Cultivo in vitro

Que es?

Es el cultivo en un medio nutritivo, en condiciones estriles Permite la propagacin de grandes volmenes de plantas en menor tiempo

Principales usos
Floricultura. Investigacin (preservacin investigacin bsica). Industria Farmacutica (Investigacin de metabolitos secundarios) Industria Alimenticia (clonacin de organismos con caractersticas ideales).

Historia
En 1904 Hanning desarroll un nuevo mtodo de cultivo de plantas al que se llam cultivo de embriones. Aisl in vitro embriones inmaduros de algunos miembros de la familia Crucferas, obteniendo plntulas viables.

En orquideas
Las semillas de orqudeas se encuentran muy poco desarrolladas aun cuando estn maduras, por lo tanto requieren de la infeccin fngica para su germinacin y desarrollo en la naturaleza.

 El papel de la micorriza para la germinacin de las semillas de orqudeas fue descubierto por Noel Bernard en 1899 y sent las bases para la germinacin simbitica in vitro.

 El mtodo asimbitico fue desarrollado en 1922 por Knudson en el que observ que era posible la germinacin in vitro sin la presencia fngica (Ammirato et al., 1990).

 La germinacin in vitro de semillas puede promover altos porcentajes de germinacin a diferencia de la naturaleza donde menos del 10% de las semillas germina. Cuando la semilla germina, a partir del embrin se forma un cuerpo llamado protocormo, el cual dependiendo de la especie desarrolla primero las partes areas y posteriormente las races, en estos casos el protocormo es denominado tipo cattleya

Medio de cultivo Murashige y Skoog (MS)

El medio de cultivo formulado por Murashige y Skoog (1962) es el ms popular para las formulaciones nutritivas para el crecimiento vegetal.
El contenido mineral del medio est basado en el anlisis de las cenizas del tejido incinerado de tabaco.

Caractersticas
Los componentes del medio de cultivo estn divido en cuatro categoras: Macroelementos Microelementos Vitaminas Aminocidos

Macronutrientes: Nitrgeno (N), potasio (K), calcio (Ca), fsforo (P) magensio (Mg) y azufre (S). Micronutrientes: Fierro (Fe), sodio (Na), cloro (Cl), manganeso (Mn), zinc (Zn), boro (B), cobre (Cu), molibdeno (Mo) y posiblemente niquel (Ni).

Macronutrientes
El N es esencial para el crecimiento y desarrollo vegetal, es constituyente de aminocidos y protenas, cidos nucleicos, clorofila y hormonas. Fsforo es abundante en tejido en crecimiento y meristemtico y es esencial para la fotosntesis y respiracin, es adicionado al medio en forma monobsica o dibsica KH2PO4

 Potasio ayuda a mantener un potencial osmtico adecuado dentro de las clulas, el K afecta los flujos de otros elementos como el nitrgeno, carbono y fsforo. Magnesio es esencial como componente de la clorofila y utilizado para la actividad de numerosas enzimas especialmente involucradas en la transferencia de fosfato

 Azfre es absorbido en forma oxidada, pero es incorporado a los diferentes compuesto qumicos en forma reducida SH, -S, -S-S- , se emplea para la sntesis de lpidos y al regular la estructura de las protenas, sirve como ligando de protenas que contienen metales

 Calcio ayuda al balance inico dentro de la planta, est involucrado en las propiedades estructurales y fisiolgicas de las membranas celulares y de la pared celular.

Micronutrientes
Manganeso participa en la definicin de la estructura de las metaloprotenas involucradas en la fotosntesis.
Zinc tiene una accin sobre la DNA y en la estructura de las protenas.

 Boro esta involucrado en la sntesis de lignina y en el metabolismo de los cidos fenlicos.

Cobre es necesario para numerosas reacciones, se aade al medio de cultivo en muy baja cantidad (0.1M) debido a que puede resultar muy txico

Los restantes
Molibdeno Cobalto Yodo Cloro Calcio Sodio Nquel Aluminio Fierro

Vitaminas
Las vitaminas son compuestos que requeridos en muy pequeas cantidades como factores auxiliares, la ausencia de stas limita el crecimiento y desarrollo anormal.

Las vitaminas adicionadas al medios

Tiamina (Vitamina B1) cido Nicotnico (niacina) Piridoxina (Vitamina B6) myo-Inositol

Fuentes de Carbono
Las clulas in vitro no pueden llevar a cabo una fotosntesis normal por lo que no pueden tener una condicin auttrofa, por tanto es necesario adicionar una fuente de carbono. La sacarosa es la forma de azcar ms comnmente trasportada en las plantas

pH del medio
El pH del medio de cultivo debe ser aquel que no altere el funcionamiento de las membranas celulares o el interior del citoplasma ya que el pH altera procesos metablicos. pH 5.7

Materiales de Soporte
Entre los materiales de soporte mas empleados tenemos: Agar Agarosa Gelrite Phytagel

Agar
El agar es producto natural extrado de varias especies de algas rojas (rodfitas) Este el agente gelificante ms empleado debido a que: -Se mezcla con el agua y forma un gel que se funde a casi 100 C y solidifica a 45 C , esto significa que es estable a las temperaturas de incubacin -El gel no es digerido por las enzimas vegetales -El agar no reacciona con los constituyentes del medio de cultivo.

Tipos de capsula
Capsula verde, este tipo de capsula no se ha abierto, esto quiere decir que en su interior ,las semillas se encuentran libres de contaminantes, por lo tanto solo deben de ser esterilizadas por fuera con alcohol y cloro, se introduce la capsula en la campana previamente estril y ah se abre para acceder a las semillas

 Capsula seca, este tipo de capsula se abri con el fin de liberar las semillas, eso quiere decir que las semillas se encuentran contaminadas, hay varios mtodos para desinfectar semillas, en general se requiere de una membrana para evitar que las semillas se dispersen en el medio de desinfeccin,

Diagrama de flujo de cultivo in vitro

rea de trabajo
Desinfectar con alcohol al 96 o 70 Limpiar los mechero, prenderlos e introducirlos

Material
Desinfectar con alcohol e introducir al rea de trabajo No sacar los materiales que ya se desinfectaron

Colocarse la bata, pelo recogido, sin pulseras o relojes

Rociarse alcohol y meter las manos al rea de trabajo (no tener contacto con los mecheros)

Flamear las pinzas y dejar que se enfren, no hacer movimientos bruscos

Flamear la orilla de los frascos y destapar del que se toma la plntula y el nuevo

Colocar el platico adherente, nombre de la especie y la fecha

Flamear la orilla del frasco y la tapa, cerrar cada uno

Tomar con las pinzas la planta y llevarla al otro frasco sin hacer movimientos bruscos