facultativos podem crescer em meios de cultura. Alm disto, inmeros fungos permanecem estreis em meios de cultura e outros no completam o seu ciclo de vida normal ou, ainda, apresentam estados teratolgicos (formas anormais). Por estas razes, uma infinidade de meios tem sido elaborados e testados continuamente.

Tabela 1. Alguns fungos fitopatgenos no cultivados em meios de cultura. fungo Podosphaera leucotricha Erysiphe poligoni Bremia lactucae Pseudoperonospora humili Uromyces phaseoli Uromyces pisi Hemileia vastatrix Ustilago maydis Ustilago scitaminea ordem Erysiphales Erysiphales Peronosporales Peronosporales Uredinales Uredinales Uredinales Ustilaginales Ustilaginales nome da doena mildio pulverulento da ma mildio pulverulento do feijoeiro mildio brando da alface mildio brando do lpulo ferrugem do feijoeiro ferrugem da ervilha ferrugem do cafeeiro carvo do milho carvo da cana de acar

Por outro lado, os fungos, por viverem em ambientes diferentes, apresentam grandes diferenas quanto s suas necessidades nutricionais. Por esta razo, no existe um meio de cultura universal capaz de ser utilizado para todos os fungos. O meio de cultura ideal naturalmente o que mais se assemelha ao substrato no qual o fungo ocorre na natureza. Apesar de todas estas desvantagens, pode-se aprender muito sobre um determinado fungo quando cultivado em um meio de cultura artificial. Atravs do isolamento de culturas obtidas em meios de cultura podemos comprovar, por exemplo, a patogenicidade de um fungo fitopatgeno, isolando-o, inoculando-o e reisolando-o (Postulado de Koch). Podemos tambm, realizar importantes estudos sobre fisiologia, bioqumica, gentica, controle biolgico, influncia de vrios fatores (pH, temperatura, nutrientes, etc.) sobre o crescimento e reproduo, efeito de substncias como fungicidas e muitos outros. As caractersticas apresentadas pelas colnias fngicas puras em meios de cultura, tais como: cor, dimetro, aspecto, bem como por suas estruturas (esporos, hifas, conidiforos, etc.), constituem elementos vitais no reconhecimento e identificao dos fungos. Meios de cultura constitudos de compostos quimicamente definidos so denominados meios sintticos. Como conseqncia da definio, as substncias qumicas presentes e a concentrao qumica destas no meio de cultura so conhecidas. Por outro lado, meios de cultura que contenham extrato de levedura, peptona ou outras substncias no quimicamente definidas ou material vegetal ou, at mesmo, animal (sangue, por exemplo) so denominados de meios naturais. Conseqentemente, as substncias qumicas presentes e a concentrao destas, neste meio de cultura, no so conhecidas exatamente. O crescimento fngico nos meios naturais , geralmente, muito melhor do que em meios sintticos, contudo, tm a desvantagem de no poderem ser repetidos indefinidamente e exatamente iguais aos utilizados em experimentos anteriores. Por outro lado, os meios sintticos proporcionam maiores informaes sobre, por exemplo, os requerimentos nutricionais de um certo fungo, uma vez que apresentam a possibilidade de se poder alterar a composio qumica do meio sob condies controladas, isto , existe a possibilidade de serem acrescentados outros nutrientes, permite o aumento ou diminuio

da quantidade dos compostos originais ou, ainda, possibilita a substituio das fontes de nutrientes originais por outras. Os meios de cultura podem, ainda, ser lquidos ou slidos. Os meios slidos so, algumas vezes, Considerados mais naturais do que os lquidos uma vez que uma grande parte dos substratos naturais de muitos fungos apresentam consistncia slida, por exemplo, madeira, tecidos vegetais ou animais e solo. Para solidificar um meio de cultura podem ser utilizados gelatina, agar ou silicagel. A gelatina foi o primeiro agente solidificante a ser usado em meios de cultura, contudo, apresenta algumas desvantagens como a de se liqefazer a 23C e poder ser utilizada como fonte de carbono e nitrognio por inmeros fungos no sendo, assim, satisfatria para experimentos nutricionais. Em laboratrio de micologia, a fim de diminuir os custos na elaborao de meios de cultura, pode-se utilizar uma mistura de gelatina e agar para uma solidificao adequada do meio. Entretanto, devem ser realizados testes a fim de verificar a ocorrncia de alguma alterao na cultura fngica ou mesmo no meio aps crescimento fngico. Ainda, meios contendo esta mistura de agentes solidificantes devem ser estritamente utilizados para a multiplicao de culturas fngicas. O agar o agente solidificante mais adequado e mais utilizado em meios de cultura. Geralmente, o agar acrescentado na proporo de 1,5 a 2% para solidificar os meios. O meio de cultura contendo agar, aps esterilizao, apresenta a vantagem de no se liqefazer at alcanar a temperatura de 100C. Esta a propriedade mais importante uma vez que torna o meio utilizvel em um amplo espectro de temperatura, possibilitando a realizao de experimentos com fungos em vrias temperaturas. Aps liquefao, permanece em estado lquido, durante o processo de esfriamento, at cerca de 45C. Esta outra propriedade facilita a distribuio dos meios de cultura para outros recipientes, aps autoclavagem, ou ainda, a adio de substncias termolbeis que no suportariam temperaturas mais altas (50 a 100C). O agar uma mistura complexa de polissacardeos extrados de espcies de algas vermelhas (Gelidium, Gracilaria, Pterocladia, Acanthopeltis e Ahmfeltia). O agar uma galactana contendo grupos hidroxlicos esterificados com cido sulfrico, solvel em gua quente mas insolvel em gua fria. No agar existem dois polissacardeos predominantes a agarose e a agaropectina que afetam particularmente sua performance nos meios de cultura. A agarose responsvel pelas propriedades de gelificao enquanto que a agaropectina pelas propriedades de viscosidade. No utilizado pelos fungos como fonte de nutrientes, contudo, por ser um produto natural extrado de algas, pode conter muitos contaminantes como micronutrientes, vitaminas e inibidores do crescimento. Nos casos de experimentos de alta preciso na rea de bioqumica ou mesmo fisiologia de fungos pode ser utilizado um agar mais purificado, para solidificar o meio, como por exemplo o agar nobre ou, rigor, usar meio sem adio de agar, isto , meio lquido. De acordo com Lilly, meios lquidos acrescidos de agar no so classificados como meios sintticos, mas como semi-sintticos (tabela 2). Contudo, o agar grau bacteriolgico adequado para a grande maioria dos meios de cultura slidos para aplicaes micolgicas.

Tabela 2. Caractersticas do agar (Oxoid Ltd.). Concentrao de substncias SO4 N2 total Ca Mg Fe 1 Tcnico (n 3) 1,7 % 0,1 % 400 ppm 100 ppm Bacteriolgico (n 1)1 0,9 % 0,1 % 100 ppm 40 ppm 2 Purificado 0,7 % 0,1 % 100 ppm 70 ppm 10 ppm 1: recomendado para meios de cultura e 2: recomendado para imunoeletroforse e difuso em gel (pode ser usado em meios de cultura) Tipo de agar Por outro lado, em meios de cultura de rotina em laboratrios de micologia, pode ser utilizado um tipo de agar com menor ndice de purificao como, por exemplo, o agar alimentcio a fim de diminuir os custos na elaborao de meios de cultura. Contudo, deve-se prestar ateno, pois a adio deste tipo de agar aos meios de cultura pode afetar o crescimento dos fungos. ons metlicos livres (Ca, Mg e Fe), em altas concentraes, podem reagir com sais de fosfato formando precipitados insolveis e, portanto, tornando alguns nutrientes essenciais indisponveis para o crescimento fngico. A silicagel (NaSiO3) um material inorgnico que pode ser usado como agente solidificante de meios de cultura, entretanto, o seu uso no se tornou comum, a despeito do desenvolvimento de tcnicas de rotina para a preparao de meios, por ser um material de difcil manipulao. Meios de cultura lquidos so mais adequados para experimentos que requerem, por exemplo, a determinao de peso seco micelial (uma das formas de avaliar crescimento fngico) ou, ainda, naqueles onde h necessidade de quantificar as alteraes provocadas na composio qumica do meio durante o perodo de incubao do fungo (utilizao de um nutriente ou produo de uma substncia pelo fungo). Por outro lado, os meios slidos so mais adequados para estudos que tem por finalidade, por exemplo, verificar as alteraes provocadas na forma da colnia fngica, na densidade de esporulao ou mesmo nas alteraes provocadas nas estruturas reprodutivas e vegetativas do fungo. Ainda, nos meios slidos o crescimento pode ser avaliado atravs do dimetro da colnia fngica. DETERMINAO E AJUSTE DO PH A determinao do pH de um meio de cultura pode ser realizada atravs de duas formas utilizando: a. papel indicador de pH b. potencimetro O papel indicador de pH muito utilizado por no envolver alto custo e por facilitar bastante a operao de medio e ajuste, embora, a preciso seja menor. Entretanto, pode-se melhorar a preciso nas leituras de pH feitas com papel indicador utilizando diferentes papis para faixas mais estreitas de pH. Na atualidade, o potencimetro tem sido utilizado com maior freqncia na determinao do pH por apresentar um custo no muito alto e por existirem modelos de bolso que facilitam o seu transporte. A determinao e, mesmo o ajuste do pH de meios de cultura feito aps sua elaborao e, antes de acrescentar o agar, no caso de meios slidos.

Geralmente, os meios de cultura apresentam reao cida (isto depende basicamente da gua e de alguns nutrientes usados para elaborar o meio) e, portanto, basta acrescentar alguns mililitros de uma soluo de NaOH ou KOH (geralmente, na concentrao de 1 N) para neutraliz-los. Quando o meio de cultura apresentar reao bsica, acrescentar HCl (geralmente, na concentrao de 1 N) para neutraliz-lo. Em geral, durante a esterilizao do meio de cultura, por autoclavagem, ocorre uma queda do pH de cerca de 0,1 a 0,3 unidades. Devido a isto, para trabalhos que requerem uma determinao mais precisa necessrio realizar a leitura do pH aps a esterilizao do meio de cultura. Quando se deseja acidificar um meio de cultura para um pH abaixo de 5,0 deve-se acrescentar um volume conhecido de uma soluo cida, aps a esterilizao , pois do contrrio o agar no provocar a solidificao perfeita do meio. A elaborao de meios de cultura envolvem basicamente as seguintes etapas: a. cada substncia qumica deve ser dissolvida completamente, em um volume apropriado de gua destilada, antes de ser adicionada outra substncia. b. determinar o pH, ajustando-o, se for necessrio, para o pH desejado, acrescentando soluo bsica ou cida. Geralmente, os meios de cultura para fungos no necessitam de ajuste de pH uma vez que estes toleram uma ampla faixa de pH (2 a 9). No entanto, um ajuste para um pH entre 4 e 7 mais adequado. c. o meio distribudo em frascos adequados (erlenmeyer, balo ou tubo de ensaio) cujas bocas devem ser fechadas com tampo de algodo hidrfobo. No encher completamente o frasco, isto , para um frasco com capacidade de 500 ml, colocar no mximo 300 ml de meio (aproximadamente 2/3 da capacidade do frasco). Acrescentar agar quando desejar meio slido. d. o meio de cultura esterilizado em autoclave, na maioria da vezes, e redistribudo temperatura de cerca de 45C para placas de Petri em ambiente assptico (cmara de fluxo laminar ou cmara assptica dotada de luz UV). ESTERILIZAO Uma vez que os meios so preparados para cultivar fungos em cultura pura, todos os microorganismos estranhos ao que se deseja cultivar devem ser eliminados. Para isto, h necessidade de esterilizar o meio de cultura, antes de utiliz-lo, a fim de eliminar todos os microorganismos que tenham contaminado o meio durante a sua elaborao ou mesmo contaminantes presentes no recipiente onde so preparados os meios. A esterilizao definida como um processo de destruio ou eliminao completa de todos os microorganismos de um material ou de um ambiente de trabalho. Atravs da esterilizao dos meios de cultura e do instrumental usado nos trabalhos micolgicos possvel o isolamento e a manuteno de culturas fngicas puras. A esterilizao pode ser alcanada atravs de processos fsicos e qumicos. Os processos fsicos envolvem geralmente o emprego do calor e da filtrao para esterilizao dos meios de cultura. Outros agentes fsicos como luz ultravioleta (UV), raios X e gama no so utilizados para a esterilizao dos meios de cultura, mas podem ser empregados em situaes bastante especficas. A luz UV tem amplo emprego na esterilizao de pequenas reas de trabalho onde

manipulam-se meios de cultura esterilizados ou culturas fngicas (cmara de fluxo laminar e cmara assptica) e os raios gama, por exemplo, na obteno de mutantes em fungos. Os processos prticos nos quais so empregados o calor podem ser divididos em duas categorias: calor seco e calor mido. A. CALOR SECO A esterilizao por calor seco recomendada quando o contato direto ou completo do vapor de gua sob presso (calor mido) com o material a ser esterilizado pode danific-lo, como por exemplo, leos. 1. FORNO ELTRICO O forno eltrico utilizado para a esterilizao de vidraria em geral como: placas de Petri, pipetas, bquer, erlenmeyer e outros produtos que no so prejudicados por altas temperaturas. Materiais ou instrumentos que no suportam altas temperaturas por longos perodos de tempo como os meios de cultura e objetos de borracha devem ser esterilizados atravs de outros processos. O calor seco menos eficiente como agente esterilizante do que o calor mido e, portanto, para obter resultados satisfatrios h necessidade de aumentar a temperatura e prolongar o tempo de esterilizao. A vidraria esterilizada, geralmente, temperatura de 160 a 180C durante 1 a 2 horas. Entretanto, outras relaes temperatura-tempo podem ser utilizadas (tabela 3). Tabela 3. Temperatura e tempo necessrios para a esterilizao de vidrarias em forno eltrico*. Temperatura (C) Tempo de exposio (minutos) 170-180 60 160 120 150 150 140 180 121 1 dia ou 1 noite * extrado de Tuite (1969) 2. FLAMBAGEM A flambagem consiste no aquecimento direto do material a ser esterilizado em uma chama de bico de Bunsen. O mtodo de flambagem utilizado para alas de inoculao, extremidade de pipetas, boca de tubo de ensaio, bisturis e alas de Drigalsky.

B. CALOR MIDO 1. AUTOCLAVE O calor produzido por uma autoclave, sob a forma de vapor de gua sob presso, o agente esterilizante mais utilizado em laboratrios de micologia. A autoclave proporciona a obteno de temperaturas mais elevadas que as obtidas por fervura da gua (100C). A autoclave consiste basicamente de uma cmara de vapor com parede dupla, equipada com dispositivos que permitem o enchimento da cmara de esterilizao com vapor de gua e a manuteno em determinada temperatura e presso por perodos de tempo relativamente longos. Ao utilizar a autoclave absolutamente necessrio que o ar existente na cmara de esterilizao seja completamente substitudo por vapor de gua. Persistindo o ar, a temperatura alcanada no interior da cmara ser consideravelmente menor do que se houvesse vapor de gua sob a mesma presso e, conseqentemente, o meio no seria esterilizado. No entanto, no a presso que provoca a destruio dos microorganismos contaminantes, mas sim a alta temperatura do vapor da gua. A autoclave um equipamento extremamente essencial em laboratrios de micologia, no somente para a esterilizao de meios de cultura, solo, como tambm, para a eliminao de placas de Petri contendo fungos patognicos e no patognicos a serem descartados. Geralmente, a autoclave utilizada numa presso de 1 atm (Tabela 4) durante um perodo de tempo de 15 a 20 minutos para a esterilizao de meios de cultura. O tempo de esterilizao depende da natureza e do volume do material a ser esterilizado (Tabela 5). Tabela 4. Relao aproximada entre presso do vapor de gua e temperatura. presso libras/pol 5 15 20 atm 0 1 2 C 109,0 121,5 126,5 temperatura F 228 251 260

Tabela 5. Tempo requerido para esterilizao de lquidos em autoclave de acordo com o volume do material Capacidade do recipiente* Tempo de exposio em minutos (121C e 1 atm) 1000 ml 20-25 500 ml 17-22 200 ml 12-15 125 ml 12-14 * erlenmeyer contendo lquido at a metade ou at 2/3 da capacidade (Tuite, 1969)

Frascos contendo meios de cultura ou lquidos a serem esterilizados, no devem ser cheios totalmente, mas serem cheios de a de sua capacidade. Este procedimento evita que os tampes sejam molhados internamente, durante a autoclavagem e, tambm, que resduos qumicos do algodo contaminem o meio ou lquido, alterando sua composio. Alguns materiais, porm, no podem ser esterilizados por autoclavagem. Substncias no miscveis com a gua, por exemplo leos, no so atingidos pelo vapor de gua sob alta temperatura e, portanto, os microorganismos neles contidos podero sobreviver. Por outro lado, algumas substncias so alteradas ou destrudas por tratamento trmico intenso e, portanto, recomenda-se a utilizao de outro mtodo de esterilizao. Os acares so, especialmente, suscetveis a uma quebra qumica chamada de caramelizao (reao complexa entre acares e aminocidos) resultando em um meio de colorao marrom, o que em determinados casos pode dificultar a visualizao de algum pigmento produzido pelo fungo e excretado para o meio. Os fosfatos podem reagir com a glicose convertendo-a em cetose e a tiamina sensvel ao calor. Interaes qumicas entre os componentes do meio de cultura podem ser evitadas esterilizando, separadamente, os componentes suscetveis. Aps a esterilizao, o contedo de um frasco pode ser adicionado ao outro, assepticamente. Calor mido mais eficiente na eliminao de microrganismos que o calor seco pois tem maior poder de penetrao e, tambm, porque as reaes qumicas como por exemplo a termocoagulao de protenas catalisada pela gua. 2. ESTERILIZAO FRACIONADA (TINDALIZAO) Alguns meios de cultura e substncias qumicas sofrem alteraes quando submetidos temperaturas acima de 100C. Contudo, se suportarem temperaturas mais baixas (56 a 80C) possvel esteriliz-los atravs do processo de esterilizao fracionada. Algumas substncias que so adicionadas aos meios de cultura podem sofrer decomposio em temperaturas mais elevadas como o soro sanguneo que coagula a 65C. O processo envolve o aquecimento descontnuo do material durante 3 dias consecutivos por um determinado perodo de tempo, intercalados com perodos de incubao. Os esporos resistentes ao calor germinaro durante os perodos de incubao e na subsequente exposio ao calor as clulas vegetativas sero destrudas. Em geral, utiliza-se o aparelho de Arnold (banho-maria) neste processo de esterilizao, mas tambm possvel empregar a autoclave com vapor fluente (100C) (a vlvula de escape do vapor de gua dever permanecer totalmente aberta). C. FILTRAO Alguns produtos ou substncias que podem ser adicionados aos meios de cultura, particularmente, soros animais, algumas vitaminas, enzimas e antibiticos so termolbeis, isto , so destrudos pela ao do calor e, portanto, devem ser esterilizados pelo processo de filtrao.

A filtrao consiste em passar uma soluo destas substncias atravs de uma membrana porosa que retm os microorganismos contaminantes. Este processo no causa destruio dos microorganismos contaminantes, mas atua retendo-os na membrana. Os filtros de membrana (tipo Millipore) apresentam poros com dimenses uniformes, especficas e predeterminadas. As membranas so compostas de steres inertes de celulose. Os filtros de membrana so tambm muito utilizados em tcnicas microbiolgicas para a identificao e contagem de microorganismos presentes na gua. O processo de esterilizao por filtrao consiste em forar a passagem da soluo atravs da membrana aplicando-se uma presso negativa no frasco de filtrao (kitasato) por meio de uma bomba de vcuo. Concludo o processo de esterilizao por filtrao so tomados precaues para evitar a recontaminao da soluo ao ser transferida para o meio de cultura ou outros frascos. D. OUTROS PROCESSOS Os mtodos abaixo no so usados propriamente na esterilizao de meios de cultura ou instrumentos micolgicos, mas em condies bastante especficas e auxiliares manipulao de meios ou fungos. 1. QUMICO O agente qumico xido de propileno ou xido de etileno so freqentemente utilizados devido a sua volatilidade e a facilidade de ser prontamente eliminado aps o tratamento do material a ser esterilizado. Por exemplo, para verificar a resistncia de uma srie de variedades de abacaxi ao fungo fitopatgeno, Fusarium sp, as folhas da planta podem ser esterilizadas com xido de propileno. Este processo de esterilizao no provoca qualquer alterao qumica nas folhas do abacaxi. Este procedimento utilizado na esterilizao de substncias lbeis ao calor e tecidos vegetais ou em situaes onde o uso de vapor de gua (autoclave) inadequado. Contudo, os agentes qumicos devem ser manipulados cuidadosamente e utilizados com restries pois podem provocar algumas alteraes no material a ser esterilizado e tem ao lenta. Placas de Petri de plstico podem ser esterilizadas com estes agentes qumicos sem problemas. 2. RADIAES O raio X um tipo de radiao ionizante no utilizada no controle microbiano por no ter utilidade prtica em laboratrio micolgico devido aos seguintes fatores: sua produo em quantidade onerosa e a aplicao de forma eficiente dificultada porque a radiao dirigida em todas as direes a partir do seu ponto de origem. Os raios gama so radiaes do tipo ionizante de alta energia e alto poder de penetrao como o raio X. So utilizadas em pequena escala na indstria de alimentos (alimentos embalados) e na indstria farmacutica uma vez que este tipo de radiao produz relativamente pouco calor no material irradiado ( chamada de esterilizao a frio) sendo, assim, possvel esterilizar produtos farmacuticos termolbeis.

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A luz UV uma radiao do tipo no ionizante com pouca energia e baixo poder de penetrao. A luz UV utilizada nas salas asspticas ou capela de fluxo laminar para manipulao de meios de cultura ou fungos e na indstria para tratamento de superfcies contaminadas por microorganismos. Antes e depois de qualquer trabalho na sala assptica, ligar a luz UV por 30 minutos (durante o trabalho a luz UV dever estar desligada). Como medida auxiliar, a sala assptica ou a capela de fluxo laminar deve ser previamente limpa com solues de lcool, formol ou hipoclorito de sdio. LITERATURA RECOMENDADA BLACK, J.G. Microbiologia Fundamentos e Perspectivas. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan. 2002. BROCK, T.D., MADIGAN, M.T., MARTINGO, J.M. & PARKER, J. Biology of Microorganisms. New Jersey, Prentice Hall. 1994. FUNDER, S. Practical Mycology. Manual for Identification of Fungi. Oslo, Broggers Boktr. Forlag. 1953.. PELCZAR, Jr., M.J., CHAN, E.C.S. & KRIEG, N.R. Microbiologia. Vol. 1. Conceitos e Aplicaes. So Paulo, Makron Books do Brasil Editora Ltda. 1996. TUITE, J. Plant Pathological Methods. Fungi and Bacteria. Minnesotta, Burgess Publishing Co. 1969