Produksi Ekstraseluler Anti-leukemia Enzim L-asparaginase dari Actinomycetes Laut oleh solidstate dan Submerged Fermentasi: Pemurnian dan

Karakterisasi

abstrak Tujuan: Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengisolasi actinomycetes kelautan, layar mereka untuk Lasparaginase aktivitas dan karakterisasi enzim. Metode: actinomycetes Kelautan diisolasi dari sampel sedimen yang diperoleh dari Tamilnadu dan Kerala di India. Isolat diidentifikasi sebagai aktinomisetes dengan tes mikroskopis dan biokimia. Produksi L-asparaginase dilakukan di tiga media yang berbeda, yaitu, solid-state media, Trypton Glukosa Yeast ekstrak (TGY) kaldu dan Trypton Fruktosa ekstrak Ragi (TFY) kaldu itu enzim dimurnikan untuk homogenitas dekat dengan pengendapan amonium sulfat, dialisis, filtrasi gel pada Sephadex G-100 kolom dan SDSPAGE. Hasil: Di antara 10 isolat laut mengalami skrining awal, hanya isolat S3, S4 dan K8 menunjukkan potensi L-asparaginase aktivitas. Semua tanah kelautan tiga isolat disintesis asparaginase dengan hasil berkisar 24,6-49,2 IU / ml. Tanah mengisolasi S3 menunjukkan produktivitas tertinggi 49,2 IU / ml dengan kandungan protein 65 ug / ml dan aktivitas optimum pada pH 7,5 dan 50 C. Nilai Km jelas untuk substrat adalah 25 pM. Mg2 + ion sedikit menstimulasi aktivitas sementara Cu2 +, Zn2 + dan EDTA telah dihambat. Kesimpulan: Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktinomisetes laut dapat menjadi sumber potensi hasil tinggi, substrat yang tinggi spesifisitas L-asparaginase, yang merupakan agen anti-leukemia. Kata kunci: L-asparaginase, Solid-state media, TGY kaldu, kaldu TFY, SDS-PAGE, Km dan Vmax.

PENDAHULUAN Mikroba laut merupakan sumber potensial untuk bioaktif penting secara komersial compounds1, 2. Di antara kelautan mikroorganisme, aktinomisetes telah mendapatkan khusus penting sebagai sumber yang paling ampuh antibiotik dan sekunder bioaktif lainnya metabolites3. Sementara sebagian besar studi tentang actinomycetes telah berfokus pada antibiotik produksi, hanya beberapa laporan telah berdiam di mereka enzimatik potential4. Penemuan L-asparaginase (Lasparaginase aminohydrolase, E.C.3.5.1.1), agen obat untuk pengobatan tumor ganas, dibuat pada tahun 1922 5. Clementi menunjukkan bahwa marmot serum berisi aktivitas tinggi dari L-asparaginase5, sementara Mashburn dan Wriston berhasil

dimurnikan Escherichia coli L-asparaginase dan menunjukkan tumor-hambat activity5 nya. L-asparaginase mengubah L-asparagine untuk Laspartic acid. Sejak beberapa jenis tumor sel membutuhkan L-asparagine untuk protein sintesis, mereka kehilangan sebuah penting faktor pertumbuhan di hadapan Lasparaginase. Efektif menipisnya Lasparagine

Hasil di sitotoksisitas untuk leukemia cells5 tapi sejauh ini, tumor aktivitas inhibisi telah ditunjukkan hanya dengan asparaginases dari E. coli, Erwinia aroideae dan Serratia marcescens6. Itu administrasi seperti protein enzim untuk durasi yang panjang, secara umum, menghasilkan sesuai antibodi dalam jaringan, menyebabkan syok anafilaksis atau netralisasi efek obat. Oleh karena itu, penggunaan Lasparaginase serologis berbeda baru dengan efek terapi yang sama sangat desirable7. Sampai sekarang, L-asparaginase diproduksi oleh teknik fermentasi terendam. Namun, solid-state fermentasi (SSF) adalah lebih efektif teknik sebagai hasil dari produk beberapa kali lebih tinggi dari terendam fermentasi (SF). Ia juga menawarkan banyak keuntungan lainnya, termasuk resistensi kontaminasi, kemudahan ekstraksi produk dan sederhana metode untuk mengobati difermentasi residue8. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengisolasi Lasparaginase dari aktinomisetes laut oleh solid-state fermentasi dengan menggunakan bungkil kedelai dan terendam fermentasi serta parsial pemurnian, dan karakterisasi minyak mentah ekstrak enzim.

EKSPERIMENTAL Bahan Sampel sedimen laut dikumpulkan dari situs yang berbeda di Tamilnadu dan Kerala, India pada kedalaman 10 cm pada Mei 2007 dan ditempatkan dalam kantong polythene yang baru, dengan menggunakan steril spatula, sebelum analisis laboratorium. Pati, kasein, ekstrak ragi, pepton, l-asparagin, bungkil kedelai, ekstrak daging sapi, akrilamida, bisacrylamide, bovine serum albumin dan commassie brilian biru G-250 adalah dibeli dari Hi-media (Mumbai, India). Sephadex G-100 diperoleh dari Sigma- Aldrich, Jerman, sementara asam trikloroasetat dibeli dari E. Merck Ltd, Mumbai, India. Semua bahan kimia lainnya yang analitis kelas dan digunakan tanpa modifikasi lebih lanjut. Pengayaan dan isolasi kelautan mikroorganisme Satu gram sedimen dipindahkan ke kerucut botol berisi 100 ml steril air laut broth9 kompleks, pati steril kasein kaldu dan glukosa agar asparagin disusun water10 laut alami untuk preenrichment yang sampel. Labu adalah diinkubasi pada 30 C selama 14 hari dalam shaker inkubator. Sebuah loopful inokulum tersebut dari pra-diperkaya kaldu air laut yang kompleks, pati kasein kaldu atau glukosa adalah kaldu asparagin melesat pada agar-agar air laut yang kompleks (SWC), pati kasein agar (SCA) dan glukosa asparagin agar, dan plat

diinkubasi pada 30 C selama 7 hari. Tunggal diskrit koloni diisolasi dan digunakan untuk identifikasi. Karakterisasi isolat tanah laut Koloni terisolasi diidentifikasi dengan menggunakan Standar Internasional Streptomyces Proyek (ISP) procedure10. Morfologi identifikasi koloni terisolasi dilakukan oleh pewarnaan sederhana, pewarnaan Grams dan motilitas pengujian dengan menggantung penurunan method11. Karakterisasi biokimia adalah dengan Produksi melanoid test menggunakan Waksman media pada suhu inkubasi 37 C selama 4 hari untuk mendeteksi pigmen memproduksi milik isolat; nitrat organik Uji reduksi dilakukan di organik nitrat kaldu pada suhu inkubasi 37 C selama satu minggu untuk mendeteksi nitrat mengurangi milik isolat; produksi asam Uji dilakukan dalam kaldu glukosa nutrisi pada suhu inkubasi 20 C selama 15 hari untuk mendeteksi fermentasi glukosa menyebabkan produksi asam; hidrogen sulfida tes produksi dilakukan di SIM Agar pada suhu inkubasi 37 C selama 5 hari, sedangkan uji pencairan gelatin dilakukan di gelatin nutrisi pada inkubasi suhu 37 C selama 24 48 jam untuk deteksi gelatin hidrolisis sifat isolates12. Skrining tanah isolat untuk Lasparaginase produksi dengan cepat-plate assay Isolat disaring untuk asparaginase Aktivitas menggunakan metode Gulati et al13. Itu media yang digunakan telah dimodifikasi M-9 Media digabungkan dengan indikator pH (merah fenol). L-asparaginase aktivitas yang diidentifikasi oleh pembentukan zona merah muda di sekitar koloni. Dua piring kontrol juga disusun dengan menggunakan dimodifikasi M-9 media - satu adalah tanpa pewarna sementara yang lain adalah tanpa asparagin. Mentah produksi enzim Enzim kasar disiapkan oleh metode solid-state fermentasi (SSF) dan terendam fermentasi (SF) Solid-state fermentasi (SSF) metode Media fermentasi terdiri dari 5 g bungkil kedelai dan 10 ml 0,1 M natrium dapar fosfat (pH 7,0) dalam suatu tabung 250 ml. Para termos yang diautoklaf selama 15 menit pada 121 C dan tekanan 15 lb, kemudian didinginkan dan diinokulasi dengan 3 ml dari sebelumnya disiapkan suspensi bakteri. Itu diinkubasi pada 37 C selama 4 hari tanpa gemetar dan enzim kasar diendapkan di akhir fermentasi dengan penambahan 90 ml dari buffer fosfat 0,1 M natrium (pH 7,0) diikuti dengan sentrifugasi pada 8000 rpm selama 20 min 8. Submerged fermentasi (SF) metode Sejumlah (100ml) Glukosa Trypton Ekstrak ragi (TGY) kaldu (media produksi, pH 7,0) yang terdiri dari glukosa, 0.1g, K2HPO4, 0,1 g; ekstrak ragi, 0,5 g; Trypton, 0,5 g; air, sampai 100 ml, dan terkandung dalam 250 ml Erlenmeyer termos, diinokulasikan secara terpisah dengan isolat tanah dan diinkubasi pada - 28 C dalam shaker inkubator-berosilasi pada 200 putaran / menit selama 24 jam. Pada akhir periode fermentasi, enzim mentah disiapkan oleh sentrifugasi pada 10000 rpm selama 20 menit. Supernatan sel-bebas diambil sebagai enzyme14 mentah. Demikian pula, 100ml Trypton Fruktosa Ragi ekstrak (TFY) kaldu (media

produksi, pH 7,0) terdiri dari Trypton, 0,5 g; ragi ekstrak, 0,5 g, fruktosa, 0,1 g; kalium dihidrogen fosfat, 0.1g, dan air, untuk 100 ml juga diinokulasi dengan tanah isolat dan diinkubasi pada - 28 C dalam shakerincubator berosilasi pada 200 putaran / menit selama 24 jam. Enzim kasar disiapkan oleh sentrifugasi pada 10000 rpm selama 20 min15. Protein penentuan Kadar protein ditentukan menurut metode Lowry et al16. Sebuah larutan stok protein standar, bovine serum albumin (BSA), pada konsentrasi 1000 mg / ml adalah dibuat. Dari solusi ini, 0,2 sampai 1 ml bekerja larutan standar pada konsentrasi 100 mg / ml diambil dalam tabung reaksi. Itu Volume dibuat sampai dengan 1 ml dengan suling air untuk memberikan konsentrasi mulai dari 20 sampai 100 mg / ml. 1 ml reagen cocatteau folins ditambahkan ke masing-masing tabung reaksi. Setelah 30 menit dari inkubasi, absorbansi diukur pada 660 nm menggunakan UV berkas ganda terlihat spektrofotometer (model SL 164, Elico, Hyderabad, India), dan kadar protein ditentukan. Penentuan L-asparaginase aktivitas Metode yang digunakan adalah dasarnya bahwa Mashburn dan Wriston17. Dalam pengujian ini, laju hidrolisis L-asparagine adalah ditentukan dengan mengukur amonia dirilis menggunakan reaksi Nessler itu. Campuran dari 0,1 ml ekstrak enzim, 0,2 ml 0,05 M TrisHCl buffer (pH 8,6), dan 1,7 ml 0.01M L-asparagine diinkubasi selama 10 menit pada 37 C. Reaksi dihentikan dengan penambahan tersebut dari 0,5 ml 1.5M asam trikloroasetat. Setelah sentrifugasi pada 10000 rpm, 0,5 ml supernatan terdilusi menjadi 7 ml dengan suling air dan diobati dengan 1 ml yang Nessler reagen. Reaksi warna diizinkan untuk mengembangkan selama 10 menit dan absorbansi dibaca pada 480 nm dengan spektrofotometer. Itu amonia yang dibebaskan ini diekstrapolasikan dari kurva yang diperoleh dengan amonium sulfat. Satu Unit (IU) dari L-asparaginase didefinisikan sebagai bahwa jumlah enzim yang membebaskan 1 mol amonia per menit di bawah assay conditions18. Pemurnian Lasparaginase dari kelautan actinomycetes L-asparaginase sebagian dimurnikan dengan menggunakan prosedur berikut: The enzim kasar dibawa ke saturasi 45% dengan amonium sulfat pada pH 8,4 dan terus semalam di ruang dingin pada 4 C. Itu setelah mengalami sentrifugasi pada 8000 rpm selama 10 menit pada 4 C. Endapan itu dibuang, sedangkan supernatan dibawa kejenuhan 85% dengan amonium sulfat dan disentrifugasi pada 8000 rpm pada 4 C selama 10 min. Endapan langkah ini adalah dikumpulkan dan disimpan pada 4 C 6. Dialisis tabung, yang sebelumnya direndam dalam 1M Tris HCl penyangga, digunakan untuk dialisis dari mengendap. Endapan dilarutkan dalam 1M Tris HCl buffer dan didialisis terhadap sama penyangga 6. Selanjutnya, didialisis Sampel dimuat ke pra-disetimbangkan kolom dikemas dengan 0,05 M Tris HCl Sephadex G 100. Itu dielusi dengan 0,05 M Tris HCl (pH 8,4) buffer yang mengandung 0,1 M KCl. Sebanyak 30 fraksi dikumpulkan di laju

alir dari 5 ml/30 menit. Pecahan menunjukkan aktivitas yang tinggi dikumpulkan dan digunakan untuk lebih lanjut studies6. Karakterisasi yang dimurnikan secara parsial Lasparaginase Pengaruh ion pH, suhu dan logam Kegiatan pH profil dimurnikan secara parsial enzim (pH kisaran 3,5-10,5) telah dipelajari. Buffer asetat (0,1 M, pH berkisar 3,5 5,5), 0,1 M dapar fosfat (pH 6,0-8,0 kisaran) dan 0,1 M Tris HCl buffer (pH kisaran 8,5-10,5) digunakan untuk purpose19 ini. Pengujian itu dilakukan dengan menggunakan 0,1 ml tepat diencerkan enzim. Aktivitas enzim spesifik adalah dihitung dengan mengukur amonia dirilis, berdasarkan reaksi Nessler ini, oleh metode Mashburn dan Wriston20 dijelaskan di atas untuk penentuan Lasparaginase aktivitas. Demikian pula, aktivitas enzim diukur pada berbagai suhu berkisar antara 30 C sampai 100 C, dan pada pH optimum dengan menggunakan uji yang prosedur yang diuraikan above20. Dalam rangka untuk menentukan aktivitas enzim dalam adanya ion logam yang berbeda (Mg2 +, Cu2 +, Zn2 + dan EDTA), larutan garam yang berbeda - magnesium sulfat, sulfat tembaga, seng sulfat dan etilena diamina tetraacetic acid (EDTA) - ditambahkan ke enzim substrat campuran reaksi untuk menghasilkan akhir konsentrasi 1, 3 dan 10mm, respectively21. Aktivitas spesifik dari masing-masing Sampel kemudian ditentukan dengan metode dari Mashburn dan Wriston20. Penentuan Km dan Vmax Ini merupakan salah satu parameter penting untuk mengevaluasi kegunaan potensi enzim untuk anti-leukemia terapi. Awal kecepatan sampel diperkirakan dalam kisaran Lasparagine konsentrasi (4 sampai 160 M). Km dan Vmax dihitung dari Lineweaver-Burk plot18.

HASIL Pengayaan dan isolasi kelautan actinomycetes di media yang berbeda Dari 20 sampel sedimen laut diuji, hanya 10 sedimen menunjukkan pertumbuhan pengayaan media. Ini 10 isolat disubkultur dan digunakan untuk studi lebih lanjut. Identifikasi actinomycetes Semua isolat menghasilkan abu-abu dan putih koloni tanpa pigmentasi dan menunjukkan pertumbuhan yang cepat dalam waktu dua hari. mereka adalah diidentifikasi sebagai Streptomyces spp. oleh geser budaya, karakteristik morfologi, fisiologis dan sifat enzimatik, karbon pemanfaatan dan penggunaan nitrogen. Itu sampel Streptomyces spp yang diisolasi dari Tamilnadu yang ditunjuk S3, S4 dan S6, sedangkan dari Kerala yang ditunjuk K4 dan K8. The biokimia karakteristik isolat tanah dirangkum dalam Tabel 1. Screening of Lasparaginase positif budaya Dari terisolasi Streptomyces spp. Disaring untuk L-asparaginase aktivitas, hanya S3 dan S4 dari Tamilnadu dan K8 dari Kerala menunjukkan hasil positif dalam metode uji plate yang cepat. Produksi L-asparaginase Ketiga isolat diperiksa disintesis

asparaginase dengan hasil berkisar antara 24.61 ke 49,23 U / ml. Namun, tanah mengisolasi S3 adalah dipilih untuk studi lebih lanjut karena sifatnya produktivitas tinggi (49,23 U / ml). protein konsentrasi Konsentrasi protein yang diperoleh dari S3 organisme terisolasi ditemukan menjadi 65 pg / ml.

PEMBAHASAN Meskipun L-asparaginase dari bakteri memiliki secara luas ditandai, yang mirip Perhatian belum dibayarkan kepada actinomycetes23. Sampai saat ini, antibiotik adalah senyawa bioaktif utama yang diperoleh dari actinomycetes. Namun, kemampuan untuk menghasilkan berbagai enzim dapat menarik penelitian bunga dalam prokariota. Tanah isolat S3 dan S4 dari Tamilnadu dan tanah mengisolasi K8 dari Kerala memiliki Lasparaginase aktivitas. Namun organisme tidak menghasilkan zona merah muda dalam kontrol baik kelompok - M-9 media yang digabungkan dengan Lasparagine tanpa merah fenol dan M-9 Media dimasukkan tanpa L-asparagine. Hal ini menunjukkan bahwa pembentukan zona merah muda karena hanya untuk L-asparaginase produksi. Di antara tiga media yang digunakan, solid-state Media memberikan aktivitas enzim tertinggi untuk semua 3 isolat. Mekanisme depresi Efek di TGY dan TFY kaldu diperkirakan hasil dari kehadiran metabolisme glukosa produk. Studi menunjukkan bahwa dalam kasus asparaginase biosintesis, depresi yang efek karbohidrat mungkin merupakan fungsi dari kemampuan mereka untuk menurunkan nilai pH fermentasi media24. Perbandingan terendam dan solid-state fermentasi menunjukkan perbedaan yang signifikan dalam enzim aktivitas. Hal ini menunjukkan bahwa mungkin ada peningkatan akumulasi antara metabolit antara substrat dan produk formasi dalam fermentasi terendam. Ini adalah juga mungkin karena perbedaan dalam fisiologis keadaan mikroorganisme di fermentasi solid-state dan terendam. Untuk yang terbaik dari pengetahuan kami, ini adalah yang pertama melaporkan produksi dan parsial pemurnian L-asparaginase dari laut actinomycetes terisolasi melalui solid state fermentasi (SSF). Pada langkah pemurnian akhir, enzim menunjukkan aktivitas spesifik 662,61 IU / mg, yang kira-kira 2 kali lipat kemurnian. Terbaik pH ditemukan menjadi 7,5, yang dekat dengan pH darah, dibandingkan dengan Lasparaginases dari lainnya bakteri sumber seperti Serratia marcescens, Mycobacterium spp. Dan Pseudomonas spp menunjukkan pH optimum kisaran 8,0-8,5 15, 20, 27. Pada 50 C, enzim menunjukkan aktivitas optimal. Itu hasil uji sensitivitas Lasparaginase untuk ion logam berat mengindikasikan bahwa aktivitas enzim tergantung pada kehadiran fungsional sulfhidril kelompok. Afinitas L-asparaginase ke substrat berhubungan dengan derajat keefektifan terhadap tumors25. Afinitas substrat Lasparaginase yang diukur dengan nilai Km adalah

ditemukan 2,4 x 10-5 M untuk L-asparagine. Hal ini lebih baik dibandingkan dengan nilai Km dilaporkan untuk antineoplastik L-asparaginases dari sumber lain seperti E. coli (1,25 x 10 - 5 M) 26, Proteus vulgaris (2,6 x 10-5 M) 27 dan Erwinia aroideae NRRL Q-138 (3,0 x 10-5 M) 27. Linearitas dari Lineweaver-Burk Plot timbal balik ganda menunjukkan bahwa terisolasi L-asparaginase mengikuti Michaelis-Menten kinetika.

KESIMPULAN Penelitian ini hanya menunjukkan laut yang sedimen sampel dari Tamilnadu dan Kerala di India merupakan sumber potensial dari bioaktif aktinomisetes tetapi juga menunjukkan bahwa perlakuan awal yang berbeda metode dapat berhasil diterapkan untuk isolasi actinomycetes. Hyperproductive marine actinomycetes dengan tinggi Lasparaginase Kegiatan itu berhasil diisolasi dengan menggunakan substrat biaya rendah - kacang kedelai makan. Selanjutnya, terisolasi Lasparaginase tampaknya menjadi menjanjikan agen dan memerlukan investigasi lebih lanjut dari perusahaan potensi anti-leukemia aktivitas. Atas dasar dari data yang diperoleh, kelautan aktinomisetes mungkin menjadi sumber yang belum tergarap dari berpotensi berharga produk dan mungkin juga lebih baik untuk skrining massal umum bakteri. Akibatnya, kami sarankan enzim yang mendegradasi asam amino harus mendapat perhatian yang lebih besar sebagai potensi terapi agen.