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BIOTECNOLOGIA 2011

MARIA ANTONIA MALAJOVICH

BIOTECNOLOGIA 2011
MARIA ANTONIA MALAJOVICH

www.bteduc.bio.br

Copyright 2004 by Maria Antonia Malajovich ISBN: 85-7323-223-4 Copyright 2011 by Maria Antonia Malajovich Os conceitos emitidos nesta obra so de inteira responsabilidade da autora

MALAJOVICH M. A. Biotecnologia 2011. Rio de Janeiro, Edies da Biblioteca Max Feffer do Instituto de Tecnologia ORT, 2012.

Edies BIBLIOTECA MAX FEFFER do INSTITUTO DE TECNOLOGIA ORT do Rio de Janeiro Rua Dona Mariana 213 Rio de Janeiro, 22280-020 RJ - Brasil Tel.: (5521)2539-1842; FAX: (5521)2286-9174 http://www.ort.org.br

BIOTECNOLOGIA: ENSINO E DIVULGAO http://www.bteduc.bio.br

AO LEITOR Biotecnologia 2011 a ltima atualizao do livro publicado em 2004 por Axcell Books do Brasil, em 2006 pela Universidad de Quilmes Editorial (em espanhol) e divulgado na Internet, a partir de 2009, no site Biotecnologia: ensino e divulgao (www.bteduc.bio.br). Agradeo a Elizabeth Lissovsky pela reviso do portugus. Inicia-se o texto com uma apresentao sobre o que Biotecnologia (Captulo 1). A seguir, apresentam-se os fundamentos da Biotecnologia, isto os agentes biolgicos (Captulos 2 a 5) e as ferramentas bsicas (Captulos 6 a 9). A ltima parte, O impacto na sociedade analisa o impacto das novas tecnologias biolgicas em setores to diversos como indstria, energia, meio ambiente, biodiversidade, agricultura, pecuria, alimentos e sade. Alm de um sumrio detalhado, uma lista das 92 figuras e das 30 tabelas, o livro conta com uma lista da bibliografia consultada e um ndice remissivo. Nascida em universidades e centros de pesquisa, onde perdura at hoje, a biotecnologia objetiva principalmente o desenvolvimento local ou regional, o progresso da agricultura e a melhora dos tratamentos de sade. Empresas pblicas e privadas de diferentes portes utilizam as tecnologias com base biolgica para obter produtos diversos e, tambm, para assegurar servios. O perfil da biotecnologia varia de um pas para outro, em funo dos recursos naturais, econmicos e polticos, das caractersticas das empresas envolvidas e do papel assumido pelos setores pblico e privado. A incluso de exemplos do Brasil e de outros pases latino-americanos tenta mostrar um pouco dessa diversidade. A expanso da biotecnologia introduz mudanas na sociedade. Por ser uma rea ainda pouco conhecida, a percepo pblica costuma oscilar entre a aceitao e a hostilidade, em funo das presses de lobbies e grupos de opinio. Alguns temas so polmicos, seja porque despertam apreenses em relao segurana dos procedimentos, seja porque nos exigem uma reflexo tica cuidadosa. No espere o leitor encontrar respostas dogmticas: as tecnologias no so nem boas nem ruins, so o que fazemos com elas.

Maria Antonia Malajovich Janeiro de 2012

BIOTECNOLOGIA 2011
SUMRIO
INTRODUO

CAPTULO
1. O QUE BIOTECNOLOGIA? A BIOTECNOLOGIA TRADICIONAL A BIOTECNOLOGIA MODERNA AS DEFINIES DE BIOTECNOLOGIA O IMPACTO DA BIOTECNOLOGIA BIOTECNOLOGIA E DESENVOLVIMENTO A HISTRIA DA BIOTECNOLOGIA

PGINA
1

OS AGENTES BIOLGICOS
CAPTULO
2. AS CLULAS E OS CROMOSSOMOS A CLULA COMO UNIDADE DOS SERES VIVOS
Unidade estrutural Unidade funcional

PGINA
9

TCNICAS LABORATORIAIS TODA CLULA DERIVA DE OUTRA PREEXISTENTE OS CROMOSSOMOS A TEORIA CROMOSSMICA DA HEREDITARIEDADE CLULAS E CROMOSSOMOS COMO AGENTES BIOLGICOS

3. OS MICRORGANISMOS A DIVERSIDADE MICROBIANA


As eubactrias As arqueas Os protistas Os fungos Os vrus, na fronteira do vivo e do no vivo

21

AS TCNICAS MICROBIOLGICAS BIOSSEGURANA E BIOSSEGURIDADE OS MICRORGANISMOS COMO AGENTES BIOLGICOS

4. AS ENZIMAS E OS ANTICORPOS AS PROTENAS


Estrutura As bases de algumas tcnicas laboratoriais

33

AS ENZIMAS
A catlise enzimtica Os diversos tipos de enzimas Importncia econmica

OS ANTICORPOS A molcula de anticorpo A unio antgeno-anticorpo A produo de anticorpos no organismo A produo de anticorpos no laboratrio A utilizao dos anticorpos

Maria Antonia Malajovich

CAPTULO
5. OS CIDOS NUCLEICOS E OS GENES OS CIDOS NUCLEICOS
A dupla hlice O cdigo gentico

PGINA
47

A EXPRESSO GNICA
O fluxo da informao gentica Clulas procariticas Clulas eucariticas

O COMPLEXO MUNDO DOS RNAs A GENMICA


O GENOMA HUMANO A GENMICA EM AMRICA LATINA

AS FERRAMENTAS BSICAS
CAPTULO
7. A CULTURA DE CLULAS E TECIDOS O CULTIVO DE CLULAS E TECIDOS VEGETAIS
As primeiras tentativas Os meios de cultura As etapas do processo As diferentes modalidades Melhoramento e conservao da biodiversidade vegetal A difuso da tecnologia

PGINA
69

A CULTURA DE CLULAS ANIMAIS


A manipulao in vitro das clulas animais As aplicaes da cultura in vitro de clulas de mamferos

8. A TECNOLOGIA DO DNA AS FERRAMENTAS DISPONVEIS


AS NUCLEASES OU ENZIMAS DE RESTRIO A ELETROFORESE DO DNA HIBRIDIZAO E SONDAS GNICAS A TCNICA DE SOUTHERN O FINGERPRINT A SNTESE E AMPLIFICAO DE DNA O SEQUENCIAMENTO DO DNA OS ARRAYS A BIOLOGIA SINTTICA

81

9. A ENGENHARIA GENTICA O NASCIMENTO DA BIOTECNOLOGIA MODERNA


As primeiras experincias Mitos e realidade

93

AS BIBLIOTECAS DE GENES A CONSTRUO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE


Encontrar o gene Inserir o gene Identificar os microrganismos recombinantes

A CONSTRUO DE PLANTAS TRANSGNICAS


O transgene A transferncia dos genes a clulas vegetais O problema dos marcadores seletivos Do laboratrio ao campo

CLULAS E ANIMAIS TRANSGNICOS


A transferncia gnica a clulas animais Os rebanhos farmacuticos

ii

BIOTECNOLOGIA 2011 / Sumrio

O IMPACTO NA SOCIEDADE
CAPTULO PGINA
109

10. BIOTECNOLOGIA E INDSTRIA


O PROCESSO WEIZMANN A INDSTRIA QUMICA
A via qumica A via biotecnolgica

OS PRODUTOS BIOTECNOLGICOS
Metablitos de interesse comercial Enzimas Biopolmeros e bioplsticos

OS BIOCOMBUSTVEIS
Etanol Biogs Biodiesel Perspectivas

11. BIOTECNOLOGIA E MEIO AMBIENTE O DESENVOLVIMENTO SUSTENTVEL AS TECNOLOGIAS LIMPAS


A substituio de processos industriais A substituio de insumos agrcolas

125

A REDUO DOS RESDUOS


A degradao do lixo O tratamento das guas residuais O tratamento dos efluentes industriais As emisses de gases e o efeito estufa

A BIORREMEDIAO
Os contaminantes Os tratamentos Um exemplo: os vazamentos de petrleo

A RECUPERAO DE RECURSOS NATURAIS


O petrleo Os metais A biominerao

O DIAGNSTICO DE CONTAMINAO AMBIENTAL


Indicadores biolgicos Tcnicas genticas Tcnicas imunolgicas Biossensores

12. BIOTECNOLOGIA E BIODIVERSIDADE A DESAPARIO DOS ECOSSISTEMAS NATURAIS O HOMEM E AS PLANTAS


As plantas alimentcias As plantas comerciais As plantas medicinais

139

A BIODIVERSIDADE AMEAADA
A eroso gentica A expanso do agronegcio A transgnese

A PROTEO DA BIODIVERSIDADE
Os centros de diversificao A conservao da biodiversidade O CGIAR e o centro internacional da batata O protocolo de Cartagena de biossegurana

iii

Maria Antonia Malajovich

CAPTULO
13. BIOTECNOLOGIA E AGRICULTURA A EVOLUO DAS PRTICAS AGRCOLAS A OBTENO DE NOVAS VARIEDADES
Mutao gnica e seleo Alterao do nmero de cromossomos Engenharia gentica

PGINA
151

O PRINCPIO DE PRECAUO AS PLANTAS BIOTECNOLGICAS ATUAIS


Modificao das propriedades agronmicas Plantas com qualidades nutricionais melhoradas Plantas com propriedades novas

O AGRONEGCIO
A adoo dos cultivos biotecnolgicos no mundo O mercado de sementes A Unio Europeia e a moratria Os pases de Amrica Latina

A COEXISTNCIA POSSVEL?

14. BIOTECNOLOGIA E PECURIA A CRIAO DE ANIMAIS A NUTRIO DOS ANIMAIS


A necessidade de raes De liebig vaca louca Variaes sobre a composio das raes As raes transgnicas

165

O MELHORAMENTO GENTICO DO GADO


O controle da reproduo As novas tecnologias O MELHORAMENTO DA PRODUO Carne, leite, ovos e l A aquicultura

A SADE DOS ANIMAIS


Resistncia a doenas Preveno e tratamento

NOVAS UTILIZAES DOS ANIMAIS DOMSTICOS


Modelos de estudo para doenas humanas Xenotransplantes Os animais como biorreatores O marco conceitual dos trs rs

OS ANIMAIS DE ESTIMAO

18. BIOTECNOLOGIA E SADE - TESTES DIAGNSTICOS OS TESTES DIAGNSTICOS AS TENDNCIAS ATUAIS


O que um bom teste As tcnicas com base bioqumica As tcnicas com base imunolgica As tcnicas com base gentica

215

O DIAGNSTICO DAS DOENAS INFECCIOSAS A TIPIFICAO DE TECIDOS


Sangue Outros tecidos e rgos

A PRTICA FORENSE O DIAGNSTICO DE DOENAS DE ORIGEM GENTICA


As limitaes dos testes As estratgias seguidas Diagnstico preventivo e preditivo

iv

BIOTECNOLOGIA 2011 / Sumrio

CAPTULO

PGINA

19. BIOTECNOLOGIA E SADE - MEDICAMENTOS A INDSTRIA DE MEDICAMENTOS OS PRINCPIOS ATIVOS DAS PLANTAS
O caso da aspirina Os fitoterpicos As novas tecnologias A importncia de um marco legal Os limites ao uso de antibiticos A necessidade de inovao

229

AS PRIMEIRAS MOLCULAS TERAPUTICAS


O caso da insulina A substituio do produto natural Os produtos e suas utilizaes A indstria biotecnolgica

OS MEDICAMENTOS PERSONALIZADOS
A farmacogenmica O custo dos novos medicamentos

PATENTES E GENRICOS

20. BIOTECNOLOGIA E SADE - NOVOS TRATAMENTOS A APROVAO DE UM TRATAMENTO EXPERIMENTAL AS TERAPIAS BIOLGICAS
Os anticorpos monoclonais O cncer como doena gentica As vacinas teraputicas

247

AS TERAPIAS GNICAS
Terapias somticas e germinais Os altos e baixos de uma tecnologia O estado da arte As promessas do silenciamento gnico

A MEDICINA REGENERATIVA
Os transplantes de rgos A engenharia de tecidos As terapias celulares

CONSIDERAES FINAIS BIBLIOGRAFIA NDICE REMISSIVO

261 263 293

LISTA DE FIGURAS E TABELAS


INTRODUO CAPTULO 1. O QUE BIOTECNOLOGIA?
FIGURA 1.1. O campo da Biotecnologia. TABELA 1.1. Produtos e servios de origem biotecnolgica, em diferentes setores.

OS AGENTES BIOLGICOS CAPTULO 2. AS CLULAS E OS CROMOSSOMOS


FIGURA 2.1. Representaes esquemticas da estrutura celular (bacteriana, eucaritica animal e vegetal). FIGURA 2.2. As clulas-tronco embrionrias. FIGURA 2.3. Mitose e meiose. FIGURA 2.4. Monoibridismo. FIGURA 2.5. Diibridismo. FIGURA 2.6. Representao dos cromossomos humanos. TABELA 2.1. A funo e a distribuio das estruturas celulares. TABELA 2.2. As clulas como agentes biolgicos.

CAPTULO 3. OS MICRORGANISMOS
FIGURA 3.1. Bactrias e clones. FIGURA 3.2. Alguns tipos de vrus. FIGURA 3.3. A multiplicao de um bacterifago. FIGURA 3.4. Alguns logotipos utilizados como indicao de risco biolgico. TABELA 3.1. Os microrganismos dentro do marco da uma classificao biolgica atual. TABELA 3.2. As bactrias (Eubactrias e Arqueas) como agentes biolgicos. TABELA 3.3. As algas como agentes biolgicos. TABELA 3.4. Os fungos como agentes biolgicos. TABELA 3.5. Principais destaques entre os agentes biolgicos microbianos.

CAPTULO 4. AS ENZIMAS E OS ANTICORPOS


FIGURA 4.1. A composio qumica de uma bactria. FIGURA 4.2. Aminocidos e protenas. FIGURA 4.3. Cromatografia em coluna. FIGURA 4.4. Eletroforese. FIGURA 4.5. O mecanismo da atividade enzimtica (Modelo chave-fechadura). FIGURA 4.6. A estrutura da molcula de anticorpo (IgG) FIGURA 4.7. Os anticorpos e o reconhecimento do antgeno. FIGURA 4.8. O encontro do linfcito B e do antgeno, e a seleo clonal. FIGURA 4.9. A produo de anticorpos no laboratrio. FIGURA 4.10. Os ensaios imunolgicos (associao com molculas fluorescentes ou com enzimas). TABELA 4.1. As funes das protenas no organismo. TABELA 4.2. A classificao internacional das enzimas. TABELA 4.3. As enzimas como agente biolgico. TABELA 4.4. Os anticorpos como agentes biolgicos.

CAPTULO 5. OS CIDOS NUCLEICOS E OS GENES


FIGURA 5.1. Os cidos nucleicos (composio qumica, estrutura da molcula de DNA). FIGURA 5.2. O fluxo da informao gentica. FIGURA 5.3. A sntese de protenas em clulas procariticas e eucariticas. FIGURA 5.4. A organizao e regulao dos genes nas clulas procariticas. FIGURA 5.5. A organizao e regulao dos genes nas clulas eucariticas. FIGURA 5.6. As etapas da sntese de protenas (Recapitulao). FIGURA 5.7. O silenciamento gnico. TABELA 5.1. O cdigo gentico. TABELA 5.2. O DNA como agente biolgico. vi

BIOTECNOLOGIA 2011 / Lista de figuras e tabelas

AS FERRAMENTAS BSICAS CAPTULO 6. OS PROCESSOS FERMENTATIVOS


FIGURA 6.1. O processo fermentativo genrico FIGURA 6.2. Respirao e fermentao. FIGURA 6.3. As diversas fases do crescimento de uma populao microbiana e a produo de metablitos (As fases de crescimento de uma populao; a produo de metablitos primrios e secundrios). FIGURA 6.4. Biorreator para fermentaes em fase slida FIGURA 6.5. Um processo tradicional, a produo de vinagre (Mtodo de Orlans) FIGURA 6.6. Modelo de biorreator utilizado em fermentaes submersas. FIGURA 6.7. Fermentaes, agentes biolgicos e biorreatores. FIGURA 6.8. A mudana de escala, do laboratrio indstria.

CAPTULO 7. A CULTURA DE CLULAS E TECIDOS


FIGURA 7.1. As diversas partes de uma planta angiosperma. FIGURA 7.2. O procedimento a seguir para se obter uma cultura assptica no laboratrio. FIGURA 7.3. Obteno de subculturas a partir de explantes nodais. FIGURA 7.4. A cultura de meristemas. FIGURA 7.5. As diferentes possibilidades dos cultivos de calos. FIGURA 7.6. As possibilidades do cultivo de clulas vegetais e animais. FIGURA 7.7. As culturas de clulas de origem animal (Cultura de leuccitos para a anlise do caritipo; etapas da cultura de clulas a partir de um fragmento de tecido). TABELA 7.1. Os componentes do meio de cultura para clulas vegetais. TABELA 7.2. Os componentes de um meio de cultura bsico para clulas animais. TABELA 7.3. Origem e utilizao de algumas linhagens celulares.

CAPTULO 8. A TECNOLOGIA DO DNA


FIGURA 8.1. A eletroforese do DNA. FIGURA 8.2. Os polimorfismos de restrio. FIGURA 8.3. Hibridizao de uma sonda com a sequncia complementar. FIGURA 8.4. O mtodo de Southern. FIGURA 8.5. O polimorfismo de uma sequncia de vinters (VNTRs). FIGURA 8.6. A sntese de oligonucleotdeos. FIGURA 8.7. A sntese de cDNA por transcriptase reversa. FIGURA 8.8. A reao em cadeia da polimerase (Os elementos necessrios; a amplificao do DNA). FIGURA 8.9. O sequenciamento de um fragmento de DNA. FIGURA 8.10. Fundamentos da tecnologia de arrays.

CAPTULO 9. A ENGENHARIA GENTICA


FIGURA 9.1. A experincia que deu origem engenharia gentica: cortar, colar, copiar. FIGURA 9.2. Sapobacter ou Bactosapo? FIGURA 9.3. A construo de bibliotecas de genes. FIGURA 9.4. A produo de somatotropina por engenharia gentica. FIGURA 9.5. Algumas estratgias possveis de clonagem. FIGURA 9.6. A estrutura de um vetor de expresso. FIGURA 9.7. A construo de uma planta transgnica no laboratrio. FIGURA 9.8. As etapas da construo de uma planta transgnica. FIGURA 9.9. Dolly, um clone obtido por transferncia nuclear. FIGURA 9.10. Construo de animais transgnicos (microinjeo; transfeco de clulas-tronco embrionrias).

vii

Maria Antonia Malajovich

O IMPACTO NA SOCIEDADE CAPTULO 10. BIOTECNOLOGIA E INDSTRIA


FIGURA 10.1. As etapas necessrias para a produo de etanol a partir de diferentes matrias-primas. FIGURA 10.2. A produo de etanol a partir da cana-de-acar. FIGURA 10.3. A biodigesto em condies aerbias e anaerbias. FIGURA 10.4. As complexas etapas da produo de biogs dentro do biodigestor. FIGURA 10.5. As utilizaes do biogs. FIGURA 10.6. A reao de transesterificao. TABELA 10.1. Diversidade de produtos derivados de algumas matrias-primas renovveis. TABELA 10.2. Metablitos primrios e secundrios obtidos por fermentao e/ou bioconverso enzimtica. TABELA 10.3. O poder calorfico de vrios combustveis.

CAPTULO 11. BIOTECNOLOGIA E MEIO AMBIENTE


FIGURA 11.1. A indstria de papel e de celulose. FIGURA 11.2. A compostagem. FIGURA 11.3. O tratamento das guas residuais. FIGURA 11.4. As estratgias de biorremediao. FIGURA 11.5. O funcionamento de um biossensor. TABELA 11.1. Alguns exemplos de utilizao de agentes biolgicos como pesticidas. TABELA 11.2. Os principais contaminantes do meio ambiente.

CAPTULO 12. BIOTECNOLOGIA E BIODIVERSIDADE


FIGURA 12.1. O transporte de plantas de um continente a outro. FIGURA 12.2. Distribuio da produo agrcola (gros e cereais, pradarias e pastagens, cultivos diversos) na rea habitvel do planeta. TABELA 12.1. Os principais tipos de vegetais que entram em nossa alimentao. TABELA 12.2. O tamanho da populao humana. TABELA 12.3. As plantas e a indstria. TABELA 12.4. Os centros de diversificao e os cultivos originrios.

CAPTULO 13. BIOTECNOLOGIA E AGRICULTURA


FIGURA 13.1. O milho. FIGURA 13.2. A produo de milho hbrido. FIGURA 13.3. As etapas da construo de uma planta transgnica. FIGURA 13.4. Os elos que integram a cadeia produtiva da semente.

CAPTULO 14. BIOTECNOLOGIA E PECURIA


FIGURA 14.1. O Controle da reproduo em bovinos. TABELA 14.1. O risco de escapamento de um animal transgnico. TABELA 14.2. Significado e alcance dos trs Rs.

CAPTULO 15. BIOTECNOLOGIA E ALIMENTOS


FIGURA 15.1. A panificao. FIGURA 15.2. A vinificao. FIGURA 15.3. As etapas da produo de cerveja. FIGURA 15.4. A produo de laticnios (iogurte, queijo). FIGURA 15.5. A produo de xarope de frutose.

viii

BIOTECNOLOGIA 2011 / Lista de figuras e tabelas

CAPTULO 16. BIOTECNOLOGIA E NOVOS ALIMENTOS


FIGURA 16.1. A estrutura de um transgene. FIGURA 16.2. O smbolo de transgnico, adotado no Brasil.

CAPTULO 17. BIOTECNOLOGIA E SADE AS VACINAS


FIGURA 17.1. A resposta primria e secundria do organismo. FIGURA 17.2. A memria imunolgica. FIGURA 17.3. A utilizao da tecnologia do DNA-recombinante na vacina contra a hepatite B. FIGURA 17.4. Os diferentes tipos de vacinas virais. TABELA 17.1. As principais instituies produtoras de vacinas no Brasil.

CAPTULO 18. BIOTECNOLOGIA E SADE OS TESTES DIAGNSTICOS


FIGURA 18.1. Imagens comerciais de alguns dispositivos miniaturizados utilizados em testes diagnsticos. FIGURA 18.2. Imagem comercial dos sistemas API de Biomrieux. FIGURA 18.3. Uma microplaca de poliestireno. FIGURA 18.4. Os mtodos direto e indireto de um teste positivo de ELISA. FIGURA 18.5. Imagem mostrando a identificao dos 46 pares de cromossomos humanos mediante a tcnica de SKY. FIGURA 18.6. Imagem comercial de um termociclador para a reao em cadeia da polimerase. FIGURA 18.7. O uso de arrays no diagnstico de mutaes nos genes BRCA1 e BRCA2. FIGURA 18.8. O sistema HLA. TABELA 18.1. As qualidades de um bom teste de diagnstico. TABELA 18.2. Algumas das mais de 8.000 doenas genticas descritas.

CAPTULO 19 BIOTECNOLOGIA E SADE OS MEDICAMENTOS


FIGURA 19.1. As etapas do desenvolvimento de um medicamento. FIGURA 19.2. A frmula da aspirina. FIGURA 19.3. A frmula da penicilina. FIGURA 19.4. A estrutura da molcula de insulina humana. FIGURA 19.5. A sntese da insulina.( sntese in vivo; sntese em Escherichia coli (1982). FIGURA 19.6. Os fundamentos do projeto internacional HapMap. TABELA 19.1. A linha do tempo de entrada dos antibiticos e antibacterianos no mercado. TABELA 19.2. Alguns biofrmacos de interesse mdico. TABELA 19.3. As principais protenas teraputicas comercializadas atualmente.

CAPTULO 20 BIOTECNOLOGIA E SADE OS NOVOS TRATAMENTOS


FIGURA 20.1. A transformao de uma clula normal em cancerosa por mutao (cncer de clon). FIGURA 20.2. O tratamento com sipuleucel-T (Provenge). FIGURA 20.3. O princpio da terapia gnica. FIGURA 20.4. As tecnologias de silenciamento gnico. FIGURA 20.5. A clonagem teraputica, uma forma de gerar clulas-tronco embrionrias com a informao gentica do doador do ncleo. TABELA 20.1. Os 10 anticorpos monoclonais de uso teraputico, lderes de venda em 2010. TABELA 20.2. As caractersticas comparadas das clulas-tronco adultas e embrionrias.

ix

Maria Antonia Malajovich

1. O QUE BIOTECNOLOGIA?

A BIOTECNOLOGIA TRADICIONAL Cultivar vegetais, domesticar animais, transformar os alimentos ou aproveitar as propriedades curativas de algumas plantas so atividades que remontam alvorada da humanidade e se desenvolveram com base no conhecimento emprico, ignorando a existncia dos microrganismos ou das leis da hereditariedade. No incio do sculo XIX, a demanda de mo de obra por uma indstria incipiente estimula a migrao da populao do campo para a cidade. Em condies sanitrias cada vez mais degradadas, as doenas e a fome acompanham o homem. Ao mesmo tempo, o progresso exige processos industriais mais eficientes. A compreenso dos fenmenos naturais torna-se indispensvel para responder s necessidades da sociedade. A partir de 1850 surgem novas reas do conhecimento. Nasce a Microbiologia, a Imunologia, a Bioqumica e a Gentica. A Qumica Industrial se desenvolve aceleradamente e, tambm, aumenta a interveno da Engenharia Agrcola e da Pecuria no gerenciamento do campo. Em 1914, Karl Ereky, um engenheiro agrcola hngaro, desenvolve um gigantesco plano de criao de sunos visando substituir as prticas tradicionais por uma indstria agrcola capitalista baseada no conhecimento cientfico. Deve-se a Ereky (1919) a primeira definio de biotecnologia, como a cincia e os mtodos que permitem a obteno de produtos a partir de matria-prima, mediante a interveno de organismos vivos. Para ele, a era bioqumica substituiria a era da pedra e do ferro. O sculo XX assiste a um desenvolvimento extraordinrio da cincia e da tecnologia (eletrnica, informtica). Da convergncia entre ambas resultam logros extraordinrios em vrios setores produtivos, onde os seres vivos constituem a base de itens to diversos como a produo de variedades vegetais mais produtivas, a fabricao de novos alimentos, o tratamento do lixo, a produo de enzimas e os antibiticos. A BIOTECNOLOGIA MODERNA A proposta de J. D. Watson e F. Crick (1953) de um modelo helicoidal para a molcula de DNA representa, sem dvida, um marco fundamental na histria da Biologia Molecular. Mas a divisria entre a Biotecnologia clssica e a Biotecnologia moderna uma srie de experincias realizadas por H. Boyer e S. Cohen que culmina em 1973 com a transferncia de um gene de sapo a uma bactria. A partir desse momento possvel mudar o programa gentico de um organismo transferindo-lhe genes de outra espcie. A importncia e os riscos inerentes nova tecnologia no passaram despercebidos para as pessoas envolvidas. Fato indito na histria, em 1975 os cientistas reunidos em Asilomar (USA) estabeleceram uma moratria em seus trabalhos at serem definidas as condies de segurana adequadas, o que aconteceu pouco tempo mais tarde. Na passagem de uma biotecnologia de laboratrio a uma biotecnologia industrial, a Engenharia Gentica ocupa um lugar de destaque como tecnologia inovadora. Em alguns casos, como os da insulina e do hormnio do crescimento, a inovao consiste em substituir os mtodos de obteno tradicionais. Em outros casos, como o dos anticorpos monoclonais ou do Golden Rice, um arroz com vitamina A, trata-se de produtos inteiramente novos.
Copyright Maria Antonia Malajovich Biotecnologia: ensino e divulgao (www.bteduc.bio.br)

Maria Antonia Malajovich

Entretanto, a manipulao gnica no a nica ferramenta disponvel. A Biotecnologia abrange hoje uma rea ampla do conhecimento que decorre da cincia bsica (biologia molecular, microbiologia, biologia celular, gentica etc.), da cincia aplicada (tcnicas imunolgicas e bioqumicas, assim como tcnicas decorrentes da fsica e da eletrnica), e de outras tecnologias (fermentaes, separaes, purificaes, informtica, robtica e controle de processos). Trata-se de uma rede complexa de conhecimentos onde cincia e tecnologia se entrelaam e complementam. AS DEFINIES DE BIOTECNOLOGIA O impacto causado pelas primeiras experincias de Engenharia Gentica estimulou numerosas tentativas de redefinio do campo da Biotecnologia. Mediante a substituio da expresso interveno de organismos vivos por utilizao de processos celulares e moleculares tratou-se de diferenciar a Biotecnologia clssica da moderna. Porm, devido enorme difuso das tcnicas de manipulao gnica, elas acabam se superpondo, e, fora do contexto histrico, difcil distinguir o limite entre ambas. Por outro lado, como a definio de um setor de atividades depende dos interesses dos grupos envolvidos, muitas vezes reflete a viso dos setores profissionais predominantes. Por isso, se revisitarmos os textos da dcada de 1980, anos em que a expresso biotecnologia se expande, encontraremos mais de uma dzia de definies diferentes do termo. Levantamos, entre as definies encontradas com maior frequncia, as seguintes: o OECD - Organisation for Economic Co-Operation and Development: A aplicao dos princpios da cincia e da engenharia no tratamento de matrias por agentes biolgicos na produo de bens e servios (1982). o OTA Office of Technology Assessment: Biotecnologia, de uma forma abrangente, inclui qualquer tcnica que utiliza organismos vivos (ou partes deles) para obter ou modificar produtos, melhorar plantas e animais, ou desenvolver microrganismos para usos especficos (1984). o EFB - European Federation of Biotechnology: Uso integrado da bioqumica, da microbiologia e da engenharia para conseguir aplicar as capacidades de microrganismos, clulas cultivadas animais ou vegetais ou parte dos mesmos na indstria, na sade e nos processos relativos ao meio ambiente (1988). o E.H. Houwink: o uso controlado da informao biolgica (1989). o BIO - Biotechnology Industry Organization: em sentido amplo, Biotecnologia "bio" + "tecnologia", isto o uso de processos biolgicos para resolver problemas ou fazer produtos teis (2003). Observa-se que, com o tempo, o conceito ganha uma expresso mais simples. As definies mais recentes no fazem mais referncia aos processos tecnolgicos envolvidos; talvez porque, alm de complexos e diversos, estes evoluam muito rapidamente. Neste texto consideraremos a biotecnologia de uma maneira ampla, definida como uma atividade baseada em conhecimentos multidisciplinares, que utiliza agentes biolgicos para fazer produtos teis ou resolver problemas. Esta definio suficientemente abrangente para englobar atividades to variadas como as de engenheiros, qumicos, agrnomos, veterinrios, microbiologistas, bilogos, mdicos, advogados, empresrios, economistas etc.(Figura 1.1).
2

BIOTECNOLOGIA 2011 / Captulo 1: O que Biotecnologia?

O IMPACTO DA BIOTECNOLOGIA J no se trata de promessas ou de perspectivas futuras; os produtos e processos biotecnolgicos fazem parte de nosso dia a dia, trazendo oportunidades de emprego e investimentos. Trata-se de plantas resistentes a doenas, plsticos biodegradveis, detergentes mais eficientes, biocombustveis, e tambm processos industriais menos poluentes, menor necessidade de pesticidas, biorremediao de poluentes, centenas de testes de diagnstico e de medicamentos novos (Tabela 1.1).

FIGURA 1.1. O campo da Biotecnologia.


Conhecimentos Agentes biolgicos

Cincia e tecnologia BIOTECNOLOGIA Fazer produtos teis

Organismos, clulas, organelas, molculas

Resolver problemas

TABELA 1.1. Produtos e servios de origem biotecnolgica, em diferentes setores.


SETORES Energia Indstria TIPOS DE PRODUTOS OU SERVIOS Etanol, biogs e outros combustveis (a partir de biomassa). Butanol, acetona, glicerol, cidos, vitaminas etc. Numerosas enzimas para outras indstrias (txtil, de detergentes etc.). Recuperao de petrleo, biorremediao (tratamento de guas servidas e de lixo, eliminao de poluentes). Adubo, silagem, biopesticidas, biofertilizantes, mudas de plantas livres de doenas, mudas de rvores para reflorestamento. Plantas com caractersticas novas incorporadas (transgnicas): maior valor nutritivo, resistncia a pragas e condies de cultivo adversas (seca, salinidade, etc.). Embries, animais com caractersticas novas (transgnicos), vacinas e medicamentos para uso veterinrio. Panificao (pes e biscoitos), laticnios (queijos, iogurtes e outras bebidas lcteas), bebidas (cervejas, vinhos e bebidas destiladas) e aditivos diversos (shoyu, monoglutamato de sdio, adoantes etc.); protena de clula nica (PUC) para raes, alimentos de origem transgnica com propriedades novas. Antibiticos e medicamentos para diversas doenas, hormnios, vacinas, reagentes e testes para diagnstico, tratamentos novos etc.

Meio ambiente

Agricultura

Pecuria

Alimentao

Sade

Maria Antonia Malajovich

BIOTECNOLOGIA E DESENVOLVIMENTO Por se tratar de uma coleo de tecnologias diversas, o uso das biotecnologias no se restringe necessariamente aos pases desenvolvidos. Existe um espao que os pases emergentes podem ocupar, em funo de suas riquezas naturais, desde que existam prioridades econmicas e polticas definidas claramente. A condio fundamental contar com instituies competentes que formem uma massa crtica de pesquisadores e pessoal tcnico treinado. A China e a ndia contam hoje com uma indstria biotecnolgica avanada e diversificada. Assim como a Amrica Latina, onde esta se concentra principalmente na Argentina, no Brasil, no Chile, na Colmbia, em Cuba e no Mxico. Pases como Uruguai e Venezuela tambm tm atividade em algumas reas, assim como, em menor escala, Equador, Costa Rica, Paraguai, Peru e Bolvia. Na regio, umas 500 empresas incidem em vrios setores: meio ambiente e indstria, agroalimentos e pecuria, sade animal e humana. No entanto, a Biotecnologia suscita ainda opinies e sentimentos controversos. Enquanto alguns setores a percebem como uma tecnologia baseada em um slido conhecimento cientfico, para outros se trata de uma atividade antinatural e perigosa. O enfrentamento de partidrios e opositores ocorre com menos frequncia no terreno das razes que no das paixes, sejam elas polticas, religiosas ou ideolgicas. Ao discutir se a biotecnologia progressista ou reacionria, boa ou ruim, se esquece que o que caracteriza uma tecnologia o uso que fazemos dela. Produtos e processos inimaginveis trinta anos atrs entram em nosso cotidiano antes que os alicerces cientficos e tecnolgicos correspondentes se insiram em nossa cultura, atravs de uma divulgao ampla que atinja tambm o sistema educativo em todos os seus nveis. No existe possibilidade alguma de construir uma sociedade moderna se os seus integrantes ignorarem os aspectos mais gerais de cincia e tecnologia. O desconhecimento aumenta o risco de rejeitar tecnologias promissoras, capazes de abrir perspectivas novas, com vistas a um desenvolvimento sustentvel em reas to crticas como a sade, a produo de alimentos, a energia e o meio ambiente. A proposta deste livro revisar os fundamentos das biotecnologias e mostrar como esses se aplicam em diversos setores produtivos da sociedade, destacando como exemplos alguns empreendimentos latino-americanos bem sucedidos. Esperamos que ele seja de ajuda para todos os que nos preocupamos com os alcances desta fascinante (r)evoluo tecnolgica. A HISTRIA DA BIOTECNOLOGIA
DATA ANTIGUIDADE ACONTECIMENTOS FUNDAMENTAIS Preparao e conservao de alimentos e bebidas por fermentao (po, queijo, cerveja, vinho e vinagre); cultivo de plantas (batata, milho, cevada, trigo etc.); domesticao de animais; tratamento de infeces (com produtos de origem vegetal tais como p de crisntemo e derivados de soja com fungos). Destilao do lcool.

IDADE MDIA Sculo XII IDADE MODERNA Sculo XVI Sculo XVII

Cronistas registram a colheita de algas para alimentao, nos lagos de Mxico, pelos astecas. Incio da produo comercial de cerveja; extrao de metais por ao microbiana na Espanha; cultivo de fungos na Frana; Hooke descobre a existncia de clulas (1665).

BIOTECNOLOGIA 2011 / Captulo 1: O que Biotecnologia? Sculo XVIII Invento da mquina a vapor (1752). A partir de 1750, crece o cultivo de leguminosas na Europa e se difunde a prtica de rotao de cultivos, aumentando a produtividade e melhorando o uso da terra.

IDADE CONTEMPORNEA 1797 1809 1835 a 1855 1863 a 1886 Jenner inocula uma criana com um vrus que o protege contra a varola. Appert utiliza o calor para esterilizar e conservar comida, processo que ser utilizado nas campanhas napolenicas. Schleiden, Schwann e Virchow enunciam a teoria celular. Pasteur inventa um processo para conservar alimentos sem alterar suas propriedades organolpticas (Pasteurizao, 1863), derruba a teoria da abiognese (1864), investiga as doenas do bicho-da-seda (1865), identifica a levedura como o agente responsvel pela fermentao alcolica (1876), usa microrganismos atenuados para obter vacinas contra o antraz e a clera (1881), faz os primeiros testes de uma vacina contra a raiva (1881). Paralelamente, Koch inicia o desenvolvimento de tcnicas fundamentais para o estudo dos microrganismos (1876), e enuncia quatro postulados sobre os agentes infecciosos como causa de doenas. Em 1865 Mendel apresenta o seu trabalho Experincias de hibridizao em plantas. Inaugurao em Paris do Instituto Pasteur. Descoberta do vrus do mosaico do tabaco; introduo do trator na agricultura. Bchner mostra que enzimas extradas da levedura podem transformar acar em lcool. Primeiro transplante de um rgo: o rim de um cachorro a outro cachorro. Redescobrimento das leis da hereditariedade, j enunciadas por Mendel em 1865, porm esquecidas. O primeiro transplante de crnea se realiza com sucesso; isto porque a crnea no tem antgenos. Ehrlich descobre o primeiro agente quimioterpico, chamado Salvarsan, que ser utilizado contra sfilis. Em Manchester, na Inglaterra, comeam a ser introduzidos os sistemas de purificao de esgoto baseados na atividade microbiana. Rhm obtm a patente de uma preparao enzimtica para a lavagem de roupas; Weizmann consegue a produo de acetona e butanol por microrganismos. Morgan publica Mechanism of Mendelian Heredity. Imobilizam-se as enzimas, uma tcnica que facilita sua utilizao em processos industriais. Morrem de gripe espanhola mais de vinte milhes de pessoas, um nmero de vtimas superior ao da Primeira Guerra Mundial. Constroem-se biodigestores para a produo de metano (China e ndia). O engenheiro agrcola hngaro Ereky utiliza pela primeira vez a palavra biotecnologia. Muller descobre que os raios X causam mutaes. F. Griffith descobre a transformao, isto a transferncia de informao gentica de uma linhagem bacteriana a outra. Comercializao do milho hbrido, isto de sementes de um milho mais produtivo. Obteno de cido ctrico por fermentao. Na Frana, produo comercial de um biopesticida (Bacillus thuringiensis). Avanos na mecanizao do trabalho agrcola. Produo em grande escala da penicilina (descoberta por Fleming em 1928, desenvolvida por Florey e Chain). Inseminao artificial de gado utilizando smen congelado. Descoberta da presena de genes saltatrios no milho por Brbara Mc Clintock. J. D. Watson e F. Crick propem um modelo da estrutura do DNA. Reinart regenera plantas de cenoura a partir de uma cultura de clulas (calo).

1887 1892 1897 1899 1900 1905 1906 1910 1912 a 1914 1915 1916 1918

1919 1927 1928 1933 1936 1938 1940 a 1950 1944 1951 1953 1959

Maria Antonia Malajovich 1960 1961 1962 1967 1968 1973 Aumento da produo de cido lctico, cido ctrico, acetona e butanol por via fermentativa. Descoberta do cdigo gentico. Desenvolvimento de uma protease alcalina para uso em sabes para a lavagem de roupas pela empresa dinamarquesa Novo. Plantio de novas variedades de trigo mais produtivas, no Mxico, dando incio ao que ser chamado de Revoluo Verde. Primeiro transplante de corao, na frica do Sul. O paciente sobrevive 18 dias. Produo industrial de aminocidos utilizando enzimas imobilizadas. Havendo desenvolvido tcnicas de corte e reunio do DNA, Cohen e Boyer transferem um gene a um organismo de outra espcie. Lanado no Brasil o programa de produo de lcool a partir de biomassa (Pr-lcool) G. J. F. Khler e C. Milstein desenvolvem a tecnologia de hibridomas e obtm anticorpos monoclonais. A empresa Novo produz xarope com alto contedo de frutose por via enzimtica como adoante alternativo sacarose. A Conferncia de Asilomar pede ao National Institute of Health (NIH) que sejam estabelecidas normas para a regulao dos experimentos com DNA-recombinante, o que acontecer meses mais tarde. Utilizao da tcnica de hibridizao molecular no diagnstico pr-natal da alfa talassemia. Genentech, Inc., a primeira empresa biotecnolgica, fundada um ano antes por Boyer e Swanson, obtm a protena somatotropina (hormnio de crescimento) mediante a tecnologia do DNA-recombinante. Nasce na Inglaterra Louise Brown, o primeiro beb de proveta. Produo do hormnio de crescimento humano, utilizando a tecnologia do DNArecombinante. A Suprema Corte de Justia dos Estados Unidos aprova o princpio de patentes para as formas de vida de origem recombinante. As primeiras patentes so de A. N. Chakrabarty, para um microrganismo para biorremediao de petrleo, e de H. Cohen e S.Boyer, pelo processo de 1973. K. Mullis inventa a tcnica da Reao em Cadeia de Polimerase (PCR) cuja patente ser obtida por Cetus, Inc. em 1985 e vendida em 1991 a Hoffman-La Roche, Inc. por 300 milhes de dlares. Obteno da primeira planta geneticamente modificada. Obteno da primeira linhagem de clulas-tronco de camundongo. A insulina humana de origem recombinante da Genentech, Inc. comercializada. Uma licena ser obtida mais tarde pela empresa Eli Lilly, que a vender com o nome de Humulina. A primeira vacina de DNA-recombinante para o gado comercializada na Europa. Realizam-se as primeiras experincias de Engenharia Gentica em plantas (petnia). Syntex Corporation recebe a aprovao da Food and Drug Administration (FDA) de um teste para Chlamydia trachomatis baseado na utilizao de anticorpos monoclonais. Isolado o vrus HIV no Instituto Pasteur (Frana) e no NIH (National Institute of Health, Estados Unidos). A. Jeffreys introduz a tcnica do Fingerprint (impresses digitais), que, um ano depois, ser utilizada pelos tribunais para a identificao de suspeitos. Clonagem e sequenciamento do genoma do HIV pela empresa Chiron Corp. A Environmental Protection Agency (EPA) dos Estados Unidos aprova a liberao de plantas de tabaco transgnicas. Um grupo de especialistas em segurana em Biotecnologia da Organizao para a Cooperao Econmica e o Desenvolvimento (OECD) declara que a previsibilidade das mudanas genticas obtidas por Engenharia Gentica frequentemente maior que a correspondente s tcnicas tradicionais, e que os riscos associados com organismos transgnicos podem ser avaliados do mesmo modo que os riscos associados aos outros organismos. Aprovada a primeira vacina biotecnolgica para uso humano, trata-se de Recombivax-HB, contra a hepatite B.

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BIOTECNOLOGIA 2011 / Captulo 1: O que Biotecnologia? 1987 Advanced Genetic Sciences libera em campo bactrias DNA-recombinante (Frostban) que inibem a formao de gelo nos cultivos de morango, na Califrnia; a FDA aprova o fator ativador de plasminognio, obtido por engenharia gentica, para o tratamento de ataques cardacos. A Universidade de Harvard obtm a patente de um rato transgnico desenvolvido especialmente para o estudo do cncer; na mesma dcada, os europeus obtero a patente de outro rato transgnico, sensvel a substncias carcinognicas. Genencor International Inc. obtm a patente de um processo que permite obter enzimas (proteases) resistentes a alvejantes (processo bleach) para a fabricao de sabes para a lavagem de roupa. Com a criao do National Center for Human Genome Research se inicia o mapeamento do genoma humano. Primeira experincia de terapia gnica para uma doena rara (ADA) em uma menina de quatro anos. Pfizer comercializa Chy-Max TM, uma enzima de origem recombinante para a preparao de queijos. GenPharm International, Inc. consegue uma vaca transgnica que produz no leite protenas humanas para alimentao infantil. A Universidade da Califrnia (UCSF) e a Universidade de Stanford contabilizam 100 patentes relativas ao DNArecombinante. Uma tcnica, elaborada por cientistas americanos e britnicos, permite testar anormalidades como a fibrose cstica e a hemofilia em embries in vitro. A FDA declara que os alimentos de origem transgnica no demandam uma regulao especial. Aprovada a utilizao do hormnio de crescimento bovino rBGH/rBST, produzido por Monsanto Co., para aumentar a produo de leite. Lanamento no mercado do tomate FlavSavr, que, devido inativao de um gene, amadurece na planta. Decifrado o primeiro genoma de uma bactria, Haemophilus influenzae. Sequenciado o primeiro genoma de um organismo eucarionte, a levedura Saccharomyces cerevisiae. Desenvolve-se o primeiro GeneChip (Stanford, Affymetrix). No Reino Unido, nascem Dolly, uma ovelha clonada, e, meses mais tarde, uma segunda ovelha, Polly, clonada e geneticamente modificada. Os cultivos transgnicos so introduzidos em vrios pases. Contabilizam-se mais de 1.500 empresas de Biotecnologia nos Estados Unidos e mais de 3.000 no mundo. Clulas-tronco embrionrias so utilizadas para regenerar tecidos. Sequenciamento do primeiro genoma animal, o verme Caenorrabditis elegans. Isolada a primeira linhagem de clulas-tronco embrionrias humanas. Sequenciamento do primeiro cromossomo humano. Pesquisadores descobrem que as clulas-tronco podem ser induzidas a se diferenciar em diversos tipos celulares. O rascunho do sequenciamento do genoma humano anunciado simultaneamente por Collins, do Consrcio do Genoma Humano, e Venter, da Celera Inc. Sequenciados tambm o genoma da mosca Drosophila melanogaster, o primeiro genoma de uma planta (Arabidopsis thaliana) e, no Brasil, o de uma bactria que ataca os ctricos (Xylella fastidiosa). O rascunho do sequenciamento do Genoma Humano publicado simultaneamente nas revistas Science e Nature. Sequenciamento do genoma de plantas de interesse agronmico para os pases em desenvolvimento (arroz, banana). Sequenciamento do genoma de bactrias de importncia agronmica. Obteno de clulas sanguneas a partir de clulas-tronco embrionrias. Completados o rascunho do proteoma funcional da levedura e o sequenciamento do genoma do agente e do vetor transmissor da malria. Identificam-se mais de 200 genes envolvidos na diferenciao das clulas-tronco. Descoberta da participao de molculas de RNA na regulao de vrios processos celulares. Em diversos pases inicia-se a utilizao de clulas-tronco adultas para o tratamento experimental de diversas doenas (leucemia, mal de Chagas, diabetes e anemia falciforme). 7

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Maria Antonia Malajovich 2003 Comercializao como mascote, do GloFish, um peixe transgnico que brilha na escurido, originalmente criado para detectar poluentes. Clonagem de vrios tipos de animais e de espcies ameaadas de extino. Comercializao de novos medicamentos (Avastin ou bevacizumab) e testes de diagnsticos. O grupo de pesquisadores liderado por S. Yamanaka consegue induzir a pluripotencialidade celular em clulas somticas. As autoridades europeias de segurana alimentar concluem que os genes marcadores de resistncia aos antibiticos no apresentam riscos relevantes para a sade humana ou animal nem para o meio ambiente. Pesquisadores japoneses desenvolvem a primeira rosa azul, geneticamente modificada. Autorizada na Unio Europeia a comercializao da batata transgnica Amflora (BASF) para uso industrial. Pesquisadores do Instituto Craig Venter constroem a primeira clula sinttica.

2004 2006 2007

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2. AS CLULAS E OS CROMOSSOMOS

A CLULA COMO UNIDADE DOS SERES VIVOS

UNIDADE ESTRUTURAL A clula a unidade estrutural dos seres vivos. Trate-se de bactrias, amebas, espermatozoides ou neurnios, todas as clulas so formadas por gua, ons inorgnicos e molculas orgnicas (protenas, carboidratos, lipdios e cidos nucleicos). E todas elas apresentam uma membrana plasmtica que separa o citoplasma do meio externo e permite o intercmbio de molculas entre ambos. As clulas procariticas se encontram exclusivamente no Reino Monera. Pequenas (0,001 a 0,005 mm) e com requerimentos nutricionais simples, estas clulas se multiplicam rapidamente. A informao gentica se encontra em um cromossomo circular formado por uma molcula de DNA e associado a uma invaginao da membrana plasmtica (mesossomo). Pequenas molculas circulares adicionais (plasmdeos) podem tambm estar presentes. Numerosos ribossomos asseguram a sntese proteica (Figura 2.1). Bem mais complexa a estrutura das clulas eucariticas, presentes nos quatro Reinos restantes (Protista, Fungo, Planta e Animal). Com um tamanho variando entre 0,01 e 0,10 mm, estas clulas so dez vezes maiores que as procariticas. A presena de compartimentos diferenciados, ou organelas, que cumprem atividades especficas, resulta em uma subdiviso do trabalho que garante a eficincia do funcionamento celular (Figura 2.2). O citoplasma percorrido por um sistema de membranas, o retculo endoplasmtico, que est associado aos ribossomos e, por conseguinte, sntese de protenas. Processados no aparelho de Golgi, os produtos celulares so secretados ou distribudos em outras estruturas (lisossomos, membrana celular). O metabolismo energtico est associado a organelas citoplasmticas, complexas e rodeadas de membranas (mitocndrias, cloroplastos e peroxissomos). Um citoesqueleto, formado por tbulos e filamentos proteicos, mantm a forma da clula, alm de assegurar o transporte interno das organelas e os movimentos celulares. A informao gentica est distribuda em cromossomos, cada um deles formado por uma molcula linear de DNA associada a protenas. Os cromossomos e o nuclolo se encontram no ncleo, que funciona como um centro de controle celular. A membrana nuclear, um envoltrio com poros que separa o ncleo do citoplasma, permite o intercmbio de substncias entre ambos. Apesar de ter uma organizao muito parecida, as clulas animais diferem das clulas vegetais em alguns aspectos. Nas clulas vegetais encontramos uma parede celular ao redor da membrana plasmtica; o citoplasma contm cloroplastos, onde ocorre a fotossntese, e grandes vacolos, onde se armazenam substncias e degradam macromolculas. Nenhuma dessas estruturas se observa nas clulas animais; estas tm um centrolo que falta nas clulas vegetais (Tabela 2.1).

Copyright Maria Antonia Malajovich Biotecnologia: ensino e divulgao (www.bteduc.bio.br)

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FIGURA 2.1. Representaes esquemticas da estrutura celular.

Clula procaritica (bacteriana)

Clula eucaritica (vegetal)

Clula eucaritica (animal)

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BIOTECNOLOGIA 2011 / Captulo 2: As clulas e os cromossomos

TABELA 2.1. A funo e a distribuio das estruturas celulares.


Estrutura FUNO CLULA BACTERIANA CLULA ANIMAL Ausente CLULA VEGETAL Presente

Parede celular

Manuteno da forma e proteo da clula. Manuteno da estabilidade do meio intracelular; controle das trocas entre a clula e o meio extracelular. Controle do fluxo de substncias entre o ncleo e o citoplasma. Controle da estrutura e do funcionamento celular. Formao de ribossomos. Formao de clios e flagelos; participao na diviso celular. Sntese de protenas. Sntese de protenas. Sntese de lipdios; armazenamento e inativao de substncias. Secreo celular. Respirao celular aerbia. Equilbrio osmtico e armazenamento. Digesto intracelular. Fotossntese. Manuteno da forma celular; contrao; ancoragem de organelas.

Presente ou ausente

Membrana plasmtica

Presente

Carioteca ou membrana nuclear

Ausente nico e circular; apenas DNA. Ausente

Presente Mltiplos e lineares; DNA e protenas. Presente

Cromossomo(s)

Nuclolo(s) Centrolos

Ausente

Presente Presente

Ausente

Ribossomos Retculo endoplasmtico rugoso Retculo endoplasmtico liso

Ausente

Presente

Complexo de golgi Mitocndrias Vacolo central

Presente Ausente Presente Ausente Ausente Ausente Presente

Lisossomos Cloroplastos Citoesqueleto

Ausente

Presente

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UNIDADE FUNCIONAL A clula tambm a unidade funcional de um organismo O citoplasma uma soluo viscosa onde continuamente ocorrem reaes de sntese e degradao de substncias, consumindo ou liberando energia. Estas reaes constituem o que denominamos metabolismo. As reaes metablicas so facilitadas por protenas com atividade cataltica, denominadas enzimas. Assim como as protenas estruturais, as enzimas se sintetizam nos ribossomos, que so pequenos componentes citoplasmticos, no membranosos. A estrutura das protenas depende da informao gentica codificada no cido desoxirribonucleico (DNA) e transcrita no cido ribonucleico (RNA), que a leva do ncleo at o citoplasma. As semelhanas de estrutura e funcionamento celulares decorrem de uma origem evolutiva comum, aproximadamente 3,8 milhes de anos atrs. Os dois tipos celulares que reconhecemos hoje, as clulas procariticas e as eucariticas, apareceram entre um e um milho e meio de anos mais tarde. TCNICAS LABORATORIAIS O estudo das clulas se v facilitado por um conjunto de tcnicas laboratoriais, tais como: o Tcnicas microscpicas que permitem uma visualizao detalhada da clula:
Microscopia ptica, que se utiliza para observar os cortes de tecidos. Geralmente, estes so fixados (lcool, cido actico, formaldedo) e tingidos com corantes que reagem com as protenas ou com os cidos nucleicos, aumentando o contraste da imagem. Microscopia de contraste de fase, que transforma as diferenas de espessura ou de densidade do fragmento observado em diferenas de contraste. Microscopia fluorescente, que associa anticorpos especficos a um reagente como o PVF (protena verde fluorescente de medusa), de forma a marcar as molculas e visualizar sua distribuio nas clulas. Microscopia confocal, que combina a microscopia fluorescente com a anlise eletrnica da imagem, fornecendo uma imagem tridimensional. Microscopia eletrnica, que permite a observao em um plano de cortes tingidos com sais de metais pesados (microscopia de transmisso) e a observao tridimensional de clulas (microscopia de varredura). Microscopia de tunelamento, com os diversos tipos de microscpios de varredura por sonda (SPM, do ingls scanning probe microscope) que, alm de fornecer uma imagem de molculas e tomos, permitem medies e a manipulao de molculas e tomos.

o Tcnicas fsicas como a centrifugao diferencial (ultracentrifugao, centrifugao em gradiente) para separar os componentes celulares para estudos bioqumicos posteriores. o Tcnicas instrumentais que possibilitam a contagem de clulas e a separao de populaes celulares (cell sorter) ou de cromossomos (flow sorter). o Tcnicas de cultura de clulas com objetivos diversos.

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TODA CLULA DERIVA DE OUTRA PREEXISTENTE Assim como uma planta se forma a partir de outra planta e um animal de outro animal, toda clula deriva de outra preexistente. Este conceito, enunciado por R. Virchow em 1855, no foi plenamente aceito at dez anos mais tarde, quando L. Pasteur mostrou experimentalmente que a proliferao de microrganismos em um meio orgnico estril se deve contaminao deste com os microrganismos presentes no ar, que, ao encontrar um meio propcio, se multiplicam rapidamente. Todo organismo multicelular se forma a partir da multiplicao de uma nica clula-ovo ou zigoto. As contribuies dos genes maternos e paternos para o desenvolvimento do embrio no so idnticas (imprinting). As clulas embrionrias se diferenciam, formando mais de 200 tipos de clulas em animais, e um pouco menos nos vegetais. Os diferentes tipos celulares cumprem funes especficas que, integradas, asseguram a unidade do organismo. Nos vegetais, a persistncia de tecidos embrionrios totipotentes (meristemas) na planta adulta permite o crescimento e a regenerao durante a vida toda do organismo. Em condies apropriadas, clulas especializadas podem reverter a um estado no diferenciado e regenerar um organismo completo e diferenciado. Nessas propriedades se fundamenta a propagao de plantas in vitro. Nos animais superiores, a totipotncia se restringe s clulas do embrio com menos de quatro dias, que so as nicas capazes de regenerar um organismo inteiro. No entanto, no embrio de mais de quatro dias, algumas clulas internas do blastcito (clulas-tronco embrionrias) podem originar todos os tecidos do organismo, sendo consideradas pluripotentes (Figura 2.3). Tambm tecidos adultos (medula ssea, sangue, crnea e retina, polpa dentria, fgado, pele, trato digestivo e pncreas) apresentam clulas-tronco. Elas podem permanecer nos tecidos, multiplicando-se durante longos perodos de tempo sem que ocorra a diferenciao. Em determinadas condies fisiolgicas, essas clulas-tronco adultas originam clulas especializadas de vrios tipos, assegurando a manuteno e o reparo do tecido onde se encontram. Um nico tipo de clula-tronco multipotente da medula ssea, por exemplo, gera todas as clulas sanguneas (hemcias, leuccitos e plaquetas). Clulas-tronco unipotentes se diferenciam em uma nica linhagem celular como, por exemplo, os queratincitos da pele.

FIGURA 2.2. As clulas-tronco embrionrias.


As clulas-tronco podem ser extradas do blastcito com 5 a 7 dias e cultivadas in vitro; colocadas em condies experimentais adequadas, diferenciam-se nos distintos tipos celulares.

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Por serem mais fceis de conseguir, as clulas-tronco adultas encontraram rapidamente aplicaes teraputicas promissoras. No aconteceu o mesmo com as clulas-tronco embrionrias. Estas podem ser obtidas seja a partir de um embrio, obtido por transferncia de um ncleo a um ovcito anucleado, seja a partir dos embries supernumerrios congelados nas clnicas de fertilizao assistida. Os dois mtodos suscitaram grandes debates ticos em torno de quem forneceria os ovcitos e do status do embrio. A polmica comea a esmorecer com o desenvolvimento de uma tecnologia que permite obter, a partir de clulas somticas, clulas iPS (do ingls, induced pluripotent stem cells) com propriedades equivalentes s das clulas-tronco embrionrias. A induo de pluripotencialidade mediante a insero de alguns genes em clulas adultas um passo importante para acabar com a necessidade de utilizar embries congelados. A tecnologia de reprogramao celular se desenvolve rapidamente, aumentando nosso conhecimento sobre o controle gentico da diferenciao e abrindo uma nova senda para a implementao de testes, medicamentos e tratamentos novos. Entender os mecanismos que controlam o crescimento e a diferenciao celular um dos maiores desafios atuais, porque as clulas-tronco possibilitaro novos tratamentos de regenerao celular para doenas cardacas, diabetes e doena de Parkinson. OS CROMOSSOMOS Cada cromossomo est formado por um filamento de DNA enrolado, a espaos regulares, sobre protenas (histonas). Durante a maior parte do ciclo celular, os cromossomos se encontram distendidos, formando uma rede de filamentos finos (cromatina). Na diviso celular, a cromatina se condensa, possibilitando a observao microscpica dos cromossomos. Do ponto de vista morfolgico, estes se caracterizam pelo tamanho e a posio do centrmero, uma constrio que divide o cromossomo em dois braos. O nmero de cromossomos n constante em todos os indivduos de uma mesma espcie; n = 4 em Drosophila melanogaster e n = 23 no homem, por exemplo. Como nas clulas somticas os cromossomos se encontram sempre em pares, na espcie humana o nmero de cromossomos (2n) de 46, sendo que um par determina o sexo. Os cromossomos sexuais so idnticos na mulher (46, XX) e diferentes no homem (46, XY). Em outras espcies, a determinao do sexo segue mecanismos diversos. Um pouco antes da diviso de uma clula, os cromossomos se duplicam, de maneira que cada uma das clulas filhas recebe 2n cromossomos. A mitose mantm constante o nmero de cromossomos nas clulas somticas dos indivduos de uma mesma espcie. J nas clulas reprodutivas, a meiose reduz a n o nmero de cromossomos; na fecundao, a fuso dos gametas ir restaurar o nmero n caracterstico da espcie. Durante a meiose, o entrecruzamento dos cromossomos permite a permuta e recombinao dos genes (Figura 2.4). Durante a formao dos gametas, erros na disjuno dos cromossomos podem dar origem a indivduos com frmulas cromossmicas alteradas. Na sndrome de Down, por exemplo, a pessoa apresenta geralmente um cromossomo 21 adicional. (mulheres 47, XX + 21; homens 47, XY + 21). Estima-se que a percentagem de recm-nascidos com alguma anomalia cromossmica estaria em torno de 0,85%, dos quais s alguns apresentariam algum sintoma. Alteraes cromossmicas tambm podem ser relacionadas com alguns tipos de cncer. Na leucemia mieloide crnica, por exemplo, se observa a translocao recproca de dois pedaos dos cromossomos 9 e 22. De um modo geral, frequente encontrar alteraes no nmero de cromossomos das clulas cancerosas.

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A TEORIA CROMOSSMICA DA HEREDITARIEDADE Em 1865, Gregor Mendel apresentou seu trabalho Experincias de hibridizao em plantas; este reunia os resultados experimentais realizados com ervilhas (Pisum sativum), durante sete anos, no jardim do monastrio Agostino de Brno (Morvia). Apesar de passar quase despercebido, o trabalho acabou sendo distribudo por vrias bibliotecas da Europa e Amrica, graas a sua publicao um ano mais tarde nos Anais da Sociedade de Histria Natural. No texto figuram algumas generalizaes. Conhecida como Primeira Lei de Mendel, Lei de Segregao ou Monoibridismo, a primeira delas se refere segregao dos fatores (alelos) de um par (um gene) na formao de gametas. A segunda, que conhecida como Segunda Lei de Mendel, Lei de Segregao Independente ou Diibridismo, se refere segregao dos fatores (alelos) de dois ou mais pares (dois ou mais genes) independentes na formao de gametas.

FIGURA 2.3. Mitose e meiose.


Durante a meiose, a permuta de fragmentos cromossmicos homlogos possibilita a recombinao dos genes.

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FIGURA 2.4. Monoibridismo.


A cor do corpo da Drosophila depende de um gene, localizado no cromossomo III, com dois alelos (e = corpo preto ou ebony, e+= corpo amarelo). O cruzamento entre duas linhagens puras de moscas que diferem pela cor do corpo (amarelo ou preto) gera, na primeira gerao (F1), moscas de corpo amarelo, mostrando a recessividade do alelo e. Do cruzamento entre indivduos da F1 nasce uma segunda gerao (F2) com uma proporo fenotpica de 3 moscas amarelas: 1 mosca preta. Esta proporo decorre da segregao dos alelos de um gene, na formao de gametas.

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BIOTECNOLOGIA 2011 / Captulo 2: As clulas e os cromossomos

FIGURA 2.5. Diibridismo.


A cor do corpo da Drosophila depende de um gene, localizado no cromossomo III, com dois alelos (e = corpo preto ou ebony; e+= corpo amarelo). A presena ou ausncia de olhos depende de um gene, localizado no + cromossomo IV, com dois alelos (ey = sem olhos, ey = com olhos). O cruzamento entre duas linhagens puras de moscas que diferem pela cor do corpo (amarelo ou preto) e a presena ou ausncia de olhos gera, na primeira gerao (F1), moscas com olhos e de corpo amarelo, mostrando a recessividade dos alelos ey e e. Do cruzamento entre moscas da F1 nasce uma segunda gerao (F2) com uma proporo fenotpica de 9 moscas amarelas com olhos: 3 moscas amarelas sem olhos, 3 moscas pretas com olhos: 1 mosca preta sem olhos. Esta proporo decorre da segregao independente dos alelos dos genes localizados em diferentes cromossomos homlogos na formao de gametas.

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Em 1900, depois de chegar de maneira independente a concluses semelhantes, os pesquisadores K. Correns, E. Von Tschermak e H.de Vries redescobriram nas bibliotecas o trabalho de Mendel. Nesse intervalo de 35 anos tinha sido descrita a diviso celular (mitose, 1875; meiose, 1890); o prximo passo correspondeu a Sutton e Boveri (1902), sugerindo que os fatores hereditrios de Mendel estariam nos cromossomos. A confirmao desta hiptese decorreu dos trabalhos de T.H.Morgan e sua brilhante equipe na Universidade de Columbia (Nova York), com a mosca da fruta, Drosophila melanogaster. Em 1910, depois de uma srie de cruzamentos e de anlises estatsticas, Morgan mostrou que a herana da cor branca do olho do mutante white est associada transmisso do cromossomo X, que determina o sexo. Morgan e seus colaboradores identificaram numerosos outros mutantes de Drosophila melanogaster com um padro mendeliano de hereditariedade. Alm de moscas com olhos brancos em vez de vermelhos, encontraram outras com asas curtas em vez de longas, com corpo de cor marrom ou preta em vez de amarela etc. Os genes correspondentes se classificam em quatro grupos de ligao, sendo que cada um deles est associado a um dos quatro pares de cromossomos da Drosophila. Como durante a meiose se produzem permutas entre segmentos cromossmicos, nos cruzamentos aparecem indivduos recombinantes, isto , com outras combinaes gnicas diferentes das previstas pelas leis mendelianas. A partir dos dados obtidos em milhares de cruzamentos sobre a recombinao dos genes de um mesmo grupo de ligao chega-se a estabelecer a distncia gentica entre estes. Com a descoberta de clulas com cromossomos gigantes (politnicos) nas glndulas salivares das larvas de drosfila, comearam os primeiros trabalhos de mapeamento, associando os dados genticos aos dados fsicos. A observao microscpica das bandas nos cromossomos mostrou com enorme riqueza de detalhes uma sucesso consistente de bandas largas e estreitas. Da associao entre os mtodos genticos e os mtodos citolgicos surgiram os primeiros mapas fsicos, associando uma regio cromossmica a cada gene. Das descobertas de Morgan e sua equipe, nasce a Teoria do Gene, segundo a qual:

1. Os caracteres de um indivduo correspondem a elementos pares, os genes. 2. Os genes esto ligados uns aos outros nos cromossomos, formando um determinado nmero de grupos de ligao. 3. Os genes de cada par se separam durante a gametognese, de acordo com a Primeira Lei de Mendel e, em consequncia, cada gameta fica contendo apenas um conjunto de genes (Figura 2.4). 4. Os genes pertencentes a grupos de ligao diferentes segregam independentemente, de acordo com a Segunda Lei de Mendel (Figura 2.5). 5. Entre os elementos pertencentes a cada grupo de ligao, ocorre uma troca ordenada chamada permuta ou crossing-over, que leva recombinao dos genes (Figura 2.3). A frequncia da permuta fornece a prova da linearidade dos genes em cada grupo de ligao e permite determinar sua posio relativa.

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Os estudos posteriores mostraram a complexidade dos padres de hereditariedade, que incluem casos de: o Alelismo mltiplo, quando um gene admite mltiplos alelos; dominantes, recessivos ou codominantes (Sistema ABO, por exemplo). o Pleiotropia, quando um gene determina diversos caracteres (pelagem e sobrevivncia em ratos, por exemplo). o Herana polignica, quando um carter est determinado por vrios genes de efeito cumulativo (altura, cor dos olhos). o Interao gnica, quando uma caracterstica depende da ao de muitos genes. Finalmente, deve-se destacar que o fentipo de um indivduo o resultado da interao entre o gentipo e o ambiente em que este se expressa. CLULAS E CROMOSSOMOS COMO AGENTES BIOLGICOS Um dos testes pioneiros de diagnstico gentico est baseado na observao microscpica dos cromossomos de clulas somticas durante a diviso celular (mitose). A identificao se v facilitada pela presena de regies ou bandas reveladas mediante algumas tcnicas de colorao. O nmero e a estrutura dos cromossomos so analisados e apresentados em um arranjo (caritipo) que segue uma classificao convencional (Figura 2.6). Os testes de diagnstico gentico envolvendo a anlise de caritipos esto amplamente difundidos na prtica mdica, sendo facilitados atualmente pela utilizao de corantes especficos para cada par cromossmico. FIGURA 2.6. Representao dos cromossomos humanos.
O arranjo segue uma classificao convencional que leva em conta o tamanho, a posio do centrmero (tracejado no esquema) e o padro das bandas de cada cromossomo.
Fonte: http://www.molecularstation.com/molecular-biology-images/data/502/karyotype.png

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Como agentes biolgicos, as clulas encontram outras aplicaes (Tabela 2.2). Clulas vegetais cultivadas in vitro produzem substncias de alto valor agregado, importantes para as indstrias alimentar, cosmtica e farmacutica. Tambm se utilizam para regenerar plantas. A multiplicao de vrus em cultivos de clulas de insetos permite a comercializao de prticas de controle biolgico. A sntese de algumas substncias importantes para a indstria farmacutica, como o fator ativador de plasminognio, depende do cultivo in vitro de clulas animais. Estas tambm substituem os animais nos testes toxicolgicos e so utilizadas na multiplicao de vrus para a preparao de vacinas. Tambm possibilitam a produo de anticorpos. Combinando as tcnicas de cultivo celular com o desenvolvimento de materiais biolgicos semelhantes ao colgeno, uma rea nova de engenharia de tecidos visa a reparao ou substituio de tecidos lesionados. Os enxertos de pele artificial, cultivada in vitro, saram ferimentos e/ou queimaduras em seres humanos. TABELA 2.2. As clulas como agentes biolgicos.
Indstria alimentar e cosmtica (adoantes, corantes, flavorizantes e aromatizantes). Indstria farmacutica (alcaloides e esteroides). CLULAS Animais e/ou humanas Estudos toxicolgicos. Diagnstico clnico (caritipos). Indstria farmacutica (produo de anticorpos e vacinas). Medicina regenerativa (produo de tecidos de substituio).

Vegetais

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3. OS MICRORGANISMOS

A DIVERSIDADE MICROBIANA O termo microrganismos se aplica a um grupo heterogneo de seres que vivem como clulas independentes ou como agregados celulares: bactrias, arqueas, protozorios, algas e fungos e, tambm, vrus (Tabela 3.1). Salvo estes ltimos, que esto na fronteira entre o vivo e o no vivo, os encontramos dentro dos trs domnios em que se classificam os seres vivos: Bacteria, Archaea e Eukarya. TABELA 3.1: Os microrganismos dentro do marco da uma classificao biolgica atual.
DOMNIO REINO TIPO DE CLULA ESTRUTURA CELULAR BACTERIA EUBACTERIA Procaritica ARCHAEA ARCHAEBACTERIA Procaritica EUKARYA PROTISTA Eucaritica FUNGI Eucaritica PLANTAE Eucaritica ANIMALIA Eucaritica

Parede celular com peptidoglicano

Parede celular sem peptidoglicano

Parede celular de celulose, em alguns. Presena de cloroplastos, em alguns.

Parede celular Parede celular de Sem parede de quitina. celulose. celular nem cloroplastos. Ausncia de cloroplastos. Presencia de cloroplastos. Uni ou pluricelular Heterotrfica (absoro) Leveduras, Mofos, Bolores e Cogumelos. Pluricelular Pluricelular

ORGANIZAO Unicelular

Unicelular

Uni ou pluricelular Autotrfica ou Heterotrfica Protozorios e Algas

NUTRIO (*)

Autotrfica ou Autotrfica Heterotrfica ou Heterotrfica Eubactrias Arqueas

Autotrfica

Heterotrfica (ingesto) Invertebrados e Cordados

EXEMPLOS

Brifitas (musgos), Pteridfitas (samambaias), Gimnospermas e Angiospermas.

* Nutrio
Nutrio autotrfica: o organismo produz seu prprio alimento a partir de substncias inorgnicas e de uma fonte de energia. Os seres autotrficos podem realizar fotossntese (para a qual a fonte de energia a luz solar) ou quimiossntese (para a qual a fonte de energia uma reao qumica exotrmica). Nutrio heterotrfica: o organismo se alimenta de molculas orgnicas elaboradas por outros seres vivos por absoro (captao de nutrientes dissolvidos na gua), ou ingesto (entrada de partculas de alimentos no dissolvidas).

Copyright Maria Antonia Malajovich Biotecnologia: ensino e divulgao (www.bteduc.bio.br)

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Os microrganismos mostram uma diversidade surpreendente de estrutura e modos de vida. Alguns so procariontes, como as bactrias; outros eucariontes, como os protozorios, as algas e os fungos. Os aerbios crescem se houver oxignio, os anaerbios se no o houver. Formas livres colonizam todos os ambientes terrestres, desde o cume das montanhas at as profundidades dos oceanos. Mas h tambm parasitas que crescem custa de outros seres vivos, onde encontram abrigo e alimento, e os que mostram diversos graus de dependncia de outros seres vivos. Os auttrofos sintetizam seus alimentos a partir de dixido de carbono; os fotossintticos utilizam a luz como fonte de energia e os quimiossintticos, algumas reaes qumicas inorgnicas. Os hetertrofos dependem das molculas orgnicas elaboradas pelos auttrofos, que absorvem ou ingerem. O fato de mant-los agrupados sob a denominao de microrganismos talvez obedea menos a uma questo de semelhana que a razes prticas; j que os mesmos mtodos bsicos de estudo (isolamento, cultura in vitro, identificao) podem ser aplicados, com pequenas variaes, a esses grupos. AS EUBACTRIAS As eubactrias ou bactrias so organismos unicelulares procariticos em que uma parede celular pode cumprir uma funo protetora. Alm do DNA cromossmico, podem apresentar molculas circulares extras de DNA denominadas plasmdeos. Em condies favorveis de umidade, acidez e temperatura, as bactrias se multiplicam rapidamente por fisso celular produzindo milhes de clulas em poucas horas (Figura 3.1). Em uma de suas acepes, a palavra clone se aplica s clulas que derivam de uma nica clula. Algumas espcies bacterianas tambm mantm formas de reproduo sexuada, possibilitando a recombinao do material gentico. As eubactrias formam um grupo com mais de 5.000 espcies conhecidas. Pequenas (0,00050,005 mm) e de formas diversas (esfricas, bastonetes, helicoidais), elas podem ser encontradas isoladas ou em pares, cadeias ou agregados. Algumas se locomovem livremente, mediante um ou mais flagelos distribudos na superfcie celular, outras se aderem mediante pelos ou fmbrias a um organismo hospedeiro. O grupo inclui tambm as cianobactrias, que sero comentadas mais adiante junto com as algas. Em condies desfavorveis, algumas bactrias formam esporos que resistem em forma latente at que a situao mude, germinando e retomando sua atividade fisiolgica. Um exemplo interessante, na Europa do sculo XIX, o da existncia de campos malditos, campos em que as ovelhas no deviam transitar, devido ao alto risco de contrair o carbnculo ou antraz. De fato, os bacilos presentes nos animais vitimados pela doena e enterrados nesses campos formavam esporos que, trazidos superfcie pelas minhocas, contaminavam as pastagens. Uma tcnica laboratorial (colorao de Gram) permite diferenciar as bactrias pela estrutura da parede celular. Entre as Gram-positivas, cuja parede celular mais simples, encontramos gneros como Clostridium, Bacillus, Mycobacterium (com algumas espcies que causam a tuberculose e a lepra) e os Actinomicetes, como Streptomyces, produtora de antibiticos como a estreptomicina. Entre as Gram-negativas, encontramos os micoplasmas, Escherichia coli, uma colonizadora do trato digestivo de muitos organismos, Salmonella, um agente de muitas intoxicaes alimentares, as cianobactrias fotossintticas, os espiroquetas (Treponema pallidum e Borrelia burgdorferi, causantes da sfilis e da doena de Lyme, respectivamente) e as clamdias (responsveis por tracoma e uretrites).

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Estima-se que as bactrias sejam responsveis por aproximadamente metade das doenas humanas. As Gram-negativas resultam mais difceis de tratar que as Gram-positivas, devido a uma camada adicional na parede celular que as protege e dificulta a entrada de antibiticos. Assim como o homem, os animais e as plantas tambm so afetados por patgenos bacterianos. O dano decorre da invaso dos tecidos do hospedeiro ou da liberao de substncias txicas (exo e endotoxinas). Mas nem todas so patognicas. A participao das bactrias na reciclagem dos elementos fundamental do ponto de vista ecolgico, possibilitando o tratamento de resduos e de guas servidas e, tambm, a eliminao de compostos recalcitrantes (biorremediao) e a extrao de minrios (biolixvia). Por outro lado, a fixao de nitrognio e a produo de toxinas pesticidas contribuem para melhorar as prticas agrcolas. Devido a suas propriedades metablicas, muitas eubactrias so utilizadas na produo de alimentos (laticnios, vinagre, picles e azeitonas) e de aditivos (vitaminas, aminocidos, gomas emulsificantes e estabilizantes), na indstria qumica (acetona, butanol e plsticos biodegradveis) e na indstria farmacutica (vacinas, toxinas e antibiticos). Tambm se utilizam na produo de enzimas para uso industrial e mdico (Tabela 3.2). AS ARQUEAS As arqueobactrias, ou arqueas, diferem das eubactrias pela estrutura da parede celular e, tambm, por alguns aspectos metablicos relacionados com a sntese de protenas que as aproximam dos eucariontes. Algumas vivem em habitats inspitos, como as solfataras dos vulces ou giseres, a temperaturas superiores a 60-800C (Islndia, Costa Rica). Outras prosperam em lagos onde a concentrao salina altssima, como o Grande Lago Salgado (Estados Unidos) ou o Mar Morto (Israel). Entre as arqueas existem tambm gneros com vias metablicas peculiares que as tornam dependentes de enxofre ou produtoras de metano. Devido a estas propriedades, nos ltimos anos tem-se acelerado a prospeco de arqueas com propriedades potencialmente interessantes, para serem utilizadas em processos industriais que exijam condies ambientais extremas. No entanto, estudos recentes de ecologia molecular mostram que as arqueas no se limitam a ambientes extremos, sendo sua diversidade bem maior do imaginado previamente. FIGURA 3.1. Bactrias e clones.
Por diviso binria de uma bactria gera-se um clone de bactrias semelhantes

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TABELA 3.2. As bactrias (Eubactrias e Arqueas) como agentes biolgicos.


AGENTES BIOLGICOS APLICAES Tratamento de resduos e de guas servidas. Produo de energia (metano). Biorremediao, extrao de minrio. Bactrias Indstria qumica (acetona, butanol, cido lctico, cido actico). Enzimas industriais. Agricultura (rizbios, biopesticidas). Alimentos (laticnios, vinagres, picles, azeitonas, silagem). Indstria de alimentos (vitaminas B12 e -caroteno, aminocidos lisina e cido glutmico; polissacardeos xantana e dextrana*). Indstria farmacutica (enzimas de uso mdico, antibiticos, vacinas e toxinas). (*) A dextrana tambm tem usos mdicos

TABELA 3.3. As algas como agentes biolgicos.


AGENTES BIOLGICOS Biomassa Algas APLICAES Tratamento de efluentes, biomonitoramento de poluio, obteno de energia. Agricultura (adubo). Produo de alimentos (alimentao humana, rao para avicultura e aquicultura). Indstria de alimentos (aditivos, complementos nutricionais, substitutos proteicos, espessantes e emulsionantes). Molculas Indstria de cosmticos (cidos graxos e outras substncias tais como ficocoloides, pigmentos, glicerol, abrasivos finos etc.). Indstria farmacutica (compostos biologicamente ativos, tais como toxinas, antibiticos, antivirais e antitumorais).

TABELA 3.4. Os fungos como agentes biolgicos.


AGENTES BIOLGICOS APLICAES Agricultura (controle biolgico de insetos e nematoides, micorrizos). Produtos de fermentao (etanol, glicerol, cido ctrico). Fungos Enzimas industriais. Biomassa (fermento de padaria, micoprotena). Indstria de alimentos (panificao, queijaria). Indstria de bebidas (cervejas e vinhos, destilados). Produtos metablicos (extrato de levedura, hormnios de crescimento vegetal). Indstria farmacutica (antibiticos, vitaminas, vacinas, esteroides). 24

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OS PROTISTAS Os Protozorios se classificam no reino Protista, um grupo mal definido de seres eucariticos unicelulares ou pluricelulares, auttrofos ou hetertrofos, de reproduo sexuada ou assexuada. Trata-se de organismos unicelulares heterotrficos, cujo tamanho varia entre 0,002 e 1mm. Alguns vivem livres em ambientes marinhos, de gua doce, ou simplesmente muito midos. Outros parasitam outras espcies, nas quais causam doenas: Girdia, Amoeba, Trichomonas, Plasmodium, Toxoplasma, Leischmania etc. De importncia fundamental para o ser humano do ponto de vista mdico, sua caracterizao molecular pode dar origem a testes diagnsticos e vacinas. Classificadas junto com os protozorios no reino Protista, as algas so organismos uni ou pluricelulares, autotrficos e aquticos. Situadas na base das cadeias alimentcias aquticas, as algas cumprem um papel fundamental na biosfera por serem capazes de fixar gs carbnico e produzir oxignio. Algumas participam na formao de solos e na fixao de nitrognio. Apesar de no ter rgos diferenciados, as macroalgas marinhas (algas pardas, algas vermelhas e parte das algas verdes) formam filamentos e talos que podem chegar a medir mais de trinta metros. So utilizadas como adubo e, tambm, na alimentao humana (Porphyra ou nori e Laminaria, como o kombu, no Oriente; cochayuyo no Chile). Devido a sua capacidade de formar gis e emulses, os ficocoloides extrados dessas algas (agar, carragenina, alginato) so empregados em anlises clnicas (preparao de meios de cultivo para cultivo de bactrias e fungos) e em vrias indstrias, tais como a alimentcia (sorvetes, cremes, geleias etc.), a farmacutica (laxantes, cpsulas de remdios) e a cosmtica (cremes, sabonetes, xampus, dentifrcios etc). As microalgas representam um grupo extremamente diversificado de umas 25.000 espcies das quais s um pequeno grupo est bem estudado. Este compreende aproximadamente cinquenta espcies de microrganismos fotossintticos, tanto eucariontes (diatomceas, dinoflagelados, euglenoides e outras algas verdes) como procariontes (cianobactrias, antigamente algas azulesverdeadas). A proliferao de microalgas como floraes na natureza (mars vermelhas) ou em reservatrios, geralmente devido eutrofizao das guas, causa a morte de outros organismos, sendo muito perigosa se estiver acompanhada pela liberao de toxinas. Porm, em alguns sistemas de tratamento de efluentes as microalgas so incorporadas nos tanques para remover nutrientes inorgnicos e adicionar oxignio. Tambm so usadas como indicadores de poluio. O metano um gs combustvel que resulta da degradao de biomassa de algas por microrganismos anaerbios. Por outro lado, a produo de hidrognio por algas representa uma alternativa energtica promissora. As microalgas so aproveitadas na alimentao animal como rao para a avicultura e a aquicultura. Algumas das substncias que elas sintetizam so includas na alimentao humana como complementos nutricionais e substitutos proteicos; trata-se de aminocidos, cidos graxos e vitaminas (B12, -caroteno ou provitamina A). Tambm so utilizadas na formulao de cosmticos e na indstria farmacutica (Tabela 3.3).

OS FUNGOS O Reino Fungi comporta mais de 100.000 espcies. Os fungos so organismos eucariticos, uni ou pluricelulares, com uma parede celular formada por quitina. Todos eles so hetertrofos e podem se reproduzir sexuada ou assexuadamente. As leveduras so fungos unicelulares que se desenvolvem em lugares midos e se reproduzem por brotamento.
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Pertence a esse grupo um dos microrganismos de maior importncia econmica: Saccharomyces cerevisiae, o popular levedo de cerveja (ou, simplesmente, levedura) utilizado tradicionalmente na preparao de alimentos e de bebidas, assim como na produo de etanol, vitaminas e outros metablitos. Transformada mediante tcnicas de engenharia gentica, esta levedura produz uma vacina contra a hepatite B (Tabela 3.4). Entretanto, nem todas as leveduras so benficas; Candida albicans, um microrganismo oportunista da flora normal humana pode, em certas condies, proliferar de maneira anormal, tornando-se patognica. Nos bolores e mofos, as clulas formam um emaranhado de filamentos ou hifas, denominado miclio. Os mofos crescem rapidamente por fragmentao do miclio e se disseminam mediante esporos; como Aspergillus niger, um produtor de cido ctrico; ou como Rhizopus, o fungo preto do po, que se expande sobre a superfcie deste apesar dos conservantes acrescentados; ou ainda como Aspergillus flavus, um bolor que ataca as sementes de leguminosas (amendoim, feijo, soja) e produz uma toxina poderosa, a aflatoxina, causando graves intoxicaes. Neste grupo tambm se encontra o Penicillium, um gnero que conta com diversas espcies, uma das quais utilizada na indstria farmacutica, para a produo de penicilina, e outras na indstria de alimentos, para a maturao de queijos como o Roquefort, o Gorgonzola e o Camembert. Os cogumelos so os corpos reprodutivos de muitos fungos. Alguns so venenosos (Ammanita), outros produzem substncia alucingena, tais como a psilobicina, utilizada por grupos nativos mexicanos em rituais religiosos, ou a ergotamina, sintetizada quimicamente no sculo XX com o nome de LSD (cido lisrgico). Mas tambm os h comestveis como o Agaricus ou champignon, o Shiitake e o Pleurotus, que so cultivados e comercializados pelo homem. Em termos ambientais, um quarto da colheita de frutas e vegetais destrudo pelos fungos; pragas como a ferrugem do caf, o esporo do centeio e a vassoura-de-bruxa afetam gravemente a agricultura. Na Irlanda no sculo XIX, o Phytophtora infestans atacou a batata, destruindo a fonte bsica de alimentao; a praga causou um milho de mortes e a emigrao forada de boa parte da populao. Os liquens resultam da simbiose entre um fungo e uma alga. Alguns so comestveis, supondose que a Lecanora esculenta seja o man referido na Bblia. O grupo no tem sido muito explorado economicamente, apesar de ter encontrado aplicaes como corantes (tintura de tornassol, um indicador de pH), no tingimento de tecidos e como fixadores na indstria de perfumes. Tambm so indicadores de poluio (biomonitoramento). Em contrapartida, outra associao, desta vez entre um fungo filamentoso e as razes das plantas vasculares, os micorrizos, ocupam um lugar de destaque na agricultura em solos tropicais por facilitarem a solubilizao dos fosfatos. OS VRUS, NA FRONTEIRA DO VIVO E DO NO VIVO Os vrus so partculas inertes sem nenhuma atividade metablica, no limite entre o vivo e o no vivo. Os menores medem 20 nanmetros (1nm = 10-4 mm). Podem atravessar filtros extremamente finos e cristalizar. Sua estrutura muito simples: um cido nucleico (DNA ou RNA, como filamento simples ou duplo) dentro de uma capa proteica ou capsdeo. Muitos possuem enzimas que sero liberadas dentro da clula hospedeira (Figura 3.2) Como parasitas obrigatrios de bactrias, plantas ou animais, ao infetar uma clula viva passam a utiliz-la para sua prpria reproduo. Alguns se integram no genoma da clula infetada (bacterifagos, retrovrus). Devido a esta propriedade, os vrus tm sido utilizados como vetores para introduzir genes em uma clula hospedeira (Figura 3.3).
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Vrias doenas humanas so causadas por vrus, tais como o poliovrus, o HIV, o coronavrus responsvel pela SAR (sndrome aguda respiratria) etc. Ao infectar as clulas animais normais, alguns vrus as transformam em clulas cancerosas. Os vrus que infectam insetos podem ser utilizados no controle de pragas. Na luta contra a lagarta da soja, o Baculovrus evita a aplicao de 1,2 milho de litros de inseticidas por ano nas lavouras brasileiras. FIGURA 3.2. Alguns tipos de vrus.
Os adenovrus e o HIV parasitam clulas humanas; o bacterifago, bactrias.

HIV

Adenovrus

Bacterifago

FIGURA 3.3. A multiplicao de um bacterifago.


A infeco da bactria pelo bacterifago destri a clula (ciclo ltico). Em alguns casos, o DNA viral se integra no cromossomo sendo transmitido s clulas filhas; em determinadas condies o vrus retoma sua atividade, reiniciando o ciclo ltico.

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AS TCNICAS MICROBIOLGICAS Diversos tipos de tcnicas, muitas das quais datam do sculo XIX, facilitam o trabalho laboratorial. A identificao de um microrganismo demanda a observao microscpica e a utilizao de alguns mtodos especficos de colorao, complementados por testes bioqumicos e eventualmente genticos e imunolgicos. Encontrar e manter um microrganismo no laboratrio demanda a aplicao de tcnicas bacteriolgicas aplicveis tambm, com algumas variaes, a fungos e algas. Cultivar microrganismos exige, alm do desenho de um meio nutriente que satisfaa suas necessidades metablicas, um cuidado especial com as condies de temperatura e iluminao em que este ser incubado. Os meios nutrientes se empregam lquidos ou solidificados com gar, uma substncia que lhes confere uma consistncia gelatinosa. Os recipientes mais comuns so tubos de ensaio e placas circulares de vidro com tampa (Placas de Petri); e, para inocular os meios, se utilizam alas de platina e pipetas de diferentes tipos. A grande dificuldade do laboratrio microbiolgico est em conseguir a multiplicao do microrganismo desejado evitando as contaminaes, isto a multiplicao de outros microrganismos. Trabalha-se em condies asspticas, o que demanda a esterilizao prvia do material de vidro, dos meios nutrientes e dos instrumentos (alas, pipetas) que sero utilizados. E na transferncia do material biolgico, evita-se cuidadosamente toda contaminao com os microrganismos do ar. Equipamentos especialmente desenhados para trabalhar sob um fluxo de ar esterilizado ajudam o profissional. Tambm se evitam as contaminaes na hora de eliminar o material utilizado, a fim de no liberar microrganismos prejudiciais no ambiente. Os microrganismos so isolados a partir de amostras de solo, gua, ar ou fluidos corporais. As linhagens obtidas se conservam como culturas puras. Microrganismos com caractersticas diferentes so obtidos induzindo mutaes e selecionando as linhagens mutantes. Cada laboratrio mantm os estoques microbianos necessrios, que tambm podem ser solicitados a centros especializados (Colees de cultura). O nmero de microrganismos em uma amostra pode ser estimado por diversos mtodos: contagem microscpica, contagem eletrnica, contagem em placa, turvao do meio, massa seca, contedo de nitrognio ou medidas indiretas da atividade microbiolgica. Em geral, as tcnicas clssicas so trabalhosas e muito demoradas para o diagnstico clnico, por isso esto sendo substitudas por tcnicas miniaturizadas mais rpidas que identificam os microrganismos com base em algumas reaes bioqumicas em kits padronizados. A tendncia geral de automatizao do laboratrio microbiolgico. Em outra linha de ao, a partir do incio do sculo XX surge a Microbiologia Ambiental, trazendo uma nova viso em relao s populaes microbianas presentes na natureza. No entanto, nossa ignorncia em relao aos microrganismos ainda enorme. O nmero de espcies que conseguimos cultivar no laboratrio no representa ainda mais do que 1 a 5 % da totalidade existente; dependemos dos avanos na rea da genmica para ampliar nosso conhecimento das comunidades microbianas do ambiente.

BIOSSEGURANA E BIOSSEGURIDADE De acordo com a Organizao Mundial da Sade, o termo biossegurana abrange os princpios, tcnicas e prticas necessrias para evitar a exposio acidental a patgenos e toxinas assim como sua liberao acidental (Figura 3.4).

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Os microrganismos so classificados segundo o risco de causarem danos aos profissionais que trabalham com eles e coletividade. Os critrios so: a patogenicidade para o homem, a virulncia, o modo de transmisso, a endemicidade e a existncia ou no de uma teraputica eficaz. Definem-se assim quatro grupos de risco: Grupo 1: Baixo risco individual e coletivo. Microrganismos que nunca foram descritos como agentes causadores de doenas para o homem e que no constituem risco para o meio ambiente. Exemplos: Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Escherichia coli (algumas linhagens), Lactobacillus sp. Grupo 2: Risco individual moderado, risco coletivo limitado. Microrganismos que podem causar doenas no homem, com pouca probabilidade de alto risco para os profissionais do laboratrio. Exemplos: Salmonella, Toxoplasma, Schistosoma mansoni, Streptococcus sp, vrus da rubola, vrus do sarampo e vrus da hepatite B. Grupo 3: Risco individual elevado, risco coletivo baixo. Microrganismos que podem causar doenas graves aos profissionais do laboratrio. Exemplos: Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis e vrus da imunodeficincia humana (HIV). Grupo 4: Srio risco para os profissionais do laboratrio e para a coletividade. Microrganismos que causam doenas graves para o homem. Exemplos: vrus Ebola, vrus Lassa e vrus Marburg. A cada grupo de microrganismos correspondem normas estritas de trabalho, que abrangem desde a arquitetura do laboratrio e as caractersticas dos equipamentos at as precaues que devem ser tomadas pelos profissionais e a forma em que o lixo ser descartado. O conceito de biossegurana se complementa com o de biosseguridade, isto , o conjunto de medidas de proteo de uma instituio e dos trabalhadores necessrias para evitar a perda, o roubo, o uso incorreto ou a liberao intencional de patgenos e toxinas (bioterrorismo). FIGURA 3.4. Alguns logotipos utilizados como indicao de risco biolgico.

Biossegurana

Biosseguridade

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OS MICRORGANISMOS COMO AGENTES BIOLGICOS Encontra-se na Tabela 3.5 uma lista dos principais os agentes biolgicos microbianos e suas utilizaes.

TABELA 3.5. Principais destaques entre os agentes biolgicos microbianos.


ALGAS Spirulina UTILIZAO O seu alto teor proteico, que corresponde a 60% do peso seco, lhe confere um elevado valor nutritivo; as protenas representam aproximadamente 2% do peso seco da batata e 6-10% do trigo. Quando da chegada dos espanhis, os astecas j preparavam umas bolachas (tecuitlatl) com a Spirulina coletada no lago Texcoco. Na frica, no lago Tchad, ainda hoje ela coletada e consumida como alimento. Spirulina, assim como Chlorella, so vendidas em tabletes como complemento nutritivo. Acumula glicerol em condies de alta salinidade, com o qual consegue evitar a desidratao. Pode crescer no Mar Morto, sendo tambm cultivada em tanques ou lagoas, perto do Mar Vermelho, para a extrao de outros produtos metablicos (glicerol e -caroteno).

Dunaliella

FUNGOS Saccharomyces cerevisiae

UTILIZAO Conhecido como levedo de cerveja ou levedura, utilizado na preparao de alimentos (po, biscoitos, fermento de padaria) e de bebidas (cerveja, vinho e destilados), assim como na produo de outras substncias de importncia industrial (etanol, vitaminas e outros metablitos). A levedura cresce facilmente em laboratrio. Tambm pode ser manipulada geneticamente. Nos fermentadores ou biorreatores industriais onde se multiplica rapidamente apartir de matrias-primas de baixo custo, ela permanece ativa durante perodos longos e, ao concluir o processo, pode ser separada por filtrao ou centrifugao. Com 12.000.000 de pares de bases e 6.000 genes em 16 cromossomos, Saccharomyces cerevisiae foi, em 1997, o primeiro organismo eucaritico a ter o seu genoma sequenciado. Algumas espcies alcanam grande importncia industrial, como A.niger, utilizada para a produo de cido ctrico ou de enzimas (em linhagens modificadas geneticamente). Algumas espcies so utilizadas na indstria farmacutica (penicilina) ou indstria de alimentos (queijos azuis, como o Roquefort e o Gorgonzola; queijo Camembert).

Aspergillus

Penicillium

ARQUEOBACTRIAS Thermus aquaticus

UTILIZAO Isolada em uma poa do parque nacional de Yellowstone (Estados Unidos), esta bactria produz uma enzima que copia o DNA a uma temperatura alta. Esta enzima permite obter milhes de cpias de um fragmento de DNA em um processo automatizado que revolucionou a Biotecnologia, chamado PCR (Polymerase Chain Reaction ou Reao em cadeia da polimerase). Vivem em lugares onde h ausncia de oxignio, seja no tubo digestivo de alguns animais (gado, cupins) ou nos pntanos. Estas bactrias transformam o acetato resultante da degradao de celulose por outras bactrias em metano, um gs combustvel.

Bactrias metanognicas

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BIOTECNOLOGIA 2011 / Captulo 3: Os microrganismos

EUBACTRIAS Bactrias lcticas

UTILIZAO Os gneros Lactobacillus e Streptococcus so responsveis por vrios processos, tais como a elaborao de queijos e de iogurtes, o envelhecimento dos vinhos, a conservao de alimentos (sauerkraut ou repolho fermentado, silagem para o gado); a produo de cido lctico, um aditivo utilizado na indstria de alimentos como acidulante e estabilizante. Este microrganismo prolifera no solo e na superfcie das plantas, sintetizando uma toxina fatal para as larvas de insetos. Esta produzida comercialmente h mais de 40 anos, representando 90% das vendas de inseticidas biolgicos e reduzindo a necessidade de aplicao de pesticidas qumicos nas lavouras. Nos ltimos anos, o gene codificador da toxina tem sido transferido a plantas (algodo, milho) para que estas sintetizem diretamente o inseticida. Alm do cheiro caracterstico da terra removida, este gnero de bactrias do solo produz substncias antibiticas (estreptomicina, tetraciclina, eritromicina), antifngicas (nistatina), herbicidas, antitumorais e supressoras de rejeio a transplantes. Vrias linhagens se utilizam na eliminao de poluentes. Algumas quebram molculas de hidrocarbonetos, como os existentes nos acidentes de derramamento de petrleo; outras podem remover o mercrio aqutico. Agente patognico para as plantas dicotiledneas que desenvolvem um tumor ou galha quando infetadas. Com a remoo de um gene, perde a capacidade de provocar tumores, conservando a capacidade infecciosa, utilizada na engenharia gentica de vegetais. Na indstria txtil, Clostridium butiricum libera as fibras vegetais durante a macerao do cnhamo e do linho. Clostridium acetobutyricum utilizado na produo industrial de acetona e butanol. Clostridium botulinum produz uma toxina poderosssima; calcula-se que um grama desta bastaria para matar um milho de pessoas. A ingesto de conservas contaminadas e mal esterilizadas resulta quase sempre em um desfecho fatal. Devido a sua ao inibitria da contrao muscular, a toxina botulnica utilizada em concentraes muito pequenas, para reduzir as rugas e marcas de expresso durante certo tempo (efeito cosmtico). Descoberta em 1855, esta bactria Gram-negativa vive no trato digestivo do homem e de outros animais. Tem forma de bastonete (0,002 mm de comprimento, 0,0008 mm de dimetro), 1 a 4 molculas de DNA e 15.000 a 30.000 ribossomos. Flagelos e pelos permitem que se movimente rapidamente. Algumas linhagens so patognicas, podendo contaminar os alimentos (carne, leite, vegetais) que devem ser cozidos adequadamente. Os seus requerimentos nutricionais bsicos so simples. gua, sais minerais, uma fonte de nitrognio e uma fonte de energia. Em condies adequadas, se divide a cada 20-40 minutos; tambm pode se reproduzir de maneira sexuada (conjugao). Devido facilidade com que ela pode ser cultivada no laboratrio, Escherichia coli tem se tornado uma ferramenta indispensvel para estudos bioqumicos e genticos, incluindo a Engenharia Gentica. O seu genoma compreende 4,6 milhes de pares de bases que codificam em torno de 4.000 protenas diferentes. A introduo de transgenes em Escherichia coli K12, uma linhagem inofensiva de laboratrio, possibilitou os primeiros processos de produo de insulina, de interferon e de hormnio de crescimento. Entretanto, por se tratar de uma clula procaritica, nem sempre a melhor opo de "fbrica" para a sntese de produtos de origem animal ou vegetal, tendo sido aos poucos substituda por outras clulas eucariticas, como a levedura. 31

Bacillus thuringiensis

Streptomyces

Pseudomonas

Agrobacterium tumefaciens

Bactrias butricas

Escherichia coli

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4. AS ENZIMAS E OS ANTICORPOS

AS PROTENAS Todos os organismos esto formados por gua e molculas de diversos tipos, inorgnicas e orgnicas (Figura 4.1). Entre estas ltimas, se encontra um grupo de macromolculas, as protenas, que participam em numerosas atividades, cumprindo um papel fundamental para os seres vivos (Tabela 4.1). Pertencem a este grupo as enzimas, molculas de ao cataltica, e os anticorpos, molculas que participam na defesa do organismo. ESTRUTURA As protenas so macromolculas formadas por 20 aminocidos diferentes. Estes se caracterizam por ter, unidos ao tomo de carbono, um grupo amino (bsico), um grupo carboxila (cido) e um radical varivel (Figura 4.2 A). A presena de um carbono assimtrico resulta em duas formas moleculares (L) e (D) que diferem por suas propriedades pticas. Os aminocidos que compem as protenas correspondem forma (L). A reao de condensao entre o grupo carboxila de um aminocido e o grupo amina de outro cria uma ligao peptdica (Figura 4.2 B). A unio de vrios aminocidos forma uma cadeia peptdica que se caracteriza no s pelo nmero e tipo de aminocidos que a compem, como pela sequncia em que estes se encontram, denominada estrutura primria. Ao se estabelecerem ligaes entre os grupos que formam os enlaces peptdicos, a cadeia adota uma estrutura regular ou estrutura secundria, geralmente em forma de hlice ou de folha. As interaes entre as cadeias laterais dos aminocidos causam o dobramento da protena, resultando uma configurao espacial que chamada de estrutura terciria. A forma final de uma protena depender ainda da associao entre vrios polipeptdios, no que se denomina de estrutura quaternria (Figura 4.2 C). Quando sintetizada dentro da clula, uma protena adotar espontaneamente a configurao espacial que decorre de sua estrutura primria. Entretanto, fatores ambientais como o pH, a concentrao salina ou a temperatura podem causar alteraes momentneas ou definitivas na forma da molcula. TABELA 4.1. As funes das protenas no organismo.
FUNO Componentes estruturais Substncias de reserva Ao cataltica Outras EXEMPLOS Queratina do cabelo, colgeno da derme, actina e miosina das fibras musculares. Albumina do ovo, casena do leite. Enzimas que controlam as reaes qumicas celulares. Transmisso de informao (hormnios proteicos), participao nos mecanismos de defesa (anticorpos, citocinas), transporte e armazenamento de pequenas molculas (hemoglobina).

Copyright Maria Antonia Malajovich Biotecnologia: ensino e divulgao (www.bteduc.bio.br)

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FIGURA 4.1. A composio qumica de uma bactria.

FIGURA 4.2. Aminocidos e protenas.

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AS BASES DE ALGUMAS TCNICAS LABORATORIAIS Cromatografia Esta tcnica permite separar as substncias de uma mistura com fins analticos e preparativos. Est baseada na migrao diferencial das molculas de uma mistura, colocada em uma fase mvel, sobre um suporte estacionrio ou matriz (Figura 4.3). Em funo das caractersticas da fase estacionria, distinguem-se diferentes modalidades: cromatografia em papel, em camada delgada, cromatografia em gs, cromatografia lquida etc. Na cromatografia em coluna, por exemplo, a separao das protenas de uma mistura depende da estrutura da matriz, slida e permevel, que se encontra imersa em um solvente. A separao obedece a trs tipos de mecanismos: o Troca inica. A matriz est formada por pequenas partculas carregadas que retm as molculas de carga contrria. Como a associao depende de fatores como o pH e a fora inica da soluo, a modificao destes fatores permite controlar a separao. o Filtrao em gel. A matriz consiste em partculas porosas que separam as protenas em funo de seu tamanho, como uma peneira molecular. o Afinidade. As partculas da matriz esto unidas por ligaes covalentes a molculas (enzimas, anticorpos) que interagem com a protena de interesse. Para liberar a protena retida na coluna, muda-se o pH ou a concentrao salina. Desse modo se consegue a protena purificada. Eletroforese Molculas ionizadas colocadas em um campo eltrico migram de acordo com suas cargas e pesos moleculares. Se a carga for positiva, elas migraro para o plo negativo ou ctodo e, inversamente, se ela for negativa, a migrao ocorrer na direo do plo positivo ou nodo. Este o fundamento de outra tcnica analtica, a eletroforese (Figura 4.4). Se uma mistura de peptdeos for colocada em um campo eltrico, eles migraro de acordo com sua carga, forma e tamanho, formando cada um deles uma banda caracterstica que ser visualizada mediante um corante ou uma reao qumica especfica. Observe-se que a carga de um peptdeo resulta da soma das cargas correspondentes aos grupos amina e carboxila terminais e dos radicais dos aminocidos que o compem, e que essa carga varia com o pH do meio. A eletroforese permite separar os componentes de uma mistura. Existem numerosas variaes da tcnica em funo do suporte (papel de filtro, slica-gel, membranas de acetato de celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida), da disposio da cuba (horizontal ou vertical), da direo da migrao (unidirecional ou bidirecional) etc.

Espectrometria de massa Esta tcnica analtica mede a massa molecular a partir da razo entre a massa e a carga de molculas ionizadas, medida que permite a identificao de uma substncia. Com a descoberta de mtodos de ionizao adaptados s molculas biolgicas como o MALDI (do ingls, Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization), a espectrometria de massa se tornou nos ltimos anos uma ferramenta indispensvel na identificao de protenas, acares, cidos nucleicos, lipdios e outros compostos orgnicos.

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Aplicada s protenas, a espectrometria de massa identifica a molcula por comparao com outras de um banco de dados. Tambm fornece uma anlise estrutural da molcula indicando a sequncia de aminocidos. Com esta tcnica possvel estudar o conjunto de protenas de um organismo (proteoma) e dissecar as interaes das protenas com outras molculas. Por ser um mtodo automatizado e rpido, tem alcanado mltiplas aplicaes em farmacologia e diagnstico.

FIGURA 4.3. Cromatografia em coluna.


O processo est baseado na velocidade de migrao diferencial das molculas proteicas em uma matriz imersa em um solvente.

FIGURA 4.4. Eletroforese.


Separao dos peptdeos de uma mistura, por migrao diferencial em um campo eltrico.

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AS ENZIMAS A CATLISE ENZIMTICA As reaes qumicas que ocorrem nos seres vivos dependem da atividade cataltica das enzimas. Estas molculas agem diminuindo a energia de ativao necessria de uma reao qumica, sendo capazes de promov-las e aceler-las, sem ser alteradas ou destrudas. A molcula de enzima reconhece um substrato especfico (S), formando com ele um complexo molecular ou estado de transio (SE). O encaixe no stio ativo da molcula facilita a transformao do substrato no(s) produto(s) da reao (P). A enzima recuperada no fim da reao, podendo atuar inmeras vezes (Figura 4.5). A reao pode ser representada como a seguir:

S+E

SE

P+E

A primeira caracterstica das enzimas a especificidade; uma enzima como a lactase, que opera sobre a lactose, no agir sobre a sacarose; duas enzimas que hidrolisem o amido podero faz-lo cortando a molcula de maneira diferente, como a -amilase e a -amilase. A segunda que, em funo de sua origem biolgica, as enzimas so biodegradveis e agem em condies brandas de temperatura e pH. A ao enzimtica depende do pH, da temperatura, da presena de cofatores inorgnicos (zinco, ferro, cobre) e/ou orgnicos (coenzimas, muitas das quais so vitaminas). Os metais pesados alteram a estrutura molecular da enzima de maneira irreversvel impedindo sua ao cataltica (desnaturao). Uma inibio da atividade enzimtica ocorre quando molculas muito parecidas com o substrato competem com este para ocupar o stio ativo da enzima (inibio competitiva). Ou quando outras molculas se ligam a determinadas partes da enzima, alterando a estrutura espacial e dificultando o encaixe com o substrato (inibio no competitiva).

FIGURA 4.5. O mecanismo da atividade enzimtica (Modelo chave-fechadura).


A atividade enzimtica no modifica o equilbrio da reao.

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OS DIVERSOS TIPOS DE ENZIMAS Uma forma de classificar as enzimas pelo tipo de reao que catalisam, acrescentando o sufixo ase ao nome do substrato que transformado: protease, lactase, amilase, lipase, celulase. Tambm se pode adicionar ase ao nome da reao catalisada: hidrolase, oxirredutase. Quando combinadas as duas regras anteriores, se mencionam o nome do substrato e da reao catalisada adicionando ase como, por exemplo, em DNA-polimerase. Porm, algumas enzimas, como a renina ou a trombina, conservam seus nomes tradicionais (Tabela 4.2). TABELA 4.2. A classificao internacional das enzimas.
CLASSE Oxirredutases Transferases Hidrolases Liases TIPO DE REAO CATALISADA Reaes onde se transferem eltrons. Reaes onde se transferem grupos qumicos. Reaes de hidrlise, isto , de transferncia de grupos funcionais para a gua. Adio de grupos a duplas ligaes ou formao de duplas ligaes por eliminao de grupos. Produo de ismeros por transferncia de grupos dentro de molculas. Formao de ligaes C-C, C-S, C-O e C-N por reaes de condensao. EXEMPLOS Desidrogenases, oxidases. Transaminases, fosforilases. Proteases, carboidrases, peptidases, lipases. Decarboxilases (renina, trombina).

Isomerases Ligases

Isomerases, mutases. Sintetases.

TABELA 4.3. As enzimas como agente biolgico.


AGENTES BIOLGICOS APLICAES Indstria de alimentos e bebidas (clarificao de vinhos e sucos de frutas, substituio da maltagem pelo tratamento do amido na elaborao de cervejas, fabricao de po, biscoitos e bolachas, produo de adoantes, fabricao de laticnios, suplementao de raes animais). Produtos de limpeza (detergentes e lava-roupas para a remoo de manchas difceis, produtos para limpar dentaduras e lentes de contato). ENZIMAS Indstria txtil (desengomador de tecidos, acabamento de jeans). Curtumes (amaciamento de couros). Indstrias de papel e celulose (branqueamento de polpa de celulose). Cosmtica (produtos de higiene bucal, depilatrios, tratamento da acne e da caspa, cosmocuticos em geral). Indstria farmacutica (reagentes para uso em anlises clnicas, nucleases para a manipulao gnica). Tratamentos mdicos (combate de inflamaes, edemas e leses; dissolventes de cogulos sanguneos, agentes teraputicos em transtornos digestivos).

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IMPORTNCIA ECONMICA As enzimas apresentam numerosas vantagens quando utilizadas como agentes biolgicos em processos tecnolgicos: especificidade, operao em condies facilmente controlveis e biodegradabilidade. De um modo geral, os tratamentos enzimticos diminuem a carga poluidora dos efluentes industriais. Das 25.000 enzimas que, segundo as estimativas, existiriam na natureza, at o momento s foram classificadas umas 2.800, sendo comercializadas 400. O mercado se distribui fundamentalmente entre as proteases (59%), as carboidrases (28%) e as lipases (3%), trs grandes conjuntos de enzimas que so utilizadas por diversas indstrias; os 10% restantes do mercado correspondem s enzimas analticas e farmacuticas (Tabela 4.3). Nos sabes lava-roupas, as enzimas prometem ao consumidor roupas limpas e com aparncia de novas. Um exrcito constitudo por proteases, amilases e lipases digere as manchas difceis (sangue, leite, molho de tomate, capim, chocolate, batom etc.), enquanto que as celulases removem as microfibrilas de celulose das roupas. No sendo mais necessrio esfregar as manchas, a limpeza se realiza com pouco esforo e sem desgaste do tecido; como estas molculas trabalham a temperaturas baixas, o consumo de energia menor. Com mais uma vantagem para o fabricante: as enzimas no representam mais que uma frao muito pequena do sabo (0,4-0,8%), correspondente a 1% do seu custo. As enzimas so empregadas tambm no acabamento de roupas. Para conseguir o aspecto usado, os jeans eram lavados com pedras (stone washed), um processo que tinha o inconveniente de causar a abraso da maquinaria e o desgaste do tecido. Nos ltimos anos, as pedras foram substitudas por celulases, com resultados satisfatrios. Os curtumes, em vez de excrementos de cachorro ou de pombo, se valem hoje de enzimas pancreticas para amaciar e desengordurar as peles. Na indstria de alimentos e bebidas, as enzimas participam na produo de adoantes, de po, biscoitos e bolachas, de queijos. Na extrao de sucos de frutas, as pectinases aumentam substancialmente o rendimento do processo, ao liberar o suco retido na pectina das paredes celulares vegetais. Tambm facilitam a clarificao de vinhos e cervejas. As enzimas entram na composio de vrios produtos cosmticos, tais como depilatrios, desodorantes e artigos para a higiene bucal. Em dermatologia, algumas das aplicaes mais frequentes esto no combate ao envelhecimento e no tratamento de acne e de caspa. Como medicamentos, as enzimas se utilizam em vrios contextos, especialmente em quimioterapia e nas terapias trombolticas. E muitos entre os mais corriqueiros testes de diagnstico dependem de reagentes enzimticos. As enzimas permitem a resoluo de misturas de molculas racmicas, nas que h duas formas isomricas, tipo mo direita e mo esquerda, com diferente atividade biolgica. Desse modo, podero ser evitados problemas como o da talidomida, um medicamento que causou o nascimento de numerosos bebs com deformaes congnitas, na dcada de 1960. A tragdia teria sido consequncia da presena no produto comercial da forma molecular tipo mo direita, de ao teratognica, junto ao tipo mo esquerda, de ao calmante. Atualmente, esto sendo estudados mtodos enzimticos para eliminar os prons responsveis pela denominada doena da vaca louca. Tambm se cogita a utilizao de enzimas para limpar reas contaminadas com agentes qumicos como o gs sarin.

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FIGURA 4.6. A estrutura da molcula de anticorpo (IgG).

FIGURA 4.7. Os anticorpos e o reconhecimento do antgeno.


Observe-se que, ao compartilhar estruturas (determinantes antignicos ou eptopos), alguns antgenos podem ser reconhecidos por um mesmo anticorpo, dando origem a uma reao cruzada.

FIGURA 4.8. O encontro do linfcito B e do antgeno, e a seleo clonal.

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OS ANTICORPOS Dentro da estratgia de defesa de um organismo, os anticorpos so elementos importantes no reconhecimento do eu e na eliminao do no eu (antgeno). Uma parte importante da resposta imune envolve a produo de anticorpos que reconhecem o antgeno, desencadeano os mecanismos de destruio adequados. Em condies experimentais de laboratrio, a reao antgeno-anticorpo ocorre quando os reagentes se encontram em meio lquido e nas concentraes adequadas, sendo visualizada como: o Uma precipitao, se os antgenos estiverem dissolvidos em um meio lquido ou em um gel (poliacrilamida). o Uma aglutinao, se os antgenos estiverem localizados sobre partculas (hemcias ou bactrias).

A MOLCULA DE ANTICORPO A molcula de anticorpo denominada IgG (Imunoglobulina G) formada por duas cadeias polipeptdicas leves e duas pesadas em forma de Y, ao qual se associa um pequeno nmero de grupos carboidrato. Uma parte da molcula constante; as regies variveis localizadas nas extremidades dos braos do Y respondem pelo reconhecimento do antgeno (Figura 4.6). Este tipo de anticorpo se encontra no soro sanguneo, na frao proteica caracterizada por eletroforese como globulina.

A UNIO ANTGENO-ANTICORPO A unio antgeno-anticorpo ocorre quando um anticorpo encontra no antgeno uma forma complementar, geralmente parte de uma molcula livre ou ancorada na membrana celular. Um antgeno pode ter vrias destas formas (eptopos ou determinantes antignicos) e ser reconhecido por anticorpos diferentes (Figura 4.7).

A PRODUO DE ANTICORPOS NO ORGANISMO As clulas responsveis pela produo de anticorpos so os linfcitos B, que se formam na medula ssea. Depois de um processo de diferenciao que envolve uma srie de rearranjos genticos, cada linfcito pode reconhecer um nico eptopo (Figura 4.8). Ao encontrar o eptopo especfico, o linfcito B prolifera, originando um clone de clulas secretoras de anticorpos. Uma vez eliminado o antgeno, algumas clulas desse clone permanecero no organismo como clulas-memria. Em um contato posterior com o mesmo eptopo, as clulasmemria daro incio resposta imune, que ser mais rpida e mais intensa que a primeira. Apesar de cada linfcito ser capaz de reconhecer um nico eptopo, todos os linfcitos podem reconhecer aproximadamente 108 eptopos diferentes, o que explica a eficincia da resposta imune.

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FIGURA 4.9. A produo de anticorpos no laboratrio.

A: A produo de anticorpos policlonais. Recolhe-se o soro de um animal imunizado contra uma mistura de molculas entre as quais est a molcula X. No soro se encontraro misturados anticorpos de diferente especificidade, um dos quais reconhece X. B: A produo de anticorpos monoclonais. Injeta-se em um rato a mesma mistura de molculas; dias mais tarde, extrai-se o bao do animal e fusionam-se os linfcitos B (alguns dos quais reconhecem a molcula X) com clulas de mieloma. Os hibridomas so separados, cultivados e testados para identificar os que produzem anticorpos contra X.

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FIGURA 4.10. Os ensaios imunolgicos.


1. Associao dos anticorpos com molculas fluorescentes O anticorpo marcado pode reconhecer diretamente o antgeno (reao direta) ou reconhecer o anticorpo unido ao antgeno (reao indireta).

2. Associao dos anticorpos com enzimas. O antgeno pode ser reconhecido por um anticorpo associado a uma enzima que reage com o seu substrato, formando um produto colorido (reao direta). Tambm pode ser reconhecido por um anticorpo especfico, e este por um anticorpo que reconhece a frao constante do anticorpo. O segundo anticorpo est associado a uma enzima que, ao reagir com o seu substrato especfico, forma um produto colorido (reao indireta).

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A PRODUO DE ANTICORPOS NO LABORATRIO Os anticorpos ocupam um lugar de destaque nos testes de diagnstico clnico, por reunir duas propriedades que os transformam em uma ferramenta ideal: especificidade e diversidade. A injeo de animais (ratos, ovelhas, coelhos) com um antgeno induz em pouco tempo a produo de anticorpos especficos que podem ser separados do soro sanguneo do animal. Se o antgeno utilizado possuir vrios eptopos, no soro extrado se encontrar uma mistura de anticorpos, chamados policlonais, resultantes da ativao de vrios clones de linfcitos B, cada um dos quais reconhece um dos eptopos do antgeno. Observe-se que, alm dos anticorpos especficos, o soro tambm ter anticorpos contra eventuais impurezas do antgeno e anticorpos contra outros antgenos aos que o animal esteve exposto anteriormente. Em consequncia, a purificao de um soro ser um processo longo e complexo a ser repetido a cada extrao de sangue do animal. Contudo, reagentes de laboratrio deste tipo foram utilizados normalmente at a dcada de 1980. No possvel cultivar separadamente os linfcitos porque estes sobrevivem pouco tempo in vitro. A obteno de clones que sintetizem anticorpos especficos contra um nico eptopo, isto monoclonais, s se tornou possvel com o desenvolvimento da tecnologia de hibridomas (Kohler, Milstein, 1975). Um hibridoma resulta da fuso entre um linfcito B e uma clula cancerosa de mieloma. Reunindo as propriedades de ambas as clulas, cada hibridoma capaz de sintetizar um nico tipo de anticorpo (monoclonal) e de se multiplicar indefinidamente no laboratrio, seja em cultivo de tecidos, seja na cavidade do peritoneu de um animal hospedeiro (Figura 4.9). A UTILIZAO DOS ANTICORPOS Os anticorpos monoclonais encontraram imediatamente aplicaes, substituindo praticamente os anticorpos policlonais, tanto na purificao de biomolculas e clulas como nos testes de diagnstico clnico ou ambiental ou no controle de qualidade dos alimentos. Anticorpos especficos fixados nas partculas de uma coluna de afinidade permitem separar molculas de uma mistura que circule por ela. Outra utilizao extremamente engenhosa est na separao de populaes celulares em um aparelho denominado cell sorter. As clulas so marcadas com anticorpos ligados a uma molcula fluorescente; ao passar atravs de raios laser, adquirem cargas eltricas, sendo separadas mediante uma placa defletora do equipamento. A visualizao da reao entre o antgeno e o anticorpo se v facilitada quando estes ltimos recebem alguma marcao. Em cortes histolgicos, o antgeno localizado pelos anticorpos acoplados a uma molcula fluorescente que possa ser identificada microscopicamente (Figura 4.10). Associados a uma molcula radiativa, os anticorpos so utilizados na dosagem de substncias presentes nos fluidos corporais, sendo quantificada a radioatividade por exposio de uma placa sensvel. A obteno de anticorpos contra a frao constante da molcula de anticorpos humanos representa um avano considervel na produo de reagentes para o diagnstico clnico. Nos ensaios imunoenzimticos, utilizam-se estes anticorpos acoplados a uma enzima que reage com o seu substrato, formando um produto colorido (Figura 4.10). A utilizao de anticorpos monoclonais com fins teraputicos demorou muito mais que o esperado. Sendo produzidos por clulas de camundongo ou de rato, eles so reconhecidos como estranhos quando injetados no homem, formando-se complexos imunes que lesionam gravemente os rins.

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A fim de evitar essas reaes, comearam a serem elaborados anticorpos monoclonais quimricos (33% de protena animal) e humanizados (10% de protena animal). Estes conservam parte das sequncias animais, especialmente nas partes que reconhecem o antgeno, sendo o restante da molcula substitudo por sequncias humanas. Ultimamente, com a obteno de anticorpos monoclonais humanos mediante tcnicas de engenharia gentica, se abriram novos caminhos para o diagnstico e o tratamento de doenas (Tabela 4.4). TABELA 4.4. Os anticorpos como agentes biolgicos.
AGENTES BIOLGICOS APLICAES Purificao de molculas. Reagentes de laboratrio. Anticorpos Reagentes para diagnstico. Imunoterapias.

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5. OS CIDOS NUCLEICOS E OS GENES

OS CIDOS NUCLEICOS Embora descobertos em 1869, por Miescher, no pus das bandagens de ferimentos, o papel dos cidos nucleicos na hereditariedade e no controle da atividade celular comeou a ser esclarecido apenas em meados do sculo XX. O cido desoxirribonucleico (DNA) carrega em sua estrutura as instrues necessrias para a construo de um organismo. Estas direcionam o desenvolvimento de suas caractersticas bioqumicas, fisiolgicas, anatmicas e inclusive de algumas das comportamentais. Nas clulas procariticas, uma molcula grande e circular de DNA forma o cromossomo, havendo tambm uma ou duas molculas de DNA extracromossmico, formando estruturas circulares, denominadas plasmdeos. Nas clulas eucariticas, vrias molculas lineares de DNA associadas a protenas formam os cromossomos, localizados dentro do ncleo celular. Tambm h DNA em algumas organelas, como os cloroplastos e as mitocndrias. O cido ribonucleico (RNA) se encontra no ncleo e no citoplasma celular. Do ponto de vista qumico, os cidos nucleicos (cido ribonucleico e desoxirribonucleico) so macromolculas formadas a partir de unidades chamadas nucleotdeos (Figura 5.1). Um nucleotdeo resulta da associao mediante ligaes qumicas covalentes de trs tipos de elementos: uma molcula de cido fosfrico, um acar de cinco carbonos (pentose: ribose ou desoxirribose) e uma base cclica nitrogenada: adenina, citosina, guanina, timina ou uracila. Da unio dos nucleotdeos mediante unies covalentes entre as extremidades 5' e 3', formam-se cadeias. A DUPLA HLICE J na dcada de 1940, vrios trabalhos indicavam claramente que o material responsvel pela hereditariedade era o DNA. Porm, o modo como esta molcula poderia assegurar essa funo s comeou a se vislumbrar em 1953, quando J. D. Watson e F. Crick formularam um modelo da estrutura tridimensional do DNA que, segundo suas prprias palavras, poderia ter um considervel interesse biolgico. No modelo de Watson e Crick, duas cadeias de nucleotdeos formam uma figura parecida com uma escada de corda torcida, a dupla hlice. Nessa escada, o cido fosfrico e o acar so as partes verticais (corrimos) e as bases nitrogenadas so os degraus (Figura 5.1). As cadeias so antiparalelas, isto , se uma corre na direo 5' 3' a outra corre na direo 3' 5. Ambas as cadeias esto unidas entre si por pontes de hidrognio entre as bases, sendo que as ligaes ocorrem sempre entre adenina e timina (2 pontes) e entre citosina e guanina (3 pontes). De acordo com o modelo, quando em um filamento a sequncia de bases AGTACG, no outro filamento ela ser TCATGC. Como as sequncias so complementares, cada filamento pode servir como molde para a sntese de uma nova molcula. E, no momento da diviso celular, cada clulafilha poder receber uma molcula semelhante da clula-me.

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FIGURA 5.1. Os cidos nucleicos.


1. Composio qumica: observe-se a posio dos grupos 3 e 5 no acar.

2. A molcula de DNA. A. O pareamento das bases ocorre sempre entre uma purina e uma pirimidina: adenina e timina ou uracila; guanina e citosina. B. A duplicao do DNA d origem a duas molculas semelhantes ( direita). Observe-se que o processo de duplicao envolve numerosas enzimas, sendo bem mais complexo do que est representado.

A. A dupla hlice

B. A duplicao do DNA

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O CDIGO GENTICO A autoduplicao do DNA permite que cada clula receba uma cpia do material gentico, com as instrues necessrias para a construo e funcionamento do indivduo. O funcionamento de uma clula depende, fundamentalmente, de dois tipos de molculas: os cidos nucleicos e as protenas. Ambos esto relacionados, sendo que a estrutura primria de um polipeptdeo codificada por um gene, isto , um segmento de DNA. O cdigo simples, correspondendo um aminocido a cada trinca de bases. A tabela 5.1 nos mostra quais os aminocidos correspondentes aos diferentes cdons ou trincas de bases do mRNA. Alguns so codificados por uma nica trinca, como o triptfano (UGG) ou a metionina (AUG); outros admitem vrios cdons que geram sinonmia como, por exemplo, a prolina (CCU, CCC, CCA, CCG). O incio da sequncia sinalizado por AUG, o cdon correspondente a metionina, sendo este aminocido removido posteriormente; o fim da sequncia sinalizado por UAA, UAG ou UGA, trs cdons que significam stop. Mudanas na sequncia de bases do DNA podem ter como consequncia a substituio de um aminocido por outro. No exemplo da figura 5.3, se GUG for substitudo por CGU, no peptdeo correspondente a valina ser substitudo por leucina. Mas, em funo da sinonmia do cdigo, se a trinca GUG for substituda por GUA ou GUC, o aminocido codificado continuar sendo a valina. Perdas ou adies de uma base modificam o resto da sequncia do peptdeo. As pequenas mudanas ou mutaes de ponto se devem a erros na duplicao do DNA; sua frequncia aumenta em presena de alguns agentes qumicos e fsicos como a luz ultravioleta e os raios X. TABELA 5.1: O cdigo gentico
SEGUNDA BASE CITOSINA (C) ADENINA (A) Ser Ser Ser Ser Pro Pro Pro Pro Thr Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ala Tyr Tyr Stop Stop His His Gln Gln Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu

PRIMEIRA BASE URACILA (U)

URACILA (U) Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ile Ile Ile Met Val Val Val Val

GUANINA (G) Cys Cys Stop Trp Arg Arg Arg Arg Ser Ser Arg Arg Gly Gly Gly Gly

TERCEIRA BASE (U) (C) (A) (G) (U) (C) (A) (G) (U) (C) (A) (G) (U) (C) (A) (G)

CITOSINA (C)

ADENINA (A)

GUANINA (G)

Abreviaturas: Asp = cido Asprtico; Glu = cido Glutmico; Ala = Alanina; Arg = Arginina; Asn = Asparagina; Cys = Cistena; Phe = Fenilalanina; Gly = Glicina; Gln = Glutamina; His = Histidina; Ile = Isoleucina; Leu = Leucina; Lys = Lisina; Met = Metionina; Pro = Prolina; Ser = Serina; Tyr = Tirosina; Thr = Treonina; Trp = Triptfano; Val = Valina.

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FIGURA 5.2. O fluxo da informao gentica. DNA


Filamento codificador Filamento molde

TRANSCRIO

mRNA
r RNA tRNA + aminocidos

TRADUO
Transporta os aminocidos e os coloca no lugar adequado

Onde ocorre a sntese

Peptdeo

FIGURA 5.3. A sntese de protenas em clulas procariticas e eucariticas. A. Clulas procariticas


Transcrio Traduo Modificaes posteriores

DNA

mRNA

Protena

Alterao da atividade da protena

B. Clulas eucariticas
Transcrio Processamento do RNA Traduo Modificaes posteriores

DNA

RNA transcrito

mRNA

mRNA

Protena

Alterao da atividade da protena

Ncleo

Poro Membrana nuclear

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A EXPRESSO GNICA O FLUXO DA INFORMAO GENTICA A informao codificada no DNA transcrita em uma molcula mensageira que a leva at os ribossomos, onde as indicaes sero traduzidas da linguagem dos cidos nucleicos linguagem das protenas, sendo montado o peptdeo correspondente. Deste modo, se estabelece na clula um fluxo da informao gentica que segue em uma direo nica: do DNA ao RNA, do RNA ao peptdeo (Figura 5.2). Uma exceo a esta regra a dos retrovrus, cujo material hereditrio RNA e que contam com uma enzima (transcriptase reversa) que lhes permite transcrever a informao no sentido RNA DNA. Na sntese de protenas intervm, basicamente, trs tipos de RNA: mRNA, rRNA e tRNA. O cido ribonucleico mensageiro, ou mRNA, de tamanho varivel e filamento nico. A molcula de mRNA leva at os ribossomos a informao gentica transcrita em trincas de bases (cdons) complementares a algum segmento de uma das cadeias do DNA. Associado a protenas, o cido ribonucleico ribossmico ou rRNA forma as duas subunidades dos ribossomos, que so as estruturas celulares onde ocorre a sntese proteica. O cido ribonucleico de transferncia tRNA capaz de reconhecer simultaneamente um aminocido e um cdon de mRNA. Existem 61 tipos moleculares diferentes de tRNA. Segundo o denominado Dogma Central da Biologia Molecular, a informao gentica codificada no DNA transcrita no mRNA e traduzida no ribossomo com a participao dos tRNAs. O produto final um peptdeo. As clulas procariticas e eucariticas apresentam algumas diferenas em relao s etapas da sntese de protenas e aos mecanismos de regulao correspondentes (Figura 5.3). CLULAS PROCARITICAS Uma bactria pode contar com aproximadamente 2.500 genes; nem todos funcionando simultaneamente. Se houver lactose no meio (e faltar glicose), as bactrias sintetizaro aquelas enzimas que possibilitem sua utilizao. E se faltar o aminocido triptfano no meio, produziro os vrios tipos de enzimas necessrias para sintetiz-lo. Isto se v facilitado pela agrupao dos genes correspondentes em baterias (perons), que so ligadas ou desligadas em conjunto. Neste processo de ligar e desligar esto envolvidas trs regies anteriores sequncia codificadora: o promotor, o operador e o regulador. A enzima RNA-polimerase encaixa no promotor, desde onde comear a se deslocar ao longo do gene. Protenas sintetizadas pelo gene regulador agem no operador, abrindo ou bloqueando a passagem da RNA-polimerase. Este mecanismo possibilita a induo ou represso da transcrio da sequncia codificadora (Figura 5.4). A organizao dos genes de uma mesma via metablica em perons permite que a clula se adapte rapidamente s condies ambientais, com certa economia de recursos. O funcionamento do peron depende da funo exercida pelos genes (degradao ou sntese). Por isso, a presena de lactose induz a transcrio do peron lac, sendo sintetizadas vrias enzimas necessrias para degrad-la; em ausncia de lactose, o peron deixa de funcionar. J no peron Trp, a presena de triptfano reprime a transcrio das enzimas necessrias para sintetizar esse aminocido. Na clula procaritica, alm dos genes funcionarem em bloco, a sntese proteica comea quando o mRNA est ainda sendo transcrito, de maneira que a transcrio e a traduo so simultneas. Uma sequncia especfica que no traduzida indica o stio de unio ao ribossomo.

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CLULAS EUCARITICAS A transcrio As bactrias no so as nicas que ligam e desligam os seus genes. Uma clula humana com 30.000 a 35.000 genes no expressa mais que 3 a 5% destes, que no sero necessariamente os mesmos ao longo da vida embrionria ou em diferentes tipos celulares. Entretanto, salvo em nematdeos, no foram achados perons nas clulas eucariticas; os genes responsveis por uma sequncia de reaes metablicas se encontram dispersos em um ou em vrios cromossomos. O controle da transcrio comea na compactao do cromossomo e na metilao de algumas bases, podendo dificultar o acesso da maquinaria de transcrio ao DNA. Esta inclui fatores de ativao, fatores de transcrio e protenas reguladoras, algumas das quais dependem de outras sequncias, estimuladoras e inibidoras, distantes do gene em at vrios milhares de bases (Figura 5.5). Ao reconhecer a presena dos fatores e protenas reguladoras na regio anterior ao gene, a RNA-polimerase encaixa nas sequencias promotoras da transcrio. Associada a outros fatores adicionais, a enzima se desloca abrindo a dupla hlice e transcrevendo a sequencia codificadora de um ou outro filamento no RNA. A enzima avana na direo 5- 3, sendo que vrias molculas de RNA-polimerase podem estar transcrevendo o mesmo gene simultaneamente em algo parecido com uma fila indiana. A sntese acaba quando a RNA-polimerase encontra uma sequencia finalizadora. Uma vez cumprida sua tarefa, a molcula de RNA-polimerase ser liberada. Regies denominadas UTR (do ingls untranslated regions), portadoras de sequncias sinalizadoras que no sero traduzidas, se localizam a montante e a jusante da unidade de transcrio. As sequncias reguladoras levam, alm do stio de unio ao ribossomo, outras que podem determinar quando, por quanto tempo e em que clulas o gene ser transcrito.

O processamento do RNA transcrito Nos organismos eucariticos, a estrutura do gene fragmentada (Figura 5.5). A sequncia gnica transcrita por inteiro no RNA e, posteriormente, um mecanismo de corte e reunio ir eliminar algumas das sequncias intercalares. Estas permanecero no ncleo (ntrons) em quanto que as restantes (xons) formaro o RNA mensageiro que sair do ncleo na direo do citoplasma. Tanto o nmero como a extenso das sequncias intercalares varia em diferentes genes. As consequncias biolgicas deste mecanismo so importantes. Protenas sintetizadas utilizando as vias alternativas de corte e reunio permitem que um nico gene se expresse de maneira diferente em diversos tecidos. O corte e reunio dos fragmentos no a nica modificao do RNA transcrito; este recebe um revestimento inicial ou cap (7-metilguanosina) que o dirigir ao ribossomo, e uma cauda de poli(A) que lhe dar estabilidade na sua viagem at a maquinaria de traduo.

A traduo e o destino das protenas A sntese proteica se inicia depois do mRNA atravessar a membrana nuclear e migrar para o citoplasma. Assim como a transcrio, a traduo envolve a participao de numerosas enzimas e protenas reguladoras.

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Algumas molculas de mRNA levam sequncias sinalizadoras que as dirigem at os ribossomos associados ao retculo endoplasmtico, sendo as protenas sintetizadas secretadas fora da clula. Outras molculas de mRNA sero traduzidas nos ribossomos livres no citosol, sendo as protenas resultantes utilizadas no mesmo lugar ou nas organelas celulares. O mRNA reconhece o ribossomo mediante uma sequncia especfica; a associao entre ambos d incio sntese peptdica. Cada tRNA carrega o aminocido que lhe corresponde at a cadeia peptdica. A complementaridade entre um dos cdons do mRNA e o anticdon do tRNA garante que este coloque o aminocido no lugar adequado na sequncia. Existem vrios mecanismos de regulao envolvendo a ao de protenas associadas ao complexo ribossmico, variaes na vida mdia do mRNA e inclusive a traduo do mRNA por vrios ribossomos ao mesmo tempo. O peptdeo sintetizado passar por diversas modificaes e associaes, at se constituir no produto final ativo, uma protena com uma estrutura quaternria determinada. Uma viso geral comparativa da sntese proteica em clulas eucariticas e procariticas (Figura 5.6). FIGURA 5.4. A organizao e regulao dos genes nas clulas procariticas. peron
Gene regulador DNA Gene Gene promotor operador Gene 1 Genes estruturais Gene 2 Gene 3

Sequncia transcrita Fim da transcrio Em alguns perons, o produto de gene regulador bloqueia a entrada da RNA-polimerase no operador; em outros a desbloqueia

FIGURA 5.5. A organizao e regulao dos genes nas clulas eucariticas.


As UTR so sequncias sinalizadoras que no sero traduzidas.

Gene Sequncias reguladoras promotoras da transcrio UTR DNA Unidade de transcrio. Inclui as sequncias iniciais e finais, os xons e os ntrons Incio da transcrio Fim da transcrio Sequncias reguladoras finalizadoras da transcrio UTR

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FIGURA 5.6. As etapas da sntese de protenas (Recapitulao).


A) Clula eucaritica Citoplasma DNA DNA ntrons Gene mRNA TRANSCRIO xons mRNA Protenas B) Clula procaritica

A
RNA cap

Ncleo

A: Adio de um revestimento inicial


e de uma cauda de poli-A

B B: Mecanismos de corte e reunio mRNA


TRADUO Protena

FIGURA 5.7. O silenciamento gnico.

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O COMPLEXO MUNDO DOS RNAs Nem todos os genes codificam protenas, alguns codificam cidos ribonucleicos que no so traduzidos como protenas (rRNA, tRNA). Nos ltimos anos comeou a ser desvendada a existncia de pequenas molculas de RNA (sRNA, do ingls small RNA) e sua importncia nas atividades celulares. O sRNA participa no processamento de ntrons e de xons, na regulao da expresso gnica e na conservao dos telmeros. Essas atividades so possveis devido estrutura molecular do RNA, que permite o pareamento com uma molcula de sequencia complementar e, tambm, s propriedades de se associar com protenas e de desenvolver uma atividade cataltica. Dentre os diversos tipos de RNA descritos nos ltimos anos, destacam-se os que impedem a expresso gnica, no nvel da traduo. Trata-se de molculas de RNA de filamento duplo que so clivados por enzimas em pequenos fragmentos de aproximadamente 20 nucleotdeos. A associao entre um pequeno fragmento e o complexo proteico RISC (do ingls RNA-induced silencing complex), desencadeia a degradao de um dos filamentos. O filamento restante permanece associado a RISC, podendo parear com qualquer RNAm parcial o totalmente complementar, bloqueando a traduo ou provocando sua destruio (Figura 5.7). Aplicado tanto a molculas de RNA endgenas como exgenas, o mecanismo permite silenciar a expresso de um gene e eliminar as molculas de RNA viral que tenham-se introduzido na clula. As primeiras aplicaes contemplam a agricultura e a medicina.

A GENMICA O GENOMA HUMANO O termo genoma designa o conjunto completo de cromossomos haploides que contm toda a informao gentica de um indivduo. O genoma nuclear da espcie humana est representado em 24 cromossomos diferentes (22 autossmicos, X e Y) em cada um dos quais h uma molcula de DNA. Devido presena de DNA nas mitocndrias, de herana exclusivamente materna, existe tambm de um genoma mitocondrial. Em 1990, teve incio o Projeto Genoma Humano (HGP, do ingls Human Genome Project), um dos projetos cientficos mais ambiciosos j realizados, envolvendo pesquisadores de mais de 18 pases na tarefa de mapear e sequenciar o DNA humano e tambm o de outros organismos. Em Junho do ano 2000, o International Human Genome Sequencing Consortium e a Celera Genomics, uma empresa privada norte-americana, anunciaram simultaneamente ter completado o rascunho do genoma humano. Os resultados foram publicados em fevereiro de 2001, nas revistas Nature e Science. Em abril de 2003, cinquenta anos depois da descoberta da dupla hlice, o Consrcio anunciou ter completado 99% do mapeamento. Os seus resultados esto armazenados em bancos de dados pblicos que podem ser acessados via Internet. Entre as principais concluses: o o O nmero de bases no genoma humano chega a 3,2 bilhes, e o nmero de genes a um valor compreendido entre 30.000 e 40.000; s 2% do genoma codificaria protenas. O nmero de genes em organismos como a mosca Drosophila melanogaster ou o verme Caenorrabditis elegans trs vezes menor. Compartilhamos com estes organismos alguns genes e contamos com outros que so caractersticos dos vertebrados como, por exemplo, vrios dos genes referentes ao sistema imune.
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o o

A densidade dos genes em diversos cromossomos e em diferentes partes deles varia. Existem grandes espaos entre os genes, s vezes chamados de DNA-lixo. Sequncias repetidas, no codificadoras, cuja funo direta ainda no bem conhecida, ocupam pelo menos 50% do genoma. O tamanho dos genes varivel, sendo na mdia de 3.000 bases. Na realidade, o tamanho no parece ter muita importncia. Como boa parte dos genes poderia ser lida de diversos modos, o nmero de protenas poderia ser bem maior. Independentemente de nossa origem tnica, compartimos com os outros seres humanos 99,9% da sequncia gnica. As diferenas entre os seres humanos se devem a variaes de uma base em 3.000.000 de pontos dentro e fora dos genes. Estas variaes se denominam polimorfismos de um nucleotdeo nico ou SNPs (do ingls, single nucleotide polymorphisms). Os SNPs podem dar informaes sobre a base gentica da susceptibilidade a uma srie de doenas ou servir como marcadores das mesmas (doena cardiovascular, diabetes, artrite e cnceres). Em vrios genes foram encontradas sequncias associadas a doenas (cncer de mama, cegueira, surdez, doenas musculares).

Os laboratrios de sequenciamento modernos esto altamente automatizados, sendo que muito do trabalho feito por robs e computadores. Uma quantidade enorme da informao obtida se encontra na Internet, armazenada em grandes bancos de dados. O desenvolvimento da Bioinformtica, um conjunto de novas tecnologias que utiliza mtodos computacionais e matemticos para analisar as informaes, tem sido fundamental para o progresso dos estudos sobre os genomas. Muitos dos estudos atuais no so mais feitos in vivo nem in vitro, mas in silico. A Genmica surge como uma nova disciplina que tenta responder a algumas questes fundamentais: Onde esto os genes? O que faz cada gene? Como diferem os organismos em relao a seus genes? Cada uma dessas perguntas a subdivide em especialidades como a Genmica estrutural, a Genmica funcional ou a Genmica comparativa. Paralelamente, se definem outras reas de estudo, tais como: o o o A transcriptmica, concernente ao RNA transcrito ou transcriptoma, isto , aos padres de expresso gnica. A protemica, referente ao conjunto de protenas da clula ou proteoma, que varia ao se diferenciarem as clulas e em resposta a estmulos ambientais. A metabolmica, relativa ao conjunto de substratos e subprodutos de reaes enzimticas que incidem no fentipo celular.

TABELA 5.2. O DNA como agente biolgico.


AGENTES BIOLGICOS APLICAES Identificao de microrganismos patognicos Controle da qualidade dos alimentos Medicina molecular (diagnsticos, tratamentos personalizados, terapias gnicas) DNA e genmica Testes genticos (diagnsticos, avaliao dos riscos de sade) Agronomia e pecuria (mtodos seletivos mais eficientes). Indstria farmacolgica (protenas teraputicas, vacinas recombinantes e de DNA) Prtica forense (identificao das pessoas) Estudos antropolgicos e evolutivos 56

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A genmica tem aplicaes imediatas no campo mdico e farmacolgico, atravs dos testes genticos e dos novos medicamentos (Tabela 5.2). Estima-se que, entre os 30.000 a 40.000 genes humanos recentemente descobertos, 5.000 a 10.000 poderiam ser o alvo de novos produtos farmacolgicos. Se forem consideradas as protenas, o nmero de alvos pode ser multiplicado por dez. Paralelamente ao mapeamento do genoma humano, mais de 900 outros organismos foram sequenciados (microrganismos, plantas, animais). Em 2009, os mais de 4.500 projetos em andamento abrangem organismos eucariontes (22%), bactrias (53%), arqueas (22%) e metagenomas (3%). Em curto ou mdio prazo, esta informao reverter tambm no desenvolvimento da agricultura, da pecuria e da indstria qumica. A GENMICA EM AMRICA LATINA Vrios pases de Amrica Latina contam com projetos em andamento (Argentina, Brasil, Chile e Mxico). De um modo geral, estes envolvem parcerias entre instituies pblicas e privadas, sendo beneficiados por acordos internacionais com pases desenvolvidos (Estados Unidos, Frana, Alemanha) ou por redes de cooperao inter-regionais (Brasil, Argentina, Chile, Uruguai e Paraguai). Pioneiro na cincia genmica, o Brasil alcana resultados significativos em diversas reas, tais como: o Sade humana: Sequenciamento de Schistosoma mansoni (um protozorio causador da esquistossomose), de Leischmania chagasi (um protozorio causador do calazar), de Paracoccidioides brasiliensis (um fungo causador de micose), de Trypanosoma cruzi (um protozorio causador da doena de Chagas), de Anopheles darlingi (um mosquito transmissor da malria) de Leptospira interrogans (uma bactria transmitida pela urina do rato e que afeta o homem). Tambm se desenvolvem importantes estudos sobre o Genoma Humano do Cncer e o Genoma Clnico. Sade animal: Sequenciamento de Mycoplasma synoviae (um vrus que afeta os bovinos) e Mycoplasma hyopneumoniae (um vrus que afeta os sunos). Pecuria: Mapeamento de Bos indicus (gado Nelore adaptado ao Brasil), estudos sobre o genoma funcional do boi, do frango, da abelha. Agricultura: Sequenciamento de Xylella fastidiosa (causadora da praga do amarelinho das videiras), de Xanthomonas (uma bactria causadora do cancro ctrico ou tristeza), de Leifsonia xyli (bactria que ataca a cana-de-acar), de Crinipellis perniciosa (um fungo causador da vassoura de bruxa, que ataca o cacau), de Baculovrus anticarsia (um vrus que ataca a lagarta da soja), de Mycosphaerella fijiensis (que causa a sigatoka negra da banana) de Gluconacetobacter diazotrophicus e de Herbaspirillum seropedicae (bactrias fixadoras de nitrognio). Indstria: Sequenciamento de Chromobacterium violaceum (uma bactria que pode originar compostos de interesse farmacolgico) e de vrias plantas industriais (guaran, caf, cana-deacar, eucalipto, alm de leguminosas como soja, feijo, feijo-caupi e amendoim).

o o o

Essas realizaes foram possveis graas ao envolvimento pioneiro da Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (Fapesp) e criao de Rede Nacional de Sequenciamento do Programa Genoma Brasileiro (CNPq, Ministrio de Cincia e Tecnologia), com 25 laboratrios regionais e um laboratrio de bioinformtica (Laboratrio Nacional de Computao Cientfica), a participao da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria (Embrapa) e vrias universidades que deram a infraestrutura necessria e possibilitaram a capacitao profissional. A criao de empresas novas com fundo de capital de risco visa desenvolver produtos biotecnolgicos que gerem e comercializem patentes na rea da genmica aplicada, com o qual, em um futuro prximo, a participao do Brasil nesta rea se ver afianada.
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6. OS BIOPROCESSOS

BIOPROCESSOS, PROCESSOS FERMENTATIVOS E INDSTRIA A produo de vinhos e cervejas o primeiro processo fermentativo desenvolvido em escala industrial. Ao longo do sculo XX, a expanso da Microbiologia Industrial possibilitou, mediante o desenvolvimento de processos baseados no metabolismo microbiano, a produo de diversas substncias (acetona, butanol, etanol, cido ctrico, antibiticos etc.). Atualmente, as fermentaes encontram aplicaes novas, tanto no tratamento ambiental como na produo de alimentos e aditivos, de produtos qumicos e de medicamentos. Por motivos histricos, ainda hoje o termo processos fermentativos se aplica em biotecnologia a qualquer processo microbiano operado em grande escala, independentemente de ser ou no uma fermentao. E o termo fermentador se usa como sinnimo de biorreator, designando o recipiente onde ocorre o processo (Figura 6.1).

FIGURA 6.1. O processo fermentativo genrico.

Preparao do inculo

FASE DE LABORATRIO

FASE INDUSTRIAL
Preparao do meio Esterilizao

Controles (temperatura, pH)

Ar

Esterilizao

Tratamento final

Subprodutos

Produtos

Resduos

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OS MICRORGANISMOS INDUSTRIAIS NOES SOBRE O METABOLISMO PRIMRIO E SECUNDRIO Denominamos metabolismo o conjunto de reaes qumicas de degradao (catabolismo) e de sntese (anabolismo) de substncias em um organismo. As primeiras liberam energia, as outras a consomem. As clulas e a maioria dos microrganismos retiram dos compostos orgnicos a energia que precisam, para a manuteno de sua estrutura e para suas atividades. Nas vias catablicas, a degradao de compostos orgnicos em molculas menores libera energia; uma parte desta ser acumulada sob a forma de ATP (trifosfato de adenosina), e a restante dissipada como calor. Respirao e fermentao so as principais vias catablicas (Figura 6.2). A quantidade de energia liberada e os produtos finais diferem se a oxidao do composto orgnico for total ou parcial. Na gliclise, a glicose degradada at uma molcula de trs carbonos, o piruvato. Em presena de oxignio, a entrada do piruvato no ciclo de Krebs e a fosforilao oxidativa permitem a quebra total da glicose em CO2 e H2O, liberando uma grande quantidade de energia sob a forma de ATP (respirao aerbia). Mediante a reduo do piruvato ou de algum de seus derivados (fermentao), vrios microrganismos geram outras substncias orgnicas: acetona, butanol, etanol, cido lctico, cido actico, glicerol etc. Estas reaes ocorrem geralmente em ambientes onde o substrato abundante, sendo pequena a quantidade de energia obtida. Dependendo das condies ambientais, isto , da presena ou ausncia de oxignio, algumas leveduras e bactrias (assim como as clulas musculares) podem respirar ou fermentar. FIGURA 6.2. Respirao e fermentao.
Na respirao, onde o ltimo aceptor de eltrons o oxignio, a oxidao de glicose se completa at chegar a CO2 e H2O, produzindo 36-38 molculas de ATP. Na fermentao, o ltimo aceptor de eltrons o piruvato ou algum outro derivado, produzindo 2 ATP.

Glicose GLICLISE (2 ATP) Citoplasma FERMENTAO cido pirvico Sem O2 Com O2 Composto orgnico (etanol, cido lctico)

RESPIRAO Ciclo de Krebs e cadeia respiratria

Citoplasma (procariontes) Mitocndria (eucariontes)

CO2 , H2O e 36-38 ATP

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A respirao e algumas fermentaes so representadas mediante equaes, como a seguir: o Respirao aerbia: C6H12O6 + 6 O2 +38 ADP + 38Pi Glicose 6 CO2 + 6 H2O + 38 ATP

o Fermentao alcolica (leveduras como S. cerevisiae e algumas bactrias): C6H12O6 + 2 ADP + 2Pi Glicose CH3 CH2OH Etanol + CO2 + 2 ATP

o Fermentao lctica (bactrias como Streptococcus e Lactobacillus): C6H12O6 + 2 ADP + 2Pi Glicose CH 3 CHOH COOH + 2 ATP cido lctico

No metabolismo, os caminhos de degradao se cruzam com os de sntese. Outras molculas (aminocidos, cidos graxos) podem entrar em determinados pontos da via catablica da glicose, convergindo para a produo de energia e de pequenas molculas simples (CO2, H2O e NH3). Inversamente, alguns dos compostos intermedirios do catabolismo so os pontos de partida para vias anablicas. Entretanto, as vias metablicas no so reversveis: o caminho seguido na degradao de uma substncia parcial ou totalmente diferente do caminho de sntese correspondente, podendo inclusive ocorrer em compartimentos celulares diferentes. Esta separao facilita a regulao enzimtica do metabolismo que ocorre com o menor desperdcio de matria e energia. Alm das vias metablicas primrias, que so comuns a todos os microrganismos, existem outras vias metablicas secundrias especficas. A ativao de umas e/ou de outras depende do microrganismo e das condies em que ele se desenvolve em seu ambiente natural ou em que ir ser cultivado. Os metablitos primrios esto relacionados com o crescimento dos microrganismos e a transformao de nutrientes em biomassa; sendo os principais exemplos o etanol, o cido lctico ou os aminocidos. J os metablitos secundrios, mesmo sendo desnecessrios no metabolismo microbiano, permitem a sobrevivncia em ambientes extremamente competitivos que contam com escassos nutrientes. So metablitos secundrios os antibiticos, os alcaloides, os pigmentos, algumas enzimas e toxinas. De um modo geral, quando os microrganismos se desenvolvem em um meio com uma quantidade limitada de nutrientes, a populao passa por diversas fases (Figura 6.3A). o o o Fase lag: perodo de adaptao em que, apesar de no se multiplicar, os microrganismos sintetizam enzimas e constituintes celulares. Fase log: a populao cresce de maneira exponencial, sendo sintetizados numerosos metablitos primrios. Fase estacionria: devido ao esgotamento dos nutrientes e acumulao de excretas, algumas clulas morrem, enquanto outras se dividem. No fim da fase log e incio da fase estacionria comeam a serem sintetizados os metablitos secundrios. Fase de declnio: sem a renovao dos nutrientes, as clulas morrem em um tempo varivel.

Com vistas ao desenvolvimento de um bioprocesso, a escolha do microrganismo ter que ser feita em funo de suas vias metablicas; e as condies de cultivo dependero do objetivo da fermentao, um metablito primrio ou um metablito secundrio (Figura 6.3B).
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FIGURA 6.3: As diversas fases do crescimento de uma populao microbiana e a produo de metablitos.
A. As fases de crescimento de uma populao. log do nmero de clulas

Tempo Fase lag Fase log Fase estacionria Fase de declnio

B: A produo de metablitos primrios e secundrios. Os nutrientes do meio permitem a multiplicao celular e a formao do metablito primrio, que pode ser utilizado pelas clulas para sintetizar o metablito secundrio (a); este pode tambm ser sintetizado diretamente a partir de alguma substncia do meio (b). a

Meio nutriente

Clulas

Metablito primrio

Metablito secundrio

MEIOS DE CULTURA E MATRIA-PRIMA A composio do meio de cultura depende das necessidades metablicas do microrganismo escolhido. Este deve conter todos os nutrientes necessrios nas concentraes adequadas, que variam em funo do microrganismo e do objetivo do processo. Em geral, os meios de cultura utilizados no laboratrio incluem:
o o o o o gua. Uma fonte de energia e de carbono: glicose, amido etc. Uma fonte de nitrognio: inorgnica (sulfato de amnia, nitrato de potssio etc.), orgnica (asparragina, succinato de amnia, glutamato, ureia etc.) ou complexa (farinha de soja, peptona etc.). Sais minerais, tais como fosfato de potssio (K2HPO4 ou KH2PO4), sulfato de magnsio (MgSO4 7H2O), cloreto de clcio (CaCl2) etc. Elementos-trao: ferro, zinco, mangans, cobre, cobalto, molibdnio.

Com vistas a uma explorao comercial, os meios definidos so substitudos na indstria por matrias-primas de baixo custo como, por exemplo, soro de leite, melao de cana ou de beterraba, amido de milho etc. Em alguns casos, a matria-prima passa por um tratamento prvio com mtodos fsicos e/ou qumicos. No caso de se tratar de um processo enzimtico, o meio dever levar, alm do substrato adequado, os elementos necessrios para que a enzima possa desenvolver sua atividade cataltica (precursores, cofatores etc.).
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BIOTECNOLOGIA 2011 / Captulo 6: Os bioprocessos

A ESCOLHA DAS LINHAGENS De um modo geral, para que o cultivo em um fermentador resulte economicamente vivel, o microrganismo deve ser capaz de se multiplicar rapidamente, sintetizando grande quantidade do produto a partir de uma matria-prima barata. Existem Bancos e Colees de Cultura que vendem esse tipo de linhagens de microrganismos como culturas puras, geneticamente estveis e aptas para o cultivo em grande escala. Apesar de terem sido isoladas do meio ambiente, as linhagens industriais diferem substancialmente das linhagens originais, em virtude de uma srie de alteraes genticas (mutaes, recombinaes) obtidas no laboratrio. Algumas vias metablicas, especialmente as do metabolismo secundrio, podem ter sido alteradas, de maneira a aumentar ao mximo a sntese do produto desejado e evitar a produo de algumas substncias desnecessrias. Em geral, por estar to selecionadas geneticamente, tendo inclusive algumas vias metablicas anuladas ou desbalanceadas, estas linhagens sobrevivem pouco tempo no meio ambiente. Porm, como norma geral, as linhagens industriais no devem ser patognicas nem produzir toxinas. A produo de medicamentos ou de vacinas um caso especial que exige medidas de segurana estritas. Os microrganismos constituem um grupo biolgico muito diversificado e, ainda, pouco conhecido, por isso existem muitas expectativas em relao prospeco de linhagens em ambientes extremos ou pouco usuais. No se precisa desenvolver um processo novo para cada microrganismo que apresente alguma caracterstica comercial interessante. A tendncia atual de transferir os genes correspondentes a algum dos microrganismos conhecidos, adaptados s condies industriais. OS DIFERENTES TIPOS DE BIOPROCESSOS OS PROCESSOS TRADICIONAIS Algumas fermentaes se desenvolvem sobre resduos agroindustriais ou florestais, como gros, palha, bagao, serragem etc. Este tipo de fermentao em meio slido umedecido utilizada na produo de alimentos como, por exemplo, o levedo da massa na panificao, a maturao de queijos por ao de fungos (Roquefort, Gorgonzola), o cultivo de fungos, a fermentao do cacau, do caf e do ch etc. Na sia, a preparao do koji, soja fermentada, a base de alimentos tradicionais como o tofu, o miss, o shoyu e o sak. Em alguns lugares, estas fermentaes ainda ocorrem artesanalmente, dentro de folhas de bananeira e cestas de bambu ou mesmo em montes; tambm existem hoje equipamentos sofisticado com bandejas, colunas, frascos e tambores rotativos, alguns totalmente automatizados (Figura 6.4). Outra variante interessante do processo fermentativo a produo tradicional de vinagre (Processo Francs ou de Orlans) em barris de carvalho. O vinho inoculado com bactrias do gnero Acetobacter que formam na superfcie a "me do vinagre", uma pelcula que flutua, presa a um quadriculado de madeira que a impede de afundar. Deste modo, o microrganismo cresce na superfcie de um meio lquido, em contato simultneo com o ar e com o meio. O processo fornece excelentes vinagres, mas lento e exige muito espao, sendo a capacidade de cada barril de 200 litros (Figura 6.5). Existem outros processos semelhantes, conduzidos por fungos, que formam uma pelcula de miclio na superfcie do lquido.

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FIGURA 6.4. Biorreator para fermentaes em fase slida.


Injeo de ar Umidade Controles Sada de ar

Bandejas com a matria-prima para o cultivo de microrganismos

FIGURA 6.5. Um processo tradicional, a produo de vinagre (Mtodo de Orlans).


Tubo para adicionar o vinho

Entrada de ar Me do vinagre Mosto Retirada do vinagre

OS PROCESSOS SUBMERSOS Atualmente, a maioria dos processos industriais se desenvolve em cubas de vidro ou de ao de at 20 litros. Os agentes biolgicos se encontram submersos no meio de cultivo que ocupa, aproximadamente, 75% da cuba. s vezes necessrio injetar ar, e em muitas fermentaes se forma espuma. O desenho do biorreator deve se adequar ao objetivo do processo, respondendo eventualmente a diversos imperativos, tais como a esterilizao do sistema, a aerao e homogeneizao do meio, o acrscimo de nutrientes e de aditivos antiespuma, a manuteno do pH etc. Os modelos de fermentadores mais utilizados com microrganismos contam com aerao e agitao mecnica. Esta facilita a distribuio dos nutrientes na cuba, mas gera calor que deve ser eliminado mediante a circulao de gua fria (Figura 6.6). Se o processo exigir assepsia, esta ser conseguida mediante:
o o A esterilizao do meio, dentro ou fora do fermentador. A desinfeco ou esterilizao do equipamento, por injeo de vapor ou mediante o calor gerado por serpentinas, sendo esta medida extensiva a todos os ductos de entrada e sada e s vlvulas correspondentes. A esterilizao do ar, mediante filtros adequados.

Em outros tipos de biorreatores, em coluna ou torre, a homogeneizao depende da injeo de ar (Figura 6.7). Os tanques podem chegar a 3.000 m3 de capacidade como, por exemplo, os fermentadores para a produo de protenas de clula nica, da Imperial Chemical Industries (ICI), no Reino Unido.
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BIOTECNOLOGIA 2011 / Captulo 6: Os bioprocessos

FIGURA 6.6. Modelo de biorreator utilizado em fermentaes submersas.

OUTROS SISTEMAS SUBMERSOS Os sistemas submersos so apropriados para o cultivo de microrganismos livres, mas resultam pouco econmicos quando se trabalha com clulas ou enzimas caras. A imobilizao em fermentadores menores, seja por adeso a um suporte inerte, seja por incluso dentro de um polmero que permita o contato com o meio de cultura, alm de simplificar a purificao do produto permite a reutilizao das clulas ou das enzimas, que permanecem dentro do biorreator (Figura 6.7). O crescimento da populao microbiana, ou a quantidade do produto formado so monitorados a partir de amostras extradas ao longo do processo. Existem fermentadores adaptados s necessidade de cada agente biolgico e de cada tipo de processos DO LABORATRIO INDSTRIA A MUDANA DE ESCALA A capacidade de uma cuba varia entre 1 e 10 l para um fermentador de laboratrio, chegando a 5.000 l em uma planta piloto e 100.000 l em uma planta industrial. Uma operao simples de laboratrio pode ser impraticvel, ou pouco econmica, quando realizada em grande escala. No laboratrio, aps as primeiras experincias realizadas na bancada, o processo passa a ser estudado em um biorreator de at 10 litros de capacidade, onde se analisam as variveis fsico-qumicas em outra escala.
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Ao aumentar o tamanho do equipamento, altera-se a relao superfcie/volume, de modo que as condies de operao do fermentador na planta piloto devero ser ajustadas at se aproximar das correspondentes a um processo comercial. Se a experincia na planta piloto for bem-sucedida, o processo poder ser desenvolvido em um fermentador industrial (Figura 6.8). A automatizao do monitoramento e do controle da fermentao permite que a informao relativa aos parmetros fsicos e qumicos (pH, temperatura, oxignio, velocidade de agitao, o nvel do meio etc.) seja recolhida on-line por sondas e sensores. Para que o processo se aproxime das condies ideais, a informao analisada em relao a um modelo previamente estabelecido. Como este se elabora a partir da experincia obtida com cubas menores (laboratrio, piloto), os ajustes mudana de escala so de grande complexidade. FIGURA 6.7. Fermentaes, agentes biolgicos e biorreatores.
FERMENTAES SUBMERSAS

Podem ser conduzidas por


CLULAS E ENZIMAS Livres Imobilizadas

Em suportes inertes Reatores com agitao mecnica Reatores com agitao pneumtica Reatores de leito fixo

Entre membranas

Reatores de fibra oca

Reatores em torre Reatores STR

Ou de leito fluidizado Ou com membranas planas

Coluna de bolhas

Reatores air-lift

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FIGURA 6.8. A mudana de escala, do laboratrio indstria. A mudana de escala entre o processo laboratorial e o processo industrial cria vrios problemas de ndole tecnolgica.

Bancada

Fermentador de laboratrio 1 - 10 litros

Fermentador piloto 50 200 500 litros

Fermentador industrial 5.000 50.000 200.000 litros 5 50 200 m3

LABORATRIO

PILOTO

INDSTRIA

A CONDUO DO PROCESSO O processo fermentativo pode ser conduzido de maneira contnua ou descontnua (batelada), sendo que ambas as formas apresentam vantagens e inconvenientes. Em um sistema descontnuo de produo, uma vez que o fermentador carregado com a matria-prima e o inculo correspondentes, a fermentao prossegue at o esgotamento dos nutrientes. Concludo o processo e extrado o produto, o fermentador esvaziado, limpo e esterilizado antes de receber outra carga. Apesar do tempo improdutivo entre uma batelada e a seguinte, o sistema relativamente flexvel, j que o mesmo equipamento pode ser utilizado na fabricao de produtos diferentes. A produo em bateladas bastante utilizada na indstria farmacutica porque o risco de contaminao permanece relativamente baixo. J no sistema contnuo de produo, o acrscimo de nutrientes e a retirada do produto ocorrem simultaneamente ao longo do processo, eliminando-se quase totalmente o tempo improdutivo. Como o risco de contaminao aumenta, o sistema se adapta a processos que no exijam assepsia, como a produo de protena microbiana e de lcool e, obviamente, o tratamento de gua. Entre o sistema em batelada e o sistema contnuo existe um sistema intermedirio de batelada alimentada em que, periodicamente, parte do contedo (meio de cultivo + produto) retirada e substituda por meio fresco.

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A RECUPERAO DO PRODUTO A recuperao do produto representa uma frao considervel do custo de um processo fermentativo. Se o produto for secretado fora da clula, estar disperso em um volume grande de gua e ser necessrio separ-lo por decantao ou filtrao. Mas se o produto permanecer dentro das clulas, estas tero que ser desintegradas para proceder a sua extrao. O produto se concentra por sedimentao, precipitao, filtrao, centrifugao, extrao por solventes, destilao, evaporao do solvente e secagem. Se a purificao for necessria, esta envolver outros procedimentos, como a cristalizao e os mtodos cromatogrficos. Um problema a considerar o despejo dos resduos de uma fermentao, alguns dos quais podem representar um perigo para o meio ambiente como, por exemplo, o vinhoto resultante da produo de etanol ou o soro das indstrias de laticnios. Existem formas de tratamento, como o crescimento de biomassa sobre resduos industriais, que eliminam o problema e ainda permitem a obteno de mais um produto.

OS BIOPROCESSOS NA INDSTRIA DE FERTILIZANTES Os bioprocessos so utilizados por numerosas indstrias na produo de bens e servios, em vrios setores produtivos (indstria, meio ambiente, sade). Vrios exemplos sero tratados nos captulos correspondentes (indstria, meio ambiente, alimentos, sade). A utilizao de bioprocessos na indstria de fertilizantes uma aplicao interessante porque permite a substituio de produtos qumicos derivados do petrleo por agentes biolgicos, menos prejudiciais para o meio ambiente. Na Amrica Latina, a produo de biofertilizantes envolve numerosas empresas, pequenas e mdias, que contam com um slido suporte tecnolgico originado em universidades e instituies pblicas de pesquisa agronmica. O termo biofertilizante se aplica aos produtos que contm agentes biolgicos capazes de favorecer o desenvolvimento vegetal. Um destes agentes o Rhizobium, uma bactria simbionte das razes de leguminosas que fixa o nitrognio atmosfrico, reduzindo a necessidade de aplicar fertilizantes nitrogenados nas lavouras. Vrios pases produzem inoculantes agrcolas; entre eles: Argentina, Brasil, Chile, Colmbia, Cuba, Mxico, Peru e Uruguai. As linhagens bacterianas so estirpes selecionadas por sua eficincia em uma ampla gama de cultivares e amplamente adaptadas s condies locais. A multiplicao dos microrganismos se realiza em etapas sucessivas, utilizando recipientes cada vez maiores at chegar a biorreatores de 1.500 litros. Uma vez recuperados, os microrganismos so veiculados em meio lquido ou em turfa estril, sendo empacotados e posteriormente vendidos e distribudos aos agricultores. Segundo a legislao do Mercosul, durante o prazo de validade do produto, a concentrao dever ser de 10 8 microrganismos viveis por grama de produto. Com o mapeamento do genoma de microrganismos como o Rhizobium etli (Mxico) e o Gluconacetobacter diazotrophicus (Brasil), a biotecnologia moderna comea a se inserir neste campo. No entanto, at o presente, a indstria baseia a produo dos microrganismos nas tecnologias fermentativas clssicas.

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7. A CULTURA DE CLULAS E TECIDOS

O CULTIVO DE CLULAS E TECIDOS VEGETAIS AS PRIMEIRAS TENTATIVAS A reproduo assexual utilizada para obter um grande nmero de mudas a partir de uma nica planta. Dependendo do caso, aproveitam-se bulbos (cebola), cormos (gladolo), rizomas (samambaias), tubrculos (batata-inglesa), caules (banana), razes (batata-doce, maa, amora), folhas (begnia, espada-de-so-jorge), estacas (videiras) etc. As plantas obtidas por propagao assexuada ou vegetativa so idnticas planta-me e idnticas entre si. Em outras palavras, so clones. A capacidade de uma clula regenerar rplicas do organismo do qual ela deriva denominada totipotncia. Restringida em animais, esta propriedade caracterstica das plantas. Em funo das condies fisiolgicas e ambientais, as clulas vegetais seguem vias metablicas diferentes. A totipotncia permite a sobrevivncia das plantas superiores aps o ataque de herbvoros, pragas e patgenos ou em condies ambientais desfavorveis. As primeiras tentativas de cultura de tecidos vegetais em laboratrio datam de 1902, no entanto, a primeira experincia bem-sucedida a germinao in vitro de sementes de orqudea (Knudson, 1922). Transferidas assepticamente ao meio de cultura, e incubadas em condies favorveis, as sementes e mais tarde as plntulas se mantiveram protegidas do ataque de fungos e bactrias. Com algumas variaes, o mtodo usado ainda hoje por numerosos floricultores, porque, devido ao tamanho minsculo das sementes e ausncia de reservas nutritivas, as possibilidades de sobrevivncia das plntulas aps a germinao in vivo so muito baixas. Distintamente das experincias anteriores, a micropropagao se inicia a partir de explantes, isto , de pequenos fragmentos de tecido extrados de diversas partes da planta, tais como folhas, razes, segmentos nodais e gemas axilares, gemas florais e apicais (Figura 7.1 ).

FIGURA 7.1. As diversas partes de uma planta angiosperma.

Copyright Maria Antonia Malajovich Biotecnologia: ensino e divulgao (www.bteduc.bio.br)

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OS MEIOS DE CULTURA O meio de cultura inclui gua, uma fonte de carbono, substncias inorgnicas (sais minerais), vitaminas, hormnios e fatores reguladores do crescimento (Tabela 1). Alguns destes componentes podem ser substitudos por misturas pouco definidas, mais econmicas ou simples de manipular (gua de coco, suco de tomate, suco de laranja). Geralmente, o pH do meio varia entre 5,0 e 6,5. A composio do meio de cultura varia com as necessidades de cada espcie. O crescimento e a diferenciao celular so controlados modificando a proporo entre os hormnios e reguladores de crescimento. De um modo geral, se a proporo entre citocininas e auxinas for maior que 1, desenvolvem-se brotos, se for menor, razes e, se for igual, calos. A incubao ocorre a uma temperatura entre 23 e 28 C, com 12 a 14 horas dirias de iluminao. TABELA 7.1. Os componentes do meio de cultura para clulas vegetais.
COMPONENTES gua destilada Fonte de carbono CARACTERSTICAS E EXEMPLOS Representa 95% do meio nutriente. Geralmente se utiliza sacarose. A fonte de carbono necessria porque os explantes no so totalmente autotrficos e a fotossntese in vitro no supre as necessidades das clulas. Macroelementos (N, P, K, Ca, Mg, S) e microelementos (Fe, Co, Zn, Ni, B, Al, Mn, Mo, Cu, I), em uma proporo que depende da planta escolhida. Mioinositol, vitamina B1 (tiamina), cido nicotnico (niacina), vitamina B6 (piridoxina), pantotenato de clcio, cido flico, vitamina B 2 (riboflavina), vitamina C (cido ascrbico), vitamina H (biotina), cido para-aminobenzoico e vitamina E (tocoferol). Auxinas Estas promovem o alongamento celular, a formao de calos e de razes adventcias; inibem a formao de brotos axilares adventcios e, s vezes, a embriognese em suspenses celulares. Exemplos: IAA (cido indolactico), NAA (cido naftalenoactico), IBA (cido indolbutrico), 2,4 D (2,4diclorofenoxiactico). Citocininas Estas promovem a diviso celular, regulam o crescimento e o desenvolvimento dos tecidos vegetais. Exemplos: cinetina, 2iP (2isopentiladenina), BAP (benzilaminopurina), zeatina. Outras substncias Exemplos: giberelinas, cido abcssico, etileno. Misturas de substncias pouco definidas Materiais inertes Exemplos: extrato de levedura, extratos vegetais, hidrolisados de casena, peptona e triptona. A tendncia atual em pesquisa de substitu-los por meios de composio definida. Utilizados como suporte. Exemplos: agar, agarose, outros polissacardeos (Gelrite, Phytagel), l de vidro, papel de filtro, areia, esponjas de poliestireno.

Substncias inorgnicas Vitaminas

Hormnios e reguladores de crescimento

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BIOTECNOLOGIA 2011 / Captulo 7: A cultura de clulas e tecidos

AS ETAPAS DO PROCESSO A capacidade de regenerao maior nas plantas herbceas que nas lenhosas, distribuindo-se em forma desigual entre algumas famlias de Solanceas, Crucferas, Gesnericeas, Compostas e Liliceas; depende tambm do gentipo e das condies ambientais, diminuindo com a idade da planta. A cultura in vitro tem a vantagem de ser mais rpida e de ocupar muito menos espao que a multiplicao in vivo. As principais aplicaes esto no cultivo de plantas ornamentais, de hortalias e na silvicultura. Os explantes se cultivam assepticamente em meios de composio adequada, possibilitando a regenerao direta da planta. O processo envolve quatro etapas: A. Estabelecimento de uma cultura assptica. Uma vez retirados da planta-me, os explantes so desinfetados com um agente qumico, geralmente hipoclorito de sdio, que mais tarde lavado. Os explantes so transferidos para o meio de cultura, em condies asspticas semelhantes s utilizadas para a cultura de microrganismos (Figura 7.2). A incubao ocorrer a uma temperatura entre 23 e 28 C, com iluminao durante 12 a 14 horas dirias. B. Multiplicao. Os propgulos desenvolvidos so divididos e transferidos para um meio de multiplicao, de maneira a se obter numerosas subculturas (Figura 7.3).

C. Preparao das plntulas para a transferncia ao solo. As plntulas das subculturas so transferidas para um meio de enraizamento onde, alm de desenvolver razes, enrijecem e comeam a fotossintetizar.

D. Aclimatao. Transferncia das plntulas, primeiro para o solo ou para algum outro substrato, mais tarde para uma casa de vegetao. Protegidas da iluminao solar direta, elas aumentaro sua capacidade fotossinttica adaptando-se lentamente as condies ambientais. FIGURA 7.2. O procedimento a seguir para se obter uma cultura assptica no laboratrio.
Separao dos explantes Esterilizao Lavados Dissecao e semeadura Incubao

gua + detergente + hipoclorito de sdio

gua estril

Condies asspticas, 20-250C, na luz

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FIGURA 7.3. Obteno de subculturas a partir de explantes nodais.

FIGURA 7.4. A cultura de meristemas.

FIGURA 7.5. As diferentes possibilidades dos cultivos de calos.

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BIOTECNOLOGIA 2011 / Captulo 7: A cultura de clulas e tecidos

AS DIFERENTES MODALIDADES A cultura de meristemas A regenerao de uma planta pode ocorrer a partir de um rgo to pequeno quanto a gema apical (tamanho 0,5 a 2 mm). Nesta, associado aos primrdios foliares e ao tecido subapical, se encontra um pequeno fragmento (0,01 a 0,3 mm) de meristema, um tecido embrionrio a partir do qual se formam todos os outros tecidos das plantas. Por isso, a cultura da gema apical pode ser substituda pela cultura de meristemas (Figura 7.4). Estoques de plantas livres de vrus e de outros patgenos so obtidos associando a cultura de meristemas com a termoterapia, uma incubao a 32-340C, por um tempo determinado (gernio, dlia, crisntemo, cana-de-acar, batata, morangueiro, alcachofra etc.). Recuperam-se com este mtodo algumas plantas que s se reproduzem naturalmente pela via assexuada e se encontram ameaadas de extino devido contaminao por vrus Os exemplos citados na bibliografia sobre o cultivo de meristemas so, no mnimo, impressionantes. Se um tubrculo de inhame de 100 g produz 25 kg de tubrculos em dois anos, por micropropagao produzir 300.000 kg; a partir de uma nica gema apical podem-se obter 4.000.000 de cravos em um ano. A tcnica tambm permite a multiplicao de espcies que se reproduzem lenta e/ou dificilmente, como as orqudeas, e acelerar a produo de mudas em plantas com ciclo anual ou bianual. Outra variao desta modalidade a microenxertia, que se aplica s essncias florestais (eucalipto) e s rvores frutferas (citros). A tcnica gera uma alta produtividade de mudas sadias, que so cultivadas em pouco espao (mais de 1.000 plantas / m 2) sem depender dos fatores climticos e da poca do ano. Do ponto de vista econmico, o custo destas mudas alto porque a cultura em meio slido necessita um trabalho minucioso e uma mo de obra especializada. A multiplicao dos propgulos em biorreatores, anlogos aos fermentadores microbianos, visa reduzir os custos. Ao modelo tradicional de ps giratrias que danifica os tecidos e as clulas, preferem-se pequenas cubas de 1 a 5 l onde os propgulos permanecem em sistemas de imerso permanente ou temporria. Apesar dos custos, a tecnologia interessante quando se planeja introduzir uma espcie em uma regio determinada porque elimina qualquer contaminao prvia. Tambm interessante para iniciar a propagao vegetativa com mudas certificadas, visando a amplificao posterior dos cultivos. A cultura de calos A cultura de calo a modalidade alternativa para aquelas plantas que no podem ser propagadas diretamente a partir de meristemas. Um calo uma massa de clulas desdiferenciadas que prolifera de maneira irregular a partir de um explante; trata-se de um tecido de tipo tumoral que, in vivo, produzido como resposta aos ferimentos em rgos e tecidos. Uma vez estabelecido em um meio de cultura, o calo pode ser subdividido a cada trs ou quatro semanas, mantendo indefinidamente as clulas em meio nutriente com a mesma composio. Se o calo for transferido a outro meio com uma concentrao diferente de hormnios, formar-se-o rgos ou embries, a partir dos quais podero ser regeneradas numerosas plantas (Figura 7.5). Diferentemente das outras modalidades de cultura de tecidos, na cultura de calos a proliferao celular est acompanhada por um aumento das variaes genticas e da instabilidade cromossmica (variao somaclonal).

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Devido a essa caracterstica, a cultura de calos resulta menos conveniente que a cultura de meristemas para micropropagao. Contudo, sua utilizao inevitvel no caso de algumas espcies economicamente importantes (cereais, leguminosas, forrageiras, espcies florestais e palmeiras tropicais). Por outro lado, a variao somaclonal permite a seleo de variedades de plantas com propriedades novas, tais como a resistncia ao estresse, ao ataque de insetos, a patgenos, a herbicidas, a concentraes salinas elevadas, a molculas qumicas (Al, Mn). A variabilidade pode ser aumentada pela utilizao de agentes mutagnicos. A cultura de clulas e rgos vegetais em biorreatores Desagregando um calo em meio lquido se obtm uma suspenso de clulas que podem ser cultivadas em biorreatores industriais visando a produo de metablitos secundrios ou de embrioides, isto de embries formados a partir de clulas somticas. Podem ser encapsulados em uma substncia gelatinosa contendo nutrientes, envolta por um plstico biodegradvel, formando sementes artificiais. Estas se desenvolvem normalmente quando semeadas na terra, por isso uma das aplicaes desta tecnologia sua disperso por avies para o reflorestamento de regies de difcil acesso. Os metablitos secundrios, ou compostos naturais, so considerados produtos de Qumica Fina, tendo um alto valor agregado no mercado. Trata-se de alcaloides, de glicosdeos cardacos, de substncias antitumorais e antimicrobianas, de hormnios esteroides etc. para a indstria farmacutica e, tambm, de corantes, adoantes e aromas para as indstrias alimentcia e cosmtica. A possibilidade de substituir os mtodos tradicionais de extrao ou de sntese, pela produo mediante o cultivo de suspenses celulares em biorreatores, gerou grandes expectativas comerciais. No incio da dcada de 1990, vrios estudos estimaram as condies necessrias para que a sntese ou a bioconverso de compostos naturais em produtos de alto valor agregado resultasse vantajosa. Os clculos mostraram que se o mercado fosse suficientemente amplo e o valor do produto superasse os US$ 500 ou 1.000 por kg, a produtividade do sistema deveria ser de pelo menos um grama de composto por litro de cultura celular. Estas condies no so to frequentes. Do ponto de vista tecnolgico, as clulas vegetais so grandes (100 m) e sedimentam com facilidade. A tendncia a formar agregados as torna muito sensveis ao cisalhamento. Como o crescimento lento, os riscos de contaminao aumentam. Tambm existem problemas relacionados com a transferncia de oxignio. Existem diversos modelos de biorreatores para o cultivo de clulas vegetais, entre os quais o tradicional de ps giratrias e outros de tipo air-lift ou de leito fluidizado. A conduo do processo pode ser descontnua, semicontnua ou contnua; neste ltimo caso se utilizam clulas imobilizadas. A escolha de uma modalidade ou outra de cultivo depende da substncia estar, ou no, associada ao crescimento celular e, tambm, de se tratar de um produto intra ou extracelular. O cultivo de rgos e especialmente de razes transformadas (hair roots) tem dado bons resultados, apesar de poucos terem alcanado um nvel comercial. Entre eles, a produo de shikonina a partir de razes (Lithospermum erythrorhizon) pela empresa Mitsui Petrochemical Ind. Ltd.; de gingenosdeo (Panax ginseng) e de purpurina (Rubia akane) por Nitto Denko Corp.; e de paclitaxel (Taxos cuspidata), comercializado como Taxol por Phyton Inc., uma empresa associada a Bristol-Myers Squibb. Espera-se que as estratgias para aumentar a produo, combinando o desenvolvimento de novos processos industriais com a engenharia metablica das clulas, possam vir a estabelecer as bases de uma agricultura molecular. Por enquanto, as aplicaes se restringem produo de alguns frmacos e de aditivos para a indstria de alimentos (flavorizantes, corantes e aromas).

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FIGURA 7.6. As possibilidades do cultivo de clulas vegetais e animais.

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MELHORAMENTO E CONSERVAO DA BIODIVERSIDADE VEGETAL Existem vrias modalidades de cultura de tecidos que contribuem para facilitar a tarefa de melhoramento (Figura 7.6) O mtodo gentico tradicional, isto , a autofecundao das plantas por vrias geraes, demora oito ou 10 anos para obter linhagens puras (homozigotas), em que se manifestem os caracteres recessivos. Esse tempo pode se reduzir a meses mediante a cultura de anteras, gerando-se plantas haploides (n cromossomos), que tratadas com colchicina originam diretamente plantas diploides (2n) homozigotas. Os protoplastos se formam por digesto enzimtica da parede celular, que poder ser regenerada novamente no meio de cultura. Durante o perodo em que a clula est sem a parede celular, pode-se introduzir material gentico estranho (transformao) ou conseguir a fuso de protoplastos de diferentes cultivares ou espcies (hibridizao somtica). Como as plantas resultantes destes cruzamentos geram sementes que dificilmente se desenvolvem, frequentemente necessrio retirar os embries do resto da semente e proceder a sua recuperao mediante a cultura in vitro. Protoplastos, clulas, calos, gemas apicais e laterais, meristemas, sementes, embries somticos e zigticos, todos podem ser congelados em nitrognio lquido a 1960C. A criopreservao facilita a preservao de numerosas plantas ornamentais, frutferas, oleaginosas, leguminosas, medicinais e aromticas. Finalmente, deve-se destacar a importncia destas tcnicas de cultura de clulas e tecidos vegetais para a conservao do germoplasma, tanto das espcies cultivadas como das espcies selvagens. A conservao da biodiversidade importante no s do ponto de vista do melhoramento agronmico como do farmacolgico, j que a maioria dos medicamentos de que dispomos contm princpios ativos extrados de plantas.

A DIFUSO DA TECNOLOGIA As tcnicas de cultura in vitro de vegetais foram rapidamente assimiladas por empresas e instituies de pesquisa e desenvolvimento, porque facilitam o melhoramento gentico das variedades comerciais e, tambm, porque representam uma etapa indispensvel na obteno de uma planta transgnica. Sendo tcnicas de domnio pblico, relativamente simples e de baixo custo, numerosas empresas as utilizam no mundo todo para garantir a qualidade gentica e fitossanitria das mudas e sementes comercializadas. Em Cuba, por exemplo, o IBP (do espanhol, Instituto de Biotecnologia de las Plantas) tem desenvolvido, junto com outros centros cientficos, protocolos para batata, cana-deacar, pltano, banana, goiaba, abacaxi, maracuj etc. O IBP est associado a uma rede de 15 biofbricas com capacidade de produzir 60 milhes de plntulas in vitro e sementes artificiais. Esta tecnologia est amplamente difundida na Amrica Latina, onde representa o segundo produto mais comercializado da biotecnologia agrcola, com ampla difuso na olericultura, na hortifruticultura, na floricultura e na propagao de plantas ornamentais, assim como na produo de plantas de interesse industrial (cana, caf) e de mudas de essncias florestais para as indstrias de papel.

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A CULTURA DE CLULAS ANIMAIS A MANIPULAO IN VITRO DAS CLULAS ANIMAIS Apesar dos primeiros estudos datarem de 1912, o cultivo de clulas animais s comeou a se desenvolver com sucesso na dcada de 1950, quando H. Eagle conseguiu definir os nutrientes necessrios para o crescimento celular (Tabela 7.2). Basicamente, um meio para o cultivo de clulas animais inclui gua, sais minerais, aminocidos, vitaminas, glicose, soro humano ou de cavalo (fatores de crescimento), antibiticos (para prevenir as contaminaes microbianas). As clulas devem ser isoladas, inoculadas e mantidas assepticamente em condies bastante estritas de temperatura (350 a 370 C), pH e umidade. TABELA 7.2. Os componentes de um meio de cultura bsico para clulas animais.
COMPONENTES gua Fonte de carbono Substncias inorgnicas L aminocidos Vitaminas Misturas de substncias pouco definidas Outros CARACTERSTICAS E EXEMPLOS Desmineralizada, destilada. Glicose. NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2. 6H2O, NaH2PO4.H2O, NaHCO3. Arginina, cistina, fenilalanina, glutamina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, treonina, triptfano, tirosina, valina. Biotina, cido flico, colina, nicotinamida, cido pantotnico, piridoxal, riboflavina, tiamina. Soro animal de diversa origem, inclusive humano. Antibiticos (penicilina, estreptomicina) e vermelho de fenol (pH 7,2-7,4).

AS APLICAES DA CULTURA IN VITRO DE CLULAS DE MAMFEROS Uma das primeiras aplicaes a cultura de linfcitos, que fornece em poucos dias um nmero adequado de clulas para a anlise do caritipo. Este visa detectar as alteraes cromossmicas estruturais e numricas que possam ser a causa de distrbios no funcionamento do organismo. Os linfcitos extrados do paciente so colocados em um meio lquido que induz a diviso celular. A adio de colchicina inibe a formao das fibras do fuso mittico, bloqueando as clulas na metfase. Um choque hipotnico provoca a lise das clulas e libera os cromossomos (Figura 7.7 A). Mas h outros tipos de clulas de mamferos que tambm se cultivam in vitro. Clulas isoladas a partir de fibroblastos ou de tecido epitelial se multiplicam na superfcie de um suporte inerte (vidro, plstico etc.), formando uma monocamada. Mediante a transferncia de algumas clulas a um meio novo (repiques), uma cultura primria gera sucessivas culturas secundrias (Figura 7.7 B). Entretanto, diferena dos microrganismos que podem ser repicados indefinidamente, as clulas animais sofrem um tipo de morte programada (apoptose) depois de aproximadamente umas cinquenta a cem divises. Deve-se ento reiniciar o cultivo com uma nova amostra. Existem algumas excees que escapam dessa limitao, como as clulas extradas de tumores ou as clulas-tronco; e tambm os linfcitos B imortalizados por infeco com o vrus de Epstein-Barr ou por fuso com clulas de mieloma (hibridomas).

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FIGURA 7.7. As culturas de clulas de origem animal.

A. Etapas da cultura de leuccitos para a anlise do caritipo.

Amostra de sangue com anticoagulante

Separao dos leuccitos por centrifugao

Cultivo dos leuccitos

Adio de colchicina e lise celular

Fixao e colorao (bandeamento)

OBSERVAO E COMPARAO

B. Etapas da cultura de clulas a partir de um fragmento de tecido.


Meio de cultivo

Repique

Desagregao mecnica ou enzimtica (tripsina, colagenase)

Suspenso celular

Cultura primria

Cultura secundria

TABELA 7.3. Origem e utilizao de algumas linhagens celulares.


CLULAS HeLa(*) MDCK 3T3 Nawalwa WI-38 VERO MRC-5 ORIGEM Carcinoma cervical humano Rim de cachorro Tecido conjuntivo de camundongo Linfoma humano Pulmo embrionrio humano Rim de macaco verde africano Pulmo embrionrio humano APLICAES Pesquisa Produo de vacinas veterinrias Tcnicas laboratoriais -interferon Produo de vacinas humanas Produo de vacinas humanas Produo de vacinas humanas

(*) Henrietta Lacks, morreu aos 31 anos de um carcinoma uterino. A linhagem de clulas HeLa isolada na poca continua sendo cultivada h mais de 50 anos.

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Nas Colees de Culturas se encontram linhagens celulares de diversos tipos, conservadas por criopreservao (Tabela 7.3). A cultura in vitro de clulas animais a rota seguida para a manufatura em grande escala de vrios produtos, tais como as vacinas e os anticorpos monoclonais. Tambm adequada para a produo de citocinas (linfocinas, interferons, eritropoietina) e de outras protenas de origem recombinante (fator ativador de plasminognio, p.ex.) que, por exigir modificaes pstraducionais complexas, no podem ser produzidas em bactrias ou leveduras transformadas. Na hora de passar da escala do laboratrio escala industrial, algumas consideraes devem ser levadas em conta. A cultura de clulas animais exige, alm de um cuidado extremado, meios de cultivo complexos e caros, desenvolvendo-se em condies muito rigorosas. Como as clulas se dividem lentamente (a cada 20 horas aproximadamente), a assepsia deve ser mantida durante perodos prolongados. As concentraes celulares so baixas, o que diminui a produtividade e a rentabilidade do processo. A demanda de oxignio alta e as clulas so muito frgeis e sensveis ao cisalhamento. Enquanto algumas clulas podem crescer livremente em suspenso, como os linfcitos, outras s crescem se houver um suporte. No biorreator, este problema pode ser resolvido de diversos modos: mediante o confinamento das clulas dentro de membranas semipermeveis, imobilizao em gis ou cpsulas ou fixao sobre suportes, tal como pequenas partculas de 100 a 400 m em vidro, plstico ou dextrina, em modelos de fermentadores anlogos aos representados no captulo anterior. Biorreatores de tamanho pequeno (at 15 l) e processos descontnuos apresentam menos problemas de contaminao, j os de maior tamanho (at 1.000 l) exigem a substituio da agitao mecnica por sistemas de tipo air lift ou leito fluidificado. Evita-se a apoptose ou morte celular renovando periodicamente parte do meio para retirar os produtos excretados. Nos ltimos anos, as tcnicas de cultura in vitro de clulas animais deram um amplo impulso s pesquisas bsicas e aplicadas, aos testes de diagnstico, s tcnicas de fertilizao in vitro, produo de compostos biolgicos (protenas recombinantes), de tecidos para transplante e de vacinas para uso humano e veterinrio. Nos estudos toxicolgicos, esta tecnologia substitui, ao menos parcialmente, a experimentao com animais, uma atividade que suscita forte resistncia na sociedade devido aos questionamentos ticos levantados. Estima-se que o mercado gerado pela venda de meios de cultivo, soros e reagentes chegar a US$ 3,4 bilhes em 2013.

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8. A TECNOLOGIA DO DNA

AS FERRAMENTAS DISPONVEIS A tecnologia do DNA engloba uma srie de procedimentos para extrair, fragmentar, sintetizar, marcar, identificar, amplificar e sequenciar o DNA. Estas tcnicas foram desenvolvidas ao longo de uma dcada (1985-1995), constituindo hoje um conjunto de ferramentas que utilizado rotineiramente nos laboratrios, geralmente em sistemas automatizados especialmente desenhados para efetuar rapidamente um nmero altssimo de operaes. A extrao de DNA um procedimento relativamente simples. De um modo geral, a quebra de paredes e membranas libera o contedo celular, do qual se eliminam o RNA e as protenas antes de separar o DNA, que se precipita com etanol. Uma vez extrado e purificado o DNA, diversos tipos de tratamento so possveis. Pelo menos uma trintena de empresas j comercializa diferentes tipos de kits para a extrao de cidos nucleicos, substituindo os protocolos tradicionais por sistemas mais fceis de automatizar. Estima-se que este mercado alcance um valor de US$ 158 bilhes, em 2014. AS NUCLEASES OU ENZIMAS DE RESTRIO Entre as numerosas enzimas utilizadas diariamente nos laboratrios, as nucleases merecem ateno especial. Estas enzimas quebram as ligaes entre os nucleotdeos de uma cadeia de DNA; algumas comeam pelas extremidades eliminando-os um a um; outras cortam a molcula por dentro. Pertencem a este ltimo grupo as enzimas de restrio, que so capazes de cortar o DNA em stios especficos. Normalmente, as enzimas de restrio so produzidas por bactrias, como uma arma de defesa contra o ataque de vrus (bacterifagos), j que ao cortar o DNA viral impedem sua multiplicao. O DNA bacteriano no atacado por suas prprias enzimas, seja porque no possui as sequncias correspondentes, seja porque estas esto camufladas pela adio de um grupo metila. Desde sua descoberta por Werner Arber, na dcada de 1960, j foram isoladas centenas de enzimas de restrio. Todas elas agem como tesouras qumicas que cortam o DNA ao reconhecer, como os seus pontos-alvo, determinadas sequncias de 4 a 8 bases. Por exemplo, a enzima EcoRI, cujo nome deriva de "Escherichia coli linhagem RY13 (R), primeira endonuclease a ser descoberta I" corta o DNA em dois pedaos com pontas lascadas: as setas indicam o ponto de corte. Observe-se a existncia de um palndromo, isto de uma sequncia que pode ser lida do mesmo modo (GAATTC) nos dois sentidos (5- 3 ou 3- 5), de forma anloga a frases como Amor a Roma. Assim como h enzimas que cortam o DNA, outras colam os fragmentos (ligases).

Copyright Maria Antonia Malajovich Biotecnologia: ensino e divulgao (www.bteduc.bio.br)

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FIGURA 8.1. A eletroforese do DNA.

FIGURA 8.2. Os polimorfismos de restrio.

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A ELETROFORESE DO DNA A eletroforese separa os fragmentos de DNA obtidos com uma enzima de restrio. As amostras so colocadas em um gel no qual se aplica um campo eltrico. Os fragmentos de DNA carregados negativamente se movimentam na direo do plo positivo. Ao encontrar uma resistncia menor, os fragmentos menores migram mais rapidamente (Figura 8.1). O poder de separao varia com o suporte (gel de agarose ou de poliacrilamida) e com o tamanho do poro, que depende da concentrao do meio. Tambm varia com as caractersticas do campo eltrico aplicado. Os fragmentos de restrio formam bandas que podem ser observadas na luz ultravioleta, aps colorao com uma substncia fluorescente. Fragmentos de tamanho conhecido inseridos no gel, maneira de uma rgua molecular, servem como padro de comparao para estimar o tamanho das bandas do DNA analisado. Uma das primeiras aplicaes da eletroforese dos fragmentos de restrio foi o estudo dos polimorfismos. A modificao do stio de restrio de uma molcula de DNA (como, por exemplo, de GAATTC para GAACTC) origina fragmentos de tamanhos diferentes, denominados RFLPs ou rifleps (do ingls, restriction fragment length polymorphism). Os RFLPs so marcadores que podem ser estudados do mesmo modo que um gene que determine um carter visvel ou uma modificao bioqumica (Figura 8.2). Uma mutao pode gerar dois alelos diferentes, A1 (nenhum stio de restrio) e A2 (um stio de restrio). Na eletroforese, o DNA dos indivduos A 1A1 ser visualizado como uma banda, o de A1A2 como trs bandas e o de A2A2 como duas bandas. HIBRIDIZAO E SONDAS GNICAS Quando o DNA colocado em determinadas condies de temperatura, pH ou concentrao salina, os dois filamentos da hlice se separam. A dissociao se deve quebra das pontes de hidrognio entre as bases complementares. Voltando s condies iniciais, essas ligaes se restabelecem e os filamentos se associam novamente. A reao de hibridizao tambm ocorre entre filamentos de DNA ou de RNA de diferentes origens e tamanhos, sempre que houver algumas sequncias complementares. Em funo desta propriedade se constroem filamentos simples, geralmente marcados radiativamente, de DNA ou RNA de sequncia conhecida. Estes se usam como sondas para reconhecer a presena de uma sequncia complementar em um cromossomo ou em um fragmento de DNA (Figura 8.3).

FIGURA 8.3. Hibridizao de uma sonda com a sequncia complementar.

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FIGURA 8.4. O mtodo de Southern.


A sonda identifica a homozigose de I (sem stio de restrio) e de III (com stio de restrio) e a heterozigose de II (um filamento sem stio de restrio e o outro com stio de restrio).

1. Preparao dos fragmentos de restrio


Trs amostras de DNA de diferente origem + enzima de restrio.

2. Eletroforese
Os fragmentos de restrio so separados por eletroforese.

3. Transferncia
O DNA desnaturado e os fragmentos unifilamentares transferidos a uma membranade nitrocelulose.

4. Sonda radiativa
Acrescenta-se uma sonda unifilamentar complementar ao gene procurado. Esta hibridiza com o fragmento portador da sequncia complementar.

5. Autorradiografia
Depois de lavar, para eliminar o excesso de reagente, coloca-se sobre o filtro um filme sensvel radiatividade.

FIGURA 8.5. O polimorfismo de uma sequncia de vinters (VNTRs).


A. Nmero de VNTRs presentes no mesmo fragmento de restrio, em 3 indivduos B. Separao dos fragmentos de restrio (eletroforese)

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O MTODO DE SOUTHERN Em 1975, E.M. Southern descreveu um mtodo para analisar fragmentos de restrio, utilizando sondas de DNA. Uma vez separados os fragmentos por eletroforese, transferem-se os fragmentos a uma membrana de nilon ou de nitrocelulose. A hibridizao de uma sonda radiativa com o seu alvo registrada em um filme apropriado (Figura 8.4). O mtodo, denominado Southern blotting, tem sido utilizado para diagnstico de doenas genticas, algumas das quais so causadas por mutaes que, ao eliminar ou criar um stio de restrio, modificam o padro de bandas. Mtodos anlogos foram desenhados para estudos de RNA (Northern blotting) e de protenas (Western blotting). Observe-se que, no primeiro caso, a sonda pode ser um fragmento de cido nucleico, mas no segundo a sonda um anticorpo especfico. O FINGERPRINT Descrita por A. Jeffreys em 1985, uma variante do mtodo de Southern focaliza as regies do genoma que no se expressam, acumulando mutaes que conferem a cada indivduo uma sequncia nica (excetuando-se os gmeos). Muitas delas representam sequncias repetidas que esto dispersas ao longo do genoma. Denominadas VNTR ou vinters (do ingls variable-number tandem repeats) estas sequncias se repetem um nmero de vezes que pode variar de um cromossomo ao seu homlogo. Sendo assim, os fragmentos de restrio correspondentes tero um tamanho diferente, o que pode ser visualizado por eletroforese (Figura 8.5). Ao aumentar o nmero de sondas para o reconhecimento de outros tipos de VNTRs, obtm-se um padro de bandas individual, parecido com o cdigo de barras do comrcio. Assim como as impresses digitais identificam as pessoas, as sondas revelam a identidade gentica de cada um de ns. O procedimento, no por acaso chamado de Fingerprint, encontrou rpida aplicao tanto na investigao de paternidade (ou maternidade), como na identificao policial ou forense. A SNTESE E AMPLIFICAO DE DNA Sntese de oligonucleotdeos A sntese de oligonucleotdeos de DNA e RNA se desenvolve hoje em mquinas automatizadas (sintetizadores) capazes de construir, em poucos minutos, molculas com dezenas de pares de bases (Figura 8.6). Estes oligonucleotdeos podem ser utilizados como sondas ou como primers para a PCR (ver um pouco mais adiante). Sntese de cDNA Uma enzima de origem viral transcreve a informao gentica no sentido RNA DNA. Esta enzima, denominada transcriptase reversa, normalmente garante aos vrus com genoma de RNA sua multiplicao no hospedeiro (como o HIV, por exemplo). O rRNA e os tRNAs podem ser isolados facilmente devido a seu tamanho; o mRNA, por sua vez, deve ser isolado dos tecidos onde se expressa. O mRNA da protena da seda ou fibrona, por exemplo, se extrai das glndulas salivares do bicho-da-seda.Como ferramenta de laboratrio, a transcriptase reversa possibilita a construo de filamentos de DNA complementares (cDNA) a qualquer molcula de RNA (Figura 8.7). Note-se que, diferente do gene original, no haver ntrons no cDNA reconstrudo a partir de RNA.
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FIGURA 8.6. A sntese de oligonucleotdeos.

FIGURA 8.7. A sntese de cDNA por transcriptase reversa.

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FIGURA 8.8. A reao em cadeia da polimerase. A. Os elementos necessrios para a reao em cadeia da polimerase.

B. A amplificao do DNA.

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A reao em cadeia da polimerase A reao em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction ou PCR) um procedimento que permite obter milhes de cpias de DNA em poucas horas (Figura 8.8 A). Para isso, se precisa do DNA que contenha a sequncia que se deseja amplificar, de desoxinucleotdeos dos quatro tipos (dATP, dTTP, dCTP e dGTP), de uma polimerase de DNA e dos primers correspondentes. Estes so pequenos fragmentos sintticos de DNA, complementares s extremidades da sequncia-alvo, sendo indispensveis para que a polimerase comece a sintetizar o filamento de DNA. A chave do processo a DNA-polimerase, uma enzima estvel a altas temperaturas que permite bactria Thermus aquaticus sobreviver em guas termais. Atualmente, esta enzima se produz por engenharia gentica. Em um ciclo pontuado por mudanas de temperatura, os filamentos de DNA so dissociados e anelados com os primers, possibilitando que a polimerase sintetize o resto da sequncia. Repetindo muitas vezes o ciclo, gera-se em pouco tempo um nmero altssimo de cpias que podem ser utilizadas em qualquer tipo de anlise (Figura 8.8 B). Uma mquina de PCR pode desenvolver 25 ciclos em menos de uma hora, amplificando 105 vezes o fragmento de DNA. Uma das grandes vantagens da PCR que no h necessidade de isolar previamente o fragmento a ser amplificado, bastando conhecer as extremidades da sequncia e escolher os primers adequados. Desenvolvendo-se de forma totalmente automatizada, o procedimento admite mltiplas variantes. A empresa Cetus comprou de seu inventor, K. Mullis, a patente da PCR por U$S 10.000, vendendo-a pouco tempo depois a Hoffmann-La Roche por U$S 300 milhes; hoje se trata de uma tcnica corriqueira em qualquer laboratrio de Biologia Molecular e provavelmente nenhum dos dois fez um bom negcio. Mais tarde, em 1993, Mullis recebeu o Prmio Nobel pela inveno da PCR. Como assinalado anteriormente em relao aos sintetizadores de oligonucleotdeos, uma das chaves do xito da PCR o fato de ser um procedimento automatizado que se desenvolve em mquinas rpidas e eficientes, resultado da integrao da Biologia Molecular com a Informtica e a Eletrnica. O sucesso da PCR se deve a sua extraordinria versatilidade, permitindo que seja utilizada, com objetivos diversos, em campos to diferentes como a agricultura, a medicina veterinria, os estudos ambientais, os testes de diagnstico e a medicina forense. Entre suas muitas aplicaes, cabe citar tambm os estudos antropolgicos e evolutivos, tais como a extrao de DNA de mmias egpcias, de animais extintos como o quagga (um tipo de zebra) ou de insetos presos em mbar 40 milhes de anos atrs. O SEQUENCIAMENTO DO DNA Desenvolvido por F. Sanger em 1977, o sequenciamento de um fragmento de DNA , tambm, um procedimento de tipo iterativo, possibilitando a construo de mquinas capazes de realizar rapidamente a tarefa (Figura 8.9). Um sistema automatizado permite identificar, na corrida eletrofortica, cada um dos quatro didesoxinucleotdeos, fornecendo diretamente a sequncia do fragmento sequenciado. Uma vez determinada a sequncia de vrias amostras, inicia-se a montagem da informao armazenada nos bancos de dados. Esta etapa se realiza em supercomputadores, exigindo um tratamento matemtico para ordenar as sequncias, preencher as lacunas e verificar os dados. Existem sequenciadores automatizados em que o gel colocado nos capilares por um braorob que acrescenta o DNA e efetua a limpeza depois da eletroforese. No ano 2000, tais braos permitiam o tratamento de uma centena de amostras em 4 horas, sem exigir mais do que 15 minutos dirios de ateno humana.
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FIGURA 8.9. O sequenciamento de um fragmento de DNA.

1.

Preparar numerosas cpias do fragmento a sequenciar (tamanho aproximado: 500 pares de bases) Incubar a preparao com as substncias necessrias para a sntese de filamentos complementares e acrescentar alguns nucleotdeos, na forma didesoxi, marcados com substncias fluorescentes de diferente cor.

2.

3.

Iniciar a sntese dos filamentos complementares que ser bloqueada quando, em vez de um desoxinucleotdeo, se incorpore um didesoxinucleotdeo, porque estes no formam ligaes fosfodister.

4.

Depois de vrios ciclos teremos fragmentos de todos os tamanhos:

5.

Os fragmentos so separados por electroforese. O sequenciador identifica cada um deles pela fluorescncia do nucleotdeo didesoxi incorporado e fornece a sequncia.

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Calculava-se que, no auge do estudo do genoma humano, uma empresa ligada a Celera (Biosystems Applied) mantinha os computadores funcionando dia e noite, chegando a gastar U$S 1.000.000 mensais com eletricidade. Apesar de ter possibilitado o estudo de numerosos genomas, a partir de 2006 o mtodo automatizado de Sanger comeou a ser considerado pouco eficiente, surgindo a necessidade de desenvolver uma nova gerao de tecnologias, mais rpidas e mais baratas. Vrias plataformas comerciais (Roche/454, Illumina/Solexa, Life/APG, Helicos Biosciences) coexistem atualmente no mercado e numerosas empresas contam com tecnologias em diferentes etapas de desenvolvimento e comercializao (IBM, Oxford Nanopore Technologies, Intelligent Biosystems, LaserGen Inc. e NABsys). Em 2006, os mtodos utilizados eram 500 vezes mais rpidos que os da dcada anterior. Hoje, alm de serem ainda mais velozes, as tecnologias de segunda gerao tem derrubado os custos do sequenciamento. Se em outubro de 2004, o custo do sequenciamento de 1 Megabase (1.000.000 de pares de bases) era de US$ 1598,91, em julho de 2011 o preo era de US $ 0,12. Em consequncia temos uma enorme avalancha de dados, que possibilita estudos comparativos e evolutivos de uma dimenso inimaginvel alguns anos atrs. Tambm abre o caminho para estudos sobre as diferenas genticas que afetam a sade e a doena. OS ARRAYS Em consequncia do conhecimento acumulado sobre o genoma do homem e de outros organismos, j podem ser estudados alguns aspectos relacionados com a expresso e a interao dos genes. Lidar com um nmero enorme de informaes demanda novos avanos tecnolgicos, entre os quais a construo de chips de DNA e microarrays. Os microchips so pequenas placas de vidro, nilon ou slica com centenas de sondas por cm 2, fixadas mediante diferentes tecnologias (robtica, fotolitografia). Coloca-se a amostra, marcada com um corante fluorescente, sobre a placa; as molculas complementares a alguma das sondas ficaro grudadas, as restantes sero eliminadas na lavagem posterior. Os pontos onde ocorreu a hibridizao so identificados por varredura com um raio laser e um software apropriado para o tratamento da informao (Figura 8.10). Escolhem-se as sondas entre os genes codificadores de protenas que se expressam na clula. Desse modo, se excluem os genes que correspondem ao rRNA, aos tRNAs, s sequncias de controle e ao DNA extragnico. A escolha de sequncias transcritas, denominadas ESTs (do ingls, expressed sequence tags), aumenta as chances de detectar os genes que participam de alguma resposta patolgica. Atualmente, a tecnologia utilizada para diversos tipos de anlise de DNA e RNA, como, por exemplo: o o o o Determinar quais os genes ativados em um tecido, em um momento do desenvolvimento ou em um estado fisiolgico, como o sono. Comparar as sequncias de dois alelos, um deles normal e o outro associado a alguma patologia. Determinar qual o medicamento adequado para um paciente. Prever o risco de uma pessoa adoecer se ela for exposta a determinada substncia etc.

Numerosas empresas fabricam arrays comercialmente; algumas estimam que em pouco tempo sero construdos arrays do tamanho de uma moeda, contendo todo o genoma humano. difcil prever os alcances desta tecnologia to promissora, mas os analistas estimam que, at 2012, o mercado chegar a 1,47 bilho de dlares por ano. .
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BIOTECNOLOGIA 2011 / Captulo 8: A tecnologia do DNA

FIGURA 8.10. Fundamentos da tecnologia de arrays.


Se as sondas representarem ESTs, saberamos que os genes representados por B7, C2, D4, E10, G8 e H5 esto ativados. O tamanho das sondas depende da tecnologia utilizada na construo do array. Observe-se que cada uma das sondas representadas no desenho corresponde a um conjunto de molculas semelhantes.

A partir do mRNA extrado, se prepara o DNA, que marcado com uma substncia fluorescente

Microarray com as sondas (oligonucleotdeos de DNA) fixadas a um suporte Hibridizao

Eliminao do cDNA marcado que no emparelhar com nenhuma sonda

Varredura (scanner) para detectar as sondas que hibridizaram com o cDNA

Resultado: Houve complementao com As sondas B7, C2, D4, E10, G8 e H5

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A BIOLOGIA SINTTICA Com o desenvolvimento da genmica e a apario de novas plataformas tecnolgicas surge, na interface entre a biologia e a engenharia, a biologia sinttica. Trata-se de uma nova rea de conhecimento com finalidades prticas, que visa o desenho e a construo de sistemas biolgicos simplificados. A sntese cada vez mais rpida de alguns genomas virais (hepatite C, 2000; poliomielite, 2002; phi X 174, 2003) permitiu a construo e o patenteamento de uma bactria parcialmente sinttica (Mycoplasma laboratorium) por pesquisadores do Instituto J. Craig Venter. Em 2010, pesquisadores do mesmo Instituto obtiveram uma bactria sinttica, mediante a introduo de unidades bsicas de DNA de Mycoplasma mycoides em uma bactria receptora de outra espcie, Mycoplasma capricolum, e a eliminao posterior do genoma desta. A bactria sinttica, denominada Synthia, se reproduz normalmente e leva sequncias especficas que confirmam sua origem artificial. Molculas de DNA sintetizadas automaticamente e associadas entre si como blocos de Lego so os elementos fundamentais para construir genomas mnimos, capazes de cumprir funes determinadas. Com o objetivo de desenvolver a biologia sinttica em benefcio da humanidade e do planeta, vrias organizaes (Biobricks Foundation, DIYBIO, SYNBIO etc.) e universidades (Harvard, MIT etc.) promovem a criao de uma comunidade que compartilhe valores e normas de trabalho, mediante a livre difuso de protocolos e sequencias biolgicas standard que possam ser usadas, com segurana, como blocos fundamentais. Esperam-se da biologia sinttica avanos substanciais em medicina, indstria, energia e meio ambiente.

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9. A ENGENHARIA GENTICA

O NASCIMENTO DA BIOTECNOLOGIA MODERNA A Gentica e a Biologia Molecular se desenvolveram rapidamente ao trmino da Segunda Guerra Mundial. Em um perodo de 25 anos, foram esclarecidos temas de enorme importncia: a estrutura dos cidos nucleicos, o cdigo gentico, a ao dos agentes mutagnicos, a gentica dos microrganismos, a estrutura e a sntese das protenas, a regulao gnica etc. nesse contexto de rpidos avanos que devemos situar as primeiras experincias que deram origem tecnologia do DNA-recombinante, tambm chamada de engenharia gentica. A utilizao da palavra recombinante nos remete recombinao gnica, um fenmeno que ocorre normalmente durante a meiose, devido permuta de fragmentos cromossmicos homlogos. Mediante o corte e a unio de pequenos pedaos de DNA, a engenharia gentica cria novas combinaes de genes, pertencentes ou no a indivduos de uma mesma espcie. A engenharia gentica um instrumento valioso para o estudo dos genomas, a produo de protenas em organismos modificados geneticamente e a gerao de organismos transgnicos com propriedades novas. AS PRIMEIRAS EXPERINCIAS Em 1972, na Universidade de Stanford (Califrnia), P. Berg conseguira associar o DNA de dois microrganismos diferentes, formando uma molcula mista de DNA. Na mesma Universidade, Stanley Cohen especializava-se na biologia dos plasmdeos microbianos, pequenas molculas de DNA circular, portadoras de alguns genes capazes de se replicar de maneira autnoma. E, na Universidade de Califrnia (San Francisco), Herbert Boyer isolava a primeira das enzimas de restrio que corta o DNA em fragmentos com pontas lascadas, uma caracterstica que simplifica a tarefa de associar (colar) os pedaos. S. Cohen e H. Boyer se encontraram em uma conferncia cientfica no Hava. A ideia de uma colaborao entre ambos teria surgido uma noite, diante da praia de Waikiki, em redor de sanduches e cervejas. As experincias conjuntas comearam assim que eles regressaram a seus laboratrios em San Francisco. Boyer dispunha da enzima de restrio EcoRI, Cohen de dois plasmdeos, um deles com um gene de resistncia a kanamicina (pSC102) e o outro com um gene de resistncia tetraciclina e um stio de restrio para EcoRI (pSC101). Na primeira experincia, os pesquisadores abriram o pSC101 e inseriram fragmentos do pSC102, utilizando a enzima de restrio e uma ligase como tesoura e cola. A seguir, eles introduziram este plasmdeo quimrico na bactria Escherichia coli. A seleo de clones resistentes a ambos antibiticos (tetraciclina e kanamicina) mostrou o sucesso do experimento (Figura 9.1). Boyer e Cohen repetiram a experincia, mas em vez de inserir no plasmdeo um pedao de DNA bacteriano, eles planejaram colocar um fragmento de DNA do sapo Xenopus laevis. Com esse objetivo, selecionaram um gene codificador de rRNA no DNA do sapo e o inseriram no plasmdeo pSC101. Introduzido o plasmdeo recombinante na bactria Escherichia coli, esta comeou a sintetizar rRNA de Xenopus (Figura 9.2). A extraordinria novidade do experimento est na transferncia de genes de uma espcie para outra bem distante na escala evolutiva; um fenmeno limitado na natureza a uma mesma espcie ou a espcies muito prximas.
Copyright Maria Antonia Malajovich Biotecnologia: ensino e divulgao (www.bteduc.bio.br)

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FIGURA 9.1. A experincia que deu origem engenharia gentica: cortar, colar, copiar. 1. Preparao dos plasmdeos recombinantes
Bactrias T R CORTAR COLAR

Enzimas de restrio Bactrias T S pSC 101 pSC 102

2. Transferncia dos plasmdeos e seleo das bactrias recombinantes Plasmdeos Bactrias T K recombinantes COPIAR OU CLONAR Multiplicar
R R

Bactrias T S K S

Meio de cultivo com tetraciclina e kanamicina

Legenda T: tetraciclina, Ts: sensvel tetraciclina, Tr: resistente tetraciclina, K= kanamicina, Ks: sensvel kanamicina, Kr: resistente kanamicina, pSC101: plasmdeo de Stanley Cohen n0 101; pSC102: plasmdeo de Stanley Cohen n0 102.

FIGURA 9.2. Sapobacter ou Bactosapo?


Com a entrada de um plasmdeo recombinante, com DNA de Xenopus, em uma bactria, esta passa a sintetizar algumas molculas caractersticas de Xenopus.

Xenopus

DNA de Xenopus

Bactria recombinante

Molculas de Xenopus

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BIOTECNOLOGIA 2011 / Captulo 9: A engenharia gentica Fragments of amplified Xenopus laevis DNA, coding for 18S and 28S ribosomal RNA and generated by EcoRI restriction endonuclease, have been linked in vitro to the bacterial plasmid pSCl01; and the recombinant molecular species have been introduced into E. coli by transformation. These recombinant plasmids, containing both eukaryotic and prokaryotic DNA, replicate stably in E. coli. RNA isolated from E. coli minicells harboring the plasmids hybridizes to amplified X. laevis rDNA. Extrado de: Replication and Transcription of Eukaryotic DNA in Escherichia coli (MORROW J.F., COHEN S.N., CHANG A.C. Y., BOYER H.W., GOODMAN H.M.E R.B. HELLING. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 71:5, 1974

MITOS E REALIDADE As infinitas possibilidades da tecnologia do DNA-recombinante despertaram alguns dos antigos mitos. Por desobedecer a Zeus, entregando o fogo ao homem, Prometeu sofreu o terrvel castigo de ser acorrentado a uma montanha e ter o fgado devorado por uma guia. Instrumento da vingana divina, Pandora abrira a caixa da qual saram todos os males da humanidade. A ambiguidade da nova biotecnologia, com os seus desafios e promessas, costuma ser representada nas duas faces de Janus, um rei com o dom de ver simultaneamente o passado e o presente. Em 1974, P. Berg e mais nove pesquisadores publicaram uma carta nas revistas cientficas Science, Nature e Proceedings of the National Academy of Science, alertando os colegas sobre os possveis riscos da nova tecnologia e pedindo uma moratria sobre os experimentos com DNA, at serem estabelecidos os cuidados e salvaguardas necessrias. Considerando que o uso desta tecnologia apresenta vrios riscos possveis porque novos tipos de organismos, alguns deles potencialmente perigosos, podem ser introduzidos no ambiente, se no existirem os devidos controles, o National Institute of Health (NIH) formou o Recombinant DNA Advisory Committee (RAC). Em 1975, a conferncia de Asilomar (Monterrey, Califrnia), reunindo 139 pesquisadores de 17 pases, classificou os experimentos em funo do risco (baixo, mdio ou alto), pedindo a suspenso dos experimentos de alto risco enquanto no se determinassem quais as formas de conteno adequadas, tanto fsicas como biolgicas. Enfatizava-se tambm a necessidade de trabalhar com microrganismos enfraquecidos, incapazes de sobreviver fora do laboratrio. Em 1976, o RAC publicou um conjunto de normas de trabalho que, alm de revisadas periodicamente, devem ser seguidas por todos os pesquisadores e instituies que recebam dinheiro do NIH para pesquisas com DNA-recombinante. Com base nos trabalhos publicados em 1973, a Universidade de Stanford obteve uma patente que lhe rendeu U$S 300 milhes, divididos com a Universidade da Califrnia em San Francisco. A Universidade de Stanford licenciou o uso da tecnologia a mais de 400 empresas, entre as quais Amgen, Eli Lilly, Genentech, Johnson & Johnson e Schering Plough. Qual o invento patenteado? O processo ou ferramenta biotecnolgica que consiste em inserir um DNA exgeno em um plasmdeo bacteriano e este em uma bactria, que se transforma assim em uma fbrica capaz de reproduzir esse gene em quantidades ilimitadas. Nesta breve recapitulao do nascimento da Biotecnologia moderna, vale destacar a preocupao com a segurana, mostrada oportunamente pelos pesquisadores e as instituies cientficas envolvidas. No h na histria da cincia ou da tecnologia um episdio de responsabilidade coletiva comparvel ao da Conferncia de Asilomar. Paralelamente a sua explorao comercial, a engenharia gentica utilizada atualmente em centenas de laboratrios de universidades e institutos de pesquisa. E mais de trinta anos depois no h registro ou relato de nenhum acidente relacionado com essa tecnologia. Talvez valha a pena lembrar que Prometeu foi liberado depois de 30 anos, e que bem no fundo da caixa de Pandora estava a esperana.
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FIGURA 9.3. A construo de bibliotecas de genes.


A triagem dos clones pode ser feita reconhecendo a "etiqueta" representada por uma sequncia conhecida no DNA (STS, ou sequence tagged site; ESTs, ou expressed sequence tagged); no caso do gene se expressar, a triagem tambm pode ser feita com anticorpos especficos para a protena sintetizada.

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BIOTECNOLOGIA 2011 / Captulo 9: A engenharia gentica

AS BIBLIOTECAS DE GENES O enorme tamanho de um genoma dificulta tanto o mapeamento como a localizao de um gene. Uma forma de facilitar a manipulao extrair o DNA de um organismo determinado, cort-lo com enzimas de restrio, inserir os fragmentos em plasmdeos e introduzir os plasmdeos recombinantes em bactrias. Cada bactria formar um clone e cada clone levar um fragmento do genoma do organismo estudado. O conjunto de clones representa o genoma inteiro de um organismo, constituindo uma biblioteca genmica (Figura 9.3). Boa parte do DNA lixo e no leva genes. Por isso, um procedimento alternativo a montagem de uma biblioteca gnica, incluindo exclusivamente os genes que se expressam, ou seja, os genes responsveis pela sntese de protenas. Separa-se o mRNA codificador, e, com a enzima transcriptase reversa, se constroem as molculas correspondentes de cDNA. Inserem-se estas em plasmdeos, e os plasmdeos em bactrias. Com este procedimento, obviamente, o nmero de clones na biblioteca ser menor (Figura 9.3). De fato, o nmero de clones depende no s do nmero de genes como do tamanho do fragmento que o vetor pode carregar. Como os plasmdeos bacterianos e o bacterifago s transportam fragmentos pequenos de DNA de 10 kb a 20 kb, outros vetores genticos foram especialmente desenhados para carregar fragmentos maiores (cosmdeos, YACs ou yeast artificial cromossomes, BACs ou bacterial artificial chromossomes, transposons etc.). A construo de bibliotecas de genes representa o primeiro passo para o mapeamento de um genoma. Ao sequenciamento dos fragmentos segue a montagem da informao. Trata-se de uma etapa complexa em que se alinham as sequncias, se preenchem lacunas e se verificam os dados. O tratamento matemtico das informaes demanda algoritmos sofisticados e computadores poderosos. Uma vez organizada a sequncia, esta armazenada em bancos de dados. O usurio tem acesso atravs da Internet, mediante programas especializados que acumulam uma enorme quantidade de informaes.

A CONSTRUO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE Uma das primeiras protenas de origem recombinante foi a somatotropina ou hormnio de crescimento. Como a enzima de restrio eliminava do cDNA, alm da sequncia codificadora do peptdeo-guia, os nucleotdeos correspondentes aos primeiros aminocidos da molcula, estes tiveram que ser acrescentados quimicamente, em um processo extremamente engenhoso (Figura 9.4). A transferncia de um gene de uma espcie permite obter microrganismos que sintetizem alguma substncia diferente, geralmente visando o cultivo em grande escala. O gene de interesse costuma ser selecionado e estudado na bactria de laboratrio Escherichia coli e, posteriormente, transferido espcie na qual se pretende produzir a protena correspondente. Alm de Escherichia coli e de Saccharomyces cerevisiae, existem vrios outros microrganismos que so habitualmente utilizados como hospedeiros: Bacillus subtilis, Picchia pastoris, Pseudomonas, Streptomyces, Aspergillus nidulans, Neurospora crassa etc. Estes microrganismos so utilizados na produo de frmacos (insulina, hormnio de crescimento, vacinas) ou de enzimas (quimosina) e, tambm, na degradao de poluentes.

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FIGURA 9.4. A produo de somatotropina por engenharia gentica.

O sinal correspondente ao peptdeo-guia removido do cDNA com a enzima de restrio Hae III, que remove tambm 72 bases, codificadoras dos primeiros 24 aminocidos da molcula.

cDNA de somatotropina Fragmento de DNA sinttico com as 72 bases correspondentes aos 24 primeiros aminocidos

Unio dos dois fragmentos de DNA

Insero em um plasmdeo Plasmdeo recombinante Transformao

Transcrio e traduo do gene SOMATOTROPINA

FIGURA 9.5. Algumas estratgias possveis de clonagem. Biblioteca genmica Biblioteca gnica

Identificao do clone com o gene que se procura Sntese in vitro

Clonagem e subclonagem em Escherichia coli

Reao em cadeia da polimerase (PCR)

Transferncia a outro organismo, visando a expresso do gene


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BIOTECNOLOGIA 2011 / Captulo 9: A engenharia gentica

ENCONTRAR O GENE De um modo geral, encontrar um gene equivale a procurar agulha em palheiro. O gene pode ser localizado por triagem dos clones de uma livraria gnica ou genmica (Figura 9.3). Se esta no existir, pode ser necessrio constru-la, em uma primeira rodada de clonagem, para encontrar o gene de interesse. A segunda dificuldade est na obteno de numerosas cpias desse gene. Uma soluo a multiplicao do clone correspondente e posterior isolamento do gene procurado. Outra a amplificao do gene mediante a PCR, sempre que se conheam as sequncias iniciais e finais ou, eventualmente, as sequncias adjacentes regio onde est inserido. Se a sequncia do gene for conhecida e relativamente curta, podem-se construir cadeias curtas de oligonucleotdeos e associlas, formando um gene sinttico que ser amplificado por PCR. Existem numerosas estratgias, que dependem do caso e, tambm, das caractersticas e possibilidades do laboratrio (Figura 9.5). Seja qual for o caminho seguido, uma vez que as cpias do gene de interesse forem obtidas, estas tero que ser transferidas ao hospedeiro definitivo.

INSERIR O GENE Vetores de expresso gnica A transferncia de um fragmento estranho de DNA se v facilitada pela utilizao de vetores. Um vetor uma molcula de DNA que se duplica de maneira autnoma dentro de uma clula, carregando vrios genes, entre os quais alguns marcadores que permitam reconhecer sua presena dentro da clula. no vetor que ser inserido o fragmento de DNA estranho, para multiplicao ou integrao no genoma. Alm dos plasmdeos (bacterianos e de leveduras) e os bacterifagos ( , m13), tambm se utilizam como vetores os transposons, que so elementos genticos mveis capazes de pular de um lugar a outro do genoma, espalhando ou no cpias. Construdos em funo das necessidades, existem hoje vetores bacterianos, vetores de leveduras e vetores bifuncionais que podem ser utilizados tanto em bactrias como leveduras. As primeiras experincias de Engenharia Gentica foram feitas na bactria Escherichia coli, um microrganismo muito conhecido e fcil de se cultivar no laboratrio. Porm, Escherichia coli no o organismo ideal para a expresso de genes eucariticos. Clulas procariticas e eucariticas diferem em relao ao processamento do mRNA e s modificaes das protenas depois da traduo. Por este motivo, quando se procura expressar genes de mamferos, Escherichia coli substituda por outras clulas eucariticas, como a levedura Saccharomyces cerevisiae, um fungo utilizado h sculos na produo de alimentos e bebidas. Para que um gene se expresse em uma clula hospedeira, necessrio que esta reconhea seus prprios sinais de expresso. Para poder sintetizar uma protena exgena, a clula dever ler a sequncia codificadora com seus prprios sinais de transcrio (promotor) e de traduo (stio de ligao com o ribossomo, trmino de leitura). O ideal construir um vetor que j contenha os genes marcadores para seleo ou reconhecimento, os stios de restrio, uma sequncia promotora e os sinais adequados de incio e fim da transcrio. Ao colocar a sequncia codificadora da protena, o vetor funciona como um cassete de expresso (Figura 9.6).

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Outros fatores adicionais intervm na construo de um vetor de expresso. Um promotor forte, por exemplo, permitir sintetizar uma quantidade grande de protena, o que ser interessante comercialmente se esta for uma enzima. Entretanto, se a protena em questo for uma toxina que possa afetar o hospedeiro, ser prefervel escolher um promotor fraco. Uma possibilidade interessante a utilizao de um promotor que responda a um fator externo controlvel (substrato, temperatura), de maneira tal que o gene possa ser ligado ou desligado no momento que se considere conveniente. Finalmente, tambm deve ser considerado o destino da protena dentro da clula; se esta for secretada haver que acoplar na construo gnica um gene de sinalizao, que a leve at a membrana celular. FIGURA 9.6. A estrutura de um vetor de expresso.
Este deve incluir os elementos genticos da clula hospedeira para a transcrio e traduo .

Transformao e transfeco Existem diversos mtodos para inserir o DNA recombinante dentro da clula. Facilita-se a entrada do DNA com algumas manipulaes, tais como a adio de CaCl 2 no meio e/ou a modificao da temperatura. A aplicao de foras eltricas tambm aumenta as chances do DNA penetrar na clula, ao abrir os poros da membrana (eletroporao). Os plasmdeos atravessam a membrana celular em um processo denominado transformao, que ocorre em determinadas condies fisiolgicas da clula hospedeira. Em se tratando de vetores virais, a infeco da clula promove a entrada do DNA exgeno dentro da clula. Fala-se neste caso de transfeco (transformao + infeco). A tecnologia do DNA-recombinante est baseada em fenmenos que ocorrem em frequncias muito baixas. A existncia de mtodos de seleo eficientes possibilita detectar e recuperar aquelas clulas que incorporaram um gene estranho. Associa-se o gene estranho a um marcador seletivo como, por exemplo, um gene de resistncia a algum antibitico. Em presena deste, s podero se multiplicar e formar clones ou colnias as clulas que incorporaram ambos os genes. Entretanto, o uso de genes de resistncia a antibiticos considerado polmico, porque existe uma possibilidade remota dos genes serem transferidos das bactrias transformadas para as bactrias do ambiente.

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IDENTIFICAR OS MICRORGANISMOS RECOMBINANTES Tambm podem ser utilizados como marcadores seletivos os genes que codificam a sntese de um aminocido. Neste caso, a seleo do microrganismo recombinante ocorre em um meio sem esse aminocido. Alm dos marcadores seletivos, os pesquisadores contam com outro tipo de marcadores que permite identificar as bactrias transformadas e, tambm, acompanhar a expresso de um gene no organismo modificado. Destacam-se entre estes marcadores, ou genes reprteres: GAL e GUS, respectivamente o gene da -galactosidase e o gene da glucuronidase que transformam o substrato correspondente em um composto colorido; GFP, um gene da medusa Aequorea Victoria, que sintetiza uma protena fluorescente, verde brilhante na luz ultravioleta; LUC, o gene da luciferase, uma enzima dos vaga-lumes, que emite luz em presena do substrato. Mtodos alternativos envolvem a identificao de uma protena com anticorpos marcados ou o reconhecimento de um gene por hibridizao com uma sonda marcada.

A CONSTRUO DE PLANTAS TRANSGNICAS


As plantas transgnicas se originam via cultura in vitro a partir de clulas vegetais modificadas geneticamente. Portadoras de um gene exgeno ou transgene, sua obteno visa o melhoramento das propriedades agronmicas e nutritivas dos vegetais e, tambm, sua utilizao para produzir substncias novas (biofbricas). O TRANSGENE Para garantir a transferncia de uma sequncia gnica determinada, deve-se construir em redor uma estrutura complexa que inclua tambm um gene marcador, um promotor e as sequncias de leitura adequadas (sequncia terminal). Denomina-se transgene o conjunto formado pela sequncia gnica e a estrutura que o acompanha. O promotor desencadeia a transcrio da sequncia codificadora de interesse. Um promotor constitutivo permitir a expresso gnica na maioria dos tecidos e ao longo da vida da planta. Tambm existem promotores que respondem a estmulos ambientais internos ou externos, como a luz. O gene marcador confere resistncia a substncias normalmente txicas para as clulas vegetais, tais como os antibiticos ou os herbicidas, de modo que em um meio seletivo s sobrevivam clulas que integraram o transgene. A TRANSFERNCIA DOS GENES A CLULAS VEGETAIS Agrobacterium tumefaciens uma bactria do solo, que leva um plasmdeo denominado Ti (do ingls, Tumour induced plasmid). Quando infectadas com a bactria portadora desse plasmdeo, as plantas dicotiledneas desenvolvem galhas, isto , tumores caractersticos (crown gall). A eliminao de alguns genes na regio T do plasmdeo Ti conserva sua capacidade de insero no cromossomo da clula hospedeira, eliminando a propriedade de induzir tumores. Esta caracterstica transforma o plasmdeo em um vetor adequado para a transferncia de genes de outras espcies s clulas vegetais. Basta colocar o transgene na regio T do plasmdeo previamente desarmado para se obter um plasmdeo recombinante que poder ser transferido novamente a Agrobacterium ou a clulas hospedeiras, onde o transgene ir se inserir em algum lugar do genoma (Figura 9.7).
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FIGURA 9.7. A construo de uma planta transgnica no laboratrio.


O plasmdeo Ti "desarmado" portando um gene exgeno transferido a clulas de discos foliares. Formam-se calos que podero regenerar a planta inteira.

FIGURA 9.8. As etapas da construo de uma planta transgnica. Transformao por engenharia gentica Regenerao mediante tcnicas de cultura de tecidos Caracterizao molecular e bioqumica Avaliao do valor agronmico Melhoramento mediante cruzamentos com linhagens de elite Obteno de uma variedade transformada geneticamente Experimentos e testes de campo, em pequena e grande escala Autorizao da legislao local Liberao do cultivo para sua explorao comercial
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As plantas monocotiledneas (arroz, milho, trigo) no so infetadas por Agrobacterium, sendo necessrio recorrer a mtodos fsicos para a transferncia de genes. Recorre-se eletroporao, assim como ao tratamento com uma substncia que desestabilize a membrana plasmtica (polietilenglicol ou PEG). O mtodo mais difundido provavelmente seja a biolstica. Com um revlver especial (gene gun) dispara-se microprojteis de ouro ou tungstnio, recobertos de DNA, em direo s clulas. O dispositivo possibilita a entrada do DNA exgeno no ncleo, nas mitocndrias ou nos cloroplastos. De um modo geral, a transformao se realiza em protoplastos, clulas em que a parede celular foi eliminada com enzimas. O PROBLEMA DOS MARCADORES SELETIVOS O uso de marcadores de resistncia a antibiticos na construo de plantas desperta vrios questionamentos, apesar de se tratar de antibiticos sem uso clnico e que j se encontram nas bactrias do intestino. Estes marcadores podem ser substitudos, mas como sua utilidade se limita ao processo de transformao, o melhor seria elimin-los uma vez cumprida sua funo. J foram desenvolvidas vrias tcnicas genticas de remoo dos marcadores, esperando-se que nos prximos anos sua retirada se transforme em uma prtica corriqueira de laboratrio. DO LABORATRIO AO CAMPO No laboratrio, transfere-se a construo gentica s clulas receptoras por algum dos mtodos possveis (geralmente eletroporao, biolstica ou uso de vetores, como o plasmdeo Ti de Agrobacterium tumefaciens); a seguir se selecionam e recuperam as clulas transformadas e, mediante as tcnicas de cultura in vitro, se regeneram as plantas correspondentes (Figura 9.8). Notese que este trabalho costuma ser realizado em plantas cujo gentipo favorece a transformao e a regenerao da planta transformada, mas que geralmente resultam pouco vantajosas do ponto de vista agronmico. A presena do transgene, assim como o nmero de cpias e o lugar em que estas se integraram no genoma, conferida mediante tcnicas bioqumicas e/ou marcadores moleculares (polimorfismos na molcula de DNA, repetio de sequncias), porque so aspectos que podem influir na expresso gnica. Considera-se alcanado o xito quando o transgene se expressa no lugar correspondente e com um adequado nvel de atividade, restando por verificar a estabilidade da expresso gnica e o seu valor agronmico. Acabada a etapa de laboratrio, iniciam-se os testes controlados em casa de vegetao, para selecionar as plantas-me com as quais se originar vrias geraes de retrocruzamentos seletivos com alguma das linhagens elite. Os testes visam a obteno de uma linhagem transgnica de alto rendimento, adaptada a um contexto especfico, isto , um cultivar com uma produtividade potencial parecida da linhagem elite que expresse o trao codificado pelo novo transgene. Conceitualmente, estes testes so semelhantes aos efetuados no processo de melhoramento tradicional; no entanto, a utilizao de marcadores moleculares e de tcnicas de cultura in vitro permite caracterizar a prognie bem mais rapidamente. S ento d-se incio liberao planejada no meio ambiente, que envolve o cultivo de plantas em experimentos protegidos e testes de campo em diferente escala, at que o novo hbrido transgnico esteja pronto para o seu cultivo comercial. A liberao do cultivo depender da autorizao da legislao local, geralmente bastante restrita a esse respeito. No Brasil, a liberao depende da Comisso Nacional Tcnica de Biotecnologia (CTNBio), uma instncia colegiada multidisciplinar que regula mas atividades que envolvam a construo, experimentao, cultivo, manipulao, transporte, comercializao, consumo, armazenamento, liberao e descarte de OGM e derivados.
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CLULAS E ANIMAIS TRANSGNICOS


A TRANSFERNCIA GNICA A CLULAS ANIMAIS Um dos objetivos da engenharia gentica a produo de protenas recombinantes em culturas celulares. Em relao aos microrganismos, a grande vantagem das clulas animais possuir os sistemas de transcrio e de processamento das protenas indispensveis para a expresso dos genes de organismos superiores. Observe-se que em relao s clulas animais a palavra transformao designa a converso de uma clula normal em maligna, sendo substituda por transfeco. O transporte de DNA exgeno dentro da clula assegurado por mtodos fsicos (eletroporao, microinjeo, ingesto de micropartculas, fuso de lipossomos com a membrana plasmtica) e por vetores (vrus, plasmdeos e transposons). A transfeco mediante vetores virais dos quais se eliminaram as sequncias patognicas, interessa ao laboratorista porque os vrus animais infectam tecidos especficos e se integram no genoma da clula hospedeira de maneira estvel. Em mamferos, os vrus utilizados mais frequentemente como vetores so o SV40, a vacina, os retrovrus e os adenovrus. Clulas de inseto tambm podem ser manipuladas geneticamente com vetores como os elementos P de transposio de Drosophila, ou como o baculovrus, uma vez eliminado o gene que permite sua proliferao na natureza. Assim como visto anteriormente em relao aos microrganismos e s plantas, a sequncia codificadora colocada em uma construo gnica bem definida que inclui um gene marcador para selecionar as clulas que receberam o transgene. Utilizam-se como marcadores genes de resistncia a antibiticos, genes para caractersticas metablicas (Tk ou timidina quinase) etc. Para integrar a construo gnica no lugar desejado, se colocam nas extremidades sequncias de DNA homlogas s extremidades do segmento que se quer substituir. Como distinguir a integrao no lugar desejado (recombinao homloga) da integrao ocorrida em qualquer outro lugar (recombinao no homloga)? Acrescentando na construo gnica, um pouco mais longe das sequncias homlogas, um gene de seleo negativa. Se a clula o integrar em qualquer outro lugar do genoma, ela se tornar sensvel a um segundo antibitico. Inversamente, se a clula for resistente a este antibitico, tendo recebido o marcador colocado dentro da construo gnica, isto significa que houve integrao no lugar desejado. Os animais como modelos para a experimentao A transfeco de clulas cultivadas in vitro permite que sejam verificados o stio de integrao do transgene e o nmero de cpias inseridas. Uma aplicao interessante desta tecnologia na pesquisa clnica a construo de modelos animais para o estudo de doenas humanas. Desse modo se obtiveram camundongos transgnicos para genes determinantes de algumas doenas humanas, tais como cncer de mama (BRCA 1), doena de Huntington, anemia falciforme etc. Estes animais so de grande utilidade para as pesquisas farmacolgicas. Os animais como biofbricas A ovelha Dolly nasceu em 1996, depois de numerosas tentativas de transferir o ncleo de uma clula mamria a um ovcito anucleado (Figura 9.9). Adorada pela mdia, o clone Dolly teve que ser sacrificada em 2003 com um tumor no pulmo, artrite e sinais de envelhecimento precoce.

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Poucos meses depois do nascimento de Dolly, o mesmo grupo do Instituto Roslin e de PPL Therapeutics anunciou o nascimento de Polly, uma ovelha transgnica para o gene codificador do fator IX, uma protena que falta nos hemoflicos. O fato de ter-se utilizado para gerar Dolly uma clula diferenciada mantida em cultivo teve uma importncia enorme, porque clulas embrionrias em cultura podem ser transfectadas e os seus ncleos transferidos para a obteno de animais transgnicos, como Polly. Aps a transfeco de clulas-tronco embrionrias com um gene desativado, realiza-se sua transferncia a blastcitos, que, reimplantados, originaro animais quimricos, isto animais com clulas de dois tipos: umas em que o gene est ativado e outras em que no est ativado porque incorporaram o transgene. Dos cruzamentos entre quimeras com clulas germinais portadoras do gene desativado nascero animais homozigticos com duas cpias do gene inativo (Figura 9.10). Esta estratgia utilizada no s para construir modelos animais com um gene inativo (knock out), como para colocar um gene ativo (knock in). Mesmo sendo difcil de obter, um animal transgnico pode ser bem mais interessante do ponto de vista econmico que o cultivo de clulas em biorreatores, um processo complexo e de alto custo. Na construo de animais transgnicos para a produo em grande escala de uma protena recombinante, escolhe-se habitualmente um promotor que se expresse na glndula mamria, de modo que o produto gnico aparea no leite do animal. Cabras transgnicas produtoras de fator ativador de plasminognio (tPA), vacas produtoras de lactoferrina, somatotropina ou insulina j so uma realidade. Chama-se Atryn o primeiro anticoagulante liberado comercialmente em 2009, produzido a partir do leite de uma cabra transgnica pela empresa GTC Biotherapeutics.

FIGURA 9.9. Dolly, um clone obtido por transferncia nuclear.

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FIGURA 9.10. Construo de animais transgnicos.

A. Microinjeo.
Aps a transfeco, se implantan os ovos em fmeas receptivas (pseudogrvidas). Aqueles que incorporaram o transgene originaro, neste caso, animais de tamanho maior (supermouse).

B. Transfeco de clulas-tronco embrionrias.


Mediante a implantao do blastcito com clulas modificadas em uma fmea aguti, so obtidos animais quimricos, com clulas que levam o carter para pelagem marrom e clulas com o carter para pelagem preta. Do cruzamento entre quimeras, nascem alguns animais com pelagem preta, tendo incorporado o DNA exgeno no genoma.

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OS REBANHOS FARMACUTICOS
Algumas protenas teraputicas (somatotropina, insulina) so obtidas atualmente mediante o cultivo de clulas animais ou de bactrias e leveduras recombinantes; no entanto, provvel que em um futuro prximo estes agentes biolgicos sejam substitudos por mamferos transgnicos. A modificao das tcnicas de produo interessa indstria farmacutica porque elimina as dificuldades inerentes conduo dos bioprocessos e purificao dos produtos. Apesar do elevado valor da inverso inicial, bastam poucos animais para se extrair uma quantidade grande de protena recombinante, com o qual seria possvel baratear o seu preo. J existem cabras produtoras do fator ativador de plasminognio (tPA) e vacas produtoras de lactoferrina, j prximos de ser comercializados. Biosidus, uma empresa argentina do Grupo de Empresas Farmacuticas Sidus, iniciou as experincias de clonagem de bovinos em 1997. Como as dificuldades tcnicas so numerosas, muitas tentativas tiveram que ser feitas at alcanar o xito. Este chegou em 2002, com o nascimento de Pampa, uma vaca da raa Jersey que o primeiro clone bovino da Amrica Latina. Uma vez dominada a tecnologia, o passo seguinte era conseguir um animal que secretasse o hormnio de crescimento humano (somatotropina) no leite. Com esse objetivo, se elaborou uma construo gnica que inclua o gene codificador da somatotropina e um promotor para sua expresso no leite. Esta construo foi inserida em fibroblastos fetais. Da fuso destes fibroblastos com ovcitos anucleados resultaram embries que se implantaram em vacas portadoras. Em 2002, nascia Pampa Mansa, uma vaca clonada e transgnica que um ano mais tarde comeou a produzir leite com somatotropina. Estima-se que bastariam trs animais semelhantes para abastecer o mercado latino-americano. A partir de fibroblastos da orelha de Pampa Mansa obteve-se uma dinastia de vacas, clones de um clone. Em 2004, com o nascimento de Pampero, um touro transgnico resultante do cruzamento entre Pampa Mansa e um animal reprodutor, a multiplicao dos animais passou a ser independente da clonagem. O tambo farmacutico est completo. Em 2005, a empresa Biosidus obteve das autoridades a autorizao para liberar um nmero limitado de animais no meio ambiente agropecurio, em condies estritamente controladas. O prximo passo ser a aprovao do produto para o uso farmacutico. O projeto colocou a Argentina entre os pases que dominam esta tecnologia, juntamente com Estados Unidos, Alemanha, Frana, Japo, Reino Unido e Austrlia. Alm da participao pioneira de Biosidus, o tambo farmacutico demandou um investimento de US$ 7.000.000, a participao de uma equipe multidisciplinar de 40 pesquisadores e a assessoria do CONICET (Consejo de Investigaciones Cientficas y Tcnicas da Argentina). Biosidus contempla a ampliao do rebanho para outras protenas teraputicas (Dinastia Patagnia produtora de pr-insulina humana, Dinastia Portenha, produtora de hormnio de crescimento bovino).

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10. BIOTECNOLOGIA E INDSTRIA

O PROCESSO WEIZMANN Por ser o primeiro processo fermentativo industrial a se desenvolver em condies asspticas, o processo Weizmann considerado um marco histrico na biotecnologia industrial. Ao longo do sculo XIX, dois acontecimentos decisivos transformaram a borracha natural em um material estratgico para o crescimento da indstria automotora; em 1839, C. B. Goodyear descobriu que a vulcanizao lhe conferia elasticidade e resistncia e, em 1888, J. Dunlop inventou os pneus. A diminuio da oferta de borracha natural, proveniente do Brasil e das plantaes inglesas na Malsia, com o correspondente aumento do preo, desencadeou uma corrida borracha sinttica. Enquanto a Alemanha tentava sintetizar a borracha a partir de um derivado do petrleo (butadieno), a Inglaterra explorava as possibilidades de sntese de molculas precursoras por fermentao. Nesse contexto histrico, o qumico de origem russa Chaim Weizmann desenvolveu, na Universidade de Manchester (1914), um processo fermentativo no qual a bactria Clostridium acetobutilycum produz butanol (um precursor do butadieno) e acetona. Com o incio da Primeira Guerra Mundial, a ateno da Inglaterra desviou-se da borracha para a produo de explosivos e, especialmente, de uma plvora (cordite) base de nitrocelulose em cuja preparao se usa acetona como solvente. Como esta era sintetizada a partir de carbonato de clcio, uma matria-prima importada da Alemanha, a produo de acetona por via qumica se tornou invivel, e a Inglaterra comeou a explorar a via biotecnolgica. Recrutado pelo Comit de Munies e tendo cedido a patente do processo ao governo britnico, Weizmann comeou a produzir acetona por fermentao microbiana do amido de milho na Nicholson Gin Distillery (Londres). Contudo, devido guerra e falta de alimentos, o suplemento de carboidratos acabou se tornando o fator limitante da produo. Em 1916 os britnicos transferiram a produo para uma destilaria em Toronto (Canad), ao tempo que era construda outra fbrica na ndia. Em 1917 comeou a funcionar uma fbrica produtora de acetona por fermentao do milho em Indiana (Estados Unidos). Uma vez finalizada a guerra, a acetona e o butanol continuaram a ser utilizados como solventes. Os caminhos da cincia, da tecnologia e da poltica se cruzaram mais uma vez. Qumico e jornalista, Weizmann chegou a ser um dos mais importantes lderes comunitrios do movimento sionista mundial. Em 1948, ao finalizar o mandato conferido pela Liga das Naes Gr Bretanha e a partilha da Palestina, Weizmann foi escolhido primeiro presidente do Estado de Israel. O instituto de pesquisas cientficas e tecnolgicas fundado em Rehovot (Israel) leva o seu nome. O processo Weizmann est indissoluvelmente ligado histria do sculo XX. A INDSTRIA QUMICA A VIA QUMICA A indstria qumica se caracteriza por produzir substncias que atendem as necessidades de outras indstrias. Enquanto algumas empresas sintetizam os derivados petroqumicos bsicos (etileno, propileno, butadieno), outras os transformam nos petroqumicos finais: polietileno (PE), polipropileno (PP), policloreto de vinil (PVC), polisteres e xido de etileno. Um terceiro grupo converter esses materiais em objetos de consumo tais como filmes, recipientes, objetos diversos etc.
Copyright Maria Antonia Malajovich Biotecnologia: ensino e divulgao (www.bteduc.bio.br)

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As empresas devem responder s mudanas do mercado se ajustando rapidamente a qualquer variao de preo da matria-prima ou da energia. Para subsistir, uma indstria ter que reagir com versatilidade, mediante o desenvolvimento de processos tecnolgicos inovadores e rentveis. Os processos descartados podero ser utilizados novamente, a condio de o mercado se tornar novamente favorvel. Um exemplo tpico a evoluo do mercado da acetona. Subproduto da corrida borracha sinttica durante a Primeira Guerra Mundial, a acetona passou a ser um produto indispensvel para a indstria de armamentos. Uma vez concludo o conflito, reapareceu como solvente essencial na fabricao de lacas, uma funo de onde seria afastada mais tarde por outras substncias. A Indstria Qumica do sculo XX se baseou, principalmente, no petrleo e seus derivados. Apesar da crise dos anos 1970 ter chamado a ateno da sociedade sobre os riscos da dependncia de um recurso no renovvel, o petrleo ainda resulta competitivo. A situao poder mudar em meados do sculo XXI, com a diminuio das reservas conhecidas e a necessidade de apelar a tecnologias de extrao novas e caras. A VIA BIOTECNOLGICA A via biotecnolgica est baseada na transformao da biomassa, um recurso barato e renovvel. Para substituir a via qumica, devem-se desenvolver processos que possibilitem a obteno de produtos, materiais e energia a um custo competitivo e com menor impacto ambiental. Todas estas condies se encontram satisfeitas na obteno de numerosas molculas de interesse industrial a partir de milho, de leos vegetais ou de madeira (Tabela 10.1). A Biotecnologia Industrial se fundamenta na microbiologia, nas fermentaes e na biocatlise, recebendo o impacto da biotecnologia moderna (genmica, engenharia metablica, engenharia gentica) que abre perspectivas novas no melhoramento das linhagens microbianas e das variedades vegetais. A produo da vitamina B2 (BASF) e do antibitico cefalexina (DSM Life Sciences Products) so dois exemplos bem sucedidos da substituio da sntese qumica pela ao microbiana. Esta resultar vantajosa sempre que existirem vrios metablitos intermedirios entre o substrato inicial e o produto final, porque um agente biolgico ser capaz de realizar diretamente a sequncia completa de reaes. TABELA 10.1. Diversidade de produtos derivados de algumas matrias-primas renovveis.
SETOR Acar e amido MATRIA-PRIMA Cana-de-acar, beterraba aucareira, sorgo sacarino, trigo, milho, batata, arroz mandioca etc. Canola, soja, coco, girassol, dend, gorduras animais. COMPONENTES Acar, amido, melao. APLICAES Solventes, produtos farmacuticos, adesivos, resinas, polmeros, selantes, limpadores, etanol. Surfactantes para sabes e detergentes, ingredientes inativos de produtos farmacuticos, tintas, pinturas, resinas, cosmticos, cidos graxos, lubrificantes, materiais de construo. Materiais de construo, fibras, polmeros, resinas, adesivos, pinturas, revestimentos, tintas, piche.

leos vegetais

Triglicerdeos, cidos graxos, glicerol.

Madeira

Pinho, eucalipto.

Celulose, papel e lignina.

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A utilizao de organismos geneticamente modificados permite melhorar os processos produtivos e desenhar produtos novos. Em relao segurana, cabe lembrar que as caractersticas metablicas das linhagens industriais esto alteradas de modo a que elas cresam em condies artificiais muito estritas, sendo incapazes de sobreviver fora do laboratrio ou, eventualmente, de competir com os microrganismos do ambiente. A percepo pblica nutre uma atitude neutra ou favorvel em relao biotecnologia industrial. Em parte porque os produtos so utilizados como insumos para outras indstrias, o que lhes confere pouca visibilidade. E tambm porque, ao utilizar matrias-primas renovveis e desenvolver processos menos poluentes com menor gasto de energia, as biotecnologias ajudam a atenuar a imagem poluidora da indstria qumica. No por acaso que a biotecnologia industrial denominada biotecnologia branca. OS PRODUTOS BIOTECNOLGICOS Alguns processos biotecnolgicos geram substncias em quantidades pequenas (volume baixo) que sero vendidas a um preo elevado (alto valor agregado). Trata-se geralmente de metablitos secundrios cuja produo demanda grandes investimentos, um nvel tecnolgico avanado e uma mo de obra altamente qualificada. Nesta categoria, denominada qumica fina, se inserem os produtos farmacuticos e agrcolas, alguns aditivos alimentares, os aminocidos, as vitaminas e as enzimas. A via biotecnolgica tambm se aplica a algumas substncias fabricadas em grandes quantidades (volume alto), em processos que demandam investimentos menores e operaes mais simples. Entre estes produtos, de valor agregado intermedirio, encontramos metablitos primrios, tais como alguns solventes, cidos orgnicos e polmeros. No caso de substncias produzidas em grandes quantidades e com baixo valor agregado, como os biocombustveis lquidos (etanol, biodiesel) ou gasosos (biogs), nos deparamos ainda em alguns pases com sistemas produtivos desenvolvidos em pequena escala, em instalaes spticas e com uma mo de obra no especializada, que no exigem mais que equipamentos simples e pequenos investimentos. No entanto, a eficincia desses sistemas produtivos baixa, verificando-se gradual e progressivamente sua substituio por outros que contam com um nvel tecnolgico avanado e so gerenciados por grandes empresas, em empreendimentos economicamente sustentveis. A via biotecnolgica resulta hoje economicamente vivel para alguns metablitos, as enzimas, os bioplsticos e os biocombustveis. METABLITOS DE INTERESSE COMERCIAL Estima-se que, em 2010, a biotecnologia branca responder por 9% das vendas do setor qumico e que, em condies favorveis, esse valor poder subir rapidamente a 20%. Entre as molculas de interesse comercial se destacam, por sua versatilidade, vrios metablitos primrios e secundrios (Tabela 10.2). lcoois e solventes Vimos previamente alguns aspectos histricos relacionados com a produo de acetona e butanol por fermentao. Estima-se que a imobilizao de microrganismos daria um novo impulso sntese de solventes, aumentando a produtividade em aproximadamente 60%. Tambm se deve destacar a importncia do etanol, 95% do qual produzido por via biotecnolgica.

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cidos orgnicos A produo de cido ctrico (4.0 x 105 toneladas/ano) depende quase exclusivamente do cultivo do fungo filamentoso Aspergillus niger, em processos fermentativos de diversos tipos (meio slido e cultura em superfcie; meio lquido e cultura submersa). O cido ctrico utilizado na indstria de alimentos como aditivo (acidulante e antioxidante), na cosmtica como regulador do pH e, na indstria farmacutica, como anticoagulante e ingrediente de tabletes efervescentes. Em relao ao cido actico, os processos industriais modernos tambm dependem da ao bacteriana (gneros Acetobacter, Gluconacetobacter e Gluconobacter). Com numerosas aplicaes, o cido actico um precursor de vrias molculas intermedirias como o anidrido actico e os acetatos ster, e de produtos como o acetato de celulose, o celofane, o acetato raiom etc. Tambm se usa como solvente na produo de plsticos, borracha, gomas, resinas e leos volteis. A indstria farmacutica o utiliza como acidificante. O cido lctico obtido por fermentao bacteriana (Lactobacillus) ou fngica (Rhizopus oryzae), sendo um importante insumo para as indstrias de alimentos e de frmacos e a cosmtica. Tambm utilizado como monmero na sntese de cido polilctico (PLA), um polmero biodegradvel. O cido succnico tambm encontra aplicaes em vrias indstrias (alimentos, frmacos, cosmtica), assim como na produo de plsticos e de materiais para a indstria automotora. Tratase de outro bloco fundamental na sntese de polmeros, resinas de ABS (acrilo-nitrilo-butadieno), Nylon 6.6, solventes etc. TABELA 10.2. Metablitos primrios e secundrios obtidos por fermentao e/ou bioconverso enzimtica.
METABLITOS PRIMRIOS lcoois e solventes cidos orgnicos Aminocidos Polissacardeos Nucleotdeos e nucleosdeos Vitaminas Corantes EXEMPLOS Etanol, butanol, acetona, glicerol, manitol. cido lctico, cido ctrico, cido actico, cido glucnico, cido itacnico, cido mlico, cido tartrico, cido pirvico, cido succnico. cido L-glutmico (monoglutamato de sdio), L-lisina, L-fenilalanina, cido L-asprtico, L-carnitina. Xantana, dextrana, pululana, gelana, agar, alginatos, carrageninas. cido guanlico (5GMP) e cido inosnico (5IMP). Vitamina B2 (riboflavina), vitamina C (cido L-ascrbico), vitamina B12 (cianocobalamina). -caroteno, astaxantina, ficocianina, monascina.

METABLITOS SECUNDRIOS Molculas para a sade humana e/ou animal Molculas para a agricultura Molculas para a indstria de alimentos

EXEMPLOS Antibacterianos, antivirais, antifngicos, anti-helmnticos, antitumorais, soros, imunoglobulinas, vacinas, imunossupressores, estatinas etc. Inseticidas e pesticidas, fatores de crescimento vegetal. Condimentantes e aromatizantes para a indstria alimentcia.

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Aminocidos A produo industrial de aminocidos se destina nutrio humana (66%) e ao enriquecimento de raes animais (33%) e, em grau bem menor, s indstrias farmacuticas e cosmticas (1%). O mtodo produtivo mais antigo a extrao por hidrlise de protenas (soja, cabelos), que tem como limitao principal a disponibilidade da matria-prima. Os outros mtodos incluem a sntese, a fermentao e a biocatlise. A sntese qumica apresenta o inconveniente de gerar misturas das duas formas isomricas (acilD e acil-L), representadas habitualmente como tipo mo direita" e tipo "mo esquerda". Como os organismos vivos s assimilam L-aminocidos, estes devem ser separados por biocatlise das misturas racmicas. A imobilizao de enzimas estereoespecficas nos biorreatores facilita a produo industrial, reduzindo os custos de maneira significativa. Observe-se que a separao desnecessria no caso da glicina, que no apresenta ambas as formas, e da DL-metionina, j que os seres vivos convertem a forma D em L. A via fermentativa conveniente para a produo de vrios aminocidos. O agente biolgico Corynebacterium glutamicum produz cido glutmico (1,1 milho de toneladas/ano), que usado na cozinha oriental como flavorizante (glutamato monossdico), para realar o sabor dos alimentos. O cido L-asprtico e a L-fenilalanina so obtidos por imobilizao conjunta de Escherichia coli e Pseudomonas dacunhae em uma coluna de fermentao, ou por uma bactria geneticamente modificada (Escherichia coli). Ambos so os componentes do adoante no calrico Aspartame (15.000 toneladas/ano). Outros aminocidos cumprem a funo de aditivo em alimentos (L-cistena, 3.000 toneladas/ano), ou de complemento nutricional em raes animais (L-treonina, 50.000 toneladas/ano; L-lisina 550.000 toneladas/ano). Por outro lado, a indstria farmacutica absorve 1.000 toneladas/ano de L-arginina e 500 toneladas/ano de L-triptfano, de L-valina e de L-leucina. Polissacardeos Os polissacardeos de origem microbiana substituem parcialmente os espessantes e gelificantes extrados das algas marinhas. A goma xantana (20.000 toneladas/ano), um produto de fermentao da bactria Xanthomonas campestris, entra na composio de molhos prontos, pudins, geleias, sorvetes, dentifrcios etc. Suas propriedades espessantes so tambm utilizadas na recuperao do petrleo. As dextranas (200 toneladas/ano) so obtidas por via fermentativa a partir de diversos microrganismos. As de alto peso molecular se empregam como espessantes na indstria de alimentos, na preparao de filmes protetores de sementes (indstria agrcola) e na composio das emulses fotogrficas. As de baixo peso molecular se usam como plasma sanguneo artificial, para melhorar o fluxo sanguneo em casos de traumatismos e cirurgias. Vitaminas Apesar da maior parte das vitaminas serem obtidas industrialmente por via sinttica ou extrativa, a via fermentativa vantajosa nos casos da riboflavina (vitamina B 2) e do cido ascrbico (vitamina C). Ainda a nica possvel para a cianocobalamina (vitamina B12), uma molcula complexa que, naturalmente, no sintetizada por animais ou por vegetais. Um precursor da vitamina A, o caroteno, sintetizado pela alga Dunaliella bardawil, que consegue se desenvolver na gua salobra em grandes tanques ao ar livre, em uma regio desrtica perto da costa do Mar Vermelho (Israel).

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ENZIMAS Algumas enzimas podem ser extradas facilmente dos tecidos ou dos rgos de seres vivos: as amilases do malte da cevada; a papana da papaia; a ficina do figo, a bromelina do ltex do abacaxi. Do estmago de sunos se separa a pepsina e do pncreas dos mesmos se obtm a pancreatina, que uma mistura de amilases, proteases e lipases. J a renina extrada do quarto estmago de bezerros, e a catalase, do fgado ou do sangue de bovinos. A extrao de enzimas de origem vegetal ou animal est sujeita disponibilidade de terra e s flutuaes das colheitas ou do abate. Por isso, a tendncia substitu-las por outras de origem microbiana que, por serem obtidas mediante processos fermentativos em grande escala, garantem uma produo regular de qualidade constante. Mesmo cumprindo uma funo idntica, duas enzimas produzidas por microrganismos diferentes podem apresentar propriedades dessemelhantes. Por exemplo, a lactase ( galactosidase), uma enzima que hidrolisa a lactose, est presente em bactrias, leveduras e fungos. No entanto, as condies timas de funcionamento diferem uma da outra: 400C, 370C e 55-600C (temperatura); 3-4, 7,2 e 6,6 (pH). A escolha de uma enzima proveniente de um microrganismo ou de outro depender das condies que o bioprocesso demande. Considerando que a biodiversidade microbiana ainda comea a ser desvendada, assim como a arte de alterar suas vias metablicas, existem grandes chances de se encontrar enzimas com propriedades diferentes que possibilitem o desenho de processos industriais inovadores. A otimizao de um processo industrial contempla o custo da matria-prima, o tipo de fermentao (submersa ou em meio semisslido) e os controles necessrios para o bom desenvolvimento do processo, como, por exemplo, o pH e a temperatura. Do ponto de vista econmico, no vale a pena elaborar ou redimensionar esses parmetros para cada microrganismo que produza uma enzima interessante, sendo mais proveitosa a transferncia da sequncia codificadora dessa enzima a um dos microrganismos industriais j bem conhecidos (bactrias Escherichia coli, Streptomyces ou Bacillus subtilis; fungos Aspergillus oryzae, Saccharomyces cerevisiae ou Kluyveromyces). Mais de 60% da produo industrial atual de enzimas provm da biotecnologia moderna. O custo de uma enzima tambm depende das dificuldades tcnicas encontradas nas etapas posteriores fermentao (separao, purificao). Em geral, as enzimas mais baratas so as extracelulares, ou seja, as que so secretadas para fora da clula como, por exemplo, as hidrolases (amilases, proteases e celulases). As mais caras so as enzimas intracelulares, j que, por serem utilizadas como frmacos ou reagentes em testes de diagnstico, requerem um grau de pureza maior. As enzimas so insumos para outras indstrias, especialmente as de alimentos e bebidas, raes, detergentes, analticas e farmacuticas. Estima-se que o mercado global de enzimas poder alcanar, em 2013, um valor aproximado de US$ 7 bilhes/ano. Atualmente, o maior produtor Novozyme, uma empresa pertencente ao grupo Novo (Dinamarca), que responde por 47% do mercado. A empresa mantm em funcionamento vrios fermentadores de 80.000 l, contabiliza mais de 4.000 patentes e dedica a quase totalidade de seu oramento de pesquisa e desenvolvimento otimizao de microrganismos, produtos enzimticos e tecnologia. BIOPOLMEROS E BIOPLSTICOS A denominao de biopolmeros abrange dois tipos de polmeros. O primeiro inclui os que so sintetizados pelos seres vivos, como a celulose, o amido e os leos vegetais, o segundo, os que resultam da polimerizao de uma molcula bsica, como o cido lctico, proveniente de uma fonte renovvel.
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Um dos bioplsticos mais versteis o polilactato (PLA), um polister obtido por polimerizao do cido lctico resultante da fermentao de milho. Utiliza-se como recheio de almofadas e edredons (NatureWorks), revestimento de filmes e de papel (BASF), e material de embalagens descartveis (Ingeo) por diversas empresas (Coca-Cola, McDonalds). Tambm est sendo aproveitado na indstria automotora (Hyundai) e eletrnica (Samsung). Polmeros sintetizados diretamente por microrganismos, como os poli-hidroxialcanoatos (PHAs) e o poli-hidroxibutirato (PHB), comeam lentamente a entrar no mercado de embalagens da indstria de alimentos. Este ltimo, por ser biocompatvel, encontrou importantes aplicaes na rea mdica (Biopol). No interior de So Paulo, uma usina piloto relacionada com empresas do setor sucroalcooleiro (Biagi, Balbo) j est produzindo PHB por fermentao bacteriana do acar de cana (Biocycle). A transferncia dos genes codificadores de PHA (Ralstonia eutropha) e de PHB (Alcaligenes eutropus) a microrganismos e plantas (canola) representa um avano das pesquisas. Alm desses dois tipos de biopolmeros, os bioplsticos compreendem um terceiro, constitudo por polmeros biodegradveis sintetizados a partir de uma molcula de origem petroqumica, como alguns polisteres sintticos. Qualquer um dos dois critrios, a origem fonte renovvel como a propriedade biodegradabilidade, basta para definir um bioplstico. A indstria dispe atualmente de aproximadamente trinta molculas essenciais para a construo de polmeros, tais como os cidos carboxlicos, o etanol, os aminocidos, os triglicerdeos, o furfural, o sorbitol, o glicerol etc. Essas molculas, de origem biolgica, possibilitam tanto a obteno de plsticos inovadores biodegradveis como a de bioplsticos convencionais, no biodegradveis e semelhantes aos de origem petroqumica. Entre estes: as resinas de poliuretano sintetizadas a partir de leo de soja, o polister de origem bacteriano Sorona 3GT (DuPont, Genencor) de amplo uso na indstria txtil, do PVC ou polietileno verde (Braskem, Tetrapak), que um polmero do etileno obtido a partir do etanol de cana. A produo de bioplsticos ainda est limitada pelos custos, no entanto e apesar de representar atualmente apenas 1% do negcio de polmeros, se espera que esse valor aumente rapidamente se os custos diminurem. OS BIOCOMBUSTVEIS Aproximadamente 75% da energia consumida no mundo retirada dos combustveis fsseis (carvo, petrleo e gs natural). Considerando que as reservas so limitadas e que a queima de combustveis fsseis a causa de vrios problemas ambientais, parece acertado buscar outras formas de extrair energia. Uma fonte alternativa a biomassa, um recurso que, por ser renovvel, pode nos fornecer energia de modo sustentvel. A combusto a forma mais simples de liberar a energia da biomassa, seja esta madeira, resduos vegetais ou excrementos secos de ruminantes. Trata-se de um procedimento rural, no comercial. A tecnologia atual nos oferece combustveis eficientes por fermentao da biomassa, como o etanol ou o biogs. Existem outras possibilidades, tais como a obteno de biodiesel por transformao qumica de leos vegetais e, futuramente, a produo de hidrognio a partir de gua, utilizando a capacidade fotossinttica das microalgas. Os biocombustveis contribuem para reduzir alguns dos problemas ambientais que nos afligem, tais como a acumulao de CO2 e outros gases de efeito estufa. A grande vantagem da biomassa sobre os combustveis fsseis que libera uma quantidade de CO2 igual que absorveu durante o seu crescimento em um perodo recente, enquanto a quantidade de CO2 liberada pelos combustveis fsseis foi removida do ambiente h milhes de anos.
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Nos pases que os adotam, os biocombustveis substituem a gasolina, parcial ou totalmente, modificando a realidade do setor de transportes. Curiosamente, os primeiros automveis de Henry Ford, com motores de ignio por centelha, funcionavam com etanol de milho, e os primeiros motores de Rudolf Diesel, de ignio por compresso, o faziam com leo de amendoim. Com o petrleo barato, passou-se a utilizar gasolina e leo diesel para os automotores, mas o aumento dos preos na dcada de 1970 mostrou a convenincia de substituir os derivados do petrleo por etanol e biodiesel. Atualmente, o principal biocombustvel lquido para transporte o etanol. A maior parte da produo (90%) est concentrada no Brasil (fermentao da cana-de-acar) e nos Estados Unidos (fermentao do milho). Os outros pases produtores so o Canad, a China, a Unio Europeia (Frana e Alemanha) e a ndia. Embora um litro de etanol fornea bem menos energia que um litro de gasolina (66%), sua maior octanagem melhora o desempenho das misturas etanol-gasolina. At que ponto o etanol ser capaz de substituir a gasolina? A resposta depender da tecnologia disponvel, do processo produtivo e do preo do petrleo. Estima-se que, no Brasil, o bioetanol de cana-de-acar seria competitivo com o barril de petrleo a US$ 30-35; nos Estados Unidos, onde o etanol se produz a partir de milho, isso ocorreria com o barril de petrleo a US$ 55-80. Por outro lado, o desvio de matrias-primas alimentcias, como o milho ou o leo de soja, para a produo de biocombustveis levanta forte controvrsia porque redunda no aumento do preo dos alimentos, penalizando os setores mais pobres da populao. Tambm preocupa a expanso dos cultivos agroindustriais, favorecendo o desmatamento e afetando a biodiversidade. A soluo parece estar na obteno de etanol a partir de resduos lignocelulsicos, uma tecnologia complexa que ainda est em desenvolvimento (Figura 10.1). FIGURA 10.1. As etapas necessrias para a produo de etanol a partir de diferentes matriasprimas.

BIOMASSA AMILCEA

BIOMASSA SACARINA

BIOMASSA CELULSICA

Hidrlise enzimtica

Hidrlise cida ou enzimtica

CALDO AUCARADO FERMENTESCVEL

Fermentao Destilao

ETANOL

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O ETANOL A produo por via fermentativa A produo de etanol pela via biotecnolgica envolve a ao fermentativa de leveduras sobre um substrato adequado: cana-de-acar, beterraba aucareira, sorgo aucareiro, milho. No Brasil, a matria-prima a cana-de-acar (Figura 10.2). FIGURA 10.2. A produo de etanol a partir da cana-de-acar.
LAVOURA Transporte

CANA-DE-ACAR

Triturao e extrao

CALDO, GARAPA OU MOSTO

BAGAO Combustvel

LEVEDURAS Reaproveitamento Fermentao MELAO

ACAR

CO2

VINHO

LEVEDURAS Rao animal

Destilao

FLEGMA Retificao

VINHAA Fertilizante

ETANOL HIDRATADO Deshidratao

ETANOL ANIDRO

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Aps a colheita, a cana transportada at a usina onde triturada, separando o caldo do bagao. Este utilizado como combustvel, gerando calor e eletricidade para o prprio estabelecimento. O caldo se reserva produo de acar ou de etanol. Um subproduto da produo de acar, o melao, reincorporado ao processo produtivo de sacarose ou misturado ao caldo de cana para a obteno de etanol. Antes de dar incio fermentao, se acrescentam no caldo os nutrientes e antisspticos necessrios, ajustando-se tambm outros parmetros, como a temperatura e o pH. O processo fermentativo ocorre nas dornas (biorreatores) por obra das leveduras, naturais ou selecionadas. A conduo do procedimento, contnua ou descontnua, depende do estabelecimento assim como da complexidade e automao dos equipamentos disponveis. Concluda a fermentao, recuperam-se as leveduras por centrifugao, com vistas a uma posterior reutilizao e/ou produo de rao animal. Da destilao do vinho se obtm a flegma, um lquido com lcool em maior concentrao, e um resduo denominado vinhaa ou vinhoto, que deve ser tratado antes de despejado no ambiente. A retificao, isto , a eliminao das impurezas da flegma, gera o lcool hidratado, que convertido em lcool anidro por desidratao. A substituio da gasolina o caso do Brasil No Brasil, 63% da energia provm de fontes renovveis: grandes hidroeltricas (42%), madeira (10%), cana-de-acar (9%), outras (2%). A contribuio da cana-de-acar est diretamente relacionada com o uso do etanol como combustvel. Calcula-se que 60% da cana-de-acar plantada no Brasil se destina produo de etanol por fermentao. Em outros pases se utilizam matrias-primas diferentes, tais como a beterraba aucareira (Unio Europeia) ou o milho (Estados Unidos). A desvantagem das matrias-primas amilceas que demandam um tratamento enzimtico (sacarificao) antes da fermentao (Figura 10.1). O aumento do preo do petrleo durante a crise da dcada de 1970 mostrou a necessidade de ter outras fontes para substituir a gasolina. Em 1975, o Brasil instituiu o Programa Nacional do lcool (Pr-lcool) visando a produo de etanol como combustvel alternativo para os carros de passeio. Pouco tempo depois, na dcada de 1980, 5.000.000 de carros funcionavam com etanol (94% de etanol, 6% de gua) e outros 9.000.000 com uma mistura de lcool e gasolina (78% de gasolina, 22% de lcool). Em 1989, a queda do preo do petrleo e os problemas inerentes ao prprio Pr-lcool (subsdios, baixa produtividade) provocaram uma crise de desabastecimento, abalando seriamente o programa. Reativado na dcada de 1990, desta vez obedecendo a critrios de produtividade tanto na lavoura como na indstria, o programa deixou de receber subsdios. Hoje, mais de trs milhes de carros so movidos com lcool hidratado, enquanto o lcool anidro se aditiva gasolina em uma proporo que varia entre 20 e 24%, dependendo da relao oferta/procura. A introduo, em 2003, da tecnologia flexfuel, que permite abastecer os carros tanto com gasolina como com lcool hidratado, deixa ao consumidor a possibilidade de escolher o combustvel em funo de consideraes econmicas e ambientais. A produo de etanol no Brasil chegou a 24 bilhes de litros em 2009, estimando-se que ser de 36 bilhes de litros em 2012. O setor sucroalcooleiro de hoje um enorme complexo industrial com mais de 400 indstrias, com participao de vrias multinacionais em um mercado consolidado atravs de ciclos de aquisies e fuses. As pequenas usinas foram suplantadas por outras, tecnologicamente aprimoradas, que desenvolvem sistemas de produo integrados.

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Lentamente, a mecanizao da colheita elimina a necessidade das queimadas e modifica as condies de trabalho nos canaviais. Alm de etanol, as instalaes industriais fabricam aglomerado, rao animal, adubo, celulose etc. O aproveitamento do bagao fundamental porque permite gerar a energia necessria para o funcionamento das usinas e inclusive export-la, aumentando a matriz energtica renovvel do pas. A obteno de variedades de cana-de-acar com diferentes perodos de desenvolvimento (rpido, mdio e tardio) assim como o plantio sequencial diminuem as flutuaes na oferta de matria-prima. O projeto Genoma-cana, uma parceria entre a Fapesp (Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo), vrias universidades e o setor sucroalcooleiro, ir facilitar a curto prazo o melhoramento da planta (teor de acar, resistncia a pragas, resistncia seca). Encontra-se em andamento o melhoramento das leveduras, procurando desenvolver microrganismos mais produtivos e tolerantes ao etanol, ou com caractersticas (floculao) que facilitem sua recuperao uma vez concluda a fermentao. O BIOGS A biodigesto anaerbia Em condies aerbias, a digesto microbiana da matria orgnica produz gua (H 2O) e dixido de carbono (CO2). Em condies anaerbias, a ao de vrios grupos de microrganismos forma como produtos finais: metano (CH4), dixido de carbono (CO2) e gua (Figura 10.3). Nos ambientes confinados de pntanos e sepulcros, o gs formado gera alguns fenmenos assustadores de combusto espontnea (luzes dos cemitrios). Mas, nas condies mais controladas de um aterro sanitrio ou de um biorreator (= biodigestor), o gs acumulado poder ser utilizado como combustvel (biogs). O processo fermentativo (biodigesto) se desenvolve sobre resduos rurais (esterco), agroindustriais (vinhaa, efluentes das indstrias de laticnios e dos matadouros), domsticos ou comunitrios (lama de esgotos) e, tambm, sobre plantas (aguap). A matria-prima se coloca no biodigestor, em anaerobiose e a um pH neutro (6,7-7,7), evitando-se a presena de substncias solventes ou de inseticidas porque prejudicam o desenvolvimento do processo. Segundo a temperatura do biodigestor, haver uma multiplicao de bactrias mesfilas (35 0C) ou termfilas (550C) que, respectivamente, processaro a matria-prima em 15-30 dias ou em 12-14 dias. A segunda opo libera mais biogs, mas requer maior consumo de energia e um monitoramento cuidadoso, porque as bactrias termfilas no suportam bem as variaes de temperatura. Como o processo de decomposio anaerbia envolve a sucesso biolgica de vrias populaes naturais de microrganismos, as melhoras tecnolgicas visam exclusivamente a engenharia do processo. Este pode ser conduzido tanto de maneira descontnua como contnua, em biodigestores especialmente construdos para permitir o abastecimento dirio de matria-prima e a retirada de biogs. Existe um nmero grande de modelos de fermentadores, desde os muito simples (modelos tailands, chins, indiano) at os automatizados, que processam um volume grande de matriaprima. O biogs pode ser usado diretamente ou armazenado. Entre as aplicaes possveis est o abastecimento do consumo domstico (foges, lampies ou aquecedores), a gerao de energia eltrica e o acionamento de motores de veculos. Da biodigesto, restam dois resduos. Um deles um material slido fibroso que, uma vez compostado e prensado, se usa como solo artificial para o cultivo de plantas ou para melhorar a qualidade do solo. O outro um efluente lquido, que se aproveita como adubo. (Figura 10.4).
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FIGURA 10.3. A biodigesto em condies aerbias e anaerbias.

RESDUOS ORGNICOS VEGETAIS E ANIMAIS

O2

MOLCULAS ORGNICAS SIMPLES

ACETATO

Aerobiose

Anaerobiose

H2O

CO2

H2O

CH4 BIOGS

CO2

FIGURA 10.4. As complexas etapas da produo de biogs dentro do biodigestor.

MATRIA-PRIMA

MOLCULAS COMPLEXAS Microrganismos fermentativos MOLCULAS SIMPLES Bactrias acidognicas CIDOS E LCOOIS Bactrias acetognicas ACETATO Bactrias metanognicas BIODIGESTOR

BIOGS

MATERIAL SLIDO FIBROSO + EFLUENTE LQUIDO

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A utilizao do biogs O biogs est formado por 50-65% de metano e 35-50% de dixido de carbono, com traos de gs sulfdrico (corrosivo), nitrognio, oxignio e hidrognio. O poder calorfico menor que o do gs natural, um combustvel fssil cuja composio inclui metano, etano, propano e butano (Tabela 10.3). A primeira fbrica de biogs comeou a funcionar em 1859 em Bumbai (ndia). A iniciativa alcanou bastante sucesso de modo que, em 1980, a ndia contava com 150.000 biodigestores. Talvez seja esta uma das razes pelas quais se considere a digesto anaerbia como um processo biotecnolgico adequado a pequenas cidades e comunidades rurais. No entanto, a produo de biogs pode alcanar outra dimenso se for encarada como uma tecnologia moderna que visa a produo de calor e de eletricidade (Figura 10.5). Em 1995, quando contabilizava mais de cinco milhes de pequenos biodigestores rurais, a China teve o empenho de construir reatores tecnologicamente avanados, para o tratamento de rejeitos urbanos e a gerao de eletricidade. A Dinamarca o lder mundial na produo de biogs, estando bem desenvolvida a tecnologia em outros pases como os Estados Unidos, a Alemanha, a Frana, o Japo e a Sucia. Na Amrica Latina, algumas pequenas comunidades contam com geradores de biogs que as abastecem com energia suficiente para cozer os alimentos ou alimentar um motor. Contudo, nos ltimos anos surgiram vrios projetos ambiciosos de explorao do potencial existente nos aterros sanitrios urbanos (Olavarra, Argentina; Bandeirantes, Nova Iguau e Petrpolis, Brasil; Santiago, Chile; Monterrey, Mxico; Maldonado, Uruguai). O tratamento dos rejeitos agroindustriais, especialmente da indstria aucareira e da suinocultura, tambm uma fonte considervel de biogs. Cuba conta com mais de 100 fbricas produtoras de biogs.

TABELA 10.3. O poder calorfico de vrios combustveis.


GS Butano Propano Metano PODER CALORFICO (Kcal/m3) 28.000 22.000 8.500 GS Gs natural Biogs Gs de cidade PODER CALORFICO (Kcal/m3) 7.600 5.500 4.000

FIGURA 10.5. As utilizaes do biogs.


BIOGS

PLANTAS PURIFICADORAS E DE ARMAZENAMENTO

ENERGIA TRMICA

ENERGIA ELTRICA COMBUSTVEL

TRANSPORTE AUTOMOTOR
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O BIODIESEL A transesterificao O biodiesel um combustvel composto por steres (etlicos ou metlicos) produzidos na reao qumica de transesterificao entre leos vegetais e lcool (etanol ou metanol), em presena de um catalisador inorgnico ou enzimtico (lpases) (Figura 10.6). FIGURA 10.6. A reao de transesterificao. H2C O CO R HC O CO R H2C O CO R
Triglicerdeos lcool

CH2OH + 3R OH HCOH CH2OH


Glicerol steres

3R O CO R

A reao deixa como subproduto o glicerol (5 a 10% do produto bruto), que aproveitado por algumas indstrias (alimentos, cosmtica, medicamentos). Aumentar a produo de biodiesel significa ampliar o leque de aplicaes porque, diferente do bagao de cana, o glicerol gera uma substncia txica (acrolena) quando queimado. O biodiesel fornece entre 88 e 95% da energia do diesel, mas quando misturado com o diesel convencional (B1 com 1% de biodiesel a B20 com 20% de biodiesel) aumenta a qualidade do combustvel, diminuindo a emisso de partculas poluentes e gases txicos na atmosfera. A produo de biodiesel A produo de biodiesel est localizada principalmente na Unio Europeia (60%) e, em menor parte, nos Estados Unidos, na China, na Indonsia e na Malsia. A matria-prima variada: soja nos Estados Unidos, canola na Unio Europeia e no Canad, soja e girassol na Argentina, dend na sia. No Brasil, tem-se experimentado soja, mamona, babau, dend, girassol, milho, amendoim, pinho-manso etc. A implementao do Programa Nacional de Produo e Uso de Biodiesel (PNPB) estimula a produo sustentvel, enfatizando a incluso social e o desenvolvimento regional. Desde janeiro 2010, adiciona-se no Brasil 5% de biodiesel ao diesel convencional, estimando-se que a proporo aumente a 20% at 2020. Restam alguns pontos a considerar, especialmente em relao utilizao de matrias-primas como a mamona, com o intuito de estimular o pequeno agricultor. Em princpio, o biodiesel carbono-neutro. No entanto, diferente do etanol de cana, o sistema produtivo seria carbononegativo, quando se leva em conta a energia necessria para adubao e irrigao da terra, a movimentao da maquinaria agrcola, o armazenamento e transporte da matria-prima e dos produtos etc. Do ponto de vista energtico, os sistemas produtivos mais eficientes seriam os associados aos complexos agroindustriais (soja, milho, girassol), embora apresentem o grave defeito de desviar para a produo de energia as matrias-primas de alimentos e raes.

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PERSPECTIVAS Cunhado recentemente, o conceito abrangente de biorrefinaria se refere a um complexo industrial com instalaes para o processamento biotecnolgico, qumico, fsico e trmico da matria-prima renovvel, transformando-a em numerosos intermedirios qumicos e bioqumicos que alimentaro um conjunto de linhas de produo muito diversificado. A primeira gerao de biocombustveis abrange o etanol (acar de cana-de-acar ou beterraba, amido de milho) e o biodiesel (leos vegetais). A segunda gerao de bioetanol utilizar biomassa lignocelulsica proveniente dos resduos agroindustriais, tais como bagao e folhas de cana, palha e sabugo de milho, serraduras e aparas de madeira etc. A maior dificuldade reside na prpria estrutura da matria-prima lignocelulsica. A celulose (polmero de hexoses) e a hemicelulose (polmero de hexoses e de pentoses) se encontram circundadas por lignina, uma substncia de suporte das plantas, sendo necessrio um prtratamento que as separe, possibilitando a hidrlise enzimtica e a liberao de acares fermentescveis (hexoses e pentoses). Equipamentos com o design apropriado e enzimas celulolticas (celulases e hemicelulases) para uso industrial j esto a caminho. Algumas indstrias funcionam experimentalmente na Sucia, na Espanha, na Dinamarca, no Canad e nos Estados Unidos. Estima-se que o Brasil poder contar com uma instalao piloto em 2012. Tambm se investe em processos termoqumicos em que o gs de sntese obtido por combusto da biomassa convertido em etanol, por catlise ou ao microbiana. Em relao ao biodiesel, h bastante expectativa no uso de algas para a produo de hidrocarbonetos e triacilglicerdeos, porque permitiriam dedicar terras frteis e gua doce para a produo de alimentos. A adio de bioquerosene ao querosene diminuiria os custos do combustvel de avio. Recentemente instalada no interior paulista, a empresa norteamericana Solazyme espera obter, at o fim de 2013, 50 milhes de toneladas de leo a partir de algas. Em outra linha de trabalho (biologia sinttica), e com bastantes possibilidades de sucesso, se modifica o metabolismo da levedura de modo a direcion-lo para a produo de molculas interessantes para a rea de energia (biodiesel) e de qumica fina (Amyris do Brasil, Crystalsev, Santelisa, Vale, Boa Vista). Com a liberao comercial no Brasil de uma levedura transgnica que sintetiza farneseno, um precursor do biodiesel, a partir de cana de acar, se espera que a partir de 2011 sejam fabricadas 2 milhes de toneladas do biocombustvel.

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11. BIOTECNOLOGIA E MEIO AMBIENTE

O DESENVOLVIMENTO SUSTENTVEL Qual o impacto das atividades humanas sobre o meio ambiente? Que legado deixaremos para as prximas geraes? a partir destas perguntas que emerge o conceito de desenvolvimento sustentvel, definido como a capacidade de atender s necessidades do presente sem comprometer a capacidade das geraes futuras em atender suas prprias necessidades (Informe Brtland, 1987). O desenvolvimento sustentvel depende das aes realizadas nas reas econmica, social e ambiental. Este o consenso alcanado ao longo de quase duas dcadas e de vrias conferncias internacionais (Rio de Janeiro, 1992, e Agenda 21; Kyoto, 1997; Johanesburgo, 2002; Copenhague, 2009; Cancn, 2010; Durban, 2011). Contudo, os relatrios publicados em 2007 pelo Painel Intergovernamental sobre Mudanas Climticas (IPCC, da sigla em ingls) das Naes Unidas apontaram a responsabilidade do homem no futuro do planeta, mostrando que no podemos seguir protelando aes concretas de proteo do meio ambiente. Qual a contribuio das biotecnologias para o desenvolvimento sustentvel? Em relao economia, as biotecnologias diminuem os custos no s da matria-prima como da produo industrial, com processos e produtos novos e/ou de maior valor agregado. Na rea social, se espera que o desenvolvimento de novas plataformas tecnolgicas possibilite a conservao ou a criao de empregos. E na rea ambiental, as biotecnologias cumprem um importante papel na preveno, remediao e monitoramento da contaminao. AS TECNOLOGIAS LIMPAS Lentamente, a sociedade comea a aceitar que prefervel no contaminar a ter que desenvolver mtodos para limpar o ambiente. No contexto das chamadas "biotecnologias brancas", vrias tecnologias limpas podem substituir outras mais poluentes, ajudando tambm a reduzir o volume de resduos domsticos, agrcolas e industriais. A SUBSTITUIO DE PROCESSOS INDUSTRIAIS A primeira opo para diminuir a poluio a tecnologia enzimtica, porque comporta a substituio de alguns processos e produtos industriais por outros menos agressivos ao meio ambiente. Diferentemente dos catalisadores no biolgicos, as enzimas so especficas, no txicas e biodegradveis. Como agentes biolgicos, as enzimas tornam os processos produtivos mais limpos e seguros, diminuindo o consumo de energia e a quantidade de resduos. O desenvolvimento de enzimas ativas a altas temperaturas, em solventes no aquosos e em slidos, poder futuramente expandir suas aplicaes. Aplica-se a tecnologia enzimtica em setores muito diversos, alguns dos quais reconhecidamente poluentes, tais como as indstrias de alimentos, raes, detergentes, txteis, papel e celulose, couros etc. Nos curtumes, por exemplo, o uso de enzimas reduz em 40% o consumo de derivados do enxofre, ao tempo que produz couro de melhor qualidade. A introduo de at oito enzimas nos detergentes evita a fervura das roupas, diminuindo o consumo de energia e facilitando a retirada das manchas.

Copyright Maria Antonia Malajovich Biotecnologia: ensino e divulgao (www.bteduc.bio.br)

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Os plsticos representam uma frao significativa (20% v/v) do lixo dos pases industrializados, sendo a maior parte proveniente das embalagens convencionais da indstria de alimentos. Alm de permanecerem por longo tempo na natureza, sua fabricao envolve uma matria-prima no renovvel (petrleo) e um processo muito poluente que gasta uma quantidade grande de energia. Em curto ou mdio prazo, esses plsticos convencionais podero ser substitudos por polmeros de origem bacteriana ou vegetal, compostveis em poucos meses. Uma das vantagens das embalagens bioplsticas de alimentos que degradam junto com os restos de comida, dispensando as etapas de triagem e limpeza. A indstria de papel e celulose outro caso a considerar. O Brasil conta com 1,5 milho de hectares de florestas plantadas, basicamente, com eucaliptos (60%) e pinos (30%). A atividade industrial gera 100.000 empregos diretos em 450 municpios, e as exportaes alcanam o valor de US$ 2,8 bilhes. A madeira est composta por celulose, hemicelulose e lignina. Aproximadamente 90% desta ltima eliminado mediante um tratamento a altas temperaturas, realizado em meio alcalino. A lignina restante (10%) confere uma cor escura caracterstica ao produto resultante, ou pasta Kraft, que utilizada na fabricao de carto e papel pardo. O branqueamento requer um tratamento especfico com oxignio e cloro, formando-se derivados clorados txicos. Um procedimento alternativo o biopulping, em que uma enzima (xilanase) degrada o xilano da hemicelulose, facilitando a eliminao da lignina que lhe est associada (Figura 11.1). O sequenciamento do genoma do eucalipto facilitar o melhoramento da qualidade da madeira, especialmente visando aumentar a proporo celulose/lignina em rvores de crescimento rpido. O sequenciamento do genoma do fungo Phanerochaete chrysosporium ("podrido branca") revelou a existncia de mais de 240 genes codificadores de enzimas extracelulares que esto envolvidas na degradao de carboidratos. Este fungo o mais eficiente na degradao da madeira, sendo utilizado tambm na eliminao de numerosos poluentes de origem orgnica, assim como no branqueamento da polpa de papel e de txteis. FIGURA 11.1. A indstria de papel e de celulose.
O branqueamento da pasta Kraft admite tratamentos qumicos (cloro) e biolgicos (xilanase); estes ltimos diminuem a carga poluidora do efluente. MADEIRA Lignina + celulose + hemicelulose Extrao alcalina a alta temperatura

Lignina (90%)

PASTA KRAFT Lignina (10%) + celulose + hemicelulose Branqueamento com xilanase Eliminao da lignina

Branqueamento com cloro Derivados clorados da lignina

POLPA BRANCA EFLUENTE EFLUENTE

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Na fabricao do papel, o amido utilizado para conferir rigidez massa e melhorar o acabamento. O amido est composto por cadeias de amilose e de amilopectina, sendo estas ltimas as que apresentam interesse industrial. No Brasil, se aproveita o amido de mandioca porque contm menos amilose que o de milho ou de batata. Recentemente aprovada pela Comisso Europeia, a batata geneticamente modificada Amflora (BASF Plant Science) produz amido de alta qualidade, com 100% de amilopectina, sendo desnecessrio eliminar a amilose. Separada fisicamente da batata destinada ao consumo humano ou animal, este tubrculo se destina ao uso industrial de tecidos e papel. A SUBSTITUIO DE INSUMOS AGRCOLAS Um segundo conjunto de tecnologias limpas visa a substituio parcial de alguns insumos utilizados na agricultura, tais como os fertilizantes e praguicidas. A intensa aplicao de fertilizantes agrcolas, derivados do petrleo, tem consequncias negativas porque uma parte do nitrognio (N) e do fsforo (P) no absorvida pelas plantas e acaba sendo arrastada pelas chuvas at os rios e as reservas de gua. O excesso de nutrientes estimula a proliferao de algas, consumindo o oxignio dos cursos de gua e produzindo toxinas que afetam os peixes e o gado. Microrganismos vs fertilizantes qumicos O nitrognio um nutriente indispensvel para os cultivos vegetais porque faz parte da composio das protenas e dos cidos nucleicos. Encontra-se na atmosfera como N2 e no solo como nitrato, resultante da decomposio da matria orgnica ou proveniente dos fertilizantes agrcolas. Alguns microrganismos livres (Azotobacter, Azospirillum), ou simbiontes (Rhizobium ou Bradirhizobium) que vivem nos ndulos das razes das leguminosas (soja, feijo), podem fixar diretamente o nitrognio atmosfrico em uma forma utilizvel pelas plantas. Inoculando as sementes com rizbios, por exemplo, diminuir-se- a quantidade de nitrognio a ser acrescentada no solo. Trata-se de uma prtica muito simples, facilitada pela produo industrial de microrganismos selecionados para aplicao antes do plantio. A inoculao feita misturando o produto com as sementes umedecidas em tambores ou betoneiras, antes do plantio. No Brasil, vrias empresas nacionais e estrangeiras produzem inoculantes para leguminosas: BioAgro, Bio Soja, Microqumica, Nitral Urbana, Turfal, Stoller, Total Biotecnologia, Rizobacter etc. A maioria destas empresas est localizada no Paran e Rio Grande do Sul. A extenso das pesquisas sobre fixao de nitrognio s gramneas forrageiras, cereais e canade-acar, iniciadas por Johanna Dbereiner (Embrapa) na segunda metade do sculo XX, permite dispensar parcialmente a aplicao de nutrientes qumicos, com a correspondente economia de recursos. O fsforo se origina a partir das rochas do solo e da decomposio dos seres vivos. Nos solos cidos caractersticos das regies tropicais, a maior parte dos fosfatos (95-99%) forma compostos minerais ou orgnicos insolveis que no so acessveis diretamente s plantas. Por isso, o fsforo se torna um nutriente limitante para o crescimento das plantas. Os micorrizos so associaes simbiticas entre fungos e razes vegetais; os primeiros absorvem os nutrientes minerais e a gua do solo, transferindo-os para a planta hospedeira. A inoculao dos solos ou micorrizao uma tecnologia agrcola associada ao reflorestamento de pinos e eucaliptos, eliminando ou diminuindo a necessidade de se acrescentar fsforo. Muitas espcies de fungos micorrzicos so comestveis e vrios gneros so comercializados a nvel mundial: Tuber, Tricholoma, Boletu, Cantharellus, Morchella, Lactarius e Suillus.
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Alm dos fertilizantes agrcolas, outra das causas de liberao excessiva de fsforo no ambiente a criao intensiva de animais. Os porcos e as aves no conseguem metabolizar o fitato, um derivado presente nas raes, mas a complementao destas com uma enzima (fitase) tem um efeito importante no ambiente, porque ao reduzir em mais de 30% a quantidade de fsforo excretado, diminui a contaminao dos lenis de gua. A fitase produzida industrialmente por um microrganismo geneticamente modificado. A genmica poder vir a dar um novo impulso a esta rea de vital importncia. Manejo integrado de pragas vs agrotxicos Prticas agrcolas como a utilizao de variedades selecionadas e a rotao dos cultivos reduzem substancialmente a necessidade de aplicar pesticidas sintticos. O controle biolgico d um passo alm, visando a preservao das plantaes e a salvaguarda da produo de alimentos mediante a substituio dos praguicidas qumicos por alternativas biolgicas, tais como bactrias, fungos e vrus entomopatognicos. Observe-se que em seu clssico livro A Primavera Silenciosa, de 1972, a pesquisadora Rachel Carson j alertava para os danos causados pelo uso do DDT, recomendando a procura de solues de cunho biolgico. Anos mais tarde, contamos com numerosos exemplos de substituio de pesticidas por agentes biolgicos especficos (Tabela 11.1). Um deles a aplicao, nas lavouras de soja, de partculas de baculovirus, um organismo que normalmente infecta e mata as lagartas (Anticarsia gemmatalis) que parasitam essa planta. Outro a pulverizao de esporos do fungo Metarhizium anisopliae para lutar contra a cigarrinha-da-folha-da-cana-de-acar ou a broca-dos-citros. Contudo, o exemplo mais conhecido dessa tecnologia verde envolve a bactria do solo Bacillus thuringiensis ou Bt. Esta utilizada como pesticida agrcola h mais de trinta anos, sem que suas toxinas tenham causado danos s pessoas, vida silvestre ou maioria dos insetos benficos. Com o desenvolvimento da engenharia gentica, os genes correspondentes foram transferidos a vrias plantas (milho, algodo etc.) que agora produzem diretamente a toxina inseticida. TABELA 11.1. Alguns exemplos de utilizao de agentes biolgicos como pesticidas.
AGENTE BIOLGICO Fungo Metarhizium anisopliae Fungo Beauveria bassiana Bactria Bacillus thuringiensis var kurstaki Bactria Bacillus thuringiensis var israelensis Bactria Bacillus sphaericus PRAGA COMBATIDA Cigarrinha-da-folha-da-cana-de-acar (Mahanarva posticata), cigarrinha-daraiz-da-cana-de-acar (Mahanarva fimbriolata), cigarrinha-das-pastagens (Deois flavopicta). Diversas, florestais. Lagartas desfolhadoras de grandes culturas e reflorestamentos. Larvas do mosquito da dengue (Aedes aegypti, transmissor da dengue e da febre amarela) e dos borrachudos (Simulium spp.). Larvas do mosquito prego (Anopheles spp., transmissor da malria) e do mosquito urbano ou pernilongo (Culex spp., transmissor da encefalite e da filariose). Lagarta-da-soja (Anticarsia gemmatalis). Lagarta-do-cartucho-do-milho (Spodoptera frugiperda). Broca-da-cana-de-acar (Diatraea saccharalis).

Vrus Baculovrus anticarsia Vrus Baculovrus spodoptera Vespa Cotesia flavipes

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Atualmente, existem numerosos produtos a base de Bacillus thuringiensis comercializados com diferentes nomes (Bac-control, Bactur, Dipel, Ecotech Pro, Thuricide etc.) por vrias empresas nacionais e estrangeiras (Vectorcontrol, Milenia, Sumitomo, Bayer, Iharabras etc.). A utilizao do controle biolgico, baseado no conhecimento da ecologia dos agroecossistemas, constitui o que se denomina Manejo Integrado de Pragas (MIP). No Brasil, deve-se destacar o trabalho da Embrapa e de vrias universidades no desenvolvimento desta rea. Alm de biopesticidas, no controle biolgico tambm se utilizam feromnios, armadilhas e atrativos alimentares. Alguns procedimentos so econmicos e muito engenhosos, como o desenvolvido em Cuba para combater o tetun del camote, um gorgulho (Cylas formicarius) que ataca a batata-doce. Pendura-se na plantao uma lata com uma pequena quantidade de feromnio, pulverizando em redor esporos do fungo Beauveria bassian. Atrados pelo feromnio, os machos se aproximam da lata e so contaminados mortalmente pelo fungo, que incuo para os seres humanos, os animais e as plantas. Para Cuba, a experincia de vrias dcadas de trabalho com controle biolgico resultou crucial quando, devido ao embargo propiciado por Estados Unidos, o pas teve que substituir o uso de agrotxicos nas lavouras. Atualmente, o programa cubano de controle biolgico de pragas envolve laboratrios regionais, estaes de defesa vegetal, postos equipados com laboratrios de diagnsticos e mais de 200 centros de reproduo de entomfagos e entomopatgenos. A REDUO DOS RESDUOS A degradao do lixo (resduos slidos) e o tratamento de esgoto (resduos lquidos) so dois exemplos tradicionais de prestao de servios da biotecnologia tradicional nem sempre valorizados, apesar do imenso volume de matria que transformam e de sua relevncia para o meio ambiente. A DEGRADAO DO LIXO Em condies adequadas, todos os compostos naturais podem ser biodegradados. As populaes microbianas mistas do ambiente degradam as substncias orgnicas atravs de numerosas reaes, sem que sejam necessrios cuidados asspticos ou culturas puras. Em condies aerbias, os produtos finais da mineralizao da matria orgnica so dixido de carbono (CO2) e gua; em condies anaerbias, forma-se biogs. Na compostagem, uma etapa intermediria da mineralizao, os prprios microrganismos do lixo degradam a matria orgnica previamente fragmentada e misturada (Figura 11.2). Ao comear a biodigesto, a liberao de energia causa um aumento de temperatura que elimina a maioria dos microrganismos indesejveis (sanitizao). medida que a atividade microbiana decresce, o sistema se estabiliza e amadurece at perder todo o seu potencial de biodegradao. As condies do processo so otimizadas mediante o controle de alguns parmetros tais como a relao carbono/nitrognio, o oxignio, a umidade e a temperatura. O processo pode ser conduzido em sistemas simples (pilhas ao ar livre), ou complexos (silos, biorreatores), sendo necessrio, em ambos os casos, remover manual ou mecanicamente o material, para assegurar a aerao durante o processo de biodigesto. O tratamento dos resduos slidos urbanos (RSU) em usinas de compostagem um procedimento alternativo incinerao e ao depsito em lixes e aterros sanitrios. Nesses estabelecimentos, a separao prvia dos componentes permite a reciclagem de alguns materiais (metais, vidro etc.). A biodegradao aerbia ou mineralizao dos restos orgnicos os transforma em um "composto" utilizado no melhoramento de solos, em atividades de reflorestamento, para colmatar terrenos, para combater a eroso etc.
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Por outro lado, a decomposio in natura do lixo nos aterros sanitrios cria uma zona de anaerobiose onde se produz biogs. Este liberado na atmosfera, onde contribui para o efeito estufa e o aumento da temperatura, afetando o clima. O TRATAMENTO DAS GUAS RESIDUAIS O esgoto est constitudo por excrementos (fezes e urina), guas de uso domstico (banho, lavagem de roupas etc.) e, eventualmente, alguns dejetos de origem industrial. Ao ser liberado diretamente nos cursos de gua, o esgoto desestabiliza as populaes microbianas, que se multiplicam rapidamente consumindo o oxignio dissolvido e ocasionando a morte de peixes e crustceos. FIGURA 11.2. A compostagem.
LIXO ORGNICO

AR

GUA

FONTE DE NITROGNIO

Fragmentao e mistura das partculas Aumento da temperatura (sanitizao) BIODIGESTO AERBIA Diminuio e estabilizao da temperatura Maturao

CALOR

CO2

GUA

OUTRAS SUBSTNCIAS

COMPOSTO

FIGURA 11.3. O tratamento das guas residuais.

ESGOTO
Gradeamento Tanque de areia

Fossas spticas Lagoas de oxidao Filtros de gotejamento (1) Tanque de sedimentao EFLUENTE EFLUENTE

Tanque de sedimentao

Lodo Lodo ativado (2 ) Lodo EFLUENTE Biodigestor anaerbico RESDUO SLIDO Lodo

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Na biodegradao das guas do esgoto participam vrias populaes naturais. Os microrganismos aerbios (bactrias e protozorios ciliados) mineralizam parte da matria orgnica do efluente. As bactrias anaerbicas procedem biodigesto dos lodos, permitindo a obteno de biogs e a remoo de alguns nutrientes (N e P principalmente) que poderiam criar desequilbrios ecolgicos. O tratamento do esgoto envolve mtodos fsicos, qumicos e biolgicos (Figura 11.3). O processo ocorre em pelo menos trs etapas: o Tratamento primrio. O esgoto passa por um processo de filtrao que remove objetos grandes, lixo e areia. No tanque de sedimentao, a gordura sobrenadante separada do lodo sedimentado, que pode ser transferido a um biodigestor. o Tratamento secundrio. O lquido efluente do tanque de sedimentao pode ser tratado de vrios modos: Em lagoas de baixa profundidade. Em filtros de gotejamento (1), colonizados pelos prprios microrganismos do esgoto que se desenvolvem digerindo a matria orgnica do meio. Em tanques de lodo ativado (2), onde o meio agitado e oxigenado mediante a injeo de ar comprimido. Um segundo tanque de sedimentao separa o efluente do lodo. o Tratamento tercirio. Este realizado para eliminar substncias inorgnicas e orgnicas, envolvendo procedimentos como a filtrao, a volatilizao da amnia, a precipitao de fosfato etc. o Tratamento avanado. A degradao microbiana dos resduos orgnicos diminui consideravelmente a carga de microrganismos patognicos liberada no ambiente, mas no a elimina totalmente. S alguns mtodos adicionais como a clorao, a irradiao UV e o tratamento com oznio eliminam microrganismos patognicos recalcitrantes. O TRATAMENTO DOS EFLUENTES INDUSTRIAIS Alm de fundamental para a populao e o ambiente, o tratamento dos efluentes industriais estratgico para o melhoramento da imagem das indstrias mais poluentes, entre as quais figuram as qumicas, as papeleiras, as txteis, as de couro, as de alimentos, as de extrao de metais e minerais e as de produo de energia. A produo de etanol libera diretamente nos rios e cursos de gua um efluente (vinhaa) que provoca a eutrofizao, com consequncias nefastas para os seres vivos. Para avaliar a dimenso do problema, basta lembrar que por cada litro de lcool a indstria produz at 12 litros de vinhaa. As solues contemplam o uso de tecnologias mais eficientes que permitam reduzir o volume de vinhaa, e tambm sua biodigesto anaerbia para a gerao de fertilizante, alm de biogs e de eletricidade. Os efluentes das indstrias de laticnios so utilizados como matria-prima para o crescimento de microrganismos que so adicionados s raes animais. De forma anloga, o licor sulftico dos efluentes da indstria de papel e celulose pode ser eliminado produzindo biomassa, com o fungo Paecilomyces.

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Em relao aos resduos gasosos de processos industriais, o tratamento de compostos orgnicos volteis (VOCs, da sigla em ingls) feito mediante filtros biolgicos de diferentes tipos e complexidade tecnolgica. AS EMISSES DE GASES E O EFEITO ESTUFA Existem fontes naturais de gases, como os vulces e os cupins. Estes, devido atividade da flora intestinal simbionte que lhes permite digerir celulose, liberam 40 milhes de toneladas de metano por ano. No entanto, o homem o principal responsvel pela emisso dos gases que causam o efeito estufa, atravs de atividades como o depsito do lixo em aterros sanitrios, o cultivo do arroz, a criao de gado, a liberao de efluentes agroindustriais sem tratamento e a queima de combustveis fsseis (petrleo, gs natural e carvo). Os nveis de metano atmosfrico so hoje duas vezes maiores que na era pr-industrial, um dado preocupante se pensarmos que a contribuio do metano para o efeito estufa 20 vezes superior do dixido de carbono. Embora sua utilizao como combustvel elimine uma fonte de contaminao atmosfrica, a rentabilidade do processo nem sempre justifica o seu aproveitamento. Vrias iniciativas tendem a recuperar o metano dos aterros sanitrios e utiliz-lo como combustvel alternativo. A Amrica Latina, que emite 6% dos gases contaminantes, j est entrando neste mercado com vrios projetos de reaproveitamento do metano (aterros sanitrios, resduos agroindustriais) na Argentina, no Brasil, no Chile, em Cuba, no Mxico, no Uruguai. As iniciativas dependem de empresas privadas e/ou de organismos governamentais; alguns estudos preliminares contaram com financiamento do Banco Mundial. Em relao gasolina, a combusto dos biocombustveis (mistura gasolina-etanol ou etanol puro) emite quantidades menores de monxido de carbono (CO), xidos de enxofre (SOx), hidrocarbonetos e outros compostos poluentes. Em compensao, liberam-se aldedos cancergenos e, dependendo do motor, xidos de nitrognio (NOx). Apesar disso, estima-se que, entre 2004 e 2008, o uso de biocombustveis na frota flexfuel brasileira teria deixado de liberar na atmosfera 35 milhes de toneladas de CO2. Calcula-se tambm que, para que essa economia fosse de 530 milhes de toneladas de CO2, bastaria misturar com lcool apenas 10% da gasolina disponvel no planeta. O Protocolo de Kyoto (1997) previa a reduo da emisso de gases contaminantes (dixido de carbono, metano, xidos nitrosos e clorofluorocarbonetos). Ratificado por numerosos pases, mas no por Estados Unidos nem Rssia, que so responsveis respectivamente por 36% e 17% das emisses, o protocolo de Kyoto no teve os resultados esperados. TABELA 11.2. Os principais contaminantes do meio ambiente.
CATEGORIA Inorgnicos Orgnicos EXEMPLO Metais (cdmio, mercrio, prata, cobalto, chumbo, cobre, cromo, ferro), istopos radiativos, nitratos, nitritos, fosfatos, cianetos, asbestos. Resduos petroqumicos: petrleo, gasleo, compostos aromticos (benzeno, tolueno, etilbenzeno, xileno). Produtos sintticos: pesticidas organoalogenados como os bifeniles policlorados (PCBs) ou os hidrocarbonetos poliaromticos. Gases: dixido de enxofre (SO2), dixido de carbono (CO2), xidos nitrosos (NOx), metano (CH4). Compostos volteis: clorofluorocarbonetos (CFCs), compostos orgnicos volteis (VOCs).

Gasosos

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Contudo, criou-se um mercado paralelo da descontaminao atravs da compra e venda do Certificado de Reduo de Emisses (CER, do ingls Certificate of Emissions Reduction), que nada mais que um bnus sobre a quantidade de contaminao deixada de emitir. Deste modo, o Protocolo de Kyoto permite que, tendo superado a cota de gases a emitir, um pas continue contaminando a atmosfera se comprar bnus de um pas que no a contamina ou que reduz sua prpria contaminao. A BIORREMEDIAO Numerosas substncias, hoje presentes no ambiente, tm sido geradas pelo homem atravs da sntese qumica. Embora muitas possam ser degradadas em poucos meses por algum organismo, outras persistem na natureza por um longo tempo. Consideradas recalcitrantes, estas molculas alheias ao mundo dos seres vivos (xenobiticas) no so biodegradadas ou, quando o so, o processo muito lento. OS CONTAMINANTES Como resultado das atividades humanas, aproximadamente 2,5 milhes de toneladas de substncias qumicas perigosas so liberadas anualmente no meio ambiente (Tabela 11.2). Em alguns casos, trata-se de emisses deliberadas e regulamentadas (resduos industriais), em outros, de escapamentos acidentais (manchas de leo ou de petrleo). diferena dos resduos agrcolas e urbanos, que so biodegradados, os metais procedentes das atividades extrativas e industriais (cdmio, zinco, chumbo, selnio) permanecem no ambiente, em concentraes txicas. Sua absoro e concentrao (bioacumulao) por plantas tolerantes aos metais reduz a toxicidade do solo e facilita sua remoo em faixas de terreno pouco profundas. Existem j plantas geneticamente modificadas para transformar os compostos organomercuriais formados em diversas atividades (extrao de carvo e de ouro etc.) em uma forma voltil muito menos txica. Um problema de difcil soluo a deteco e eliminao das 60 a 70 milhes de minas antipessoais espalhadas no mundo. Uma possvel sada parece ser a utilizao de plantas de Arabidopsis transgnicas (Aresa, Dinamarca). Estas plantas, portadoras de genes microbianos, degradam a trinitroglicerina (TNT) liberando NO2, que absorvido pela planta, modificando, trs semanas mais tarde, a cor das folhas. A procura por microrganismos com caractersticas especiais o primeiro passo para resolver problemas ambientais. Alguns j conhecidos: Deinococcus radiodurans, resistente radiao; Bacillus infernus, resistente a altas temperaturas; Methanococcus jannaschi, resistente a presses de at 230 atmosferas e a altas temperaturas etc. OS TRATAMENTOS Existem vrios mtodos para retirar substncias recalcitrantes do meio ambiente (Figura 11.4). As opes contemplam a construo de barreiras fsicas, a lavagem ou ventilao do solo contaminado, e sua destruio por incinerao ou por biorremediao. Esta ltima apela para o uso de agentes biolgicos, operando com menos custo e mais rapidamente. Para que a biorremediao seja eficiente necessrio que o poluente seja transformado metabolicamente por algum microrganismo, os produtos finais sejam seguros e as condies ambientais favoream a atividade microbiana. O processo deve ter uma relao custo/beneficio interessante.
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Uma forma de biorremediao a produo de biomassa especfica no local contaminado (in situ). Do ponto de vista prtico, duas estratgias so possveis: o o Colocar microrganismos especializados no solo. Acrescentar nutrientes para estimular a ao dos microrganismos presentes no stio contaminado.

Em ambos os casos, as bactrias ou os fungos digerem o lixo perigoso transformando-o em produtos inofensivos. Uma vez consumido o material txico, os microrganismos morrem ou voltam ao seu nvel populacional normal no ambiente. Outra forma de biorremediao dos solos contaminados admite o tratamento ex situ, em que o solo escavado transferido a um biodigestor. Como a liberao de microrganismos geneticamente modificados no ambiente vista com desconfiana, sua utilizao se restringe a estes sistemas fechados. A modificao gentica dos microrganismos pode fornecer linhagens com um potencial de degradao dos contaminantes maior que o dos organismos naturais. Tambm permite o design de microrganismos que combinem vrias caractersticas de diferentes linhagens como, por exemplo, a degradao de PCBs e a sobrevivncia em uma ampla margem de temperaturas. Introduzindo os dois genes correspondentes em uma bactria incua e de fcil cultivo, essa contaminao poderia ser tratada de maneira especfica. Entre as formas de biorremediao cabe destacar a utilizao de microrganismos que sobrevivem no ambiente contaminado, por ter sistemas enzimticos capazes de digerir os poluentesalvo, ligeiramente diferentes de seus substratos normais. Esta propriedade, denominada metabolismo gratuito, possibilitou a descontaminao do Rio Savannah (Estados Unidos) de tricloroetileno (TCE), utilizado como desengordurante na fabricao de componentes de armas. Despejado no solo, o TCE contaminara as guas subterrneas, causando um problema ambiental de grandes propores. Para eliminar o contaminante, utilizou-se uma bactria que metaboliza metano, mas capaz de degradar o TCE. Ao bombear metano no solo, a bactria se multiplica; ao suspender o bombeamento, ela passa a degradar o TCE por um tempo, at que o bombeamento de metano se torna novamente necessrio. A repetio cclica do processo reduziu a contaminao a um nvel aceitvel. Esta tecnologia considerada vivel do ponto de vista comercial. FIGURA 11.4. As estratgias de biorremediao.
Microrganismos do ambiente Microrganismos selecionados Microrganismos geneticamente modificados (em sistema fechado)

MEIO CONTAMINADO

Otimizao dos fatores que estimulam a ao bacteriana (estrutura do solo, pH, aceptores de eltrons).

Suplemento de nutrientes

MEIO DESCONTAMINADO

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Os problemas que exigem biorremediao so muito pontuais, de modo que cada um deles demanda um tratamento particular. Como no h um produto a patentear, mas um servio a prestar, a tecnologia est em mos de organizaes governamentais ou de pequenas firmas que agem localmente. UM EXEMPLO: OS VAZAMENTOS DE PETRLEO Um dos mais srios problemas de contaminao ambiental o derramamento de petrleo nos mares, devido a acidentes notrios (Prestige, Exxon Valdez, Torrey Canyon, Amoco Cadiz, Braer and Sea Empress, British Petroleum) e a situaes blicas (Guerra do Golfo). As manchas de leo despejadas no mar contm compostos txicos que representam uma ameaa para a ecologia marinha e costeira, afetando todas as formas de vida aqutica e constituindo um risco para a sade do consumidor. A formao de carvo e petrleo nas profundezas da terra possvel porque, em condies anaerbias, tanto a lignina como os hidrocarbonetos so compostos qumicos estveis. Porm, em condies aerbias, ambos so degradados pelos microrganismos do ambiente. O petrleo derramado no mar flutua na superfcie, onde os componentes volteis evaporam rapidamente. O que no recuperado pelo homem, se dispersar com o movimento das ondas, permanecendo em alto-mar ou sendo levado at a costa. O petrleo derramado ser degradado pelos microrganismos naturalmente presentes no ambiente marinho, geralmente pobre em nitratos e fosfatos. Por isso, devem-se acrescentar nutrientes aos dispersantes qumicos (detergentes) ou s espumas de limpeza das rocas da costa. Estima-se que, at o momento, o solo de mais de 30.000 stios contaminados com petrleo, proveniente de vazamentos de tanques de armazenamento, tenha sido tratado por biorremediao. Uma das primeiras patentes de um ser vivo corresponde a uma bactria engenherada projetada para degradar alguns componentes do petrleo (Chakrabarty, 1971). Porm, o uso deste tipo de bactrias no teve sucesso na remoo do petrleo derramado em alguns acidentes, como o do navio Exxon Valdez no Alaska (1989). As pesquisas atuais visam preferentemente os microrganismos ambientais, especialmente Alcanivorax borkumensis, uma bactria capaz de metabolizar 70% dos compostos do petrleo, especialmente os de baixo peso molecular. O sequenciamento de seus 2.755 genes, completado recentemente, dar novas informaes sobre suas rotas metablicas e seus requerimentos de fsforo e de nitrognio. A RECUPERAO DE RECURSOS NATURAIS Os processos biolgicos tambm so utilizados para a extrao de petrleo e de metais (cobre, ouro, urnio). O PETRLEO Na extrao de petrleo, tcnicas especiais (EOR, do ingls enhanced oil recovery) envolvem o uso de polmeros de origem microbiana (xantana), para aumentar a viscosidade e facilitar o seu bombeamento. A introduo direta dos microrganismos no poo (MEOR, do ingls microrganism enhanced oil recovery) parece menos interessante do ponto de vista econmico, mas isso pode mudar se o petrleo comear a se esgotar.

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OS METAIS A extrao de metais solubilizados nas cidas e escuras guas do Rio Tinto (Andaluzia, Espanha) data do domnio romano; abandonadas durante sculos, as minas foram exploradas a partir do sculo XIX por uma empresa inglesa, hoje australiana. Em 1947, com o isolamento de bactrias quimiotrficas do gnero Thiobacillus mostrou-se que a acidificao das guas e a consequente solubilizao dos metais eram o resultado no s de uma ao qumica, mas tambm de uma ao bacteriana. As bactrias transformam os sulfetos metlicos insolveis em sulfatos solveis, mediante uma reao de oxidao que libera a energia necessria para sua reproduo e crescimento. A fixao de dixido de carbono fornece o carbono necessrio para a sntese dos componentes celulares e os requerimentos se limitam ao oxignio e a pequenas quantidades de nitrognio e fsforo. A biolixiviao se aplica especialmente extrao de cobre, ouro, zinco, nquel e cobalto. A tecnologia relativamente simples e requer pouca inverso, sendo adaptada aos pases em desenvolvimento. Na Amrica Latina, se usa a biolixiviao para a extrao de cobre (Chile, Mxico e Peru) e de ouro (Brasil, Chile e Peru). A BIOMINERAO Os Andes chilenos guardam as maiores reservas de cobre do planeta. Na poca pr-colombiana, as culturas Tiahuanaco e Inca o utilizaram na produo de bronze, uma liga de cobre e estanho. Durante o perodo colonial, a produo de cobre se manteve baixa, mas entre 1820 e 1900 extraram-se dois milhes de toneladas. Ao finalizar o sculo XIX, as jazidas com alta concentrao de cobre comearam a dar indcios de esgotamento. No sculo XX, os consrcios internacionais que dominavam a tecnologia necessria para a extrao do cobre em baixas concentraes assumiram o controle da indstria do cobre (Braden Copper Co., Kenecott Corporation, Chile Exploration Company). Segue-se um processo de chilenizao que culmina em 1971 com a nacionalizao das principais minas de cobre. Ainda hoje, o Chile o maior produtor de cobre do mundo, com 5.700 toneladas mtricas que representam 42% da produo de cobre mundial (2008). Atualmente, 36% da produo de cobre do pas est em mos da Codelco (do espanhol, Corporacin Nacional del Cobre), uma empresa estatal criada em 1976 e que emprega 16.000 pessoas. O resto produzido pelo setor privado. As primeiras experincias de biolixiviao foram realizadas entre 1950 e 1980 em Rio Tinto (Espanha), Cananea (Mxico) e Toromocho (Peru). A explorao da mina de Pudahuel (Chile, Codelco) com tecnologia nacional de biolixiviao comeou na metade da dcada de 1980. A biohidrometalurgia se estendeu rapidamente e j se encontram em funcionamento no Chile os primeiros estabelecimentos que extraem o cobre exclusivamente por biolixiviao (Cerro Colorado, Quebrada Blanca). As operaes so especialmente apropriadas para as minas de baixa qualidade ou semiesgotadas, assim como para a recuperao do cobre nos refugos existentes. A oxidao biolgica ocorre geralmente em amontoados e pilhas, recuperando-se entre 75% e 90% do cobre em perodos que oscilam de 6 a 12 meses e a um custo muito baixo. Atualmente, 5% da produo de cobre chilena depende de biolixiviao. Do desenvolvimento da biominerao participaram universidades e institutos de pesquisa, alm do setor produtivo, com apoio do governo e do PNUD (Programa das Naes Unidas para o Desenvolvimento). As pesquisas atuais contemplam o uso de microrganismos termoflicos (Sulfobolus) e a otimizao do processo de bio-oxidao.

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Fundada em 2002 por Codelco e Nippon Mining & Metals Co. Ltd., a empresa BioSigma desenvolve estudos microbiolgicos e genmicos, assim como tecnologias para a produo de biomassa. Recentemente, a empresa registrou nos Estados Unidos uma patente descrevendo um mtodo para modificar geneticamente bactrias extremfilas do gnero Acidithiobacillus, encontradas no minrio de cobre. O DIAGNSTICO DE CONTAMINAO AMBIENTAL O diagnstico de contaminao ambiental exige o monitoramento da gua, do ar e do solo. As tecnologias abrangem o uso de indicadores biolgicos, de tcnicas imunolgicas e genticas e de biossensores. INDICADORES BIOLGICOS Estes so plantas e animais capazes de acumular metais pesados e poluentes orgnicos persistentes. Determinando diretamente a concentrao do contaminante em um organismo especfico, podemos avaliar a contaminao ambiental. Uma avaliao indireta pode ser obtida a partir de outras variveis, tais como o nmero de plantas e de espcies microbianas, o nmero de indivduos nessas espcies etc. TCNICAS GENTICAS Estas se aplicam na identificao das populaes microbianas. Como ainda no sabemos cultivar em laboratrio a maior parte dos microrganismos do ambiente, uma boa parte da biodiversidade microbiana permanece desconhecida. A tecnologia do DNA facilita a identificao dessas espcies em funo das sequncias gnicas correspondentes ao RNA ribossmico (rRNA de 16S) e tambm ajuda a monitorar as mudanas nas comunidades microbianas utilizadas na remoo de poluentes, de maneira a detectar qualquer variao ambiental e restaurar rapidamente as condies timas do sistema. Microarrays adequados avaliam a expresso dos genes em uma linhagem ou uma comunidade microbiana em relao a um agente ambiental (genossensores). TCNICAS IMUNOLGICAS Estas utilizam anticorpos especficos, marcados ou associados a enzimas. As tcnicas imunoenzimticas, cujos resultados podem ser apreciados simplesmente por uma mudana de cor, resultam especialmente apropriadas para os testes de campo. Pouco a pouco esto substituindo os testes tradicionais que, alm de serem lentos, exigem um equipamento complexo, como os testes de coliformes na gua. Imunoensaios de diversos tipos permitem o monitoramento contnuo, automatizado e barato de pesticidas como o dieldrin, o parathion e os PCBs. BIOSSENSORES Estes combinam diferentes componentes biolgicos e eletrnicos imobilizados em um substrato, geralmente sob a forma de um chip. Alguns so muito seletivos, outros so sensveis a um amplo espectro de substncias.

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O componente biolgico pode ser uma enzima, um anticorpo ou um microrganismo. Respondendo a um estmulo ambiental se verifica uma mudana em suas propriedades, mudana que detectada ptica ou eletronicamente fornecendo uma medida quantitativa do contaminante (Figura 11.5). Bactrias ou leveduras imobilizadas assinalam a presena de uma determinada substncia, seja porque a metabolizam, seja porque esta inibe o prprio metabolismo microbiano. Especialmente interessante a utilizao de organismos geneticamente modificados, associando o promotor do gene de uma enzima que reage com a substncia procurada (arsnico, por exemplo) com genes indicadores (luminescncia, fluorescncia ou produo de uma substncia colorida). FIGURA 11.5. O funcionamento de um biossensor.
O sinal aumenta ou diminui em funo da concentrao do substrato contaminante, que estimula ou inibe a ao do agente biolgico. ,

Substrato Membrana Biodetector imobilizado

O substrato reage com o biodetector, originando um produto especfico Ao detectar um produto especfico, o transdutor gera um sinal eltrico
Amplificador Circuito

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12. BIOTECNOLOGIA E BIODIVERSIDADE


O conceito de biodiversidade abrange a totalidade da variao hereditria existente nos seres vivos. Aplica-se em todos os nveis de organizao biolgica, desde os genes e cromossomos de uma espcie at as diversas espcies ou comunidades presentes em ecossistemas como as florestas ou os rios. A DESAPARIO DOS ECOSSISTEMAS NATURAIS O cultivo de plantas e a domesticao de animais acompanharam o homem na passagem de uma vida nmade para uma vida sedentria, um acontecimento que ocorreu vrias vezes em lugares diferentes. Os primeiros cultivos foram a cevada e o trigo (vales do Eufrates e do Nilo, entre 13.000 a.C. e 10.000 a.C.), o arroz (regies fluviais da China e da ndia, 10.000 a.C.), e o milho e a abbora (Amrica Central, entre 9.000 e 7000 a.C.). No continente europeu, durante a Antiguidade, s foram cultivadas umas poucas espcies locais, sendo lentamente adicionadas plantas provenientes de outros lugares, muitas vezes obtidas como trofus de guerra (romanos e cruzados). s tcnicas agrcolas primitivas, que basicamente envolviam a trao animal do arado e o armazenamento de alimentos, se acrescenta na Idade Mdia a rotao trienal de culturas, uma prtica de conservao do solo e aumento da produo. Com as grandes navegaes e a descoberta do Novo Mundo, muda o perfil das plantas cultivadas nos diferentes continentes. O milho, a batata, o tomate, o feijo, o girassol e o tabaco foram introduzidos na Europa. Procedentes de diferentes lugares, o trigo, o gro-de-bico, o arroz, os ctricos, a banana, o caf e a cana-de-acar se aclimataram na Amrica (Figura 12.1). FIGURA 12.1. O transporte de plantas de um continente a outro.

1: Trigo, aveia, videira, gro-de-bico. 2: Abbora, feijo, milho, pimenta, tabaco, batata, tomate. 3: Caf, inhame. 4: Abacaxi, amendoim, cacau, caucho, mandioca, milho, tomate, pimenta, cinchona. 5: Ctricos, banana, soja, cana-de-acar, arroz. 6: Abacaxi, amendoim, cacau, caucho, mandioca, milho, tomate, algodo, abacate. Copyright Maria Antonia Malajovich Biotecnologia: ensino e divulgao (www.bteduc.bio.br)

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No Novo Mundo e ligado ao trfico de escravos, deu-se incio ao ciclo da agricultura das plantaes, com o cultivo de plantas produtoras de fibras (algodo, juta) e de borracha (caucho), de acar (cana-de-acar), de leo (amendoim, palma), de frutos (banana), de substncias estimulantes (ch, caf, cacau) etc. Nesse marco histrico se definem claramente algumas das caractersticas da agricultura moderna, que visa satisfazer as necessidades dos consumidores no s em relao produo de alimentos, como tambm de insumos industriais. Em relao aos animais a histria segue um curso parecido, comeando na sia com a domesticao do cachorro, no final do paleoltico. Entre 8.000 e 7.000 a.C., foram domesticadas a cabra e a ovelha (Mesopotmia), o boi e o zebu (Mesopotmia, Egito), o porco (China, Europa) e o gato (Mediterrneo). A domesticao do cavalo ocorreria bem mais tarde (Ucrnia, 4.000 a.C.). No continente americano, bem antes da chegada dos europeus, as populaes do continente americano mantinham criaes de lhamas, alpacas, vicunhas, perus e pres. Aps a conquista do Novo Mundo, os europeus levaram para o continente seus animais domsticos: cavalos, vacas, porcos e cachorros. Estes se multiplicaram rapidamente, causando grande devastao na flora local. As grandes plancies se tornaram um lugar ideal para a criao de gado. FIGURA 12.2. Distribuio da produo agrcola (gros e cereais, pradarias e pastagens, cultivos diversos) na rea habitvel do planeta.

TABELA 12.1. Os principais tipos de vegetais que entram em nossa alimentao.


TIPOS DE VEGETAIS Cereais Plantas proteaginosas Razes e tubrculos Plantas oleaginosas Plantas produtoras de acar Frutas e hortalias EXEMPLOS Trigo, arroz, milho, centeio, aveia, cevada, sorgo etc. Diversos tipos de feijo, lentilha, gro-de-bico, amendoim, ervilha etc. Batata, car, batata-doce, mandioca, cenoura, beterraba etc. Soja, algodo, colza, canola, amendoim, girassol etc. Cana-de-acar, beterraba sacarina. Banana, tmara, coco, azeitona, abacate, manga, uva, fruta-po, couve, couve-flor, tomate, pimenta, quiabo, berinjela, pepino, abbora etc.

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Os sculos seguintes assistiriam a um aumento significativo da produtividade agrcola em funo da introduo de novas prticas agronmicas, da mecanizao do trabalho no campo e do melhoramento gentico. No entanto, ao limitar o nmero de espcies cultivadas, o progresso da agricultura teve um impacto negativo na biodiversidade. Os ecossistemas agrcolas acompanharam a expanso do homem sobre a superfcie habitvel da Terra (Figura 12.2). Expanso limitada por oceanos, mares, desertos, montanhas e regies polares, que tornam inabitvel para o homem os dois teros da superfcie do planeta. Para evitar o desaparecimento dos ecossistemas naturais, precisa-se de uma agricultura e pecuria sustentveis, que possibilitem a conservao e a manuteno dos solos, da gua, dos processos ecolgicos e dos recursos genticos. O HOMEM E AS PLANTAS AS PLANTAS ALIMENTCIAS Os vegetais ocupam um lugar preponderante na dieta humana. Apesar de nossa alimentao incluir tambm produtos animais (carne, leite, ovos, peixes, mariscos), a maioria das protenas que ingerimos de origem vegetal. Os cereais respondem por 75% de nossas necessidades calricas. Tubrculos, razes, plantas oleaginosas e sacarinas complementam 20%. Hortalias e frutas no fornecem mais que uma pequena quantidade de calorias, sendo importantes por outros valores nutritivos (Tabela 12.1). A dependncia de um limitado nmero de espcies Apesar de existir uma grande diversidade de plantas comestveis, a maior parte dos alimentos (90%) consumidos pela humanidade se restringe a um pequeno grupo de 20 a 25 espcies que inclui a banana, a mandioca, o milho, o amendoim, algumas leguminosas, o milheto, a batata, o arroz, o sorgo, a batata-doce, a soja e o trigo (Figura 12.3). A produo de alimentos No incio do sculo, a populao humana era de 6,1 bilhes de pessoas, estimando-se que chegar a 9,3 bilhes em 2050 (Tabela 12.2). Frente a esses nmeros, cabe nos perguntarmos se a produo de alimentos ser suficiente para as necessidades da populao. Nos ltimos trinta anos, a produo de alimentos teve um aumento de 35% como resultado da seleo de variedades mais produtivas, cultivadas em condies apropriadas. Entre 1980 e 2000, embora a populao aumentasse em quase dois bilhes de pessoas, o desenvolvimento tecnolgico alcanado graas Revoluo Verde gerou uma produo de alimentos suficiente para suprir a humanidade. A duplicao da produo de cereais causou tambm uma reduo significativa dos preos. Contudo, ainda hoje, 4,5 bilhes de pessoas vivem na pobreza, sendo que aproximadamente 24.000 pessoas morrem diariamente de fome e outras 800.000, principalmente crianas e mulheres, sofrem de desnutrio. A carncia de vitamina A afeta 14 milhes de crianas, e a falta de ferro, um bilho de pessoas. Mesmo havendo suficientes alimentos para todos, eles no chegam a 1,2 bilho de pessoas que vivem com menos de um dlar por dia, nem a outros dois bilhes que vivem com menos de dois dlares por dia.

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FIGURA 12.3. Os vegetais na alimentao humana.

TABELA 12.2. O tamanho da populao humana.


ANO Nmero de pessoas (em bilhes) 1980 4,4 2000 6,1 2011 7 2030 8,3 2050 9,3

TABELA 12.3. As plantas e a indstria.


PRODUTO Biocombustveis Fibras txteis leos e gorduras Essncias e fragrncias Ltex Ceras Resinas Especiarias Taninos Tinturas PLANTAS INDUSTRIAIS Cana-de-acar, beterraba sacarina, cereais, soja, mamona etc. Algodo, sisal, linho, cnhamo, juta, coco, rami, piaava. Soja, algodo, colza, canola, amendoim, girassol, dendezeiro, babau, mamona, ssamo, oliveira, linhaa. Sassafrs, menta, citronela, geraniol, eugenol, capim-limo. Borracha, chicle (sapoti). Carnaba, jojoba. Blsamos e gomas. Pimenta-do-reino, noz moscada, canela, gengibre, cravo-da-ndia. Accia, quebracho, eucaliptos. Pau-brasil, pau-campeche, urucum.

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Segundo a Food and Agriculture Organization (FAO), para responder s necessidades da populao, a produo de alimentos dever aumentar em 60%, nos prximos 30 anos. Considerando que 90% das pessoas vivero na faixa intertropical, onde est situada a maioria dos pases em desenvolvimento, a falta de alimentos poder se agravar. Em parte porque, salvo algumas excees significativas (ch, caf, cacau, banana etc.), os alimentos se consomem no lugar mesmo onde so produzidos. E, tambm, porque ir aumentar o nmero de pessoas que em vez de produzir alimentos dever compr-los, em funo da tendncia migratria para as grandes cidades. Embora j tenham aparecido sinais de eroso e de esgotamento do solo em vrios lugares, a expanso da fronteira agrcola parece improvvel. Boa parte da terra no utilizada se encontra em regies pouco frteis, distantes, carentes de infraestrutura ou cobertas por florestas. Sua ocupao aceleraria a degradao de ecossistemas com perda de biodiversidade e risco de apario de doenas. Dois grandes desafios aguardam a humanidade: aumentar a produtividade dos sistemas agrcolas e reduzir a desigualdade de acesso aos alimentos. Se, por um lado, o desenvolvimento tecnolgico indispensvel, a histria dos ltimos anos mostra que, sem mudanas sociais e polticas, no haver soluo para o problema da fome. AS PLANTAS COMERCIAIS A produo de insumos Vrias plantas so cultivadas e comercializadas, s vezes internacionalmente, como matria-prima para diversas indstrias (Tabela 12.3). Assim como o ouro, a carne, o petrleo e o gs natural, os gros so considerados commodities, isto , produtos equivalentes independentemente do produtor. Os preos so fixados em mercados futuros que estabelecem a quantidade e a qualidade da commodity a ser comercializada. De todas as plantas industriais, a soja merece uma ateno especial. Nos ltimos anos, o seu cultivo alcanou um enorme sucesso comercial que pode ser atribudo extraordinria versatilidade de seus produtos. O gro e os brotos podem ser consumidos diretamente ou entrar como farinha na composio de pes, doces, bebidas, massas, biscoitos etc. Os gros fermentados se utilizam na culinria oriental (mis, tempeh). A frao proteica do gro substitui a protena de origem animal (carne de soja) e usada na elaborao de produtos dietticos, pastas e cremes, massas, sucrilhos, comida de bebs, bebidas etc. A torta de soja tambm includa nas raes animais. Mas, por outro lado, essa frao proteica entra na composio de adesivos, reagentes analticos, colas de madeira, emulso asfltica, produtos de limpeza, cosmticos, substitutos de couro e plsticos. O leo extrado do gro usado para cozinhar e como condimento para saladas, entrando na composio de molhos, maioneses, coberturas de bolo, bebidas, pats e margarinas. Utiliza-se tambm como anticorrosivo e antiesttico, entrando na composio de agentes dispersantes e antiespumantes, selantes, cosmticos, madeirite, corantes e tintas. Atualmente, 80-90% do leo de soja produzido provm de culturas transgnicas. Assim como a soja, outras plantas apresentam um espectro de aplicaes de amplido equivalente na alimentao e na indstria. No causa surpresa o fato de que os primeiros cultivos transgnicos a serem comercializados correspondam a quatro das plantas industriais: a soja, o milho, o algodo e a canola.

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A explorao das florestas As florestas naturais tm um valor intrnseco importantssimo na conservao da biodiversidade. No entanto, a lenha ainda utilizada como combustvel, e a explorao de madeiras representa um mercado global de mais de US $ 400 bilhes. As florestas tambm so uma fonte de matria-prima para a indstria de papel e celulose. As biotecnologias facilitam o reflorestamento atravs da micropropagao e do plantio clonal de rvores mais produtivas e de crescimento rpido. O mapeamento de genomas (Pinus, Eucalyptus) e a utilizao de marcadores genticos permitem selecionar alelos, em genes que controlam a variao fenotpica. As duas tecnologias se aplicam tambm para a obteno de rvores que possam crescer em solos ridos (salinidade, acidez). Tcnicas de engenharia gentica visam reduzir a lignina em 45-50% de maneira de modo a diminuir a necessidade de tratamentos altamente poluentes no processamento da polpa. De um modo geral, a maioria dos estudos sobre essncias est sendo realizada em relao aos gneros Pinus, Eucalyptus, Picea, Populus, Quercus e Accia. Vrios pases j realizaram experincias de transformao gentica em rvores. Na China, a tecnologia ser fundamental para o reflorestamento; por enquanto 300-500 hectares tm sido plantados com Populus resistente a insetos (portador de um transgene codificador da toxina do Bacillus thuringiensis). A floricultura Outro setor importante do ponto de vista comercial a floricultura, que abrange o cultivo de plantas ornamentais e de flores, no qual se utilizam corriqueiramente as tcnicas de cultivo de tecidos (micropropagao e embriognese somtica), a haploidizao e a fuso de protoplastos. A produo comercial de orqudeas, por exemplo, depende hoje das tcnicas de cultura in vitro. Boa parte do desenvolvimento das plantas ocorre em condies de laboratrio bem controladas, que permitem ao sistema produtivo a obteno de mudas sadias e de variedades novas. Em um mercado em expanso, no qual a produo de material de propagao (mudas, sementes e bulbos) tende a se concentrar em grandes empresas internacionais, o Brasil exporta flores e plantas tradicionais (crisntemos, rosas, gladolos, cravos, grberas etc.) e plantas tropicais (helicnias, bromlias, orqudeas, antrios etc.) em diferentes modalidades (flores de corte, flores em vaso, plantas verdes e plantas para paisagismo). A Argentina exporta rosas, cravos e palmas a cidades como Miami e Milo, de onde so distribudas internacionalmente. Tambm exporta bulbos de tulipa e uma variedade de rosa preta sem espinhos. O Instituto Nacional de Tecnologia (INTA) e a Japan International Cooperation Agency (JICA) participam de um programa de cooperao para o desenvolvimento da floricultura, assim como da produo hortifrutcola. A maior parte (75%) do mercado mundial de flores corresponde a cravos, rosas, crisntemos e grberas, espcies nas quais faltam os pigmentos responsveis pela colorao azul (antocianinas). Com a transferncia de um gene de petnia ao cravo, uma empresa australiana (Florigene) e uma japonesa (Suntori) conseguiram colocar no mercado flores inovadoras, tais como os cravos (Dianthus caryophyllus L.) de cor malva (Moondust) ou violeta (Moonshadow). Estas plantas so comercializadas em diversos pases, inclusive dentro da Unio Europeia. Na Colmbia os cravos azuis so cultivados desde 2000, para exportao, por Flores Colombianas S.A., uma filial da empresa holandesa Floriyin. Em 2009, aprovou-se o cultivo de rosas e crisntemos azuis. As principais linhas de pesquisa atuais visam o desenvolvimento de fragrncias e a transferncia a vrias espcies ornamentais de genes que prolonguem a conservao das flores nos vasos.
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AS PLANTAS MEDICINAIS At o momento, h identificadas cerca de 20.000 espcies de plantas medicinais. Muitas delas representam ainda o nico recurso possvel para 80% da populao rural, que no tem acesso aos medicamentos comercializados. Em alguns casos, o princpio ativo das plantas tem sido identificado e sintetizado quimicamente. o caso bem conhecido do cido acetilsaliclico da frmula da aspirina, cujo efeito comparvel ao do cido saliclico extrado da casca do salgueiro que, desde a Antiguidade, se administra em chs e poes, como analgsico e antitrmico. A metade das drogas medicamentosas consumidas atualmente extrada de plantas silvestres (no cultivadas). Esses medicamentos derivam de 250 espcies de plantas, que representam 0,1% das 250.000 plantas vasculares. A procura por novos medicamentos comea pela coleta das plantas e a extrao de substncias qumicas que se submetem a testes de atividade biolgica. Encontrar um princpio ativo pode significar altos lucros, embora s chegue ao mercado um em cada 10.000 produtos testados. Entre os fitoqumicos bem-sucedidos esto: a diosinina (produo de anticoncepcionais), a vincristina e a vinblastina (medicamentos anticancerosos), a morfina (anestsico) e o curare (relaxante em cirurgias). A BIODIVERSIDADE AMEAADA A EROSO GENTICA A perda de biodiversidade acarreta a perda de variao gentica (eroso gentica). Os dados so estarrecedores: 11 milhes de Ha/ano de florestas destrudas; avano da desertificao em 27 milhes de Ha/ano; desapario de 30 a 300 espcies por dia. A destruio dos ecossistemas, a diminuio do nmero de espcies existentes e a perda de variabilidade gentica so danos irreparveis; para avaliar sua gravidade basta considerar que, para o melhoramento gentico de uma linhagem cultivada, preciso recorrer aos genes das variedades silvestres. A ameaa da eroso gentica aparece claramente em relao s plantas alimentcias, um nmero restrito de cultivos, uniformizados em funo das prticas agrcolas modernas. No incio do sculo XX existiam, na ndia, mais de 30.000 variedades nativas de arroz, das quais provavelmente no restam hoje mais de cinquenta. Tambm preocupante o futuro das plantas medicinais, muitas delas silvestres, porque as melhores plantas so as primeiras a serem colhidas, enquanto as restantes ficam no terreno, produzindo as sementes que daro origem s prximas geraes. Este tipo de seleo negativa contribui para a eroso gentica das espcies. A EXPANSO DO AGRONEGCIO Por enquanto, as plantas geneticamente modificadas se limitam a um nmero reduzido de espcies e poucos traos, principalmente tolerncia a herbicidas e resistncia a insetos. A globalizao dos cultivos de plantas geneticamente modificadas traz alguns questionamentos relativos ao seu impacto sobre a biodiversidade. Vrios cenrios so possveis, com diferentes consequncias para os ecossistemas e sua biodiversidade. No primeiro, a expanso do agronegcio afetaria os espaos dedicados a outras culturas, pastagens e florestas. No segundo, ao aumentar a produo agrcola, as variedades transgnicas diminuiriam a presso sobre as reas no cultivadas, especialmente as florestas.
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A materializao de um ou outro, assim como a de qualquer outro cenrio intermedirio, depender das presses socioeconmicas e das polticas pblicas relativas produo de alimentos, exportaes e proteo do meio ambiente. Mas no da transgnese em si, porque os cenrios seriam os mesmos se em vez de plantas geneticamente modificadas dispusssemos de plantas melhoradas por mtodos tradicionais. A expanso de um pequeno nmero de espcies em monocultura representa sem dvida uma perda da biodiversidade existente no ambiente natural. Entretanto, cabe destacar que a comercializao de um nico tipo de semente no significa necessariamente a total uniformizao do material gentico. O mercado de sementes difere de outros mercados globalizados, como o de bebidas gasosas, o de eletrnica ou o de informtica, que geram produtos standard. Nenhuma semente est presente ou comercializada em todo o globo, criando-se variedades adaptadas a contextos especficos. Estas variedades ou cultivares distinguem-se entre si por suas caractersticas morfolgicas, fisiolgicas, bioqumicas ou moleculares, herdadas geneticamente. Por exemplo, se entre 1998 e 2003 foram registradas no Servio de Proteo de Cultivares do Brasil cerca de 400 cultivares de soja (Glycine max (L.) Merrill), a estratgia a mesma em relao s plantas transgnicas; havendo j no pas uma oferta de mais de 40 variedades de soja tolerante a herbicida. A TRANSGNESE A relao entre a transgnese e a natureza das espcies perturbadora para algumas pessoas, entre as quais alguns ativistas de movimentos contrrios ao uso dessa tecnologia. Existe o temor que a transferncia de genes modifique o padro das espcies, quebrando a ordem estabelecida na Criao e estabelecendo algo como o caos gentico. Na mitologia, esse medo se encontra na quimera, um misto de leo, cabra e drago que vomitava fogo, e que na Idade Mdia simbolizava o mal. Figuras mistas de homem, animal e planta se encontram magistralmente representadas pelo pintor flamengo Hieronymus Bosch (El jardn de las delicias, 1510). TABELA 12.4. Os centros de diversificao e os cultivos originrios.
REGIO Amrica Central e do Norte CULTIVOS Milho, amaranto, feijo, batata-doce, mandioca, algodo, sisal, papaia, abacate, goiaba, pimenta, abbora, tomate, baunilha, cacau, girassol, morango, noz pec, tabaco etc. Amaranto, amendoim, feijo, lupino, batata, mandioca, amendoim, algodo, caju, fruta-de-conde, abacaxi, papaia, abacate, morango, pimento, abbora, coca, mate, borracha etc. Limo, pepino, arroz, melo, manga, cana-de-acar, algodo, cnhamo, coco, arroz, fruta-po, laranja, tangerina, banana, pltano, noz-moscada, berinjela etc. Soja, colza, lichia, pera, pssego, repolho, ch, gengibre, ginseng, cnfora etc. Caf, melo, melancia, inhame, sorgo etc. Alfafa, trigo, aveia, centeio, cevada, rabanete, cenoura, ervilha, gro-de-bico, lentilha, azeitona, figo, amndoa, vinha, ma, beterraba, alho, cebola, aafro, papoula, alcauz etc.

Amrica do Sul

ndia e Sudeste Asitico

China frica (Etipia) sia menor

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Por ser de cunho religioso e essencialmente subjetivo, esta viso no corresponde ao nosso conhecimento atual sobre as espcies, que so unidades morfolgicas e reprodutivas essencialmente dinmicas. Sem fundamentao cientfica, o criacionismo ignora os inmeros estudos sobre a evoluo dos seres vivos e, tambm, as descobertas sobre os genomas, mostrando que as espcies compartilham um nmero grande de genes. Por outro lado, no deve se esquecer que muitas das plantas consideradas naturais so um invento recente do homem. Um exemplo o morango, resultante de um cruzamento acidental entre duas variedades que no coexistem na natureza: a norte-americana Fragaria virginiana e a sulamericana Fragaria chiloense, ocorrido no sculo XIX em um Jardim Botnico da Frana. Outro exemplo o tritical, um hbrido de trigo e centeio, obtido em laboratrio em fins do mesmo sculo. Tratado inicialmente como uma curiosidade cientfica, este cereal teve suas propriedades agronmicas desenvolvidas recentemente, sendo utilizado hoje na composio de pes e biscoitos e de raes animais; tambm vendido em algumas lojas de produtos naturais. A PROTEO DA BIODIVERSIDADE OS CENTROS DE DIVERSIFICAO No incio do sculo XX, o gegrafo e geneticista russo Nikolai I. Vavilov percorreu 64 pases, em mais de 100 expedies, coletando sementes, gros, tubrculos etc. Nessas viagens, ele observou que em alguns lugares o nmero de variedades cultivadas e distintas muito maior que em outros. Essas reas geogrficas corresponderiam aos centros de diversificao, ou de origem, das plantas cultivadas. Assim, a existncia de mais de 1.000 variedades de batata na Cordilheira dos Andes, cada uma delas identificada com um nome pela populao local, mostraria que esse seu centro de diversificao. A partir de observaes anlogas, Vavilov localizou seis a oito centros geogrficos onde, presumivelmente, teria se originado a agricultura (Tabela 12.4). Vavilov no chegou a completar sua obra, falecendo em 1943 na priso de Saratov, onde foi encarcerado por se opor a uma interpretao ideolgica da hereditariedade e defender o conceito mendeliano da herana. Na antiga Unio de Repblicas Socialistas Soviticas (URSS) a gentica foi considerada uma teoria reacionria e burguesa, entre 1929 e 1964. A teoria de Vavilov foi extremamente fecunda para os estudos evolutivos das plantas cultivadas e, consequentemente, para a conservao da biodiversidade. Admite-se hoje que a diversidade das plantas cultivadas e silvestres bem maior em alguns pontos geogrficos, e que alguns biomas foram mais propcios que outros para o nascimento de prticas agrcolas. Nem sempre os centros de diversidade coincidem com os centros de origem, porque as migraes humanas permitiram a apario de centros de diversidade secundria. Nestes, as espcies foram selecionadas em funo das prticas agrcolas e da presso ambiental, tornando-se tolerantes as condies ambientais e resistentes s doenas locais. A CONSERVAO DA BIODIVERSIDADE Uma das consequncias do processo evolutivo a extino de espcies, como evidenciado pelo nmero de espcies vivas, que no chega a 1% das que alguma vez povoaram a Terra. O que preocupa no tanto a apario e desapario das espcies, como a velocidade a que isso est acontecendo, porque configura uma extino em massa, causada pelo homem.

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Consideremos por exemplo o caso da Mata Atlntica brasileira, cuja biodiversidade maior ainda que a da Amaznia. A devastao tal que s restam pedaos da floresta original e sua conservao depende da manuteno de corredores entre os diversos fragmentos. Negociada sob os auspcios do Programa das Naes Unidas para o Meio Ambiente (UNEP), a Conveno sobre a Diversidade Biolgica entrou em vigor em 1993. Promove a cooperao internacional para a conservao da diversidade biolgica, o uso sustentvel dos recursos biolgicos e a distribuio justa e equitativa dos benefcios resultantes do uso dos recursos genticos. Conservar a biodiversidade e os recursos genticos significa muito mais que salv-los da extino, trata-se de conservar suficiente diversidade dentro de cada espcie de forma a garantir que seu potencial gentico seja usado no futuro. De um modo geral, em todas as variedades cultivadas atualmente tem-se incorporado genes provenientes de variedades selvagens ou dos estoques genticos conservados por povos que praticam uma agricultura tradicional. A produo comercial do tomate, por exemplo, seria impossvel sem a contribuio de genes silvestres de Amrica Latina. Graas aos trigos selvagens, dispomos de variedades resistentes aos fungos, seca, ao calor ou ao frio. A resistncia a quatro doenas do arroz que cultivado atualmente se deve a uma variedade encontrada na ndia central. A conservao in situ A biodiversidade pode ser conservada in situ mediante a proteo ambiental de uma regio determinada (unidades de conservao ambiental). Alm de manter a dinmica evolutiva das espcies, h de se contemplar as necessidades da populao local criando reservas de desenvolvimento sustentvel (Mamirau, Brasil; Slan Kan, Mxico). Na Costa Rica, uma lei de 1996 compensa aqueles que conservem ou aumentem a rea de floresta dentro de suas propriedades. Uma nova tendncia o retorno da vida selvagem mediante a reintroduo de animais como o urso, nos Pirineus, ou o lobo, nas florestas europeias. Projetos mais arrojados contemplam a criao de comunidades de grandes mamferos. Em Oostvaarderplassen (Pases Baixos), os animais extintos so substitudos por outros que lhes sejam aparentados. Extinto em 1627, o auroque substitudo pelo auroque de Heck, criado em 1920 por cruzamentos entre as mais antigas raas de bovinos europeus. O pnei Konik da Polnia ocupa o lugar do tarpan, um cavalo selvagem extinto. Um projeto anlogo procura recriar as estepes da tundra anteriores ltima era glacial (parque pleistocnico, Rssia). A conservao ex situ e os bancos de germoplasma A estratgia envolve a coleta de amostras representativas de uma populao e sua manuteno em bancos de germoplasma e/ou jardins botnicos, na forma de sementes, estacas, plantas inteiras etc. A conservao ex situ se aplica especialmente s plantas cultivadas que se reproduzem por sementes. Estas podem ser conservadas no frio durante longos perodos de tempo (a 50C durante 20 a 30 anos; de -180C a -200C durante um sculo). Como a viabilidade das sementes decai com o tempo, periodicamente devem ser germinadas, desenvolvendo novas plantas e podendo colher sementes frescas. Alm de facilitar o acesso informao dos melhoristas, a criopreservao tem a vantagem de conservar o material em um espao reduzido e com cuidados intensivos. Mas, devido s limitaes do tamanho das amostras, a conservao dos recursos fitogenticos pode ser insuficiente. Os custos so muito altos e inclusive a coleo da Estao Experimental Vavilov (So Petersburgo, Rssia), que sobreviveu Segunda Guerra Mundial, enfrenta hoje grandes dificuldades econmicas.
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Muitas plantas no resistem dessecao (coco, cacau, ctricos, caf, dend, borracha e 70% das rvores das florestas tropicais), mas podem ser conservadas graas s tcnicas de cultura de tecidos que tambm permitem a conservao de plantas de multiplicao vegetativa (razes, como a mandioca, tubrculos como a batata, banana, cana-de-acar). A criopreservao preserva os tecidos por tempo indeterminado. As tcnicas de anlise de DNA tm sido incorporadas tanto nos estudos de diversidade gentica como no controle da duplicao de amostras. Com o mapeamento do genoma das plantas bsicas para a produo agrcola e a disponibilidade dos dados no domnio pblico, abrem-se novas perspectivas na conservao dos recursos genticos. Existem hoje mais de 1.400 bancos de genes e de germoplasma com mais de 6.000.000 de amostras. Os principais se encontram nos Estados Unidos, na China, na Alemanha e no Brasil (Embrapa). Na Noruega, a 1.000 km do Polo Norte, um lugar considerado a salvo de mudanas climticas, desastres naturais e guerras, foi criado recentemente o banco de sementes de Svalbard com capacidade para armazenar 4,5 milhes de amostras, cada uma delas com 500 sementes. Devido localizao geogrfica dos centros de origem e de diversificao, resulta preocupante a recente multiplicao dos conflitos blicos (Afeganisto, Iraque) que afetam no s a populao local como comprometem o seu futuro ao devastar a sia Menor, uma regio de grande biodiversidade e riqueza gentica. Os bancos de germoplasma podem ajudar a restaurar uma agricultura devastada por conflitos blicos. Em Ruanda, um pas em que 90% das pessoas dependiam da agricultura e onde eram conhecidas 600 variedades de feijo, o conflito blico entre etnias rivais causou, em 1994, a morte de 800.000 pessoas e a migrao forada de dois milhes de pessoas. Durante esse perodo, organizaes internacionais conservaram, em bancos de germoplasma, as sementes essenciais para a reconstruo do pas. O CGIAR E O CENTRO INTERNACIONAL DA BATATA Uma das organizaes dedicadas conservao da biodiversidade e ao desenvolvimento agrcola dos pases em desenvolvimento a Future Harvest, uma iniciativa com 16 centros localizados em diversos lugares, porm mantendo uma estrutura descentralizada que favorece a difuso das informaes. Os centros so mantidos pelos governos de 165 pases, fundaes privadas e organizaes internacionais e regionais que integram o Consultative Group on International Agricultural Research (CGIAR), apoiado pela Food and Agriculture Organization (FAO). Os centros do CGIAR na Amrica Latina so: o Centro Internacional para el Mejoramiento del Maz y el Trigo (CIMMYT) no Mxico, o Centro Internacional de la Papa (CIP) no Peru e o Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) na Colmbia. A batata originria da regio andina. No sculo XVI chegou Europa onde, depois de vencer a resistncia da populao, transformou-se em um dos poucos alimentos consumidos pela populao mais pobre. Quando em meados do sculo XIX o fungo Phytophtora infestans infectou as batatas, desencadeou-se na Irlanda um terrvel perodo de fome, que causou a morte de um milho de pessoas e a emigrao de boa parte da populao. Hoje, a batata o quarto cultivo mais importante do mundo, com uma produo anual de 300 milhes de toneladas. Em muitos pases, a populao depende de batata e de outros tubrculos (batata-doce) para sua alimentao, por serem relativamente ricos em energia e nutrientes. O Centro Internacional da Papa (CIP) preserva a batata (Solanum tuberosum), a batata-doce (Ipomoea batatas) e nove tubrculos ou razes andinas (Oca, Ulluco, Mashua, Arracacha, Yacon, Achira, Ahipa, Maca, Mauka). O banco de germoplasma de batata inclui amostras de uma centena de espcies selvagens coletadas em 8 pases de Amrica Latina, alm das variedades cultivadas tradicionalmente pela populao andina.
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Entre os objetivos do CIP se encontra o melhoramento da qualidade nutricional, da resistncia a doenas e a condies climticas adversas como a seca e a geada. O centro utiliza a biotecnologia para criar formas adaptadas s condies locais e para acelerar a produo, distribuindo as variedades tradicionais e melhoradas sob a forma de sementes, tubrculos ou vitroplantas. Atualmente tambm estimula as utilizaes comerciais das variedades autctones: distribuio em pacotes (tikapapa), elaborao de chips ou hojuelas a partir de rodelas com um visual variado. O PROTOCOLO DE CARTAGENA DE BIOSSEGURANA Vigorando desde setembro de 2003, o Protocolo de Cartagena de Biossegurana suplementa a Conveno sobre a Diversidade Biolgica. O acordo contempla o risco potencial decorrente do transporte e do manuseio de todos os organismos vivos modificados (OVMs) que possam ter um efeito adverso na conservao e no uso sustentvel da diversidade, levando em considerao os riscos para a sade humana. Frente apreenso suscitada pelo trnsito e movimento dos organismos transgnicos atravs de fronteiras, os pases membros determinaram que a expresso pode conter OGMs identifique toda carga proveniente de lavouras transgnicas destinada alimentao, rao ou processamento. O Protocolo no cobre os produtos derivados dos transgnicos (como, por exemplo, papel produzido a partir de rvores transgnicas) nem os transgnicos produtores de frmacos, que so regulados por outras organizaes. Mediante o Protocolo de Cartagena se estabelece a cooperao internacional, a fim de ajudar os pases em desenvolvimento a utilizar a biotecnologia com segurana, e a regul-la eficientemente. Os governos membros se propem a promover o fluxo de informaes e a transferncia de tecnologia, conhecimentos e recursos, mediante o treinamento cientfico e tcnico correspondente.

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13. BIOTECNOLOGIA E AGRICULTURA

A EVOLUO DAS PRTICAS AGRCOLAS A agricultura visa a cultura do solo para a produo de plantas ou a criao animais teis ao homem. Embora as prticas agrcolas e as plantas cultivadas tenham-se desenvolvido em um perodo curto da histria evolutiva dos vegetais, pode-se afirmar que as plantas atuais guardam muito pouca semelhana com suas ancestrais selvagens (Figura 13.1). FIGURA 13.1. O milho.
O milho de 5.000 a 7.000 anos atrs era bem menor do que o que conhecemos atualmente. O cruzamento acidental com o teosinto, uma erva que ainda existe na natureza, teria dado origem ao milho moderno, que passou por vrias modificaes at se estender pela Amrica pr-colombiana. Diversas variedades de milho persistem at hoje no continente http://www.learner.org/courses/essential/life/session5/closer1.html

Na Europa, o uso de ferramentas rudimentares prevaleceu at a Idade Mdia, quando, em funo de vrias inovaes, as prticas agrcolas se tornaram mais eficientes. Datam deste perodo o aproveitamento da fora de trao animal, a inveno dos moinhos, a prtica de descanso dos solos e a construo de sistemas de irrigao. No sculo XVIII, a integrao das atividades agrcolas e a criao de animais originou uma nova agricultura que, alm de envolver a utilizao de esterco como fertilizante, promoveu a rotao entre os cultivos de gramneas, leguminosas e plantas forrageiras. A incidncia do progresso cientfico e tecnolgico caracteriza a agricultura do sculo XIX, destacando-se a preocupao com os requerimentos nutricionais das plantas e com as doenas que afetavam os cultivos e as criaes (antraz das ovelhas, clera das aves, doenas do bicho-da-seda etc.). Originadas por cruzamentos seletivos, as novas variedades e raas foram comercializadas internacionalmente a partir de 1850. Com a inveno da mquina a vapor e as primeiras utilizaes da eletricidade, iniciou-se a mecanizao do campo. No incio do sculo XX, o uso do trator se espalhou rapidamente. A substituio da trao animal pela maquinaria agrcola diminuiu a necessidade de produzir raes, liberando para outros cultivos a superfcie anteriormente dedicada produo de feno e aveia. Com o redescobrimento das leis de Mendel e a teoria cromossmica da herana, iniciou-se uma nova era no melhoramento de vegetais e animais. O cruzamento entre duas linhagens puras de milho origina um hbrido semelhante s linhagens parentais, mas com qualidades superiores. Esta propriedade, denominada heterose ou vigor hbrido, permite a produo de plantas mais produtivas e suficientemente homogneas, o que facilita a colheita mecnica (Figura 13.2). A partir de 1920, surgiram as primeiras empresas comerciais a explorar a heterose do milho (Estados Unidos, Canad). Estas selecionavam as linhagens parentais de milho, procediam aos cruzamentos correspondentes e vendiam as sementes hbridas ao agricultor. A primeira deste tipo foi a Hi-Bred Corn Company, transformada mais tarde em Pioneer Hi-Bred.

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FIGURA 13.2. A produo de milho hbrido.


A hibridizao permite obter hbridos simples a partir de duas linhagens, e hbridos duplos a partir de quatro linhagens. Existem hbridos mltiplos construdos a partir de pelo menos cinco linhagens.

Como a perda do efeito da heterose diminui a produtividade da descendncia das plantas hbridas, o agricultor passou a comprar anualmente as sementes. Em 1960, o milho hbrido era cultivado, com raras excees, em todas as plantaes dos Estados Unidos e do Canad. O melhoramento das plantas j no dependia daqueles diretamente envolvidos em seu cultivo, mas daqueles que produziam as sementes. A dcada de 1960 est marcada pela revoluo verde, que salvou da fome mais de 1 bilho de pessoas. Em 1970, o engenheiro agrnomo Norman Borlaug recebeu o Prmio Nobel da Paz pelo desenvolvimento de uma variedade de trigo de alto rendimento, resistente a doenas causadas por fungos. O trabalho de Borlaug, que permitiu aumentar a quantidade de alimentos, representa uma contribuio fundamental para a paz mundial. Graas ao desenvolvimento e ao cultivo de variedades melhoradas geneticamente houve uma duplicao da produtividade dos cereais, mas eram necessrias prticas agrcolas complexas (irrigao, mecanizao, aplicao de fertilizantes e pesticidas). Em funo do custo de fertilizantes e agrotxicos e de sua aplicao em quantidades excessivas, a revoluo verde trouxe tambm problemas ambientais, sociais e de sade. Contudo, devido necessidade de grandes investimentos de capital para a mecanizao e a aplicao de produtos qumicos, em muitos pases os pequenos agricultores no chegaram a usufruir a revoluo verde.

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Com a crise do petrleo da dcada de 1980, o setor de sementes agrcolas invadido pelas grandes empresas transnacionais, produtoras de agrotxicos e fertilizantes. A inverso extraordinria de recursos do setor privado em pesquisa e desenvolvimento permite a introduo das novas tcnicas de engenharia gentica na agricultura. Traspassando as barreiras interespecficas, a nova tecnologia facilita a obteno de plantas mais produtivas ou com propriedades novas. Hoje, a tecnologia est inserida na semente. Comercializadas a partir de 1996, as principais plantas transgnicas cultivadas atualmente so a soja, o milho, a canola e o algodo, com tolerncia a herbicidas e/ou resistncia a insetos. A rea semeada com estes cultivos se estende por 25 pases, dos quais cinco respondem por 43% da superfcie cultivada mundialmente (Brasil, Argentina, ndia, China e frica do Sul). A OBTENO DE NOVAS VARIEDADES MUTAO GNICA E SELEO O melhoramento est baseado na reproduo seletiva entre indivduos pertencentes a uma mesma espcie. Como a variao intraespecfica limitada, o mtodo clssico envolve a induo aleatria de mutaes por agentes fsicos ou qumicos. O mutante obtido cruzado por vrias geraes com um dos tipos parentais (retrocruzamentos), at que este incorpore as caractersticas desejadas (introgresso gnica). Esse processo demora de cinco a 15 anos e, quando finalizado, o gene selecionado estar acompanhado por outros, desejveis ou no. Duas variedades comerciais de batata (Lenape, 1960; Magnum bonum, 1990), obtidas por este mtodo, tiveram que ser retiradas do mercado devido ao alto contedo de alcaloides, caracterstico das plantas selvagens. O progresso alcanado na induo de mutaes (TILLING, do ingls Targeting induced local lesions in genomes) e na seleo assistida por marcadores moleculares facilita a obteno de novas variedades, como a batata Amflora. A genmica tambm trouxe avanos notveis, como a identificao de 40 genes de resistncia a patgenos no tomate, que foram reunidos em um gentipo nico. Contudo, em ambos os casos, trata-se de genes pertencentes mesma espcie. ALTERAO DO NMERO DE CROMOSSOMOS A multiplicao do nmero de cromossomos (poliploidia) um fenmeno que acontece espontaneamente nos vegetais, seja por no disjuno dos cromossomos ou por uma falha da citocinese durante a diviso celular. Ao longo do processo evolutivo, duplicaes dos lotes cromossmicos originais (autopoliploidia) ocorreram em vrias das espcies que so cultivadas atualmente, tais como a batata ou a cana-de-acar. A multiplicao dos lotes cromossmicos pode ocorrer em hbridos interespecficos, pouco frteis ou estreis, restaurando a fertilidade e gerando uma nova espcie, diferente de ambas as linhagens parentais (alopoliploidia). Este mecanismo deu origem a plantas como o trigo, a colza, a aveia, o tabaco, o algodo, o caf etc. A descoberta da colchicina (1935), uma substncia que interfere com a formao dos fusos mitticos, permitiu a criao de novas espcies poliploides. A hibridizao do trigo e do centeio, seguida de uma duplicao cromossmica, originou o triticale, uma planta que rene a qualidade do gro do primeiro e a rusticidade do segundo. Outra forma de alterao do nmero de cromossomos a cultura de anteras, para a obteno de plantas haploides. Essa tecnologia permite identificar mutantes recessivos e obter rapidamente variedades diferentes por hibridizao ou duplicao cromossmica.
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ENGENHARIA GENTICA medida que a distncia entre as espcies aumenta, os cruzamentos se tornam cada vez mais difceis; a transferncia dos genes pode exigir o uso de tcnicas complexas, como a fuso de protoplastos (hibridizao somtica) e o cultivo de embries. Quando os recursos genticos provm de outros organismos distantes na escala evolutiva (plantas, microrganismos ou animais), sua transferncia demanda a utilizao da engenharia gentica ou tecnologia do DNA-recombinante. Qual a diferena entre uma planta obtida por cruzamento seletivo e outra por engenharia gentica? Na primeira, genes da mesma espcie ou de uma espcie muito prxima se introduzem aleatoriamente. Na segunda, se incorpora diretamente um transgene, isto uma construo gnica que pode provir de uma espcie distante. Trata-se de uma tecnologia poderosa demais para ser negligenciada. A construo de uma planta transgnica comea com o isolamento e caracterizao do gene de interesse (transgene) e a construo de uma estrutura gentica complexa, incluindo tambm um gene promotor e um gene marcador. O primeiro possibilita a transcrio do transgene e determina se este ir se expressar em todas as clulas ou somente em alguns tecidos. O segundo permite selecionar as clulas transformadas. A construo gentica transferida s clulas receptoras por algum dos mtodos possveis (eletroporao, biolstica ou uso de vetores, como o plasmdeo Ti de Agrobacterium tumefaciens). As clulas transformadas so recuperadas procedendo-se regenerao das plantas mediante as tcnicas de cultura in vitro (Figura 13.3). O trabalho laboratorial realizado com plantas cujo gentipo favorea a transformao e a regenerao da planta transformada, mas que geralmente resultam pouco vantajosas do ponto de vista agronmico. FIGURA 13.3. As etapas da construo de uma planta transgnica.

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Mediante tcnicas bioqumicas e/ou acompanhamento de marcadores moleculares (polimorfismos na molcula de DNA, repetio de sequncias) constata-se a transferncia gnica, assim como o nmero de cpias e o lugar em que estas se integraram no genoma, dois aspectos que podem influir na expresso gnica. Considera-se alcanado o sucesso quando o transgene se expressa no lugar correspondente e com um adequado nvel de atividade, restando por verificar a estabilidade da expresso gnica e o seu valor agronmico. Acabada a etapa de laboratrio, iniciam-se os testes controlados em casa de vegetao, para selecionar as plantas-me das quais procedero vrias geraes de retrocruzamentos seletivos com alguma das linhagens elite, visando a obteno de uma linhagem transgnica de alto rendimento, adaptada a um contexto especfico. O resultado uma variedade ou cultivar que expressa o trao codificado pelo gene exgeno (transgene) e apresenta um potencial de produtividade parecido ao da linhagem elite. Conceitualmente, estes testes so semelhantes aos efetuados no processo de melhoramento tradicional. Contudo, a utilizao de tcnicas de cultura in vitro e de marcadores moleculares na caracterizao da prognie permitem que sejam completados bem mais rapidamente. D-se incio ento liberao planejada no meio ambiente, abrangendo o cultivo das plantas transgnicas em experimentos protegidos e testes de campo, realizados em diferente escala, at a nova variedade estar pronta para o seu cultivo comercial. A liberao do cultivo depender da autorizao da legislao local, geralmente bastante restrita a esse respeito. No Brasil, esta autorizao dada pela Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana (CTNBio), definida pela Lei de Biossegurana como o rgo multidisciplinar responsvel pelo controle dessa tecnologia no pas (Lei 11.105/2005, Poltica de desenvolvimento da Biotecnologia; Decreto 6.041/2007). A histria mostra que as plantas cultivadas pouco tm a ver com as que lhes deram origem e se encontram na natureza, sendo o resultado de milhares de anos de seleo artificial pela mo do homem. Em relao aos mtodos tradicionais, as biotecnologias modernas permitem a transferncia de genes entre espcies, facilitam sua identificao na prognie e aceleram o processo seletivo. O objetivo o mesmo, com mtodos mais apurados. O PRINCPIO DE PRECAUO Poucas tecnologias suscitaram tanta polmica como a introduo de organismos geneticamente modificados (OGMs) na agricultura, uma questo que no pode ser tratada levianamente. Um cultivo biotecnolgico demora anos at ser comercializado, sendo analisado cuidadosamente em cada etapa de sua construo. Alm de conhecimentos e anos de trabalho, a construo de uma planta transgnica exige o consenso das numerosas pessoas que participam no processo e a aprovao da autoridade correspondente. Ainda hoje, parte da opinio pblica considera que as plantas transgnicas no deveriam ter sido introduzidas no ambiente, nem utilizadas para o consumo humano, enquanto existir a mnima suspeita de risco. Levando o raciocnio ao extremo, enquanto no se demonstrar a ausncia de riscos. Boa parte dessa hostilidade s plantas transgnicas se apoia no princpio de precauo, um princpio que pode ser entendido de diversas maneiras. Podemos dizer, de maneira simplista, que havendo a possibilidade de me acontecer alguma coisa ruim na rua, melhor ficar em casa, ou que havendo a possibilidade de me acontecer alguma coisa ruim na rua, ao sair de casa melhor ter cuidado e prestar ateno no sinal, nos carros, nas bicicletas que circulam na contramo e, tambm, no bandido. Note-se que a deciso de no sair de casa tambm envolve riscos, tais como escorregar e levar um tombo no banheiro, queimar-se ao acender o fogo ou receber um vrus via Internet. No existe risco zero, toda ao tem riscos que devem ser analisados e gerenciados.
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No Brasil, o cultivo de plantas transgnicas regido pela lei de Biossegurana que estabelece a observncia do princpio da precauo para a proteo do meio ambiente. O Princpio 15 da Declarao do Rio de Janeiro sobre Meio Ambiente e Desenvolvimento Sustentvel (1992) diz o seguinte: De modo a proteger o meio ambiente, o princpio da precauo deve ser amplamente observado pelos Estados, de acordo com as suas capacidades. Quando houver ameaa de danos srios ou irreversveis, a ausncia de absoluta certeza cientfica no deve ser utilizada como razo para postergar medidas eficazes e economicamente viveis para prevenir a degradao ambiental. Diferente da preveno, que trata de riscos conhecidos, a precauo contempla riscos potenciais. Mesmo havendo incertezas ou falta de unanimidade entre os expertos, o princpio de precauo demanda aes concretas para a proteo do meio ambiente. Por outro lado, o Princpio 10 da mesma declarao nos diz que: A melhor maneira de tratar questes ambientais assegurar a participao, no nvel apropriado, de todos os cidados interessados. No nvel nacional, cada indivduo deve ter acesso adequado a informaes relativas ao meio ambiente de que disponham autoridades pblicas, inclusive informaes sobre materiais e atividades perigosas em suas comunidades, bem como a oportunidade de participar em processos de tomada de decises. Os Estados devem facilitar e estimular a conscientizao e a participao pblica, colocando a informao disposio de todos. Deve ser propiciado acesso efetivo a mecanismos judiciais e administrativos, inclusive no que diz respeito compensao e reparao de danos. Vrios pontos merecem ser destacados: admite-se a incerteza e a falta de unanimidade entre os expertos, afirma-se o direito de todos informao e pede-se a participao, no nvel apropriado, de todos os cidados interessados. A responsabilidade pela tomada de decises no ser exclusivamente de um grupo de indivduos, sejam estes cientistas, administradores, empresrios, polticos ou comunicadores. Ter que ser democraticamente assumida por um grupo heterogneo que represente os interesses da sociedade, mesmo tendo que abrir as portas ao marketing, aos lobbies e presso dos grupos polticos, ambientalistas ou no. Considerado por alguns grupos de opinio como um dos alicerces do desenvolvimento sustentvel e uma proteo contra o controle da tecnologia pelas grandes empresas, o princpio de precauo tambm visto por outros como um obstculo ao progresso e uma tentativa de protecionismo. A formalizao do princpio mediante uma estrutura jurdica, como a lei de biossegurana, assim como o estabelecimento de normas, regras e procedimentos claros a melhor maneira de gerenciar o desenvolvimento tecnolgico, minimizando os riscos correspondentes. AS PLANTAS BIOTECNOLGICAS ATUAIS As plantas biotecnolgicas apresentam traos, inseridos como transgenes, que visam modificar suas propriedades agronmicas e/ou melhorar suas qualidades nutricionais, industriais ou ambientais. Poderiam escapar dos limites do plantio e suplantar as plantas silvestres, tornando-se invasoras? Existe o precedente de plantas ornamentais se transformarem em pragas quando introduzidas, inadvertidamente, em um ambiente novo: a lantana prolifera descontroladamente na Austrlia; o kudzu, procedente do Japo, se espalha no sul dos Estados Unidos; e o rododendro, originrio da pennsula ibrica, se multiplica na Inglaterra. Alm da degradao ambiental devida ao desmatamento, jardinagem ou agricultura, para que o cenrio se repetisse seriam necessrias vrias caractersticas hereditrias, que so sistematicamente eliminadas como fatores indesejveis nas plantas cultivadas (dormncia da semente, plasticidade fenotpica, crescimento indeterminado, florescimento e produo contnua de sementes etc.).
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Com o objetivo de reduzir o risco futuro de introduzir um gene que transforme uma planta normal em praga, a FAO (Food and Agriculture Organization) estabeleceu uma srie de diretrizes, cumpridas em 130 pases, que se aplicam tambm a insetos, bactrias e fungos. Nenhum dos cultivos biotecnolgicos disponveis no mercado se mostrou persistente ou invasor nos testes prvios a sua comercializao ou no monitoramento posterior. MODIFICAO DAS PROPRIEDADES AGRONMICAS Os principais cultivos comercializados atualmente so a soja, a canola, o milho e o algodo. As propriedades agronmicas transformadas so a tolerncia a herbicidas, a resistncia a insetos, a resistncia a vrus, o amadurecimento tardio, o contedo e a qualidade do leo, a tolerncia seca e salinidade etc. O aumento da produtividade dos cultivos fundamental porque significa um aumento da produo de alimentos e, tambm, porque se trata de plantas de uso industrial que podem ser exportadas, gerando divisas. Tolerncia a herbicidas O crescimento das ervas daninhas no campo prejudicial por dois motivos: competem pelos mesmos nutrientes e contaminam a colheita. O agricultor pode elimin-las aplicando herbicida antes do plantio, uma prtica que demanda o revolvimento prvio do solo, acelerando a eroso. Contudo, se uma planta for tolerante a um herbicida de amplo espectro, bastar seme-la e aplicar o herbicida depois da germinao. Esta caracterstica compatvel com a adoo do plantio direto na palha e outros restos vegetais, um sistema no qual as sementes e os fertilizantes so depositados em sulcos, sem preparao do solo. Em vrios pases, comercializam-se sementes transgnicas de soja, de milho, de algodo e de canola tolerantes a herbicida. O herbicida no seletivo mais utilizado o glifosato, que est presente em vrios produtos comerciais, tais como Roundup, Buccaneer, Rodeo, Accord etc. Sua ao inibitria sobre sistemas enzimticos exclusivamente vegetais permite eliminar as ervas daninhas, anuais e perenes. Considerado pouco txico em caso de exposio oral ou de inalao, o glifosato degradado rapidamente no ambiente. Sementes de plantas tolerantes ao glifosato so comercializadas com o nome de RoundupReady (RR) pela empresa Monsanto. Com o vencimento, no ano 2000, da patente do Roundup e o aparecimento no mercado de outras variaes do produto, mais accessveis para o agricultor, as vendas geminadas das sementes e o herbicida tendem a se desfazer. Por outro lado, a BayerCropScience comercializa, com o nome Liberty Link, sementes tolerantes ao glufosinato, um herbicida presente em outro grupo de produtos (Basta, Liberty, Ignite etc.). Glifosato e glufosinato no so os nicos herbicidas no mercado. Existem outras substncias, do grupo das imidazolinonas, cuja tolerncia tem sido transferida recentemente soja Cultivance, um empreendimento da Embrapa e da Basf que ser comercializado a partir de 2011. Ao diminuir a aplicao dos agroqumicos tradicionais, os cultivos biotecnolgicos favorecem a conservao dos recursos ambientais. A aprovao de plantas transgnicas considerada caso a caso, em funo de uma anlise de riscos. Sua vantagem sobre as plantas silvestres depende da presena de um agente seletivo, como um herbicida ao qual elas sejam tolerantes. Sem o herbicida, ou fora de seu alcance, as plantas geneticamente modificadas no tm nenhuma vantagem sobre as plantas silvestres nem conseguem competir com estas em ambientes naturais.

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Contudo, o fluxo gnico em sentido contrrio preocupante, porque plantas silvestres tolerantes a herbicida poderiam competir no terreno com as plantas cultivadas, tornando-se ervas daninhas. Algumas plantas, como a trapoeraba (Commelina benghalensis) so naturalmente resistentes ao glifosato. Admite-se, no entanto, que a apario de resistncia em pelo menos 15 espcies poderia ter sido causada pela transferncia do gene correspondente, das plantas cultivadas s plantas silvestres. No Brasil, h relatos sobre resistncia ao glifosato no azevm (Lolium multiflorum) e na buva (Conyza bonariensis e C. canadiensis). A apario de plantas resistentes ao glifosato, que o herbicida mais utilizado no mundo, est sendo acompanhada com ateno. Estima-se que, depois de 10 a 20 anos de uso intenso, seja inevitvel o aparecimento de plantas silvestres tolerantes. Contudo, o agricultor pode retardar a apario dessa tolerncia, mediante algumas aes preventivas: rotar as culturas, evitar o uso repetido do mesmo herbicida, aplicar as doses adequadas em condies meteorolgicas propcias, acrescentar outras modalidades de controle etc. Resistncia a insetos Os insetos causam quebras de safra estimadas em 20-40% das colheitas. Contudo, o controle mediante o uso de agrotxicos tem causado problemas no ambiente e na sade humana, sendo portanto necessrio encontrar mtodos alternativos de combate. Muitos agricultores, inclusive entre os orgnicos, protegem h mais de 40 anos suas colheitas com um inseticida biolgico, que uma toxina produzida pelo Bacillus thuringiensis, um microrganismo do solo. Uma vez ingerida pelos insetos ou lagartas, a toxina age no sistema digestrio matando-os em poucos dias. Para o ser humano, ela no tem efeito algum. O produto comercial vendido com os nomes de Dipel, Thuricida ou Vectobac. Uma vez transferido o gene codificador da toxina do Bacillus thuringiensis s plantas, estas passam a produzi-la diretamente. Denominadas plantas Bt, estas so comercializadas com diferentes nomes como, por exemplo, algodo Bollgard e milho Yieldgard, da Monsanto, milho Agrisure, da Syngenta. Existem diversas verses do gene Cry, codificando toxinas muito especficas, efetivas em diferentes ordens de insetos. Algumas variedades (YieldGard, Agrisure) diferem pela posio do transgene, o que caracteriza diferentes eventos e permite a comercializao com nomes diferentes. Uma das vantagens das variedades Bt sobre as variedades convencionais est na menor quantidade de micotoxinas (aflatoxina e fumonisina) perigosas para a sade humana, em funo da diminuio da contaminao por fungos dos ferimentos causados por insetos. Todo inseticida age como agente seletivo, sendo inevitvel a apario de insetos resistentes. Duas estratgias so possveis a fim de evitar ou retardar a apario de larvas resistentes toxina do Bacillus thuringiensis. Uma delas visa eliminar diretamente o inseto, mediante variedades Bt que produzam uma quantidade de toxina maior que a dose aplicada habitualmente como inseticida. A outra segue um caminho indireto, semeando variedades convencionais (no Bt) em espaos predeterminados, que sero refgios onde os insetos no entrem em contato com a toxina. Em vez de tentar eliminar o inseto, diminui-se a infestao mediante uma presso seletiva mais frouxa que mantm a sensibilidade ao inseticida em uma proporo considervel da populao. Hoje, a manuteno de refgios nas lavouras de plantas Bt (algodo, milho) uma prtica bem estabelecida para o controle de insetos. O gerenciamento dos riscos envolve algumas medidas complementares que visam amortecer o impacto eventual do fluxo gnico a outros cultivos. Vimos anteriormente que um gene que confere tolerncia a um herbicida no vantajoso em ausncia do mesmo, mas o que ocorreria em se tratando de um gene que conferisse algum valor adaptativo, tal como a produo de um inseticida?
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O risco de polinizao cruzada depende da espcie, sendo mais fcil de acontecer no milho, em que o plen se dispersa levado pelo vento, do que na soja ou no trigo, em que h autofecundao. A presena de espaos ou corredores de isolamento evita a disseminao de plen transgnico no s para as variedades silvestres como, tambm, para as convencionais, evitando prejuzos significativos para o agricultor que os comercializa. O tamanho dos espaos ou corredores de isolamento depende das caractersticas reprodutivas da espcie em questo e de fatores ambientais, como o vento. No caso do milho, por exemplo, se estima que o risco de polinizao cruzada entre os cultivos passa de 1% a zero quando a distncia entre ambos aumenta de 100 a 1.000 ps. A probabilidade de ocorrer o fluxo gnico aumenta se houver, na proximidade, espcies silvestres compatveis. Por isso devem-se extremar os cuidados em relao ao cultivo de plantas geneticamente modificadas nos lugares onde existam variedades silvestres aparentadas, tais como a batata no Peru, o milho no Mxico, o arroz na ndia, a soja na Coreia e na China. No Brasil, onde existem variedades silvestres do algodo, a CTNBio delimitou zonas de excluso para o cultivo de algodo biotecnolgico. Em relao vida silvestre, apesar do estardalhao causado oportunamente pela notcia de que as borboletas monarcas seriam afetadas pelo contato com plen de plantas de milho Bt, segundo os prprios autores do estudo, trata-se de uma experincia laboratorial desenvolvida em condies diferentes das de um ambiente natural. Resistncia a vrus Assim como a vacinao, a resistncia a vrus est baseada na transferncia de uma parte do genoma viral a fim de inibir sua reproduo. A produo em excesso da protena de revestimento viral inibe a sntese de seu material gentico. Esta tecnologia foi utilizada para erradicar viroses da batata, da beterraba, do pepino, do tomate, da couve-flor e do melo. Os produtos hortcolas tm recebido menos ateno que os cereais e as leguminosas em funo da resistncia do consumidor tecnologia e, tambm, do alto custo da construo de uma planta transgnica para cultivos com pequena produo. Contudo, as variedades de papaia resistente a vrus (UH Rainbow, UH SunUp), comercializadas nos Estados Unidos, salvaram o Estado do Hava de um desastre econmico. No Brasil, a CTNBio autorizou recentemente o cultivo do feijo tolerante ao vrus do mosaico dourado. Aguarda-se a liberao do mamo resistente ao vrus da mancha anelar. Ambos foram desenvolvidos pela Embrapa. Eventos combinados A insero de um trao considerada um evento que demanda a aprovao das autoridades correspondentes. Novidade no mercado, as plantas piramidadas apresentam vrios eventos combinados, tais como tolerncia a dois herbicidas, tolerncia a herbicida e resistncia a insetos, ou resistncia a dois tipos de insetos, um que ataca a raiz e outro a parte superior da planta. O mais recente lanamento o milho Genuity SmartStaxTM (Monsanto, DowAgroSciences), que rene oito genes para o controle de pragas acima e abaixo do solo, e a tolerncia a herbicidas para o controle de plantas daninhas.

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PLANTAS COM QUALIDADES NUTRICIONAIS MELHORADAS Uma segunda leva de plantas transgnicas contempla a modificao das qualidades das plantas, isto , das propriedades que interessam ao consumidor como, por exemplo, o melhoramento da qualidade nutricional, a reduo de alrgenos, modificaes do tempo de conservao e das caractersticas organolpticas, a adequao ao processamento industrial dos leos e amidos etc. Em 1974, a variedade Tower de Brassica napus recebeu o nome de canola (do ingls canadian oil, low acid). Trata-se da colza, uma planta oleaginosa que a modificao gentica tornou comestvel, ao diminuir o teor de cidos graxos saturados e a quantidade de glucosinolato. Modificaes posteriores originaram numerosas variedades que diferem na composio dos cidos graxos, sendo algumas delas tambm tolerantes a herbicidas. Entretanto, o principal marco no desenvolvimento deste tipo de transgnicos o arroz com vitamina A (Golden Rice), que provavelmente chegar ao mercado em 2014. A carncia de vitamina A decorrente de uma dieta baseada exclusivamente no arroz causa a cegueira irreversvel e a morte de milhes de crianas na sia. A insero de dois genes de narciso e um gene bacteriano em uma variedade de arroz indica deu origem a um gro amarelado contendo -caroteno, que um dos precursores da vitamina A. Considerado um empreendimento humanitrio, vrias empresas cederam, nos pases em desenvolvimento, os seus direitos sobre as patentes envolvidas na construo do arroz dourado. Espera-se que sejam produzidas plantas com outras alteraes no teor de nutrientes: arroz contendo ferro, milho enriquecido com os aminocidos lisina e triptfano e batata com alto teor de protenas com metionina e lisina. Em 2005, a Monsanto anunciou ter obtido a variedade de soja Vistive com baixo teor de cido linolnico, o que torna o leo mais estvel e dispensa a hidrogenao, uma fonte de gordura trans. Este leo de soja utilizado como ingrediente de biscoitos (Cargill e Kelloggs). A China desenvolveu e liberou recentemente o milho com fitase para integrar as raes animais. Este milho permitir a assimilao de fosfatos pelos sunos, melhorando a produtividade do rebanho e diminuindo a poluio ambiental. PLANTAS COM PROPRIEDADES NOVAS Existe uma terceira leva de plantas biotecnolgicas desenvolvidas especialmente para desempenhar o papel de fbricas biolgicas, produzindo frmacos, vacinas e plsticos. Esto em andamento os testes de campo com alfafa, milho, arroz, tabaco, banana e batata. Para evitar a contaminao acidental dos alimentos, essas plantas tero que ser cultivadas em confinamento e processadas separadamente das plantas comuns. Formas alternativas de evitar a disseminao do transgene no plen esto sendo desenvolvidas, tais como sua insero no DNA dos cloroplastos. As protenas extradas e purificadas sero utilizadas pela indstria farmacutica. Uma regulao estrita dever controlar o cultivo, o transporte e a distribuio destas plantas. Os sistemas que poderiam tornar as plantas estreis despertaram uma forte reao contrria na opinio pblica (sistemas de proteo tecnolgicos ou TPSs, do ingls technology protection systems; tecnologias de uso gentico restrito ou GURTs, do ingls, genetic use restriction technologies). No entanto, possvel que voltem a ser considerados em relao a este tipo de plantas biotecnolgicas.

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O AGRONEGCIO A ADOO DOS CULTIVOS BIOTECNOLGICOS NO MUNDO As primeiras plantas transgnicas datam de 1995 (resistncia a insetos) e 1996 (tolerncia a herbicidas). Embora sua utilizao tenha suscitado polmicas acirradas, em quinze anos a rea semeada com cultivos biotecnolgicos aumentou progressivamente at chegar a 148 milhes de hectares, em 2010. Segundo o International Service for the Aquisition of Agri-Biotech Applications (ISAAA), uma organizao internacional que divulga anualmente os dados correspondentes adoo dos cultivos biotecnolgicos no mundo, em 2010 foram dez os pases que semearam mais de um milho de hectares: Estados Unidos, Brasil, Argentina, ndia, Canad, China, Paraguai, Paquistan, frica do Sul e Uruguai. O mercado global de sementes biotecnolgicas alcanou US$ 11,2 bilhes e o dos principais cultivos (soja, milho, algodo) se aproximou de US$ 150 bilhes. Os cultivos biotecnolgicos possibilitaram o aumento da produo agrcola e melhoraram as condies econmicas dos agricultores. Mais de 90% dos 15,4 milhes de fazendeiros que plantaram sementes biotecnolgicas so pequenos produtores rurais, especialmente na China, na ndia, nas Filipinas e na frica do Sul. Os outros so grandes produtores de pases industrializados, como os Estados Unidos e o Canad, e de pases emergentes como Argentina e Brasil. Nos pases onde a mo de obra agrcola est constituda principalmente por mulheres, os cultivos biotecnolgicos melhoraram suas condies de vida, ao permitir que elas dedicassem mais tempo ao cuidado das crianas ou a outras atividades. Os problemas de sade causados pela contaminao ambiental com agrotxicos diminuram em funo de uma reduo de 14% na aplicao de inseticidas, sendo que em alguns casos esa diminuio teria chegado a 50% (China, Argentina). Com a liberao da comercializao do arroz Bt na China e do feijo resistente vrus no Brasil, inicia-se uma nova etapa que contempla as principais fontes de alimento locais. Encontram-se em andamento vrios estudos, sobre o gro de bico na frica, a berinjela na ndia, o milho resistente seca nos Estados Unidos e na frica sub-sahariana. Calcula-se que o nmero de pases produtores de cultivos biotecnolgicos passe de 29 em 2010 a 40 em 2015, ano dos Objetivos do Milnio, um compromisso da sociedade em reduzir metade a fome e a pobreza. O MERCADO DE SEMENTES Os gigantes gnicos Nos pases do continente africano e de parte da sia, em que a agricultura a principal fonte de alimentos, os pequenos agricultores dependem das sementes; na poca da colheita eles separam uma parte que ser conservada para o plantio do prximo ano. Nos pases desenvolvidos, a proporo da populao dedicada s tarefas agrcolas bem menor, devido mecanizao do campo. A agricultura de subsistncia cede lugar a um enorme complexo agroindustrial, que integra outras atividades, como a venda de insumos (maquinarias, produtos qumicos, sementes etc.) e a transformao e distribuio de produtos. Embora a produo de sementes como atividade lucrativa remonte ao sculo XIX, o milho hbrido que inicia a dependncia do agricultor das empresas produtoras de sementes. As construes genticas que conferem vigor (heterose) s plantas foram o agricultor, ano aps ano, a comprar novas sementes.

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A transgnese no inviabiliza a utilizao de sementes para o ano seguinte. No entanto, as novas tecnologias inseridas no gro devem ser pagas mediante complexos sistemas de royalties s empresas detentoras das patentes correspondentes. Quem ir pagar? Quanto e quando e como pagar? A resposta tem suscitado vrios conflitos entre as grandes corporaes e pases como Argentina e Brasil. Logo depois da crise do petrleo da dcada de 1980, as grandes empresas transnacionais produtoras de agrotxicos e fertilizantes qumicos entraram na rea agrcola. Uma das razes que o mercado de sementes tem uma margem de lucro maior. Outra que leva menos tempo desenvolver uma planta geneticamente modificada que um produto qumico novo. Vrios ciclos de fuses caracterizaram um processo de concentrao e consolidao em que centenas de pequenas empresas foram absorvidas por enormes conglomerados, produtores de agroqumicos e de sementes, com ramificaes na indstria farmacutica. Na linha de frente em relao s novas tecnologias, estas empresas concentram um enorme poder que desperta uma forte resistncia na opinio pblica. Denominadas Gigantes Gnicos (do ingls, Gene Giants), as principais empresas produtoras de sementes so Monsanto, Syngenta, Dow AgroSciences, DuPont e Groupe Limagrain. As sementes biotecnolgicas representam 30% do mercado mundial de sementes, estimado em US$ 47 bilhes em 2015. A cadeia produtiva da semente Cada pas desenvolve variedades adaptadas a seus solos e condies climticas. Uma vez aprovados e registrados, esses cultivares podero ser disponibilizados para os agricultores. O processo de amplificao do nmero de sementes, estritamente regulamentado, contempla vrias etapas de que participam diferentes entidades do setor pblico ou privado (Figura 14.4).

FIGURA 14.4. Os elos que integram a cadeia produtiva da semente.

Estado (Institutos de pesquisa, universidades)

Inventores / Obtentores

Empresas nacionais (Sociedades, cooperativas e empresas familiares)


Empresas internacionais

Multiplicadores

Diversa estrutura empresarial

Produtores e comerciantes

Diversa estrutura empresarial

Agricultores

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No caso da caracterstica transgnica, esta precisa da aprovao das instncias legais competentes, antes de ser transferida para os cultivares locais e passar por todo o processo de multiplicao, certificao e registro, para poder chegar at o agricultor e este iniciar o plantio. A cadeia produtiva da semente envolve inventores e obtentores, multiplicadores, produtores e comerciantes de sementes e agricultores. A qualidade das sementes estabelecida pela legislao e pelas agncias de certificao de sementes, que garantem ao comprador sementes dentro dos padres. A UNIO EUROPEIA E A MORATRIA Nos Estados Unidos, trs agncias controlam e regulamentam o uso das novas tecnologias genticas: USDA (United States Department of Agriculture), EPA (Environmental Protection Agency) e FDA (Food and Drug Administration). A resistncia aos cultivos transgnicos inexistente ou muito baixa, sendo plenamente adotados desde 1996. Na Unio Europeia, a resistncia aos cultivos transgnicos muito alta. Uma moratria suspendeu em 1999 o cultivo de novas variedades transgnicas assim como a comercializao de seus produtos, porm sem atingir algumas variedades autorizadas anteriormente para cultivo, importao ou utilizao na produo de alimentos ou de raes. O primeiro passo para o levantamento da moratria foi dado em 2003, com o estabelecimento de normas de rotulagem e de rastreamento de traos transgnicos e com a implantao de diretrizes para o cultivo de plantas transgnicas, de maneira a minimizar a contaminao dos campos de cultivos orgnicos e convencionais. A aprovao da importao, em 2004, de um milho transgnico enlatado para o consumo humano (milho Bt resistente a insectos da empresa Syngenta) representa um segundo passo. Na realidade, esse milho j estava autorizado para entrar sob a forma de leo ou de outros derivados. Mas abriu uma brecha para novos pedidos de autorizao de produtos alimentcios e de milho e colza resistentes a herbicidas. Em 2010, seis pases da Unio Europeia (Espanha, Portugal, Repblica Tcheca, Polnia, Eslovaquia e Rumana) produziram milho biotecnolgico e outros trs (Alemanha, Sucia e Repblica Tcheca) cultivaram a batata Amflora. OS PASES DE AMRICA LATINA Em Amrica Latina (Brasil, Argentina, Paraguai, Uruguai, Bolivia, Colmbia, Chile, Honduras e Costa Rica), os cultivos biotecnolgicos so a soja, o milho e o algodo. Se bem o desenvolvimento das sementes depende geralmente do setor privado, em vrios pases (Argentina, Brasil, Mxico) o setor pblico comeou a generar suas prpias variedades, respondendo demanda local. Argentina e Brasil contam com uma comunidade acadmica com um alto nvel cientfico e tecnolgico ativo nas universidades e nos centros de pesquisa, com empresas de tradio histrica na difuso da tecnologia agropecuria (Inta, Embrapa) e com condies econmicas limitadas pelas sucessivas crises polticas. Em ambos os pases, numerosas empresas privadas ocupam lugares de destaque em diferentes setores do mercado biotecnolgico. A existncia de convnios e programas de intercmbio cientfico tende a elevar o nvel das atividades cientficas e tecnolgicas. Ao longo dos primeiros quinze anos de implantao das novas tecnologias agrcolas, cada pas seguiu sua prpria trajetria at estabelecer as normas legais que garantem o progresso em condies seguras.

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A COEXISTNCIA POSSVEL? Todos os sistemas agrcolas exercem algum impacto sobre o meio ambiente. No entanto, uma agricultura sustentvel pode minimizar os efeitos negativos da produo agrcola, restaurando a fertilidade e limitando a eroso da terra. Algumas prticas agrcolas j so compartilhadas pelas diversas modalidades agrcolas (orgnica, industrial ou de preciso), incluindo a rotao de culturas, a adubao verde, o manejo de pragas e de nutrientes, o plantio direto com uma cobertura na superfcie do solo etc. Outras so especficas, como, por exemplo, a proibio para os produtores orgnicos de utilizar sementes geneticamente modificadas ou de cultivar terrenos onde previamente tenham sido plantadas culturas biotecnolgicas. Cultivos convencionais e biotecnolgicos ocupam diferentes faixas de mercado e crescem em funo das oportunidades econmicas. A proporo de variedades convencionais e biotecnolgicas varia nos principais cultivos industriais, que so a soja, o algodo, o milho e a canola. A contaminao de um cultivo convencional por um cultivo biotecnolgico acarreta perdas considerveis para o agricultor. Medidas de proteo so tomadas, envolvendo o distanciamento dos cultivos e a manuteno de faixas de excluso de diferente tamanho, segundo as caractersticas da fecundao, autopolinizao ou polinizao cruzada. Testes genticos e imunolgicos permitem identificar a presena de organismos geneticamente modificados em uma carga de cultivos convencionais. O objetivo de ambas as medidas reduzir a presena de sementes adventcias a um limite comercialmente aceitvel (0,9%). Os modelos de regulao dos cultivos tradicionais, orgnicos e biotecnolgicos so considerados de ndole econmica, porque do ao agricultor a possibilidade de escolher a modalidade que melhor lhe convier. No envolvem biossegurana, porque esta analisada no momento da aprovao da variedade biotecnolgica, uma vez satisfeitas as normas legais. Um modelo de regulao, baseado em normas de coexistncia, tem sido desenvolvido na Espanha (2005).

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14. BIOTECNOLOGIA E PECURIA


A CRIAO DE ANIMAIS A criao de animais domsticos para a alimentao se limita a um pequeno nmero de espcies de mamferos, ruminantes (bovinos, ovinos, caprinos) e monogstricos (sunos, coelhos e aves), de peixes, de crustceos e de mariscos. Tambm se criam animais para a prtica de esportes (cavalos) e como companhia (gatos, cachorros, pssaros, peixes). Os grandes estabelecimentos agrcolas praticam a tradicional cultura extensiva de gado (bovino, ovino, caprino) em pradarias e pastagens, enquanto os menores tendem a investir em culturas intensivas de altos rendimentos (gado leiteiro, aves, sunos e peixes) que degradam o ambiente. A produo agrcola depende tambm de fatores econmicos e sociais. medida que melhora o nvel de vida da populao, mudam os padres de consumo e, consequentemente, a atividade agropecuria. Estima-se que entre 1993 e 2020, o consumo de carne nos pases em desenvolvimento ser duplicado. Pequenas empresas familiares sero substitudas por outras de produo intensiva, orientadas a satisfazer o mercado urbano. A criao de ruminantes diminuir em relao criao de aves e sunos. Essas mudanas exigiro maior eficincia na seleo, no gerenciamento das empresas e nos cuidados com a alimentao e a sade dos animais. Nos pases desenvolvidos, o objetivo primordial aumentar ou equilibrar a quantidade de produtos (leite, ovos, carne e l) e, simultaneamente, diminuir os custos. Em relao aos mtodos produtivos, isso significa reduzir o nmero de animais, a necessidade de trabalho e o impacto causado pelas doenas. As biotecnologias se inserem na alimentao e na conservao da sade dos animais, possibilitando tambm o controle da reproduo e a acelerao da seleo gentica. Perspectivas novas surgem com a utilizao dos animais como biorreatores, para a produo de frmacos. A NUTRIO DOS ANIMAIS A NECESSIDADE DE RAES A criao e engorda de gado de corte nas pastagens uma opo possvel para pases com grandes extenses territoriais, tais como a Argentina, a Austrlia, o Brasil, ou a Nova Zelndia. O alimento bsico do gado o capim, que cresce de maneira desigual ao longo das quatro estaes do ano. Como o nmero de cabeas depende do alimento, nos perodos em que falta capim deve-se suplementar a dieta do rebanho com feno (forragem dessecada), silagem (forragem e gros fermentados), gros, concentrados e/ou resduos agroindustriais. Por outro lado, medida que a agricultura invade as reas de pastagem, a pecuria recorre aos regimes de semiconfinamento ou confinamento, estabelecendo como objetivo primordial o aumento da produtividade (gado leiteiro, aves e sunos). Parte dos cultivos de cereais (milho) e de leguminosas (tortas de soja, algodo, colza e girassol) utilizada como rao, para suprir as necessidades proteicas e energticas dos animais, sendo necessrios de 3 a 10 kg de gros para obter 1 kg de carne. Como o valor nutricional dos gros varivel, acrescentam-se s raes alguns complementos nutritivos. Vrios produtos industrializados fornecem um contedo de nutrientes equilibrado para as necessidades dos animais, em funo de sua espcie, sua idade etc.

Copyright Maria Antonia Malajovich Biotecnologia: ensino e divulgao (www.bteduc.bio.br)

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DE LIEBIG VACA LOUCA Os suplementos nutritivos proteicos foram introduzidos a fins do sculo XIX. Em 1865, Liebig inventou um procedimento industrial para transformar os restos dos animais em extrato de carne, vendido como complemento para a alimentao humana, e farinha de carne, utilizada para fortificar as raes animais. Bem antes da Segunda Guerra Mundial, as raes dos ruminantes dos pases desenvolvidos j incluam de 2 a 5% de farinha de carne. Finalizada a guerra e at 1973, a Europa importou gros para as raes. Quando condies climticas adversas causaram uma grande quebra da safra de soja nos Estados Unidos, estes embargaram o gro disponvel, para garantir as necessidades internas. Sem gros como fonte proteica das raes, a nica opo que restou aos europeus foi a farinha de carne. Na tentativa de baratear ao mximo os custos das raes, deixou-se de extrair a gordura com solvente e modificaram-se as condies de esterilizao. A incluso de restos de animais doentes, inicialmente ovelhas com scrapie, uma doena espordica conhecida no Reino Unido desde 1732, pode ter contaminado as vacas e provocado o surto da doena da vaca louca, uma variante da doena de Creutzfeldt-Jakob que afeta o homem, causando-lhe danos neurolgicos graves. Esta variante se manifesta mais rapidamente e ataca as pessoas jovens. Em 1988, a farinha de carne foi proibida na alimentao do gado bovino e ovino. A epidemia exigiu o sacrifcio de boa parte dos rebanhos no Reino Unido e de outros pases da Europa, colocando em discusso a composio das raes animais e mostrando a necessidade de aumentar a quantidade e a qualidade dos suprimentos de gros e de plantas forrageiras.

VARIAES SOBRE A COMPOSIO DAS RAES Alm da farinha de carne, outros produtos j foram utilizados como suplemento proteico, entre eles o leite desnatado em p e a farinha de pescado, que hoje est sendo abandonada devido ao aumento do preo resultante da pesca excessiva. A biomassa microbiana seca tem dado bons resultados como fonte alternativa de protenas. Denominada SCP (do ingls, single cell protein), a protena unicelular pode ser obtida de diversas fontes. As leveduras como Saccharomyces cerevisiae constituem um subproduto nas destilarias de lcool; outras como Candida utilis ou Torula se multiplicam sobre os efluentes da indstria de papel ou das queijarias. A bactria Methylophilus methylotropus cresce sobre metanol obtido a partir do gs do Mar do Norte, sendo a SCP correspondente comercializada, no Reino Unido, sob o nome de Pruteen. O acrscimo de enzimas (proteases, celulases, amilases etc.) tende a aumentar a digestibilidade das raes. Uma dieta baseada em gros tem como inconveniente a introduo de fsforo e outros nutrientes complexados ao cido ftico. No caso dos ruminantes, a flora microbiana do sistema digestrio consegue disponibilizar parte do fsforo, mas isso no ocorre nos animais monogstricos como os sunos, as aves e, inclusive, o homem. Os fitatos impedem a assimilao do fsforo, mas a adio da enzima fitase na rao melhora a assimilao dos nutrientes e diminui a quantidade de fsforo excretado no ambiente, que uma das causas da eutrofizao dos cursos de gua. A adio de antibiticos visa proteger as raes da ao bacteriana. J a adio de probiticos procura modificar o ambiente gastrintestinal, estimulando a multiplicao de certos tipos bacterianos em detrimento de outros.

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A fitase produzida por fermentao microbiana e sua adio nas raes obrigatria na Europa. Trata-se de um mercado mundial de aproximadamente US$ 500 milhes, 40% do qual sito na China. A aprovao do milho com fitase (Academia de Cincias Agrcolas da China, Origin Agritech Ltda.) representa um marco importantssimo para a China. AS RAES TRANSGNICAS O escndalo da vaca louca, seguido pelo caso dos frangos contaminados com dioxina mostrou o descaso existente pelos produtores europeus em relao s raes animais. Por isso, em 1998, no foi surpresa o estardalhao causado por A. Pusztai, um renomado cientista do Reino Unido, ao declarar na televiso ter encontrado alteraes do sistema imune em ratos alimentados com batatas cruas, transgnicas para uma lectina inseticida natural de campnula. Uma auditoria realizada por cientistas independentes considerou essas concluses errneas, o que foi confirmado mais tarde pela Royal Society do Reino Unido. As raes representam at 70% dos custos da criao de animais, sendo um dos gargalos da produo agrcola. Toda tentativa de baratear as raes assimilada rapidamente. Porm, devido aos precedentes desastrosos e a desconfiana da populao, a introduo de plantas geneticamente modificadas foi analisada cuidadosamente em diversos tipos de animais, e no se evidenciaram sinais de toxicidade da soja, da ervilha, do lupino, do algodo e da batata em ratos, nem da colza em coelhos. As caractersticas das carcaas, dos tecidos e das carnes no mudaram em animais que receberam alimentos transgnicos. Numerosos estudos desenvolvidos em instituies de pesquisa e universidades mostraram que, tanto em relao composio qumica como digestibilidade e ao valor nutritivo, as plantas biotecnolgicas disponveis so substancialmente equivalentes s no transgnicas. Organizaes internacionais como FAO/WHO (Food and Agriculture Organization e World Health Organization) consideram, desde 1991, que a ingesto de DNA segura, independentemente de ser sua fonte transgnica ou no. As organizaes norte-americanas FDA (Food and Drug Agency), em 1992, e EPA (Environmental Protection Agency), em 2000, manifestaram-se no mesmo sentido. A Unio Europeia no considera necessrio rotular os alimentos provenientes de animais alimentados com raes geneticamente modificadas. Segundo a FASS (Federation of Animal Science Societies), as raes so digeridas normalmente pelos animais estudados, sem que sejam detectados cidos nucleicos ou protenas de origem transgnica na carne, no leite ou nos ovos. Este era um resultado esperado, porque em funo dos conhecimentos sobre digesto e absoro, tanto as protenas como o DNA so degradados durante o processo digestivo. Em alguns casos em que as plantas tm as propriedades agronmicas modificadas como, por exemplo, o milho resistente a insetos (milho-bt), verifica-se uma reduo substancial do teor em micotoxinas. Isto porque, ao diminuir os ataques de insetos, h menos leses que possibilitem a infeco e o crescimento dos fungos. As micotoxinas so muito perigosas para os animais que ingerem os gros contaminados, porque causam hemorragias, danos no fgado e nos rins, diarreias e cncer. O milho transgnico melhora a qualidade do alimento e a sade animal, especialmente dos monogstricos, mais sensveis as micotoxinas que os ruminantes. Esto sendo estudadas plantas com maior digestibilidade, como uma alfafa transgnica com menos lignina. Por outro lado, o melhoramento das plantas forrageiras tambm abre perspectivas interessantes. Observou-se, por exemplo, aumento de peso e bom crescimento da l em ovelhas alimentadas com lupino transformado geneticamente, de maneira a sintetizar uma protena de girassol com alto contedo de metionina.

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O MELHORAMENTO GENTICO DO GADO Existem hoje mais de 5.000 raas de gado, resultantes de muitos anos de adaptao a diferentes condies ambientais. O melhoramento gentico visa trs objetivos fundamentais. O primeiro aumentar a eficincia da converso do alimento, de maneira a incrementar a taxa de crescimento corporal; o segundo acrescer a produtividade (leite, ovos) e o ltimo, mais recente, modificar a composio da carcaa aumentando a quantidade de protena (carne e leite) em detrimento da gordura. Os empreendimentos bem-sucedidos na rea de melhoramento vegetal visam seleo de caracteres devidos a um nico gene, porque, para as grandes empresas, isso significa a recuperao rpida dos investimentos, atravs da venda anual de sementes. Em relao ao melhoramento animal, precisa-se de muito mais tempo. Em bovinos, por exemplo, existe um perodo de quatro anos entre uma gerao e outra. Muitas das caractersticas selecionadas em animais mostram uma variao contnua, que em vez de responder a um gene nico, resulta da contribuio de vrios genes (herana polignica ou quantitativa). Se estiverem situados em cromossomos diferentes, a seleo acarretar inevitavelmente a de genes vizinhos, que podem ser desfavorveis. Os frangos do tipo broiler, por exemplo, tm-se transformado em um alimento comum e barato, em contraste com anos atrs. Selecionados por 50 geraes, esses frangos crescem quatro ou cinco vezes mais rpido que seus antepassados. Mas, no caminho, apareceram alguns efeitos deletrios, tais como o aumento do teor de gorduras, a fertilidade baixa e a presena de anormalidades esquelticas. Por outro lado, galinhas selecionadas como poedeiras desenvolveram osteoporose, ao desviar o clcio do esqueleto para a construo da casca dos ovos. E os perus desenvolveram um tamanho tal que no conseguem acasalar sem riscos, sendo necessrio proceder inseminao artificial. A seleo assistida por marcadores moleculares obteve um grande sucesso na rea, justamente por amenizar a dificuldade de se lidar com traos multignicos. Ciclos de vida mais longos tornam mais lenta a recuperao dos investimentos de modo que, a exceo da produo de frangos, o setor resulta menos atrativo para as grandes empresas privadas. A distribuio do material gentico se encontra nas mos dos pecuaristas e de pequenos empreendimentos privados, responsveis por mais de 80% da pesquisa e desenvolvimento na rea agropecuria dos pases desenvolvidos. O CONTROLE DA REPRODUO O controle da reproduo dos animais permite a expanso rpida dos estoques, reduzindo os custos de transporte de animais. O processo comea com a seleo dos pais (reprodutores e matrizes), escolhidos pelas suas caractersticas genticas relativas produtividade e sade (Figura 15.1). A inseminao artificial se pratica desde meados do sculo XX, no gado bovino, ovino, caprino, porcino e em aves (perus, frangos). Devido ao custo, a tcnica mais utilizada com o gado de leite, que tem um preo por cabea mais alto que o gado de corte. Neste caso, complementa-se a inseminao artificial com a sexagem prvia do smen, a fim de escolher os espermatozoides que podero dar origem a fmeas. O smen colhido de um reprodutor introduzido no tero das matrizes. Considerando que uma nica ejaculao de um touro produz aproximadamente 100 doses de smen, que um animal chega a produzir 4.000 doses por ano e que a eficincia da inseminao chega a 50%, o mtodo permite obter aproximadamente 2.000 crias por reprodutor ao ano.

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Com o desenvolvimento das tcnicas de criopreservao pode-se utilizar tanto o smen fresco como o congelado, o que possibilita tambm a conservao da biodiversidade de raas em perigo de extino. Uma dose de smen custa a partir de 14 reais e, se for de qualidade comprovada, 20 reais. O touro Bandido, que teve uma exitosa participao em uma novela de televiso e morreu prematuramente, deixou smen congelado. Dele descendem os touros Zango, Matador e Carrancudo que participam em festas de rodeio por todo o Brasil. Normalmente, uma vaca produz uma cria por ano. Tratada com hormnios para induzir uma superovulao e inseminada artificialmente, essa vaca poder gerar simultaneamente cinco embries, que sero colhidos mediante a lavagem do tero e transferidos a uma vaca receptora. A criopreservao garante que 25 a 50% dos embries congelados possam originar animais vivos. Como o processo todo (superovulao + inseminao + transferncia dos embries) pode ser repetido quatro vezes por ano, apesar das limitaes tcnicas existentes, uma vaca ter 10 crias por ano. Outra variante consiste em extrair os ovcitos das vacas superovuladas, ou dos ovrios de animais sacrificados, procedendo a uma fecundao artificial antes de reimplantar os embries nas vacas receptoras. O nmero de embries tambm pode ser aumentado por bipartio, por micromanipulao do blastcito com 64 a 128 clulas. A aplicao de testes genticos nos pais e nos embries, antes de ser reimplantados, permite uma seleo apurada da descendncia. FIGURA 15.1. O Controle da reproduo em bovinos.
O controle da reproduo dos animais domsticos depende de diversas tcnicas (superovulao, inseminao artificial, coleta de ovcitos ou de embries, criopreservao, transplante de embries).

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AS NOVAS TECNOLOGIAS O mapeamento do genoma dos animais domsticos O estudo do genoma dos animais domsticos fornece informaes precisas e eficientes para a seleo de alguns caracteres. O objetivo bsico estabelecer uma correlao entre os genes e as sequncias no funcionais que, distribudas ao longo do genoma, iro cumprir o rol de marcadores moleculares. Centenas destas sequncias j foram identificadas na vaca, no porco, no frango, na cabra, na ovelha, no salmo, no camaro etc. Trata-se de micro e minissatlites, isto , sequncias curtas de DNA repetidas um nmero varivel de vezes que so transmitidas de uma gerao a outra e podem ser identificadas por eletroforese. Quando o gene responsvel por uma caracterstica de interesse est associado a um determinado marcador, ambos sero selecionados juntos. Com caracteres monognicos, os resultados se obtm rapidamente, mas com caracteres polignicos devem-se procurar os genes que contribuem substancialmente na variao. A anlise de marcadores tambm utilizada na determinao do parentesco (pedigree) e na identificao dos animais, tanto no campo como nos produtos derivados. J foram sequenciados alguns genomas de animais domsticos. medida que outros sejam completados e se conheam melhor as sequncias expressas nas molculas de mRNA, as tcnicas eletroforticas podero ser substitudas por chips de DNA (microarrays). A clonagem A clonagem de animais domsticos por partio embrionria utilizada desde a dcada de 1980. Na dcada seguinte, outras perspectivas se abriram com a tcnica de transferncia nuclear, que consiste em transferir o ncleo de uma clula doadora a um ovcito receptor, previamente anucleado, de outro animal. Dolly (1977-2003) foi o primeiro animal obtido mediante esta tcnica, depois de 277 tentativas fracassadas (Figura 9.9). Fenmeno meditico, Dolly teve um tumor no pulmo, sendo sacrificada depois de desenvolver artrite em uma pata e de mostrar sinais de envelhecimento precoce. Nascidas pouco tempo depois, Polly e suas irms levam o gene codificador do fator IX, uma protena fundamental para a coagulao sangunea. As dificuldades tcnicas esto, principalmente, na estimulao do citoplasma receptor e na coordenao entre a atividade citoplasmtica e nuclear. Quando a reprogramao celular incompleta, observam-se fenmenos epigenticos que abrangem o DNA, a cromatina e a inativao do cromossomo X. Por outro lado, os problemas de sade so mais frequentes em clones porque a gestao mais demorada e o tamanho do recm-nascido maior. As taxas de mortandade perinatal aumentam assim como o nmero de malformaes congnitas. Por enquanto, a clonagem no usada no melhoramento direto dos rebanhos, sendo aplicada aos animais fundadores, principalmente bovinos e sunos, porque so os nicos em que os benefcios justificam o custo do procedimento. Alguns exemplos so ilustrativos: Bull 86 Squared, um clone de um animal resistente brucelose, salmonelose e tuberculose; Annabell Zeta, uma vaca da raa Holstein recordista da produo de manteiga, clonada com sucesso por apresentar problemas de fertilidade; Second Chance, nascido depois de 189 tentativas de clonagem de Chance, um touro que participou em rodeios e filmes.

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A tecnologia est sendo desenvolvida tambm na Argentina e no Brasil. Ciruelito um clone de Ciruelo, grande campeo da raa Brangus. Lenda e Glria da Embrapa descendem de Vitria, uma vaca da raa Simental, nascida por transferncia nuclear; Por e Potira descendem, via bipartio embrionria, de uma vaca da raa bovina Junqueira, em alto risco de extino; tambm zebunos foram clonados. Em ambos os pases existem empresas privadas especializadas na clonagem comercial de bovinos (BioSidus, ARG Natural Beef; Vitrogen, Geneal) em empreendimentos ligados a universidades ou institutos de pesquisa agronmica. De um modo geral, a clonagem utilizada para animais de elite, doentes ou acidentados, estimando-se em redor de US$ 20.000 o preo de um bezerro clonado, nos Estados Unidos. Ainda pode demorar vrios anos at que o preo se torne interessante para o melhoramento direto na pecuria. Diferente dos bovinos, os equinos nasceriam mais saudveis. Em 2003, a mula Joy of Idaho foi o primeiro clone de um hbrido de uma gua e um jumento. No mesmo ano e depois de 847 tentativas, nasceu na Itlia a gua Prometea, gerada a partir de uma clula somtica materna, o que a torna ao mesmo tempo filha e irm gmea de sua me. Em 2005 obtiveram-se os primeiros clones de um cavalo de corrida (Pieraz Cryozootech), e de um cavalo de salto (Paris-Texas). Recentemente, nasceu na Argentina BS andubay, clone de andubay, um cavalo crioulo (Halitus, BioSidus). No Brasil, as potras Branca e Neve foram obtidas por bipartio embrionria. Observe-se que a inseminao artificial e os tratamentos de fertilidade esto proibidos em cavalos de corrida, puros-sangues. Contudo, as possibilidades da clonagem vo alm do aumento da taxa de fertilidade de animais elite e da conservao de animais com caractersticas interessantes. A clonagem pode ser utilizada para a conservao de espcies raras e em risco de extino, para a criao de rebanhos homogneos que facilitem trabalhos de pesquisa e para a propagao rpida de alguns organismos transgnicos. Esta ltima aplicao justifica a importncia dada a Dolly. A transgnese O primeiro camundongo transgnico nasceu em 1981. A partir de 1988 comearam a ser produzidos vacas, cabras, coelhos, ovelhas, frangos, porcos e peixes transgnicos. Poucos meses depois do nascimento de Dolly, o mesmo grupo do Instituto Roslin e PPL Therapeutics anunciou o nascimento de Polly, uma ovelha transgnica para o gene codificador do fator IX, uma protena fundamental para a coagulao sangunea e que falta nos hemoflicos. Observe-se que, dado o custo de um animal transgnico, mais econmico fazer um clone que construir outro. Uma das preocupaes existentes se relaciona com o risco de escapamento de um animal transgnico e a possibilidade de difundir o transgene nas populaes naturais. O risco depende de algumas caractersticas do animal, especialmente a mobilidade, a capacidade de escapar do cativeiro e a de voltar ao estado selvagem (Tabela 14.1). Outros fatores adicionais que devem ser considerados em uma simulao de risco so a viabilidade juvenil, a idade de amadurecimento sexual, a fertilidade do macho, a fecundidade da fmea, a viabilidade do adulto etc. A comercializao de animais transgnicos ou seus produtos avana muito lentamente, no s pelos altos custos como pelo tempo demandado para responder ao processo regulatrio e a resistncia eventual dos consumidores.

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TABELA 14.1. O risco de escapamento de um animal transgnico.


ESPCIE Camundongos Peixes Insetos Porcos Aves Vacas MOBILIDADE Alta Alta Alta Baixa Baixa Baixa CAPACIDADE DE VOLTAR AO ESTADO SELVAGEM Alta Alta Alta Alta Baixa Baixa CAPACIDADE DE ESCAPAR DO CONFINAMENTO Alta Alta Alta Moderada Baixa Baixa

O MELHORAMENTO DA PRODUO CARNE, LEITE, OVOS E L A produo de alimentos um dos objetivos fundamentais da atividade agropecuria. A utilizao de modificadores metablicos permite no s incrementar a produo como modificar a relao entre carne e gordura, de maneira a diminuir o desperdcio. Entre os modificadores metablicos mais utilizados esto os hormnios bST (somatropina bovina) e pST (somatropina porcina), produzidos a partir de microrganismos transformados por engenharia gentica. Os hormnios estimulam o crescimento em bezerros e porcos e a produo de leite em vacas. Sua utilizao gerou polmicas, sendo proibidos em alguns pases da Europa, mas permitidos em 19 pases, entre os quais a Argentina, o Mxico e o Brasil. Experincias de transgnese visam melhorar a qualidade do leite de vaca modificando as protenas (leite humanizado para lactantes) ou reduzindo a lactose (para as pessoas com intolerncia). Na Nova Zelndia e nos Estados Unidos vm sendo obtidas vacas que produzem mais casena no leite, uma propriedade interessante para a indstria de queijos. A insero de um gene bacteriano codificador de fitase deu a origem ao EnviropigTM, um porco que produz a enzima na saliva, de maneira que a concentrao de fsforo no esterco 60% menor que no dos porcos convencionais. Ainda sem a aprovao das autoridades pertinentes, o EnviropigTM est sendo criado em confinamento, no Canad. Algumas tentativas foram feitas em relao produo de fibras animais: ovelhas transgnicas que no precisassem de determinados suplementos de aminocidos na dieta; modificao da estrutura das fibras de l e de caxemira para facilitar o tingimento e diminuir o encolhimento; alterao das propriedades da seda. A partir de uma protena de aranha, sintetizada por uma cabra transgnica, se desenvolveu e patenteou o BiosteelTM, um produto muito resistente que pode ter diversos usos, inclusive militares. Na dcada de 1980, a transferncia de um gene codificador de hormnio de crescimento humano originou ratos duas vezes maiores. Quando repetida a experincia com porcos, obteve-se o Beltsville pig, um animal que apresentou problemas variados: dificuldades respiratrias, artrite, letargia etc. O fracasso suscitou vrios questionamentos ticos em relao ao tratamento infringido aos animais. De um modo geral, a transgnese do hormnio de crescimento (GH, do ingls growth hormone e GHFR, do ingls growth hormone factor releasing) nos animais domsticos tem sido problemtica, salvo em peixes.

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A AQUICULTURA Os principais pases produtores de peixes, mariscos e crustceos por aquicultura so a Noruega, o Chile, o Canad, os Estados Unidos, o Reino Unido, a Nova Zelndia e os pases asiticos. O desenvolvimento da aquicultura parece uma alternativa razovel para a produo de alimentos porque, em funo da pesca desmedida, os estoques de peixes nos mares e oceanos tm diminudo assustadoramente. No entanto, do ponto de vista ecolgico, ainda subsistem dvidas em relao aquicultura. Alguns peixes no exigem nenhuma complementao da rao, como as carpas e tilpias. J o camaro e o salmo so criados com raes que incluem farinha de peixe. Quais seriam as vantagens da aquicultura se for necessrio extrair peixe para a preparao das raes? A criao de peixes e mariscos uma atividade empresarial que cria empregos, demanda poucos insumos e gera um produto de alto valor agregado. Contudo, alguns problemas subsistem, como a distncia dos mercados de destino e a contaminao das guas costeiras, que dificulta a criao de mariscos filtradores de plncton, favorecendo o florescimento das algas. O gerenciamento destas variveis nas fazendas de salmo d um retorno econmico importante para a Noruega, o Chile o Canad e os Estados Unidos. No entanto, como as guas e os invernos canadenses so muito mais frios que os chilenos, onde o salmo pode ser criado o ano inteiro, os produtores canadenses e norte-americanos se interessaram por um salmo resistente ao frio e de crescimento rpido. Dentro deste contexto, a empresa AquaBounty transferiu para o salmo do Atlntico um cassete de expresso, denominado AquAdvantageTM, com dois genes codificadores de uma protena anticongelamento e um hormnio de crescimento do salmo do Pacfico. O peixe cresce rapidamente em condies comerciais, consumindo 250% mais comida e alcanando o tamanho equivalente ao de um salmo convencional em menos tempo (18 meses em vez de 24 ou 30). Para alguns especialistas, existiriam alguns riscos como a invaso e substituio dos salmes naturais pelos transgnicos ou a introduo de genes de valor adaptativo inicialmente maior que os das populaes selvagens, mas cujo valor diminuiria a mdio prazo, levando a espcie extino (genes troianos). A empresa AquaBounty considera esses riscos sob controle, em funo da condio triploide dos salmes GM AquAdvantage que garante a esterilidade de 98,9% dos peixes e das condies ambientais desfavorveis em Prince Edwards Island (Canad), onde sero produzidos os ovos. Segundo o Protocolo de Cartagena, os peixes transgnicos devem ser criados exclusivamente em conteno. Por isso, a explorao comercial de salmes transgnicos no poder ser feita como at agora, em jaulas marinhas; eles tero que crescer confinados em fazendas dentro do territrio, de maneira a diminuir os riscos de escapamento. AquaBounty planeja desenvolver o processo no Panam, em regies de altitude com a temperatura adequada e rios desfavorveis para a sobrevivncia do salmo. Aguarda-se para 2011 a aprovao do FDA (Food and Drug Administration) para sua liberao comercial. Estima-se que atualmente existam umas 30 variedades de peixes transgnicos em laboratrios de diferentes lugares. Tilpias e carpas transgnicas se encontram em vias de aprovao em Cuba e na China, respectivamente. Tambm esto sendo desenvolvidos camares e mariscos desprovidos da protena responsvel por 80% das alergias e uma truta com mais cidos graxos mega 3.

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A SADE DOS ANIMAIS RESISTNCIA A DOENAS A seleo gentica de animais resistentes uma forma de reduzir o prejuzo devido s doenas, estimado em 10 a 20% da produo. No Reino Unido, a resistncia ao scrapie, por exemplo, se tornou uma condio indispensvel para a entrada de qualquer ovino em um programa de melhoramento. Outras possibilidades so bovinos resistentes vaca louca, mastite e brucelose. O mapeamento do genoma dos animais domsticos facilita a tarefa de selecionar animais resistentes a doenas, tais como frangos resistentes doena de Marek e salmonelose. Na Frana, a transgnese est sendo utilizada para a obteno de trutas resistentes ao SHV (vrus da septicemia hemorrgica), responsvel pela perda de um quarto da produo. Em outros pases, pesquisa-se a introduo de genes que confiram resistncia a doenas que afetam o gado, como a tripanossomase ou a aftosa. PREVENO E TRATAMENTO Os principais produtos desenvolvidos para a sade animal so vacinas, kits de diagnstico, tratamentos (antibiticos, antiparasitrios) e suplementos (hormnios). Estes produtos so necessrios porque as prticas intensivas ou semi-intensivas favorecem a transmisso de doenas entre os animais. Existem numerosas vacinas contra as doenas que afetam os animais; muitas pesquisas se direcionam atualmente para a elaborao de vacinas de subunidades de antgeno em plantas modificadas geneticamente, que possam ser administradas na rao. Tambm est sendo desenvolvida uma vacina para imunizar os animais contra um hormnio reprodutivo (GnRH ou gonadotrophin-release hormone), sendo esta uma alternativa para a castrao de touros e porcos. Alguns animais domsticos constituem um reservatrio de doenas e as transmitem ao homem. Preservar a sade dos animais diminui o risco de contgio, deste modo, uma vacina contra a leishmaniose canina desenvolvida recentemente no Brasil, visa a cortar a corrente de transmisso da doena do cachorro ao homem. As anlises de DNA possibilitam a tipificao dos agentes patognicos e os estudos epidemiolgicos. Os ensaios imunoenzimticos so utilizados para o diagnstico de vrias patologias e tambm para o reconhecimento de diversos tipos de contaminao nos produtos (Salmonella, Escherichia coli, Listeria). A produo de medicamentos visa umas 200 doenas animais diferentes. As indstrias de sade investem aproximadamente US$ 400 milhes por ano em pesquisa e desenvolvimento, mas, de um modo geral, a sade animal movimenta muito menos dinheiro que a sade humana. Salvo em relao aos animais de estimao, o mercado de sade animal cresce lentamente. Na Amrica Latina, numerosas empresas do setor privado elaboram medicamentos, vacinas e testes diagnsticos dirigidos sade animal. Entre as principais: Biognesis e Bag (Argentina), Valle (Brasil), BiosChile (Chile), Laverlam (Colmbia), IASA (Mxico), Laboratrios Santa Elena (Uruguai). Cuba se destaca pela vacina contra o carrapato, que vendida em vrios pases da Amrica Latina. Em relao febre aftosa, uma endemia que afeta a produo de carne e de leite, novas vacinas mais eficientes e fceis de aplicar so indispensveis nas regies em que a doena no foi totalmente erradicada e em que aparecem surtos eventuais: Argentina, Brasil, Colmbia, Mxico, Paraguai e Uruguai.

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Do ponto de vista comercial, as vacinas DIVA (do ingls, differentiating infected from vaccinated animals) so especialmente interessantes porque permitem distinguir animais infectados de animais vacinados. Estuda-se tambm a substituio da vacina atual de vrus inativado por alfafa transgnica que expresse algumas protenas do vrus da aftosa (plant-pharming). Tecnologias avanadas so habitualmente aplicadas na produo de vacinas veterinrias. At o incio de 2011, 12 vacinas geneticamente modificadas foram liberadas no Brasil pela CTNBio (Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana). A aquicultura abre um espao para as empresas que desenvolvem testes de diagnstico e vacinas para os patgenos que afetam as fazendas, como a argentina Tecnovax S.A. e as chilenas Recalcine e AquaGestin, que desenvolveram uma vacina contra o vrus da anemia infecciosa do salmo.

NOVAS UTILIZAES DOS ANIMAIS DOMSTICOS MODELOS DE ESTUDO PARA DOENAS HUMANAS A transgnese utilizada em vrios animais (ratos, camundongos, coelhos e macacos), para transferir caractersticas que permitem sua utilizao como modelo de doenas humanas. O primeiro modelo foi obtido em 1988, ao se transplantar tecidos do sistema imune extrados de um feto humano a camundongos geneticamente imunodeficientes; os animais adquiriram um sistema imune humano. No mesmo ano, obtivera-se o oncomouse, um camundongo com um gene para cncer de mama que permite testar tanto o efeito carcinognico de algumas substncias como a ao teraputica de outras. Com este camundongo, a Universidade de Harvard recebeu a primeira patente para um animal transgnico. A partir desse momento vrios animais foram redesenhados para servir como modelo; coelhos com diferentes genes para lipoprotenas humanas constituem linhagens sensveis ou resistentes a regimes ricos em colesterol; camundongos modificados geneticamente possibilitam os estudos sobre epilepsia, obesidade; mapeamento gentico de doenas neuropsiquitricas em cachorros etc. XENOTRANSPLANTES Os porcos so considerados o fornecedor ideal de rgos para transplante porque o tamanho e a funo destes so equivalentes aos dos humanos. Vlvulas de porco substituem as vlvulas cardacas humanas, depois de eliminar todas as clulas de porco. A eliminao por knock out do gene da 1,3galactosiltransferase (1,3 GalT) na superfcie celular permitiria evitar a rejeio de um rgo transplantado. Contudo, restaria um dos maiores riscos dos xenotransplantes, que a transmisso de vrus de uma espcie a outra. OS ANIMAIS COMO BIORREATORES As protenas teraputicas incluem hormnios, anticorpos, fatores de crescimento e fatores de coagulao. Os genes codificadores de vrias delas tm sido transferidos a microrganismos. Porm, devido necessidade de modificaes ps-traducionais, algumas protenas s podem ser sintetizadas em clulas animais, cultivadas em biorreatores. Contudo, a quantidade de protena produzida muito pequena e os custos operacionais muito altos.

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Uma alternativa a transformao gentica de um animal para convert-lo em um biorreator que expresse a protena de interesse no leite, no sangue, na urina ou nos ovos. De fato, precisa-se de 2 a 3 vezes menos capital inicial, e o custo da protena recombinante cai entre cinco e dez vezes. Obviamente, a eleio de uma ou outra tecnologia depender da demanda do mercado e da dosagem requerida. A aprovao de um produto demanda os testes clnicos correspondentes, e normas regulatrias so estritas e demoradas. A liberao de ATryn, uma antitrombina com propriedades anti-inflamatrias e anticoagulantes, na Europa (2006) e nos Estados Unidos (2009) modificar rapidamente o amplo mercado de fatores de coagulao recombinantes. A empresa responsvel, GTC Biotherapeutics, produz mais de 60 protenas teraputicas diferentes no leite de cabras e vacas. Muitos produtos esto sendo desenvolvidos atualmente, no leite (vacas, cabras, ovelhas, porcos) e nos ovos (aves). Em relao ao fator IX humano, por exemplo, porcos transgnicos excretam a protena no leite em quantidade 250 a 1.000 vezes maior do que se consegue em biorreatores microbianos. Bastam algumas centenas de animais para suprir as necessidades de toda a populao. Vrios produtos se encontram em fase de testes clnicos. Na Esccia, PPL Therapeutics Ltd. cria 200 ovelhas produtoras de AAT ( -1-antitripsina), uma substncia que se encontra em testes clnicos para o tratamento de enfisema hereditrio e fibrose cstica. Nos Paises Baixos, Pharming BV obteve vacas produtoras de lactoferrina humana, uma protena com propriedades antimicrobianas. Na Argentina, BioSidus mantm um tambo farmacutico com duas dinastias de vacas: Pampa, produtora de hormnio de crescimento, e Patagonia, produtora de insulina. No Brasil, a Universidade do Cear mantm um rebanho de cabras transgnicas de raa Canind que secreta no leite o fator de estimulao de colnias de granulcitos humanos (hG-CSF). Hematech Inc. mantm um rebanho em que os genes bovinos foram removidos (knock out) e substitudos (knock in) por genes humanos. Uma vez imunizados, os animais produzem anticorpos policlonais humanos que podem ser utilizados para combater infeces, assistir a pessoas com o sistema imune comprometido ou tratar doenas autoimunes (artrite reumatoide). Anticorpos humanos (Origen Therapeutics) e interferon (AviGenics) tambm so produzidos em ovos de aves transgnicas. Algumas experincias adicionais interessantes que se encontram em andamento so a produo de anticorpos monoclonais para a artrite reumatoide no leite de ruminantes, ou a sntese de um antibitico de amplo espectro por vacas leiteiras, a fim de diminuir a incidncia de mastite por Staphylococus aureus. Outros produtos esto sendo preparados para fazer frente a um eventual surto de bioterrorismo como, por exemplo, anticorpos humanos contra antraz, varola e botulismo em vacas transgnicas (TransOva), ou antdotos contra as armas qumicas como o gs Sarin em cabras (Nexia). Todas estas aplicaes exigem o respeito de normas de segurana estritas. Parece fundamental extremar os cuidados com a eliminao das carcaas e evitar o escapamento de animais transgnicos para produtos medicinais, assim como a entrada acidental de seus produtos na cadeia dos alimentos. O MARCO CONCEITUAL DOS TRS Rs O uso de animais em experimentos tem suscitado numerosos debates, em funo do sofrimento que se lhes infringe e da dificuldade em se transpor ao ser humano a informao obtida nessas pesquisas. Estima-se em 115 milhes o nmero de animais utilizados por ano em pesquisas cientficas entre roedores (83,5%), primatas (0,15%), gatos (0,06%) e ces (0,24%).

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Em 1959, Russell e Burch estabeleceram um marco conceitual conhecido hoje como os trs Rs (do ingls, replacement, reduction and refinement). No momento atual, a cincia no tem como prescindir dos testes em animais em algum momento do desenvolvimento de novos medicamentos e de outras pesquisas. Contudo, os Rs deram incio a uma reflexo tica em relao aos animais (Tabela 14.2). Admite-se hoje que nem tudo o que tecnicamente possvel deve ser permitido, cabendo aos Comits de tica das instituies de pesquisa discutir este aspecto em relao aos projetos que envolvem seres vivos, a fim de evitar o conflito entre o bem dos seres humanos e o dos animais. Nem sempre os maus-tratos decorrem dos procedimentos experimentais, tambm podem ser genticos. Um exemplo significativo o da raa bovina Belgian Blue, que apresenta um crescimento muscular extraordinrio devido a uma mutao no gene codificador da miosina. A carne macia e com muito pouca gordura. Devido largura reduzida do canal plvico e ao grande tamanho dos bezerros, o nascimento s possvel por cesrea. Alguns pases, como a Dinamarca, pedem a extino desta raa. Em relao aos transgnicos, a principal crtica se refere ineficincia dos mtodos de microinjeo. Como s 3% a 5% dos animais carregam o transgene, o nmero de animais descartado muito alto. TABELA 14.2. Significado e alcance dos trs Rs. R 1 2 3 SIGNIFICADO Substituir Reduzir Refinar EXEMPLOS Substituio de animais vertebrados conscientes por seres inscientes, ou por mtodos in vitro. Reduo do nmero de animais necessrio para a pesquisa mediante desenhos experimentais mais apurados estatisticamente. Minimizar ao mximo o desconforto ou o sofrimento dos animais.

OS ANIMAIS DE ESTIMAO O bem-estar dos animais domsticos uma responsabilidade do homem, que deve lhes dar qualidade de vida e minimizar o sofrimento e a dor. Entre estes, os bichinhos de estimao constituem um grupo a parte. Submetidos a processos seletivos diversos, eles experimentam algumas consequncias negativas como a surdez, que atinge quase 10% dos dlmatas. Os cachorros, alis, carregam 300 condies genticas recessivas das quais 250 foram descritas tambm no homem. Em 2010, estimam-se em US$ 11 bilhes os gastos em produtos de sade para os pets norteamericanos. Trata-se de vacinas (raiva, hepatite, leucemia felina etc.) e medicamentos (artrite, parasitas, alergias, problemas dentrios, doenas cardacas, falncia renal, ansiedade de separao, sndrome de disfuno cognitiva etc.). O mercado tambm propcio para a clonagem dos animais de estimao. Algumas empresas j esto envolvidas com a tecnologia, que at agora parece ser mais fcil em relao aos gatos que aos cachorros. O desenvolvimento de Night pearls, um peixe transgnico que brilha no escuro, custou US$ 2,9 milhes. Inicialmente desenhado para monitorar a qualidade da gua, este peixe se transformou em mascote. Existem variedades com fluorescncia verde, vermelha e com uma combinao das duas cores, a um preo de US$ 17,40, no lanamento em Taiwan (2003).
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15. BIOTECNOLOGIA E ALIMENTOS


OS ALIMENTOS FERMENTADOS A descoberta dos processos fermentativos um acontecimento que ocorreu vrias vezes em momentos diferentes da histria da humanidade. A fermentao trazia duas vantagens fundamentais; uma era a eliminao das substncias txicas de alguns gros, e a outra, a preservao dos alimentos. A aquisio de conhecimentos sobre os microrganismos e as enzimas possibilita, a partir da segunda metade do sculo XIX, o desenvolvimento da indstria de alimentos. Esta soube se apropriar de todas as cincias relacionadas (microbiologia, bioqumica, engenharia qumica, automao etc.). Os alimentos fermentados constituem hoje a terceira parte da dieta humana. Seja por facilitar a assimilao dos nutrientes, seja por apresentar menos substncias txicas, esses alimentos entram na categoria dos denominados alimentos funcionais, isto , alimentos que proveem benefcios extras alm dos que seriam esperados em funo dos componentes. Afora os produtos de panificao, as bebidas alcolicas e os laticnios, existem muitos outros tipos de alimentos fermentados. Alguns so de origem animal (pescado, embutidos e presuntos), mas a maioria de origem vegetal, tanto no Ocidente (chucrute, picles, azeitonas, caf, cacau, ch) como no Oriente (shoyu, mis, tempeh, kimchi etc.) e na frica (gari, kokonte ou lafun, agbelima, togwa, kenkey etc.). O PO A arte da panificao surgiu em diferentes lugares, entre 7000 e 5000 a.C. Os primeiros pes eram umas bolachas planas de cereais modos e gua, cozidas sobre pedras quentes. Mais tarde, deve ter sido observado que, deixando a massa em repouso por um tempo, melhorava-se a textura e a digestibilidade dos pes. O passo seguinte ocorreu, provavelmente, ao acrescentar uma pequena parte da massa crua (massa cida ou p de massa) da preparao anterior. Este procedimento j era conhecido por egpcios e hebreus, 5 mil anos atrs. Os estudos microbiolgicos atuais indicam a coexistncia, no p de massa, de bactrias lcticas e leveduras. As enzimas presentes no gro catalisam a transformao do amido em acares que so transformados em cido lctico, pelas bactrias, e em etanol pelas leveduras. Devido liberao de CO2 formam-se bolhas que conferem porosidade e leveza massa. Alm de acelerar o levado, a preparao de um p de massa permite a seleo e o enriquecimento dos microrganismos dos cereais. Durante muitos sculos a preparao do po envolvia, necessariamente, o processo natural de fermentao, de modo que cada padeiro tinha que preparar seu p de massa. A passagem do procedimento artesanal panificao industrial ocorreu em 1876, nos Estados Unidos, com a produo e venda de cubos de levedura prensada, mediante um processo patenteado pelos imigrantes austro-hngaros Charles e Max Fleischmann. Atualmente, comercializam-se trs tipos de fermento biolgico (leveduras) para a panificao: o fermento prensado ativo, com 68-72% de umidade, que requer refrigerao durante o armazenamento e dura entre trs e cinco semanas. O fermento seco no ativo que se conserva mais tempo e no exige refrigerao, mas deve ser hidratado antes de usar; e o fermento ativo instantneo que, por no requerer hidratao, pode ser adicionado diretamente aos ingredientes secos.
Copyright Maria Antonia Malajovich Biotecnologia: ensino e divulgao (www.bteduc.bio.br)

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Neste campo, as inovaes no so bem aceitas. Na dcada de 1990, comercializaram-se no Reino Unido linhagens obtidas por engenharia gentica. Apesar de ser muito rpida, o seu uso foi logo descontinuado, principalmente devido pouca aceitao dos consumidores. Apesar de alguns padeiros conservarem a prtica da fermentao natural, os processos artesanais esto desaparecendo, substitudos pela tecnologia da panificao industrial. Prepara-se a massa misturando farinhas de um ou mais tipos, gua, leveduras e diversos aditivos: emulsificadores, agentes oxidantes e redutores, enzimas ( e -amilases, hemicelulases, lipases etc.) e aceleradores da fermentao. O processo envolve trs etapas de fermentao durante as quais o CO2 liberado forma bolhas que, retidas na massa, aumentam seu volume. Entre uma e outra etapa, a massa dividida e boleada, facilitando a redistribuio dos ingredientes e o desenvolvimento das caractersticas organolpticas. A moldagem visa o alinhamento das fibras proteicas do glten. Durante a coco, a mistura etanol-gua se transforma em vapor e a crosta adquire uma cor dourada. A seguir, os pes so cortados e embalados (Figura 15.1). FIGURA 15.1. A panificao.
A massa tambm pode levar outros ingredientes, tais como gordura, acar, leite em p, ovos, mel, xaropes, frutas, especiarias etc.

Farinhas

gua

Leveduras

Enzimas

Outros Aditivos

Mistura dos ingredientes

Fermentao principal
Diviso da massa

Boleamento

Fermentao secundria
Moldagem

Fermentao final
Cozimento

Resfriamento Corte em fatias Embalagem Distribuio

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O VINHO A vinificao O vinho uma bebida proveniente da fermentao alcolica da uva, originada no norte da frica e na Europa por volta de 3000 a.C. Durante o amadurecimento da uva, vrias espcies microbianas se sucedem, primeiro transformando os acares em etanol e, posteriormente, o etanol em cido actico. Considerando que o destino natural da uva o vinagre, a arte da vinificao representa um ganho tecnolgico considervel. A uva composta por gua (86%), acares fermentescveis (12%) e molculas diversas (2%). Retira-se o sumo espremendo ou prensando a polpa, sendo frequente o agregado de enzimas de macerao (pectinases, celulases e hemicelulases) para melhorar o rendimento. O agente biolgico da fermentao alcolica a levedura Saccharomyces cerevisiae, que se encontra na pele da uva. Salvo na produo artesanal, a fermentao no depende das leveduras naturais da uva. A indstria vitivincola conta com um leque amplo de linhagens selecionadas para favorecer o processo fermentativo. Na vinificao, monitora-se cuidadosamente a fermentao alcolica at a concluso do processo. Procede-se ento a duas trafegas, entre as quais ocorre uma segunda fermentao, denominada fermentao maloltica. Esta etapa, que uma das mais complexas na elaborao dos tintos, se deve ao de bactrias lcticas, como Oenococcus oeni, que transformam o cido mlico (dicido) em cido lctico (monocido). Em consequncia da fermentao maloltica, a acidez do vinho diminui e aparecem as primeiras modificaes aromticas. Posteriormente, o vinho clarificado e colocado para envelhecer em tonis ou garrafas, at o total desenvolvimento do buqu. A obteno de um vinho tinto ou branco depende basicamente do tipo de uva e do procedimento seguido (Figura 15.2). Se quisermos obter vinho branco, utilizaremos uvas brancas ou tintas sem a pele ou casca que as recobre. As uvas tintas com pele originam vinhos tintos, porque esta libera compostos fenlicos (antocianinas, flavonas, taninos). O cultivo da videira Existem diferentes espcies de videiras. A Vitis vinifera fornece os vinhos mais finos, enquanto a Vitis labrusca, a Vitis ripari e outras variedades mais rsticas da prpria Vitis vinifera so utilizadas para a elaborao de vinhos comuns. Existe uma combinao de solo e clima ideal para cada cultivo, denominada terroir, sem a qual dificilmente se obtero os melhores resultados. Alguns vinhos resultam da mistura de uvas diferentes, sendo denominados vinhos genricos ou de corte. Outros so elaborados a partir de uma nica variedade, sendo denominados varietais. Esta categoria inclui nomes como Pinot Noir, Chardonnay e Pinot Blanc (vinhos de Borgonha), CabernetSauvignon (vinhos de Bordeaux), Sangiovese (vinhos de Chianti) e Zinfendel (vinhos da Califrnia). Observe-se que, dependendo do processo utilizado para a elaborao do vinho, a partir de uma variedade de uva como a Pinot Noir podero ser obtidos vinhos to diferentes como um Borgonha ou um Champanhe. Em 2007, um grupo franco-italiano completou o mapa do genoma da Vitis vinifera, variedade Pinot Noir. A informao abrange mais de 30.000 genes, muitos dos quais respondem pelos aromas e sabores dos vinhos e outros regulam a quantidade de resveratrol, uma molcula que diminui os nveis de colesterol. Os estudos genmicos abrem numerosas perspectivas para os viticultores. Uma aplicao importante o monitoramento da madurao da fruta, mediante arrays de marcadores moleculares, possibilitando a escolha do momento adequado para a vindima.
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FIGURA 15.2. A vinificao

Uva tinta

Uva branca

Desengaamento e esmagamento

Desengaamento e esmagamento

Macerao Inoculao Inoculao

Fermentao alcolica

Fermentao alcolica

Fermentao maloltica

Clarificao Envelhecimento Engarrafamento

Clarificao

Engarrafamento

Vinho tinto

Vinho branco

Vinificao em tinto O mosto obtido por esmagamento da uva tinta passa para a cuba de fermentao, uma vez corrigidas a acidez e a quantidade de acar. Depois da primeira fermentao (fermentao alcolica), separa-se, por trasfega, o mosto da borra. Inicia-se a segunda fermentao (fermentao maloltica). Depois de clarificado, o vinho deve aguardar dois anos at estabilizar e ser engarrafado. Os vinhos rosados ou ross so obtidos seguindo um procedimento semelhante, mas deixando macerar durante menos tempo o mosto com as cascas de uva. Tambm possvel consegui-los misturando vinhos brancos e tintos.

Vinificao em branco O mosto obtido por esmagamento de uva branca ou de uva tinta sem casca, sem permitir a macerao. Salvo em alguns vinhos brancos de Borgonha, evita-se a fermentao maloltica. Os vinhos espumantes (Champagne, Cava, Prosecco) passam por uma segunda fermentao alcolica na garrafa.

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O cultivo da videira uma tarefa complexa que exige tratamentos, enxertos e podas. Os viticultores praticam a multiplicao vegetativa das videiras, o que garante uma qualidade constante, mas aumenta a susceptibilidade da plantao aos patgenos. Espera-se que os estudos genmicos permitam identificar e selecionar genes de resistncia a algumas enfermidades. A transferncia de genes de resistncia de uma variedade a outra vista com muita desconfiana pelos produtores, porque o rtulo de varietal parte da estratgia de vendas dos vinhos de qualidade. Contudo, alguns produtores consideram aceitvel a transferncia de genes de videiras rsticas para plantas de elite, com o objetivo de melhorar a produo. Com a entrada no mercado internacional de pases menos apegados s tradies (Estados Unidos, Chile, Argentina, Brasil, frica do Sul, Austrlia etc.), pode ser que as novas tecnologias genmicas se apliquem na produo de plantas resistentes a doenas e pragas. O rol da levedura na vinificao As propriedades organolpticas dos vinhos dependem basicamente da cultivar escolhida, mas as enzimas da uva e as atividades metablicas microbianas tambm cumprem um papel importante. A transformao do mosto em vinho envolve inmeras reaes qumicas desenvolvidas por leveduras e bactrias lcticas. Com o mapeamento do genoma de ambos os microrganismos e a construo de microarrays adequados, estas reaes podero vir a ser bem conhecidas e controladas. Existe a tendncia, na indstria moderna, de substituir as leveduras selvagens por leveduras enolgicas selecionadas. Contudo, alguns produtores consideram que estas ltimas massificam a qualidade do vinho, preferindo utilizar as leveduras nativas e obter assim um produto original qualitativamente diferente dos outros. Bancos de leveduras nativas facilitam a preservao da biodiversidade. Recentemente, duas linhagens de leveduras geneticamente modificadas fizeram sua entrada na indstria de vinhos dos Estados Unidos e Canad. Trata-se da levedura ML01, que realiza ambas as fermentaes (alcolica e maloltica), evitando a produo de histaminas, e da levedura ECMo01 que degrada a ureia, impedindo a formao de uma substncia carcinognica. A CERVEJA As bebidas fermentadas representam uma opo saudvel na falta de gua ou no caso de estar contaminada. Todos os povos elaboraram alguma a partir dos elementos de seu entorno, sejam estes gros, frutas, razes, caules ou folhas. Em 4000 a.C, os habitantes das margens dos rios Tigre e Eufrates (Mesopotmia) preparavam 20 variedades de cerveja a partir de um procedimento bem simples. Esmigalhava-se o po de cevada em um recipiente com gua aucarada e, uma vez concluda a fermentao, a bebida era filtrada e transvasada a outro recipiente. Os procedimentos melhoraram a partir do sculo VII, quando os frades introduziram algumas inovaes como incluir diferentes tipos de ervas, uma prtica que no sculo XI culminou com a adio de lpulo. No sculo XIV, a descoberta da tcnica de fermentao baixa deu maior estabilidade bebida. Os trabalhos de Pasteur e o progresso da Microbiologia no sculo XIX permitiram o desenvolvimento de uma poderosa indstria, cuja produo mundial supera os 1.000 milhes de hectolitros por ano. A fabricao da cerveja comea com a maltagem, um processo em que os gros de cevada germinados so secados e modos. O malte assim obtido contm as enzimas desenvolvidas durante a germinao, capazes de catalisar a transformao do amido em acares fermentescveis (Figura
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15.3). Este processo indispensvel, porque no tendo amilases, as leveduras no fermentam o amido. Na brasagem o malte misturado com gua, possibilitando a digesto do amido por ao enzimtica. Mais tarde o mosto filtrado e fervido, sendo ento acrescentadas as flores de lpulo (Humulus lupulus, da famlia das Canabinceas) que, alm de ter uma ao antissptica, conferem bebida seu sabor amargo caracterstico. A maltagem e a brasagem so atividades prvias fermentao alcolica, que ser conduzida por leveduras (Saccharomyces cerevisiae). Os processos mais tradicionais utilizam leveduras que se acumulam no topo da cuba, originando as cervejas do tipo ale, com menos de 4% de lcool. Contudo, existem outras leveduras que sedimentam no fundo, gerando as cervejas de tipo lager, com mais de 6% de lcool. Uma vez concluda a fermentao do mosto, este recebe os tratamentos finais que consistem em maturao, clarificao, carbonatao, pasteurizao e engarrafamento. No momento, a tecnologia do DNA-recombinante se limita a transformaes com genes do mesmo gnero (Saccharomyces), visando conseguir linhagens mais eficientes em relao ao processo fermentativo, adequadas cevada e ao lpulo de diferentes regies do mundo. At o momento, essas linhagens no so utilizadas comercialmente. FIGURA 15.3. As etapas da produo de cerveja.

Cevada

Maltagem: Macerao, germinao secagem e moagem do malte.

Malte Brasagem: Mistura, filtrao e fervura do mosto. Mosto Fermentao alcolica

Cerveja Acabamento: Amadurecimento, pasteurizao e engarrafamento. Comercializao

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OS QUEIJOS E IOGURTES A produo de laticnios As razes da produo de laticnios remontam ao ano 3000 a.C. (Oriente Mdio), quando o homem comprovara que, ao azedar, o leite mudava de consistncia e de sabor. O soro podia ser consumido fresco, e a adio de sal ao cogulo o conservava por mais tempo. Em torno de 2.000 a.C., a utilizao de estmagos de cabras e de ovelhas como recipientes para o leite permitiu obter queijos mais slidos e robustos. Mais tarde, os romanos introduziram extratos de plantas como o figo para coagular o leite. A explicao destes fenmenos simples. As bactrias que normalmente se encontram no bere dos animais contaminam o leite, proliferando e formando cido lctico. Nesse meio cido, as protenas precipitam, separando-se do soro. A coagulao tambm ocorre em presena das enzimas renina e pepsina da mucosa estomacal e da ficina do figo. Hoje, a produo mundial de leite fermentado (iogurte, coalhada, quefir etc.) de trs milhes de toneladas por ano enquanto a de queijos chega a 15 milhes de toneladas por ano (Figura 15.4 A). Vrias espcies bacterianas podem fermentar o leite: Streptococcus thermofilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus lactis, Bifidobacterium bifidum etc. A maioria dos produtos vendidos como leite fermentado contm um nmero alto de microrganismos vivos; sendo consumidos como probiticos, para prevenir o desenvolvimento de outros microrganismos indesejveis ou patognicos no tubo digestivo. Todos os queijos passam por trs etapas: a coagulao, o dessoramento e a maturao (Figura 15.4 B). No entanto, a tecnologia de produo de queijos permite uma srie de variaes que se traduz em mais de 400 tipos diferentes. Algumas dessas variaes so a origem do leite (vaca, cabra, ovelha, bfalo), o agente da coagulao (calor, enzimas, bactrias lcticas ou ambas), a umidade e consistncia (mole, semiduro, duro e muito duro) e a maturao. Muitos pases aceitam 35 variedades definidas por regras internacionais. O rol de microrganismos e enzimas A produo de queijos envolve a acidificao do meio pelas bactrias lcticas, geralmente Lactococcus lactis e Streptococcus thermophilus. O coalho, uma substncia extrada do estmago de bezerros, foi utilizado como agente da coagulao enzimtica durante sculos, mas sua obteno ficou cada vez mais cara e difcil. Para estabilizar a produo e satisfazer a maior demanda pelos produtos lcteos, usou-se transferir o gene da renina a uma bactria (Escherichia coli) e, mais tarde, a uma levedura (Kluyveromyces) e um mofo (Aspergillus). Alm da enzima produzida (quimosina) ser mais pura que a renina, os suplementos so constantes, aumentando a eficincia da produo de laticnios e diminuindo os custos. O melhoramento de bactrias lcticas visa a obteno de linhagens mais estveis, resistentes aos vrus bacterifagos e produtoras de bacteriocinas, que so substncias com atividade antimicrobiana. Tambm linhagens capazes de liberar mais rapidamente suas enzimas poderiam acelerar o processo de formao de aromas. Com o mapeamento do genoma, espera-se uma intensificao das pesquisas nessa direo. O desenvolvimento de bactrias e fungos durante a maturao confere suas caractersticas tpicas a alguns queijos como, por exemplo, a presena de olhaduras produzidas por Propionabacterium no Gruyre, ou de um manto branco de Penicillium no Camembert e no Brie ou, ainda, as estrias azuis de Penicillium no Gorgonzola ou no Roquefort.
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FIGURA 15.4. A produo de laticnios.


A. Iogurte tradicional e iogurte batido. As variaes dependem de acrscimos (acar, frutas etc.) e de modificaes de consistncia (cremoso, firme, batido). Leite + leite em p (+ acar)

Pasteurizao Inoculao com lactobacilos

Preenchimento das embalagens Fermentao lctica Fermentao lctica

Resfriamento

Agitao (+ adio de frutas)

Preenchimento das embalagens Iogurte tradicional Iogurte batido

Comercializao

Comercializao

B. Queijo. Os agentes biolgicos intervm nas etapas de coagulao e na maturao de alguns produtos.

Leite Pasteurizao Inoculao com lactobacilos, coalho ou enzimas e adio de CaCl 2

Fermentao lctica

Coagulao Dessoramento Enformagem, prensagem, viragem e salga

Inoculao com fungos e/ou bactrias Maturao Embalagem e comercializao

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A PROTENA DE CLULA NICA Em um sentido amplo, o termo SCP (do ingls single cell protein) se refere protena bruta ou refinada originada pelo crescimento de bactrias, algas, fungos ou mofos. De fato, os microrganismos so muito mais produtivos que os animais de criao. Enquanto uma vaca produz 200 g de protena por dia, os microrganismos, teoricamente, podem produzir 25 toneladas, no mesmo tempo e em condies ideais. Nas dcadas de 1960 e 1970, especulava-se com a utilizao de derivados do petrleo como matria-prima para o crescimento microbiano, mas com a crise dos anos 1980, a ideia de um bife de petrleo foi abandonada. Atualmente utilizam-se como substrato os excedentes e os restos agrcolas ou industriais, e a maioria dos processos visa o enriquecimento de raes animais. A introduo de protena microbiana na alimentao humana demanda um processo extra de purificao por ter um contedo de cido rico muito alto. Contudo, a empresa Ranks Hovis McDougall (RHM) conseguiu um produto, denominado Quorn, adaptado para a nutrio humana, utilizando o fungo Fusarium graminearum. Esse alimento apresenta um alto teor proteico (45%), uma composio em aminocidos parecida com a da carne de vaca, um alto contedo de fibras e uma quantidade aceitvel de cidos nucleicos (1%). Por no ter cheiro ou sabor, o produto pode ser utilizado como substituto de peixe, frango ou carne. A semelhana dependeria do comprimento das fibras.

OS ADITIVOS OS DIVERSOS TIPOS A adio de algumas substncias nos alimentos tem diversos objetivos como, por exemplo, conservlos por mais tempo (antibiticos, cido actico, cido lctico, etanol), complementar seu valor nutritivo (vitaminas, aminocidos) ou mudar a consistncia (gomas e enzimas). Os aditivos tambm so usados para melhorar a cor e o flavor, um termo que abarca o aroma, o sabor e a textura. Apesar da m fama que os acompanha, s uma em 6.000 pessoas apresenta alergia e intolerncia aos aditivos, um nmero baixo, considerando que uma pessoa em 50 alrgica ou intolerante a algum alimento. Os principais aditivos utilizados pela indstria de alimentos so os cidos ctrico e lctico, alguns corantes naturais ( -caroteno, riboflavina), flavorizantes (monoglutamato de sdio, extrato de levedura, aromas), gomas espessantes (xantana, gelana, dextrana), antioxidantes ( -caroteno), vitaminas (B2, B12, Biotina), enzimas e antibiticos. Alguns desses aditivos so obtidos em culturas de clulas vegetais. Outros tm uma origem microbiana, sendo utilizadas linhagens de microrganismos geneticamente modificados para sua produo industrial. Vimos anteriormente o importante rol desempenhado por algumas enzimas na produo de alimentos e bebidas por fermentao. Falta destacar o uso da lactase na elaborao do leite deslactosado, um produto dirigido s pessoas com intolerncia lactose. E da pectinase que, junto com celulases e amilases, facilita a extrao do suco de frutas retido na pectina, sendo tambm utilizada na clarificao do suco. Finalmente, entre os antibiticos usados para conservar alimentos, citaremos a Nisina (INS234), que inibe o crescimento de bactrias Gram-positivas em queijos, salsichas e produtos cozidos de origem avcola, e tambm a Natamicina ou Pimaricina (INS235), utilizada como conservante na superfcie de produtos crneos embutidos.

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OS ADOANTES Outro caso interessante o dos adoantes. O aspartame (cido asprtico e fenilalanina) consumido para limitar a ingesto de calorias, e o xilitol, para diminuir a incidncia de cries dentrias. Outros, como o xarope de glicose ou de frutose, substituem o acar na indstria de alimentos. A hidrlise cida ou enzimtica ( -amilase e glicoamilase) do amido do milho produz xaropes de maltose e de glicose. J a ao enzimtica da lactase sobre o soro das indstrias de laticnios origina um xarope de dextrose (glicose, galactose). Uma vez refinados e concentrados, esses xaropes podem ser usados como ingredientes na elaborao de produtos alimentcios (biscoitos, sorvetes etc.). O poder adoante da glicose menor que o da frutose, mas a transformao enzimtica (invertase ou glicose isomerase) transforma uma em outra (Figura 15.5). O resultado um xarope (42% de frutose, 52% de glicose) que pode ser concentrado por mtodos cromatogrficos at alcanar um teor de 90% de frutose. A indstria de refrigerantes substitui a sacarose pelo xarope de frutose com uma concentrao de 55%, obtido mediante a mistura dos dois tipos. O processo comeou a ser estudado na dcada de 1960, sendo o custo da glicose-isomerase o principal fator limitante da tecnologia. Com o desenvolvimento das tcnicas de imobilizao enzimtica, o processo tornou-se econmico, possibilitando o uso do amido proveniente de cereais excedentes. Mas por outro lado prejudicou os pases produtores de acar, que viram diminuir a demanda por este produto. O descobrimento de um gene microbiano capaz de transformar a sacarose em cadeias curtas de frutose (fructanos), com o mesmo gosto e desprovidas de calorias, indica que novos produtos podero entrar em breve no mercado de adoantes. FIGURA 15.5. A produo de xarope de frutose.
A hidrlise e a sacarificao do amido produzem glicose; esta transformada em frutose pela enzima glicoseisomerase, imobilizada em um biorreator.

Amido de milho, batata ou trigo

Amilases e glicoamilases

Hidrlise e sacarificao

Glicose

Isomerizao (invertase imobilizada)

Frutose

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OS ALIMENTOS BIOFORTIFICADOS O homem no se alimenta exclusivamente por motivos fisiolgicos. A seleo dos alimentos ocorre dentro de uma tradio sociocultural que inclui a noo do que saudvel. O homem tenta escolher os alimentos em funo da satisfao sensorial, emocional e afetiva que espera obter, mas o peso das consideraes econmicas decisivo. Combate-se a fome de uma populao dando-lhe acesso aos alimentos. Contudo, a falta total de alimentos hoje um fenmeno menos frequente que a desnutrio devida carncia de determinados nutrientes na dieta. Descrita magistralmente por Josu de Castro, na dcada de 1950, essa fome parcial ou fome oculta ainda afeta mais da metade da populao mundial, fundamentalmente mulheres e crianas, sendo a causa de diversas doenas. Segundo a Organizao Mundial da Sade, o ferro, o zinco e a vitamina A so as principais deficincias nutricionais dos pases em desenvolvimento. A estratgia tradicional consiste em suplementar os alimentos industrializados com os nutrientes correspondentes. Existem outras possibilidades, tais como a fertilizao dos solos e, consequentemente, o enriquecimento das culturas de base. Contudo, o melhoramento gentico parece ser a estratgia mais promissora para aumentar as concentraes de nutrientes nas culturas de base (arroz, milho, trigo, feijo, mandioca e batatadoce). A engenharia gentica pareceria, a priori, a via mais rpida para fortificar os alimentos. Porm, os empecilhos legais encontrados pelo arroz com pr-vitamina A (Golden Rice), que conta com mais de 10 anos pronto sem ter sido comercializado, desestimulam a escolha dessa tecnologia. Na biofortificao dos cultivos so utilizadas outras tecnologias com base biolgica. Nos Bancos de Germoplasma do CGIAR j foram encontradas variedades de feijo com maior contedo de ferro, de arroz e trigo com altos nveis de zinco, de mandioca, milho e batata-doce ricos em vitamina A etc. As novas tcnicas de anlise gentica de traos quantitativos e, especialmente, a seleo assistida por marcadores moleculares facilitam o melhoramento gentico das culturas de base. As novas variedades devero ser altamente produtivas e contar com os nutrientes desejados. Espera-se que contem com a aceitao das populaes necessitadas e, tambm, que os nutrientes sejam assimilados de maneira a melhorar sua condio nutricional. A biofortificao de alimentos um programa internacional desenvolvido por HarvestPlus (CGIAR), um consrcio de instituies de pesquisa e agncias de desenvolvimento que age especialmente na Amrica Latina e na frica. No Brasil, a Embrapa Agroindstria de alimentos participa do programa HarvestPlus, tendo j desenvolvido variedades biofortificadas de feijo e milho. Os primeiros testes esto sendo realizados em Sergipe. SEGURANA ALIMENTAR Em relao aos alimentos, a noo de segurana est baseada na tradio. Com o desenvolvimento de uma moderna indstria de alimentos, surgem alguns questionamentos. Atualmente, linhagens microbianas selecionadas so utilizadas para iniciar as fermentaes, como starters. Ao acabar o processo fermentativo, essas linhagens podem permanecer no meio, como os lactobacilos dos iogurtes. Tambm podem ser eliminadas por calor ou filtrao, como as leveduras do po e da cerveja. Apesar de ter passado por uma srie de processos seletivos que as torna muito diferentes geneticamente das linhagens selvagens, as linhagens starters so bem conhecidas e no representam risco algum para a sade. Classificadas pelas agncias internacionais como GRAS (do ingls, generally recognized as safe) essas linhagens so as nicas permitidas na produo de alimentos.

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No existem normas explcitas sobre o que seria um OGM food-grade, isto , um microrganismo transgnico que possa ser utilizado na indstria de alimentos. Alguns aspetos de biossegurana teriam que ser considerados. Um deles seria evitar ou eliminar qualquer gene de resistncia a antibiticos que tivesse sido introduzido como marcador seletivo na transferncia gnica. O outro diz respeito aos organismos doadores de genes, esboando-se diferentes critrios. Segundo um critrio estrito, para poder ser considerado food grade, um OGM deveria conter exclusivamente DNA da mesma espcie, aceitando-se na construo gnica a presena de pequenos fragmentos sintticos de DNA, sempre que no codifiquem DNA ou RNA. Em outros termos, a tecnologia do DNA-recombinante se aplicaria a microrganismos de diferentes linhagens da mesma espcie. Atualmente, tem obtido aceitao um critrio mais amplo, permitindo a incluso de DNA de outros microrganismos alimentares, a condio de estes pertencerem ao mesmo grupo de microrganismos que participam no processo. Como, por exemplo, a transferncia de genes das bactrias malolticas para as leveduras da vinificao. A aceitao de OGMs nos alimentos depende das regulamentaes de cada pas, bem menos flexveis na Europa que nos Estados Unidos e no Canad, onde recentemente fora colocada no mercado uma linhagem de Lactococcus geneticamente modificada e considerada GRAS. As enzimas cumprem um importante papel em vrias das indstrias de alimentos (produo de pes, biscoitos, laticnios, sucos de frutas, bebidas alcolicas, derivados do amido e de protenas). Atualmente, mais de 30 enzimas diferentes so utilizadas no processamento de alimentos. A primeira enzima sintetizada por um microrganismo transgnico foi a quimosina, que utilizada h anos como substituto da renina de origem animal, na produo de queijos. Hoje, aproximadamente 80% dos queijos so elaborados com quimosina, sendo aceitos pelos consumidores lactovegetarianos. Os microrganismos utilizados para a sntese de enzimas food-grade so organismos pertencentes categoria GRAS, bem conhecidos e altamente produtivos, aos quais foram transferidos os genes de interesse mediante engenharia gentica. Esses OGMs no esto presentes na preparao final que, depois de purificada, contm exclusivamente a enzima. Essa modalidade produtiva garante indstria de alimentos vrias enzimas seguras e de baixo custo entre proteases, amilases, lipases, lactases, pectinases, glicose-oxidase, invertases etc. A esse respeito, pareceria haver um consenso amplo, incluindo a Comisso Europeia, que considera que os aditivos (corantes, aromas e flavorizantes) s devem ser rotulados como sendo de origem transgnica se o produto final tiver DNA ou protena de origem recombinante. A mais alta autoridade internacional sobre os alimentos o Codex Alimentarius, uma comisso de FAO/WHO, reconhecida por 169 pases. Esta Comisso se encarrega de estabelecer uma metodologia que permite analisar a segurana alimentar em relao aos produtos derivados de microrganismos geneticamente modificados .

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16. BIOTECNOLOGIA E ALIMENTOS NOVOS

A ENTRADA DOS TRANSGNICOS NA CADEIA ALIMENTAR Os alimentos industrializados podem conter alguns componentes de origem transgnica (soja, milho) assim como substncias produzidas por microrganismos geneticamente modificados (enzimas, aditivos etc.). Poucos so os alimentos transgnicos que so consumidos diretamente: o milho e, nos Estados Unidos, a papaia resistente a vrus e algumas variedades de abbora. Aguarda-se a entrada no mercado do arroz com provitamina A e do salmo de crescimento rpido. A primeira onda de produtos comercializados internacionalmente esteve limitada a poucas plantas, principalmente milho, soja, algodo e canola, s quais foram transferidos traos como a tolerncia a herbicidas e/ou a resistncia a insetos e infeces virais. Essas plantas foram aceitas rapidamente pelos produtores agrcolas porque permitiam, principalmente, maior produtividade e menores custos. Apesar das novas tecnologias terem diminudo as contaminaes por fungos, melhorando a qualidade da matria-prima, os consumidores no perceberam nenhuma vantagem direta. Isso explicaria em parte a resistncia aos transgnicos por parte do grande pblico. MELHORANDO A CONSERVAO Para despertar o interesse do consumidor so necessrios produtos com qualidades que o beneficiem diretamente, tais como o aumento no tempo de conservao dos frutos. O tomate amolece com o tempo, tendo que ser colhido ainda verde e transportado rapidamente at o lugar de comercializao, onde a maturao induzida com etileno. O fruto poderia permanecer mais tempo na planta, ganhando cor e sabor, se a enzima responsvel pelo amolecimento do fruto fosse inativada. Utilizando a tecnologia anti-sense, a Calgene Inc. produziu o tomate FlavSavr, o primeiro alimento resultante da nova biotecnologia, liberado nos Estados Unidos em 1994 e descontinuado pouco tempo depois devido ao seu custo. Mais tarde, outro tomate de maturao lenta ocupou esse nicho de mercado. Diferentemente do exemplo anterior, este tomate teve uma expanso muito rpida em numerosos pases, onde comercializado com nomes distintos. A tecnologia anti-sense no foi abandonada, sendo aplicada no melhoramento de outros vegetais (brcolis, aipo, cenoura, melo e framboesa). MELHORANDO AS PROPRIEDADES INDUSTRIAIS Uma forma de despertar o interesse do consumidor melhorando algumas das propriedades dos alimentos industriais, tais como leo de canola e de girassol, com uma composio adequada s frituras, trigo com caractersticas especiais para a panificao ou batata com mais amido, que absorve menos gordura ao fritar. Um caso interessante foi o do tomate com mais pectina, desenvolvido por Zeneca Plant Science a partir de variaes genticas detectadas em cultura de tecidos. Esse tomate era utilizado na preparao de massa ou pur de tomate, com menos consumo de energia e menor necessidade de aditivos (espessantes) que o fruto tradicional.

Copyright Maria Antonia Malajovich Biotecnologia: ensino e divulgao (www.bteduc.bio.br)

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O produto resultava mais econmico tanto para a indstria como para o consumidor, sendo vendido com bastante aceitao pela rede Sainsbury (Reino Unido), entre 1996 e 1999. No auge da campanha contra os transgnicos, o produto teve que ser retirado do mercado. MELHORANDO AS CARACTERSTICAS NUTRICIONAIS Outra forma de chegar ao consumidor seria mediante produtos com melhores caractersticas nutricionais: carne e leite com menos gordura, soja e batata com mais protena, frutas mais doces, canola com vitamina A, milho com metionina, mandioca e batata sem toxinas, camaro e amendoim sem substncias alergnicas etc. Tambm seriam bem-vindos alimentos com melhores propriedades organolpticas, tais como pimentes e meles com mais aroma ou cebolas que no faam chorar. O consumidor tambm poderia ser atrado por alimentos com componentes biologicamente ativos, como os antioxidantes do ch verde ou as substncias capazes de diminuir o colesterol que se encontram no alho e na cebola. Quais as tecnologias com chances de ser aceitas pelo pblico, engenharia gentica ou melhoramento convencional, assistido por tcnicas de biologia molecular? Um primeiro caso a analisar o do arroz dourado (Golden Rice). O arroz uma planta que no produz vitamina A. Na sia, onde este constitui a base da alimentao, a deficincia vitamnica mata 6 mil crianas por dia e cega 500 mil por ano. Um grupo de pesquisadores, liderado por Ingo Potrykus, obteve, na Sua, mediante a transferncia de genes do narciso, um arroz com a capacidade de sintetizar o -caroteno, que um precursor da vitamina A. O projeto contou com subvenes privadas, e vrias das grandes corporaes cederam as suas patentes. Apesar de estar pronto desde 1999, o arroz dourado ainda no chegou ao mercado, tais os empecilhos legais encontrados em funo de sua origem transgnica, que podero pospor sua distribuio at 2014. Se o Golden Rice tivesse sido obtido por vias convencionais, estaria no mercado desde 2003. Um segundo caso o da soja Vistive (Monsanto), que rene um trao transferido mediante tcnicas de melhoramento convencionais (baixo teor de cido linolnico) e um trao de origem transgnica (tolerncia ao herbicida Roundup). Lanado no mercado norte-americano em 2005, o leo de soja Vistive representou um passo adiante na preveno de doenas cardiovasculares e de altos nveis de colesterol. Empresas como Kellog e Cargill o utilizaram logo na preparao de alimentos com melhor qualidade nutricional. Por se tratar de um nicho promissor, outras variedades com alteraes no teor de cidos graxos esto a caminho (Soymega, com mais mega 3).

A FAVOR OU CONTRA? A favor ou contra? Responder essa pergunta simplificar excessivamente uma questo complexa. Seja qual for a resposta, ela estar atrelada ao momento histrico que vivemos e s nossas concepes polticas, econmicas e sociais. Nossa atitude em relao aos transgnicos depende, em grande parte, da viso que cada um de ns tem da natureza. Conforme ela for considerada fundamentalmente boa ou fundamentalmente ruim, toda modificao que venha da mo do homem ser considerada perigosa ou vantajosa. Dependendo da confiana depositada no conhecimento cientfico e no progresso tecnolgico, os novos alimentos sero vistos como produtos interessantes e promissores ou como uma ameaa.

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BIOTECNOLOGIA 2011 / Captulo 16: Biotecnologia e alimentos novos

Apesar da subjetividade da questo, alguns dados podem ajudar a compreender a origem da polmica. Em 1996, culmina na Europa a crise da vaca louca. Em 1997, aprovado na Unio Europeia o milho resistente broca de Novartis, cujo marcador era um gene de resistncia a ampicilina. Em 1999, estoura na Blgica o escndalo dos frangos contaminados por dioxinas. A percepo pblica foi de insegurana alimentar, possibilitando a formao de uma oposio feroz. De um lado, encontraram-se as empresas de biotecnologia, ligadas a poderosos conglomerados multinacionais e com interesses econmicos muito bem definidos. Do outro, as redes de distribuio de alimentos (Carrefour, Mark and Spencer), associadas aos ambientalistas (Greenpeace, Friends of Earth) e aos produtores agrcolas (Confdration Paysanne). Com uma bem sucedida campanha de marketing (no queremos frankenfood), as redes de distribuio teriam aproveitado a oportunidade para impulsionar seus prprios produtos e lanar suas prprias marcas. Fora de qualquer argumentao baseada na cincia, a banalizao da discusso acirrou o enfrentamento entre partidrios e oponentes dos alimentos transgnicos. Os termos progressista e reacionrio foram usados indiscriminadamente por ambos os grupos. O dissenso e a discusso fazem parte das sociedades democrticas. Infelizmente, nessa campanha, queimaram-se laboratrios de pesquisa e campos com cultivos experimentais. Os fatos so preocupantes, porque nos pases ricos (Estados Unidos, Europa) no faltam alimentos, e a escolha de uma tecnologia pode depender de consideraes econmicas ou ideolgicas, mas, nos pases mais pobres, a adoo ou rejeio de uma tecnologia uma deciso que pode ter gravssimas consequncias para sua populao, condenando-a inclusive fome. Na Zmbia (2002) e em Angola (2004), os governos respectivos rejeitaram o milho enviado como ajuda humanitria para alimentar a populao, argumentando que era transgnico. Outros pases africanos tambm proibiram a importao de alimentos de origem transgnica (Malaui, Moambique e Zimbbue). O QUE O CONSUMIDOR PRECISA SABER A NOO DE SEGURANA A noo de segurana alimentar costuma ser bastante flexvel. A batata foi vista como um alimento perigoso, quando introduzida na Europa. A pasteurizao do leite teve opositores ferrenhos, porque alteraria a qualidade de um alimento saudvel. O amendoim considerado seguro, mas pode no slo se estiver contaminado com fungos. Muitas pessoas so alrgicas ao kiwi, introduzido recentemente no Ocidente. Algumas pessoas continuam ingerindo gorduras em quantidade, mesmo sabendo que so perigosas. Todos os alimentos de origem transgnica comercializados atualmente foram devidamente analisados e aprovados no pas de origem. Milhes de consumidores os consomem h vrios anos, entre norte-americanos, canadenses, sul-africanos, brasileiros, argentinos e chineses. E vrios Comits Cientficos, Prmios Nobel, Academias de Cincias e organizaes internacionais concluram que os alimentos geneticamente modificados disponveis so to seguros quanto os alimentos tradicionais. Enfrentando uma intensa propaganda e recebendo opinies contraditrias, o consumidor sentese inseguro: Ser perigoso? Ser a mesma coisa? E se causar alergia? E se simplesmente der errado e acontecer alguma coisa que ningum previu?

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FIGURA 16.1. A estrutura de um transgene.


Para garantir a seleo e a expresso da sequncia codificadora que ser transferida, deve-se construir em redor uma estrutura complexa que, alm de um promotor e uma sequncia terminal, inclui um gene marcador.

Gene marcador

Transgene

Sequncia terminal

Promotor

A INGESTO DE DNA A ingesto de DNA, per se, no perigosa. Este um componente de nossos alimentos: um tomate tem 7mg de DNA, uma banana, 50 mg e um sanduche, 60 mg. O DNA digerido normalmente, junto com os outros componentes dos alimentos. Em relao ao alimento transgnico, calcula-se que uma vaca de 600 kg consumindo uma rao composta por milho geneticamente modificado, ingeriria 600 mg de DNA por dia, dos quais 1,5 mg seria DNA recombinante, o que corresponde a 0,00024% do DNA ingerido diariamente na rao, uma proporo muito baixa. OS MARCADORES DE RESISTNCIA A ANTIBITICOS No h evidncias de transferncia in vivo do DNA ingerido ao homem ou a microrganismos no intestino. Porm, os estudos in vitro indicam que, mesmo em uma frequncia extremamente baixa, essa transferncia poderia ocorrer. Apesar de sabermos que, se uma bactria tivesse se tornado resistente, sua implantao no tubo digestivo s poderia ocorrer na presena do antibitico como agente seletivo, a utilizao de marcadores de resistncia a antibiticos no transgene um motivo de preocupao (Figura 16.1). Geralmente, utilizam-se como marcadores antibiticos sem uso clnico e para os quais j se encontrou resistncia nas bactrias intestinais, de maneira que a transferncia do marcador no mudaria a situao. Considerando que j existe a tecnologia apropriada, a recomendao das agncias internacionais de substituir ou eliminar esse tipo de marcadores. A COMPOSIO QUMICA Em relao aos produtos que j esto comercializados, o alimento geneticamente modificado e o alimento convencional tm a mesma composio qumica e o mesmo valor nutritivo. No caso de um alimento geneticamente modificado para sintetizar uma vitamina extra, por exemplo, a situao diferente e este no pode ser considerado igual ao alimento convencional. Estudos adicionais so necessrios. A PRODUO DE TOXINAS Outra preocupao diz respeito produo eventual de toxinas. Sabe-se que as plantas sintetizam, para sua defesa, substncias qumicas que podem ser txicas para o homem ou os animais. Uma delas a toxina do Bacillus thuringiensis que, por ser prejudicial para os insetos e incua para o homem, est sendo utilizada sem problemas nas lavouras orgnicas, h mais de 40 anos.
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Normalmente, a presena de uma toxina investigada mediante ensaios biolgicos em diversas espcies de animais, alimentados durante um tempo com o produto transgnico. Os ensaios so complementados com estudos de anatomia patolgica. A avaliao toxicolgica realizada nos alimentos geneticamente modificados j comercializados no detectou efeitos adversos. E, apesar de sua repercusso na mdia, as declaraes de Pusztai em 1999 sobre a toxicidade de batatas transgnicas (no comerciais) em ratos no puderam ser confirmadas. A PRODUO DE ALRGENOS A incidncia de alergias alimentares de 1-2% em adultos e 5% em crianas, sendo provocadas principalmente por trigo, leite de vaca, ovos, peixe, amendoim e soja. As alergias se caracterizam pela hipersensibilidade a uma ou mais protenas que desencadeiam reaes diversas, tais como urticria, vmito ou diarreia. A transgnese poder vir a melhorar a qualidade dos alimentos se ela for utilizada como ferramenta para eliminar substncias sabidamente alergnicas dos alimentos. Mas o temor do consumidor que o transgene acabe sintetizando alguma protena capaz de desencadear uma crise alrgica. Uma mesma protena pode ser incua para uma pessoa e alergnica para outra, sendo impossvel prever o efeito que ela ter em uma terceira. Entretanto, sabendo que alguns alimentos so mais alergnicos que outros, deve-se ter cuidado em relao origem do transgene. Um exemplo clssico citado frequentemente o da transferncia soja de um gene da castanha-do-par, com o objetivo de melhorar suas qualidades nutritivas. Vale a pena assinalar que, frente possibilidade de induzir reaes alrgicas em pessoas sensveis castanha-do-par, o projeto foi descontinuado sem que essa soja sasse do laboratrio. sabido que o risco de uma protena ser alergnica aumenta se esta apresentar determinadas sequncias de aminocidos, se ela se degradar lentamente no tubo digestivo ou se permanecer estvel durante o processamento industrial. Estas caractersticas so passveis de estudos, havendo diretrizes internacionalmente aceitas para a avaliao de alergenicidade. Complementa-se a informao mediante anlises laboratoriais com os anticorpos de pessoas sensibilizadas e, tambm, mediante testes em animais capazes de desenvolver alergias aos mesmos tipos de alimentos que os seres humanos. O risco de alergenicidade dos alimentos transgnicos comercializados at agora no maior que o dos alimentos convencionais. Observe-se que esses alimentos passaram por testes que nunca foram aplicados no arroz, no milho, na batata ou no kiwi, uma fruta introduzida recentemente no Ocidente e que se asseverou ser altamente alergnica. Em relao ao escndalo do milho Star Link, que fora liberado nos Estados Unidos para compor raes animais e contaminara tortillas e tacos destinados ao consumo humano, nenhuma das denncias de alergia protena correspondente fora confirmada. No entanto, restou uma lio bem clara em relao biossegurana: no se pode liberar um cultivo para rao se este for inadequado para seres humanos. A UTILIZAO DE UM PROMOTOR VIRAL (CaMV) Na construo de um transgene, as sequncias promotoras so colocadas para determinar quando, onde e como ir se expressar a protena codificada. Alguns autores manifestaram sua preocupao com a utilizao do promotor do vrus do mosaico da couve-flor (CaMV), considerando que sua transferncia horizontal de uma planta transgnica ao homem, no aparelho digestrio, poderia ativar outros genes no virais (oncogenes).
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Essa preocupao no teria maiores fundamentos, dado que o promotor CaMV detectado em 14 a 25% da produo de canola, de couve-flor e de repolho, sendo ingerido pelo homem em quantidades considerveis faz dcadas e sem nenhum efeito reconhecido. OUTROS EFEITOS A insero de vrias cpias gnicas em diferentes lugares do genoma poderia gerar a ativao ou desativao de outros genes, gerando no organismo geneticamente modificado algum tipo de alterao que no fora previsto. At agora, no fora registrado nenhum efeito deste tipo nos produtos comercializados, e a tecnologia de microarrays permite excluir essa possibilidade. COMO GARANTIR A SEGURANA ALIMENTAR? O PRINCPIO DE EQUIVALNCIA SUBSTANCIAL Antes de comercializar um alimento transgnico, avaliam-se os riscos que este apresenta para os seres humanos, os animais e o ambiente. Assim como no h cidade segura, h cidades mais seguras que outras. O conceito de segurana se estabelece sempre em relao a algum marco de referncia. Quando se trata de segurana alimentar, o referencial o alimento j conhecido e consumido habitualmente. Por isso, antes de chegar ao mercado, os aditivos, os conservantes e os corantes convencionais novos esto sujeitos aprovao. Assim como qualquer novo ingrediente de origem biotecnolgica. Um alimento originado por biotecnologia moderna to seguro para o consumo quanto um alimento que tenha a mesma composio, as mesmas caractersticas nutritivas e um histrico de uso seguro. Esse o denominado princpio de equivalncia substancial, admitido por numerosas organizaes internacionais como FAO (Food and Agriculture Organization), WHO (World Health Organization), OECD (Organization for Economic Cooperation and Development), ILSI (International Life Science Institute). O princpio d toda a importncia ao produto final e no tecnologia aplicada para sua obteno. A AVALIAO DE RISCOS No possvel dizer que todos os alimentos transgnicos so seguros nem sequer este alimento transgnico seguro. S podemos afirmar que os alimentos transgnicos podem ser seguros ou no e que determinado alimento transgnico to seguro quanto o seu equivalente. A anlise ter que ser feita caso a caso. Por exemplo, o amido de uma batata resistente a vrus idntico ao amido de uma batata qualquer. Porque o amido um carboidrato purificado, sem DNA nem protena da planta da qual foi extrado. O mesmo raciocnio pode ser feito em relao ao leo de canola ou de soja. J no caso da torta de soja ou da espiga de milho, os genes inseridos sintetizam protenas e ambos se encontram no produto final, por conseguinte, deve-se analisar se estes podem ter algum efeito no organismo que os ingere. Todos os parmetros anteriormente citados tero que ser avaliados: a construo do transgene, os efeitos devidos presena do transgene (eventualmente, substncias txicas ou alergnicas), o valor nutritivo e, tambm, os efeitos no previstos devidos presena do transgene. E como em dois organismos pode-se inserir o mesmo gene em diferentes lugares e de diferentes modos, cada evento dever ser analisado separadamente.
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Essa metodologia, denominada anlise de risco de alimentos geneticamente modificados para a sade humana, garante que o alimento e quaisquer substncias que resultem da modificao gentica, seja to seguro quanto seu anlogo convencional. A ROTULAGEM DOS ALIMENTOS No h no momento um consenso em relao aos rtulos: em alguns pases no h nenhuma regulamentao, em outros se adota o rotulado voluntrio ou se estabelecem normas rgidas. Nos Estados Unidos, o sistema est baseado na responsabilidade da indstria e na avaliao de vrias agncias federais, cabendo a FDA (US Food and Drug Administration) a avaliao da segurana alimentar das novas variedades (vegetais, laticnios, peixes, frutos de mar e aditivos) e USDA (US Department of Agriculture) a regulao dos produtos crneos e avcolas alm dos testes de campo de todas as plantas geneticamente modificadas. Tendo a responsabilidade pelo uso de pesticidas qumicos, corresponde EPA (Environmental Protection Agency) a aprovao das plantas geneticamente resistentes a pragas. Nos Estados Unidos, aproximadamente 20 das variedades transgnicas cultivadas esto autorizadas para o consumo humano. No so rotuladas, a menos que o valor nutricional do alimento tenha sido alterado, como no caso do leo Vistive, ou se tiver sido incorporada alguma substncia capaz de produzir alergias. A experincia de mais de uma dcada de consumo de alimentos transgnicos confirma que estes so equivalentes aos alimentos convencionais. Apesar de alguns grupos ativistas terem manifestado sua oposio aos alimentos transgnicos, isto no tem afetado a estabilidade do sistema de avaliao. Na Argentina e no Mxico, a rotulagem no obrigatria. Na Unio Europeia, rege o princpio de precauo. Como o que importa o processo seguido na produo do alimento, a legislao de 2004 manda rotular todos os produtos de origem transgnica destinados alimentao humana ou animal. A regulamentao extensiva a cantinas e restaurantes. Tambm obrigatrio o rtulo nos alimentos que contenham mais de 0,9% de material geneticamente modificado, incluindo raes, leos vegetais, sementes etc. Por outro lado, a legislao europeia considera que, sendo auxiliares de transformao, no h necessidade de rotular alimentos e bebidas preparados com substncias produzidas por OGM, se estes ou seus resduos no estiverem presentes no produto final. Tampouco so rotulados os produtos provenientes de animais alimentados com raes transgnicas (carne, leite, ovos) nem o mel de abelhas alimentadas com nctar de flores de plantas transgnicas. O objetivo destas medidas garantir a escolha do consumidor e a rastreabilidade dos transgenes ao longo da cadeia alimentar. O rtulo indica "este alimento contm organismos geneticamente modificados" ou "produzido a partir de (nome do organismo) geneticamente modificado". No Brasil, o Decreto 4.680 (24/4/2003) determina que, a partir de abril 2004, todos os produtos com mais de 1% de ingredientes transgnicos sejam rotulados, com um smbolo especfico de tamanho maior a 1 cm2, um tringulo com uma letra T inserida dentro (Figura 16.2). FIGURA 16.2. O smbolo de transgnico, adotado no Brasil.

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ROTULO E INFORMAO Quando se trata de escolher entre dois alimentos, basta recorrer nossa percepo sensorial ou, ainda, nossa experincia pessoal. Nenhuma das duas permite reconhecer a presena de ingredientes transgnicos, ou de origem transgnica, nos alimentos. Em funo da resistncia de alguns grupos de consumidores, a rotulagem pareceria a sada mais lgica para informar de maneira honesta, exata e completa sobre os produtos das prateleiras. Vimos no Captulo 13 que os produtores de sementes comerciais admitem como aceitvel uma contaminao de 1% entre as variedades convencionais. Essa contaminao tambm inevitvel quando coexistem plantaes transgnicas e convencionais. Por conseguinte, o limite de 1% redefine o nvel de pureza de um ingrediente de origem vegetal, admitindo-se que todo valor inferior a esse limite pode ser o resultado de uma contaminao acidental. Sendo assim, o consumidor pode comprar um produto com mais de 1% de ingredientes transgnicos ou um produto convencional cuja composio conta mais de 99% de ingredientes no transgnicos. Em outras palavras, o rtulo no garante ao consumidor a ausncia de transgnicos. Finalmente, cabe refletir sobre o significado de um rtulo para a maioria dos consumidores, e se a escolha entre um produto e outro no depender essencialmente do preo e do marketing. Somente o processo educativo pode dar populao os elementos bsicos para formar uma opinio informada e responsvel e fazer suas escolhas. O RASTREAMENTO DE UM TRANSGENE Em um mundo globalizado, a variedade de regulamentos e de modalidades de rotulagem um fator de complicao das transaes comerciais, em que a qualidade de um produto pode ter que ser definida em relao presena ou ausncia de um transgene. A aceitao dos transgnicos varia de um pas para outro e, tambm, entre diversos grupos de consumidores. Por isso importante contar com formas de rastreamento como a tcnica da PCR (reao em cadeia da polimerase), que pode ser aplicada em diferentes modalidades: Testes qualitativos, para reconhecer a presena ou ausncia do transgene. Testes semiquantitativos, em que a presena ou ausncia do transgene determinada em funo de um limite como 1%, por exemplo. Testes quantitativos, que fornecem informao sobre a quantidade do transgene por comparao com amostras de referncia com concentraes conhecidas. A tcnica permite identificar DNA exgeno em uma quantidade de 0,1% (1 grama em 1 quilograma), mas algumas variantes extremamente sensveis reconhecem a presena de 0,001% do transgene. Observe-se que, para aplicar estes testes, se precisa de informao sobre as sequncias do transgene. Uma forma de simplific-los seria a incluso em todas as construes genticas de uma sequncia conhecida. Esta funcionaria como uma etiqueta molecular, facilitando a identificao de qualquer transgene. Por outro lado, nem sempre a PCR informativa. Em amostras de gros ou alimentos processados, o DNA pode estar quase totalmente degradado. Nesse caso, necessrio saber quais as transformaes que o produto sofreu e estabelecer protocolos adequados. Existem mtodos imunolgicos (Western Blot, ELISA) que permitem detectar a protena sintetizada pelo transgene e eventualmente estimar a quantidade presente. Contudo, o custo de todos esses testes alto e ser pago pelo consumidor.

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17. BIOTECNOLOGIA E SADE / AS VACINAS

AS DOENAS INFECCIOSAS O cultivo de plantas e a domesticao de animais aumentaram a disponibilidade de alimentos e, como consequncia, a densidade das populaes humanas e sua sedentarizao. Essas condies possibilitaram a passagem de germes dos animais domesticados ao homem, originando doenas como a varola, o sarampo e a gripe. No sculo XIX, mais de 80% das crianas morriam de doena antes dos 10 anos de idade. Hoje, na maioria dos pases, elas esto protegidas por programas de vacinao sistemtica que as imunizam contra tuberculose, hepatite B, poliomielite, difteria, ttano, coqueluche, meningite, sarampo, rubola, caxumba e infeces por rotavrus e pneumococos. Uma vacina um produto destinado a estimular o sistema imune de maneira a prevenir ou controlar uma infeco. A vacinao chega s crianas e aos grupos de pessoas sujeitos a maiores riscos, como as mulheres (sarampo e rubola), os maiores de 60 anos (gripe, pneumonias) e os profissionais de sade (hepatite B, antraz). Tambm resguarda os residentes em determinadas reas e os viajantes (febre amarela). Por outro lado, a vacinao dos animais resulta duplamente eficiente, porque alm de proteglos da doena, quebra o elo de transmisso ao homem. Pode-se dizer que nos duzentos anos que nos separam de Jenner, o descobridor da primeira vacina antivarilica, temos alcanado o sucesso na preveno de um bom nmero de doenas infecciosas. A melhora das condies econmicas de uma populao repercute na sade da mesma e, inversamente, diminuindo a doena e suas sequelas de invalidez ou morte prematura, d-se s pessoas a possibilidade de melhorar suas condies de vida. O custo de implantao de um sistema de vacinaes baixo, porque a proteo atinge no s a pessoa que as recebe como os que entram em contato com ela. Em uma variante do velho ditado prevenir melhor que curar, segundo a WHO (Organizao Mundial da Sade; do ingls, World Health Organization), o maior impacto na rea de sade se consegue com gua limpa e vacinas. Lamentavelmente, ainda morrem anualmente dois milhes de crianas de doenas para as quais temos vacinas que no chegam at elas, devido aos conflitos armados e dificuldade de acesso aos centros de sade. E ainda no temos vacinas para doenas como o dengue, a malria ou para o HIV/AIDS. A AQUISIO DE IMUNIDADE Microrganismos infecciosos, suas molculas e substncias qumicas so antgenos. Tambm podem se comportar como antgenos as clulas de um organismo transplantadas a outro e materiais como o plen, pelos de animais e alguns alimentos nas pessoas sensibilizadas. No primeiro contato com um antgeno estranho, o organismo reage com uma resposta imunolgica primria de intensidade baixa e curta durao, acompanhada de alguns sintomas como febre, dor de cabea, erupo cutnea. Essa primeira resposta est acompanhada da aquisio de uma memria imunolgica que facilitar a eliminao do antgeno estranho. A resposta secundria envolve numerosas clulas e molculas e se caracteriza por ser rpida, intensa e duradoura (Figura 17.1).

Copyright Maria Antonia Malajovich Biotecnologia: ensino e divulgao (www.bteduc.bio.br)

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FIGURA 17.1. A resposta primria e secundria do organismo.

Intensidade da resposta imune

Semanas Primeiro contato com o patgeno (antgeno) Segundo contato com o patgeno (antgeno)

FIGURA 17.2. A memria imunolgica.

Antgeno

Detectado por clulas que ativam os diferentes tipos de linfcitos

Linfcitos T citotxicos

Linfcitos T auxiliadores

Linfcitos B

Clulas de memria Eliminam as clulas infectadas

Sntese de anticorpos Neutralizam ou marcam o antgeno dando incio a sua eliminao

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BIOTECNOLOGIA 2011 / Captulo 17: Biotecnologia e sade - Vacinas

OS DIFERENTES TIPOS DE VACINAS Todo patgeno ou antgeno estranho que penetre no organismo detectado pelo sistema imune. A resposta ao antgeno envolve uma ao humoral e uma ao mediada por clulas, ambas coordenadas por diversos componentes do sistema imunolgico. Essas duas formas de ao esto relacionadas com o tipo de ataque do patgeno: o pneumococo se multiplica nos pulmes, o bacilo do ttano produz uma toxina letal, o bacilo de Koch e todos os vrus parasitam as clulas. No caso de uma bactria ou de uma toxina, os anticorpos especficos produzidos pelos linfcitos B reconhecem os microrganismos ou toxinas circulantes, dando incio a sua destruio. Os vrus e algumas bactrias demandam outro tipo de ao, porque, ao invadir as clulas, ficam protegidos dos anticorpos. Ao expor na superfcie celular uma combinao de suas protenas com algumas protenas do invasor, a clula infectada ser reconhecida e destruda pelos linfcitos T matadores (tambm chamados Tc, do ingls T citotoxic). Tanto a ao humoral como a ao mediada por clulas dependem da participao dos linfcitos auxiliadores Ta, tambm chamados Th (do ingls, T helpers), capazes de reconhecer o antgeno e produzir molculas que estimulem a proliferao das clulas B e T. Uma vez finalizada a resposta primria, algumas clulas de memria (B, T) permanecero no sistema. Deve-se memria imunolgica a acelerao dos mecanismos de defesa em ocasio de um segundo contato com o antgeno (Figura 17.2). Uma vacina um produto destinado a treinar o sistema imune no reconhecimento de determinado patgeno, de maneira tal que este no possa desencadear uma infeco ou uma doena. As vacinas estimulam a imunidade humoral, a imunidade mediada por clulas ou, preferentemente, ambas ao mesmo tempo. A vacinao estabelece o primeiro contato do organismo com um patgeno que est incapacitado para causar a doena, conservando sua identidade molecular e a capacidade de induzir uma resposta imune. Ativam-se assim os mecanismos de defesa, em previso de um segundo contato, desta vez com o patgeno original. A PRIMEIRA GERAO As primeiras vacinas, tambm denominadas vacinas de primeira gerao, so vacinas que incluem patgenos vivos atenuados, patgenos mortos ou antgenos acelulares. As vacinas de patgenos vivos atenuados Nas vacinas de patgenos vivos, os microrganismos so atenuados mediante passagens sucessivas em diversos meios de cultivo e/ou por tratamentos fsicos em diferentes condies de temperatura, presso e pH. O procedimento permite selecionar mutantes que conservem a capacidade de induzir uma resposta imune, apesar de ter perdido a patogenicidade. Estas vacinas induzem uma resposta imune intensa e duradoura que envolve ambas as vias, a humoral e a celular. Salvo em caso de imunizao por via oral, basta uma nica dose para obter a imunidade desejada. Apesar de mais eficientes, as vacinas de patgenos vivos atenuados apresentam alguns inconvenientes. Alm de serem inadequadas para as pessoas imunodeprimidas, existe o risco de uma forma atenuada reverter para uma forma ativa. Outra desvantagem a necessidade de manter uma cadeia de frio para conserv-las refrigeradas.

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Utilizam-se na preveno de doenas de origem viral, como a febre amarela, o sarampo, a rubola, a caxumba e a poliomielite (Sabin ou OPV, do ingls oral polyomyelitevaccine). A vacina contra a tuberculose a nica preparada com uma bactria viva, o bacilo de Calmette-Gurin ou BCG. As vacinas de patgenos mortos e toxoides Estas vacinas incluem microrganismos mortos ou toxinas inativadas (toxoides) por procedimentos fsicos ou qumicos. Conferem uma resposta imune de tipo humoral pouco intensa ou duradoura, pelo que se devem administrar vrias doses e, mais tarde, manter a imunidade com doses de reforo. Requerem, tambm, a introduo de substncias coadjuvantes para estimular a resposta imune. Apesar de ser estveis e no depender da cadeia do frio, estas vacinas devem ser modificadas frequentemente para se adaptar aos sorotipos microbianos patognicos que so muito variveis. Alm de vacinas de toxoides contra a difteria e o ttano, existem vacinas de microrganismos mortos contra a clera, a gripe, a hepatite A, a peste, a poliomielite (vacina Salk) e a raiva. As vacinas de subunidades de antgenos Nestas vacinas se colocam, em vez do microrganismo todo, s as fraes da superfcie celular capazes de induzir a resposta imune. Demandam um longo trabalho de pesquisa prvia para determinar quais os melhores antgenos (subunidades) que devero ser includos na vacina e precisam de substncias coadjuvantes para estimular a imunidade. Por no levar mais que fragmentos do microrganismo, estas vacinas no apresentam os riscos das vacinas de microrganismos vivos e independem da cadeia do frio. Existem vacinas de subunidades contra a influenza ou gripe, a doena de Lyme, a hepatite B, a coqueluche e a pneumonia. A SEGUNDA GERAO A engenharia gentica revolucionou o campo das vacinas de primeira gerao, substituindo muitas delas por outras que envolvem modificaes do genoma. A inativao dos microrganismos por deleo de genes relacionados com determinados processos metablicos bsicos, por exemplo, uma forma mais segura de impedir a reverso a uma forma ativa. FIGURA 17.3. A utilizao da tecnologia do DNA-recombinante na vacina contra a hepatite B.
Vrus HBV Gene codificador do antgeno de superfcie HBsAg

Sntese do antgeno

Vacina

Levedura

Levedura transformada

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BIOTECNOLOGIA 2011 / Captulo 17: Biotecnologia e sade - Vacinas

As vacinas recombinantes A tecnologia do DNA-recombinante deu tambm um grande impulso produo de vacinas de subunidades ao possibilitar a produo do antgeno por um microrganismo transformado que possa ser cultivado sem riscos em um fermentador (Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Picchia pastoris). O primeiro xito alcanado foi com a vacina contra a hepatite B (Figura 17.3). Encontra-se em fase experimental uma vacina contra o HIV/AIDS, assim como outra contra a malria. Contudo, as vacinas de subunidades recombinantes esto limitadas produo de antgenos de tipo proteico. As vacinas conjugadas Alguns microrganismos (pneumococos, meningococos) se protegem com uma cpsula de polissacardeos que dificulta sua identificao pelo sistema imune ainda imaturo de uma criana. As novas tecnologias possibilitaram a associao de um toxoide s subunidades de polissacardeo, de maneira a estimular a resposta imune e o reconhecimento dos antgenos capsulares. Estas vacinas de antgenos conjugados so utilizadas na imunizao contra o Haemophilus influenzae B (meningite) e o Streptococcus pneumoniae ou pneumococo. As vacinas contra este ltimo so modificadas frequentemente, adicionando outros antgenos capsulares das mais de 80 linhagens que causam pneumonia em seres humanos. As vacinas vetorizadas Outro tipo interessante de vacinas so as vectorizadas, em que o gene codificador do antgeno transferido a um microrganismo incuo (bactria ou vrus). Ao infetar o hospedeiro, o vetor se multiplica e comea a produzir o antgeno, induzindo a resposta imune contra o patgeno. Com uma vacina deste tipo imunizam-se as raposas, atualmente um dos principais elos na transmisso de raiva na Europa. Em um segundo tipo de vacinas vetorizadas, o vetor no se multiplica no hospedeiro, agindo como seringa molecular para introduzir, na clula, o gene codificador do antgeno. Um vetor deste tipo, por exemplo, o canarypox, que se multiplica em aves, exclusivamente. As vacinas vetorizadas se encontram em fase experimental, no havendo ainda nenhuma aprovada para uso humano. A TERCEIRA GERAO A tecnologia mais promissora parece ser a das vacinas genticas, tambm denominadas vacinas de DNA nu. Estas consistem de um vetor de expresso com uma construo gnica que inclui o gene codificador do antgeno. Injetado diretamente no msculo, o DNA ir penetrar nas clulas apresentadoras de antgeno (clulas dendrticas). Estas migraro at os rgos linfoides, onde sintetizaro o antgeno, estimulando uma resposta imune de tipo celular que permitir imunizar o organismo hospedeiro. Esta tecnologia deve resolver vrios problemas adicionais. Como proteger o DNA, para que no seja degradado ao ser fagocitado pela clula apresentadora do antgeno? Como aplicar a vacina, por biolstica ou eletroporao? Como limitar a expresso do gene transfectado s clulas apresentadoras do antgeno dos tecidos? Persistem ainda algumas dvidas em relao ao risco do DNA se integrar no genoma da clula transfectada, ativando oncogenes ou desativando genes supressores de tumor.

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Esta tecnologia ter uma vantagem fundamental por ser um mtodo genrico que facilita o desenvolvimento e produo de novas vacinas (Figura 17.4). Estas podero ser elaboradas substituindo um gene por outro no cassete de expresso gnica, o que diminuiria os custos e o tempo necessrio para responder a uma emergncia sanitria. Tambm se poderia conseguir uma supervacina com vrios genes codificadores de antgenos, capaz de imunizar o organismo contra vrias doenas simultaneamente. Por outro lado, as vacinas de DNA estimulam ambas as respostas, humoral e mediada por clulas. Na rea veterinria, j foram aprovadas nos Estados Unidos uma vacina de DNA contra o vrus IHNV, causante da necrose hematopoitica em trutas e salmes, e outra contra o vrus do oeste do Nilo, que ataca os equinos. Na rea humana, ainda em fase experimental ou em testes clnicos, se encontram em andamento vrias vacinas deste tipo contra HIV/AIDS, malria, herpes, tuberculose, hepatite B, influenza, rotavrus etc.

FIGURA 17.4. Os diferentes tipos de vacinas virais.

Tipos de vacinas

V. patognico

V. relacionado

V. atenuado

V. morto

Subunidades

Recombinante

Transfeco

Linfcitos B e T

Doena e recuperao

Imunidade adquirida (espontnea)

Imunidade adquirida (artificial)

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BIOTECNOLOGIA 2011 / Captulo 17: Biotecnologia e sade - Vacinas

A PRODUO DE VACINAS PESQUISA E DESENVOLVIMENTO Antes de comercializar uma vacina, existem certas etapas que devem ser cumpridas. A primeira, exploratria e pr-clnica, tem uma durao de 3 a 6 anos e se inicia nas bancadas de laboratrio com experimentos que utilizam cultivos de clulas ou de tecidos. Estes estudos permitem selecionar o melhor candidato vacinal. Sua capacidade de imunizar um ser vivo comprovada em diversos testes com animais de laboratrio (camundongos, cobaias ou macacos). Se os resultados forem satisfatrios, o candidato vacinal poder passar a uma etapa clnica e ser testado em seres humanos. Os estudos clnicos se iniciam em um grupo de 10 a 100 voluntrios adultos, monitorados bem de perto, a fim de verificar a ausncia de toxicidade do candidato vacinal e sua capacidade de imunizar um ser humano. Na segunda fase, que inclui de 100 a 3.000 pessoas da populao alvo, os testes focalizam as dosagens necessrias para a imunizao. A terceira fase, que envolve de 3.000 a 40.000 pessoas, visa comprovar a eficincia do candidato vacinal em proteger os indivduos vacinados contra a doena. Nesta fase, compara-se a reduo da incidncia da doena em uma populao vacinada em relao a uma populao no vacinada. Tambm so identificados os efeitos adversos. A durao total dos estudos clnicos de 6 a 8 anos para as vacinas humanas. As pesquisas com seres humanos e, por conseguinte, todos os testes clnicos, devem ser desenvolvidos dentro do marco tico elaborado pelo tribunal de Nuremberg, por ocasio do julgamento de vinte mdicos condenados como criminosos de guerra, devido aos brutais experimentos realizados com prisioneiros durante a Segunda Guerra Mundial. Segundo o Cdigo de Nuremberg (1949), os experimentos em seres humanos devem visar o bem da sociedade e serem levados a cabo por pessoas cientificamente qualificadas. Os participantes recebero todas as explicaes necessrias antes de dar livremente o seu consentimento. As experincias sero a continuao de outras que, realizadas em modelos animais, permitam prever um resultado tal que justifique a incluso de testes em seres humanos. O sofrimento mental e fsico ser evitado, e as pessoas recebero proteo em caso de ocorrer algum efeito adverso. Nos testes clnicos de avaliao de uma nova vacina participam voluntariamente pessoas que so informadas sobre os riscos e benefcios de sua participao. Contudo, h algumas dvidas sobre a validao do consentimento informado quando os testes so realizados em populaes de escassos recursos, com baixos nveis de instruo. Se os resultados dos estudos clnicos no forem satisfatrios, ser necessria a realizao de estudos adicionais, chegando, eventualmente, a interromper os estudos clnicos e proceder escolha de outro candidato vacinal. Contudo, uma vez comprovado que a vacina segura e eficiente, a indstria farmacutica poder solicitar aos rgos competentes a licena para comercializar o produto. Esta etapa dura de 12 a 18 meses. A liberao da vacina marca o incio do processo de manufatura e da fase de vigilncia farmacolgica, um monitoramento amplo e rigoroso que coleta toda informao sobre algum efeito adverso que possa ocorrer. Em 1999, por exemplo, uma primeira vacina contra o rotavrus teve que ser retirada do mercado em consequncia de alguns casos de intususcepo relacionados com sua aplicao e identificados nesta etapa, a quarta dos estudos clnicos. Atualmente, vrios testes clnicos em seres humanos esto sendo realizados com vacinas contra diferentes doenas, tais como HIV/AIDS, malria, dengue, clera etc. As vacinas veterinrias passam pelas mesmas etapas, mas as exigncias so menores. possvel simplificar os testes com animais de laboratrio e testar o candidato vacinal no animal para o qual destinado o produto. O nmero de indivduos necessrios para os testes clnicos tambm menor.

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ASPECTOS TECNOLGICOS A produo de vacinas uma tarefa delicada, e todos os cuidados devem ser extremados. Cada lote da vacina deve passar por controles estritos a fim de garantir a qualidade e manter a credibilidade no s da indstria, mas da prpria vacinao. A vacina Salk contra a poliomielite, preparada com vrus inativados, aplicada correntemente em vrios pases, sendo considerada hoje uma das vacinas mais seguras. Porm, em 1954, duas semanas depois de liberada, esta induziu 260 casos de plio, inclusive 10 mortes. O acidente, devido inativao incompleta de algumas partculas virais, resultou de um problema na fabricao da vacina no Laboratrio Cutter (Estados Unidos). Uma vacina deve reunir vrias qualidades, principalmente eficincia, pureza, segurana e baixo custo. O processo industrial varia em funo do microrganismo utilizado para a produo de uma vacina, e responde a critrios estritos de qualidade (BPL ou Boas Prticas de Laboratrio; BPF ou Boas Prticas de Fabricao). Atualmente, o controle de qualidade ocupa 70% do tempo dedicado produo de uma vacina. As bactrias se multiplicam em biorreatores, cujo volume depender da produtividade do prprio processo fermentativo e das concentraes obtidas (bactrias, antgenos ou toxinas), assim como do tratamento posterior para a obteno de antgenos ou de toxoides. Os vrus, parasitas obrigatrios, precisam de clulas para se multiplicar. Tradicionalmente, utilizam-se a pele de bezerro e os ovos de galinha, mas a tendncia serem substitudos por culturas celulares, possibilitando o desenvolvimento de vacinas virais para uso humano (poliomielite, sarampo, rubola, influenza, caxumba, raiva) e veterinrio (febre aftosa, raiva, encefalite equina, doena de Mareck e de Newcastle etc.). Do ponto de vista tecnolgico, as mais complicadas so as vacinas combinadas. Vacinas antibacterianas podem ser preparadas em grandes quantidades, com equipamento relativamente simples, enquanto as virais precisam de aparelhos sofisticados e, em muitos casos, de um laboratrio de cultura de tecidos. As protenas recombinantes de vrus ou bactrias so produzidas em biorreatores (leveduras) ou em cultivos celulares. Ao processo de extrao seguem-se vrias operaes de purificao por tcnicas complexas (ultrafiltrao, cromatografia em coluna). Alm do antgeno, na formulao de uma vacina incluem-se outras substncias: os adjuvantes permitem dosagens menores por serem capazes de estimular a resposta imune, os estabilizantes impedem as alteraes devidas ao calor, luz ou umidade, os preservantes conservam os frascos com mltiplas doses. Uma das tendncias atuais na administrao de vacinas reduzir o nmero de doses mediante a imunizao simultnea para vrias doenas em uma mesma injeo (trplice viral ou trplice bacteriana). Tambm se d preferncia a sistemas que diminuam a necessidade de refrigerao, j que esta contribui com 15% dos custos dos programas de vacinao. Outras novidades viro da procura de novas formas de aplicao que substituam o uso de seringas, tais como pistolas, gis, adesivos cutneos, cpsulas, tabletes, inaladores e sprays nasais. Estes ltimos comearam a ser utilizados na aplicao de vacinas contra a gripe (FluMist, nos Estados Unidos; NasVax, em Israel). As vacinas orais tm importantes aplicaes na rea veterinria. Plantas e animais transgnicos produtores de antgenos podero revolucionar alguns aspectos da produo de vacinas. A ideia de ter vacinas comestveis e de poder vacinar as crianas com uma banana em vez de uma injeo muito sedutora. Contudo, alguns problemas de segurana exigem ateno, como, por exemplo, o risco de se misturar bananas-vacina e bananas-alimento, contaminando os alimentos ou dificultando o reconhecimento de um medicamento como tal. Provavelmente, os antgenos sero extrados e administrados em tabletes ou cpsulas.

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Em 2005, Dow AgroSciences registrou nos Estados Unidos uma vacina para a doena de Newcastle em aves, produzida na planta aqutica Lemna. Encontra-se em andamento uma nova vacina contra a febre amarela em plantas de tabaco hidropnicas, pela Fundao Oswaldo Cruz (Fiocruz) em parceria com instituies dos Estados Unidos. ASPECTOS ECONMICOS A produo de vacinas uma atividade menos rentvel que a produo de medicamentos. Contudo, a chegada das novas tecnologias com base biolgica despertou novamente o interesse do setor farmacutico. Atualmente, cinco grandes empresas (Sanofi-Pasteur, Merck, GlaxoSmithKline, Wyeth e Novartis) concentram de 80% a 90% do mercado global de vacinas humanas, estimado em US$ 25 bilhes em 2015. O resto est ocupado por 200 a 250 empresas que desenvolvem mais de 600 produtos. O processo de desenvolvimento de uma nova vacina leva de 14 a 25 anos, a um custo que pode variar entre US$ 300 milhes e US$ 1 bilho. Alguns produtos, como a vacina antimeningococo Prevnar, atingiram nveis de vendas que superam o bilho de dlares. Estima-se que o mercado aumentar significativamente nos prximos anos, em funo do crescimento do setor adulto e especialmente das vacinas teraputicas, que sero analisadas no Captulo 20. Tambm aquecero o mercado produtos novos, tais como as vacinas para a gripe (influenza) e as vacinas que protejam o turista (febre amarela) ou diminuam o abuso de drogas (nicotina). Em meio a numerosas crises econmicas, vrios pases latino-americanos (Argentina, Chile, por exemplo) descuidaram de suas estruturas cientficas e tecnolgicas e passaram a importar as vacinas necessrias para a populao. No entanto, e por diferentes motivos, depois de vrias dcadas de retrao na rea de produo de vacinas, esta comea a ser considerada novamente uma rea estratgica. Para os pases em desenvolvimento, o estmulo produo nacional de vacinas fundamental como parte das obrigaes frente a sua populao e, em termos de sade pblica, para manter sua independncia nesta rea. Trata-se de um setor que no pode ser negligenciado, observando-se indcios slidos de mobilizao para recompor as estruturas produtivas. Alguns pases, como Brasil, China e ndia, contam com instituies de pesquisa e desenvolvimento para a produo de imunobiolgicos, sendo frequentes as parcerias com as grandes empresas farmacuticas. Fundaes privadas, como a Bill & Melinda Gates Foundation, fornecem fundos em prol de melhores e novas vacinas que protejam as crianas das doenas. Para organizaes internacionais como a WHO (World Health Organization), a vacina a mais simples das medidas preventivas possveis na rea de sade. Nos prximos anos, haver progressos na preparao das vacinas preventivas e no desenvolvimento de produtos novos, como as vacinas teraputicas para alguns tipos de cncer ou a doena de Alzheimer. Entretanto, esperam-se vacinas novas ou melhores contra as doenas que afetam um nmero altssimo de pessoas, tais como HIV/AIDS, malria, dengue e tuberculose. UM SETOR ESTRATGICO PARA A SOCIEDADE No Brasil, onde existe uma tradio de um sculo na produo de imunobiolgicos (vacinas, soros, hemoderivados e reativos para diagnstico), as vendas chegam a US$ 600 milhes por ano, o que representa 3% do mercado da indstria farmacutica.

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TABELA 17.1. As principais instituies produtoras de vacinas no Brasil.


INSTITUIO Instituto Butantan VACINAS Dupla, Infantil (difteria e ttano) Dupla, Adulto (difteria e ttano) Trplice (difteria, ttano e coqueluche ou pertussis) Hepatite B recombinante Influenza Laboratrio BioManguinhos Poliomielite Trplice viral (sarampo, caxumba e rubola) Meningites meningoccicas (A/C, por Haemophilus influenzae, HIB e HIB/DTP) Febre amarela Tecpar Fundao Ataulfo de Paiva Antirrbica de uso veterinrio e humano (PV-BHK) Antituberculose (BCG)

At a dcada de 1960, muitas vacinas humanas e veterinrias eram fabricadas no pas. A perda da autossuficincia criou uma situao crtica quando, em incios da dcada de 1980, uma multinacional retirou-se do mercado, deixando a populao em risco de ficar sem vacina trplice, soros antitxicos e antiofdicos. Evidenciou-se nessa ocasio que a produo de vacinas um setor estratgico, ao qual a sociedade deve ter o acesso garantido. O Programa de Autossuficincia Nacional de Imunobiolgicos (PASNI) de 1985 reverteu essa situao mediante uma estratgia de substituio das importaes que estimulou a modernizao das instalaes e a incorporao de novas tecnologias nos sete laboratrios oficiais: Instituto de Tecnologia em Imunobiolgicos (Biomanguinhos, Fiocruz, RJ), Instituto Vital Brazil (IVB,RJ), Instituto de Tecnologia do Paran (Tecpar, PR), Fundao Ezequiel Dias (Funed, MG), Fundao Ataulfo de Paiva (FAP,RJ) e Instituto de Pesquisas Biolgicas (IPB, RS). Atualmente, o Instituto Butantan (SP) e BioManguinhos (RJ) produzem 11 tipos de vacinas e respondem por 70% das vacinas distribudas pelo servio pblico (Tabela 17.1). Vrias vacinas esto sendo desenvolvidas nas prprias instituies citadas anteriormente, e tambm em parcerias entre elas ou com laboratrios estrangeiros (Sanofi Pasteur, GlaxoSmithKline, Instituto Finlay etc.). Algumas das vacinas resultantes desses convnios protegem a populao de sarampo, caxumba e rubola (trplice viral), influenza, rotavrus, raiva (cultivo do vrus em clulas Vero) etc. Os diferentes acordos de cooperao internacional entre os pases latino-americanos tambm tero uma importncia fundamental para o desenvolvimento de polticas de sade pblica que garantam populao o acesso s vacinas. O ROL DAS VACINAS NA ERRADICAO DA DOENA De um modo geral, as vacinas protegem de 80% a 95% das pessoas imunizadas, e os efeitos adversos que elas podem apresentar ocorrem em frequncias muito baixas. O calendrio de imunizaes depende das autoridades nacionais e, em vrios pases, a vacinao no obrigatria. O impacto das vacinas na morbidade infantil relega ao passado algumas das temveis doenas que assolaram o sculo XX (difteria, coqueluche ou pertussis, ttano, poliomielite, meningite, caxumba, sarampo e rubola). Estima-se que a cooperao entre a indstria, os governos e as entidades no lucrativas poderia salvar 10 milhes de vidas entre 2010 e 2020.
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Lamentavelmente, em algumas comunidades subsiste ainda a resistncia s vacinas, seja por motivos culturais, religiosos ou polticos. Intromisso na liberdade individual, desafio vontade divina, degradao dos costumes ou interferncia no desenvolvimento nacional so alguns dos argumentos utilizados. As vacinas tm se mostrado eficientes na erradicao mundial da varola e na eliminao da poliomielite, pelo menos em vrios pases. Em relao gripe, ainda no existe uma vacina capaz de estimular a imunidade para as diversas linhagens. Contudo, dispomos hoje de vacinas para numerosas doenas que afetaram a humanidade durante sculos. O CASO DA VAROLA A varola uma doena eruptiva contagiosa transmitida por um vrus. A incubao dura de 7 a 17 dias; os sintomas principais so febre alta, fadiga e uma erupo de vesculas em todo o corpo. A mortandade de 30%, e os sobreviventes conservam leses caractersticas. A varola teria sido levada at a ndia por mercadores do Egito, onde vitimara o fara Ramss V. A doena se alastrou at a China (sculo I) e o Japo (sculo VI), retornando mais tarde ao Oriente Mdio e alcanando a Europa com os Cruzados (sculo XI-XII). A varola no fazia distino entre camponeses, burgueses ou nobres, cobrando vidas de humildes e poderosos, como o rei da Frana Luis XV. Quem adoece uma vez e se recupera, no adoece uma segunda vez. Esta observao deu lugar primeira tecnologia para combater a varola. No Oriente (ndia e China, sculo XI), as pessoas eram inoculadas com pus das vesculas de doentes com uma forma benigna da doena. Ao desenvolver tambm uma doena benigna, as pessoas inoculadas permaneciam protegidas pelo resto de suas vidas. Apesar de 1% a 2% de essas pessoas terem morrido ao desenvolver a doena em sua forma mais grave, a varola regrediu entre os povos que praticavam a variolizao. Em 1520, com a chegada ao Mxico de um escravo contaminado, a varola entrou no continente americano. Por ter convivido com a doena durante vrios sculos, os europeus tinham desenvolvido alguma forma de resistncia, mas, para as populaes amerndias, o contato com um germe novo levou ao extermnio de 95% de sua populao em menos de duzentos anos. A prtica da variolizao foi introduzida na Inglaterra no incio do sculo XVIII. Anos mais tarde, um inoculador, o mdico Edward Jenner, observou que as ordenhadeiras nunca desenvolviam a varola. Segundo uma crena popular, essa resistncia era consequncia da contaminao com uma doena inofensiva que se manifesta por pstulas no bere das vacas. Em 1796, quando Jenner inoculou a varola vacum em uma criana e, poucos dias mais tarde, a varola humana, a criana no adoeceu. A partir desta experincia, surge o mtodo de vacinao que se estendeu rapidamente por toda Europa. No Brasil, a vacinao foi introduzida em 1840 pelo Baro de Barbacena. Porm, quando, em 1904, sendo Oswaldo Cruz o Diretor Geral de Sade Pblica, o governo decretou a vacinao obrigatria, a resistncia se manifestou no Rio de Janeiro sob a forma de motins, estourando uma revolta que obrigou o governo a rever a medida. Em 1908, depois de uma violenta epidemia de varola (10.000 casos diagnosticados), a populao terminou aceitando a vacinao. Apesar dos surtos terem se espaado, calcula-se que, no sculo XX, 300 milhes de pessoas morreram de varola. Na dcada de 1970, a Organizao Mundial da Sade substituiu a vacinao em massa por uma campanha de erradicao em anel. A estratgia consiste em isolar os pacientes cada vez que um caso novo detectado e vacinar rapidamente todas as pessoas que tiveram algum contato com o doente. Como a vacina tem um efeito muito rpido, os resultados foram extraordinrios. Contudo, por ocasio de um surto havido

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na Iugoslvia (1972) foi necessrio complementar as medidas com uma vacinao em massa. O ltimo caso de varola ocorreu na Somlia em 1977. Em 1978, o escapamento do vrus de um laboratrio da Universidade de Birmingham (Reino Unido) causou a morte de duas pessoas. Com a confirmao da erradicao da varola em 1979, o vrus da varola comeou a ser eliminado dos laboratrios. Dois estoques virais foram conservados preventivamente, um deles no CDC (Center for Disease Control and Prevention, Atlanta, Estados Unidos) e no VECTRO (Instituto para Preparaes Virais, Moscou, Rssia). Apesar de estar prevista sua destruio no ano 2000, esta no ocorreu. A mera possibilidade de um ato de terrorismo assustadora. No se pode afirmar que no existe algum estoque de vrus em outro lugar. Em caso de um surto, os mdicos teriam dificuldades em diagnosticar uma doena restrita aos livros. A populao deixou de ser vacinada em fins da dcada de 1970, de modo que uma boa parte da populao nunca foi imunizada. Sem doses de reforo, o restante pode ter perdido a imunidade. A validade de um pequeno estoque de vacinas que sobrou de dcadas atrs est comprometida. Existem contraindicaes para a aplicao da vacina em pessoas com eczemas ou imunodeprimidas, que hoje so muito mais frequentes que no incio do sculo XX. Mesmo tendo erradicado a varola, precisamos de vacinas antivarilicas eficientes e seguras, formuladas mediante as novas tecnologias. Algumas j se encontram na fase dos estudos clnicos. O CASO DA POLIOMIELITE A poliomielite ou paralisia infantil uma doena causada por um enterovrus que se transmite pela gua. O perodo de incubao de 4 a 35 dias, e 10% das pessoas infectadas desenvolvem os seguintes sintomas: febre, fadiga, dor de cabea, vmitos, constipao ou diarreia, rigidez na nuca e dor nas extremidades. Em aproximadamente 1% dos casos, o vrus da poliomielite passa do intestino para a corrente sangunea e invade o sistema nervoso central, onde se multiplica destruindo os neurnios motores e causando a paralisia das extremidades. Estas pessoas desenvolvem a forma paraltica da doena, e, nos casos em que o vrus se aloja no bulbo, os pacientes precisam de ajuda mecnica para respirar. A doena pode deixar sequelas motoras permanentes (SPP ou sndrome post-plio). Apesar de haver evidncias da doena no Antigo Egito, os primeiros surtos epidmicos ocorreram a fins do sculo XIX. Em 1908, depois de inocular macacos com o tecido nervoso de um paciente morto, K. Landsteiner confirmou que a poliomielite uma doena infecciosa. Na primeira metade do sculo XX, as epidemias de poliomielite deixaram numerosas vtimas, principalmente entre as crianas, mas tambm entre os adultos como, por exemplo, Franklin Delano Roosevelt, presidente dos Estados Unidos. Suspeita-se que as melhores condies higinicas do sculo XX diminuram o contato prematuro da populao com o vrus. Porm, a exposio na idade escolar de um grupo vulnervel ao vrus teria favorecido a apario de surtos. Na dcada de 1950, a doena era aterradora. Havendo um surto, as escolas fechavam e as crianas eram privadas do contato entre elas, permanecendo isoladas at o perigo passar. A notcia de uma vacina teve uma repercusso extraordinria. Em 1954 comeou a ser aplicada a vacina de vrus inativados de Jonas Salk (IPV, do ingls, injetable polio vaccine), que era elaborada com trs tipos de poliovrus em rim de macaco, inativando-o posteriormente com formalina. Em 1963, houve uma segunda opo, a vacina de vrus atenuados de Albert Sabin (OPV, do ingls oral polio vaccine). Nos anos posteriores, devido a modificaes nos processos produtivos, a eficincia de ambas as vacinas aumentou significativamente.

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Ambas apresentam vantagens e desvantagens. Para ser aplicada, a IPV demanda agulhas e seringas estreis, um procedimento mais caro e complicado que a ingesto por gotas da OPV. Em contrapartida, por ser uma vacina de vrus atenuados, a OPV exige a manuteno da cadeia de frio, o que a IPV dispensa. Do ponto de vista da eficincia, a OPV confere uma imunidade mais ampla porque abrange a mucosa digestiva, impedindo a entrada do vrus selvagem no organismo e a infeco das clulas nervosas. Porm, como o vrus atenuado eliminado nas fezes e permanece no ambiente, a OPV acaba por atingir outras pessoas, afetando os no vacinados e os imunodeprimidos presentes no entorno. Por isso, alguns pases preferem a IPV e outros a OPV. Novas vacinas esto sendo pesquisadas como, por exemplo, uma de tipo recombinante que leva o gene codificador de uma protena do capsdeo viral, inserido em Escherichia coli. A sntese dessa protena por uma bactria, que coloniza normalmente o intestino, possibilitaria a imunizao do hospedeiro. Apesar do sucesso alcanado pela vacinao, a erradicao da doena parece ser bem mais difcil do que o esperado. A plio subsiste ainda em algumas regies da frica, do subcontinente indiano e do extremo Oriente, onde as campanhas de vacinao so complexas e muitas vezes interrompidas por conflitos blicos. Um surto da doena atingiu um grupo que se ope vacinao por motivos religiosos, mostrando que o vrus selvagem continua presente no ambiente (Pases Baixos, 1992-1993). Em 2000, a plio reapareceu no Haiti e na Repblica Dominicana. Na ocasio, revelou-se que o vrus atenuado pode reverter a sua forma patognica, e que, mesmo tendo desaparecido a doena, a vacinao ter que ser mantida. Em 2004, com a apario de um novo surto de plio em pases do oeste africano, confirmou-se que o objetivo ainda se encontra distante. O CASO DA INFLUENZA A influenza ou gripe uma doena causada pelo vrus da influenza e apresenta os seguintes sintomas: febre, dores musculares, garganta inflamada, fadiga e dor de cabea. O material gentico do vrus RNA, que est rodeado por um capsdeo proteico e um envelope derivado da membrana celular do hospedeiro. O RNA confere a seu portador uma enorme variabilidade porque, diferente do DNA, os erros de replicao no so reparados por nenhum mecanismo celular. Em funo das protenas do capsdeo, os vrus da influenza so classificados em trs categorias (A, B e C). As variantes de duas protenas do envelope, a hemaglutinina (HA) e a neuraminidase (NA) determinam os diferentes subtipos como, por exemplo, H1N1, H5N1 etc. Os vrus da influenza da categoria A so os mais perigosos porque se multiplicam tanto no homem como em outras espcies (aves, sunos, cachorros, cavalos). Ao pular de uma espcie a outra, o material gentico de diferente origem recombina formando vrus com caractersticas novas. Para desencadear uma pandemia necessrio que esse vrus infecte o homem e sofra uma mutao que possibilite a transmisso pessoa a pessoa. Ao longo do sculo XX, vrias pandemias de gripe assolaram a terra. Em 1918, um surto de gripe sobreveio na Espanha, de onde se espalhou pelo mundo todo causando a morte de 40 a 70 milhes de pessoas. O vrus H1N1 da gripe espanhola circulou durante vrias dcadas, embora tenha perdido parte de sua patogenicidade a partir de 1920. Em 1957, uma segunda pandemia originou-se na China. A gripe asitica, devida ao subtipo H2N2, causou a morte de 2 milhes de pessoas. Poucos anos mais tarde, em 1968, o subtipo H3N2 apareceu em Hong Kong e alastrou-se pelo mundo, deixando 47.000 mortos.

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A gripe aviria (subtipo H5N1) surgiu na sia, em 1997. Embora a transmisso tenha sempre ocorrido no sentido ave-ave e ave-homem, milhares de aves foram sacrificadas durante os surtos de 2003 e 2004 devido ao temor de uma mutao que possibilitasse a transmisso do homem ao homem. O H5N1 traz uma limitao em relao aos mtodos tradicionais de produo de vacinas, j que estes utilizam embries de frango. Selecionando a informao gentica relevante do vrus e transferindo-a para um vrus de laboratrio obtm-se um prottipo viral para a produo da vacina. Este rene a informao para estimular a resposta imune ao H5N1 e pode crescer em embries de frango. A gripe A (subtipo H1N1) ou gripe suna apareceu no Mxico em 2009. Diferentemente das variantes anteriores, esta causou mais vtimas entre os jovens e as mulheres grvidas. A resistncia dos mais velhos pode ser explicada por um contato prvio com vrus de tipo H1N1 que circularam por um tempo na populao. A existncia de medicamentos antivirais contribuiu para o controle da pandemia. Contudo, a rpida mobilizao das autoridades nacionais e internacionais, assim como das empresas farmacuticas, foi decisiva para a obteno de uma vacina adequada. Durante esta ltima pandemia, algumas fraquezas foram expostas. Uma delas a dificuldade de produzir rapidamente uma vacina em ovos embrionados, porque se estima que sejam necessrios 900 milhes para obter 300 milhes de doses da vacina. Em caso de urgncia, a produo em cultivos celulares resultaria mais rpida. Mutao do RNA e recombinao de RNAs de diferente origem so as duas estratgias que explicam a enorme variabilidade do vrus da influenza e justificam a necessidade de mudar continuamente os antgenos da vacina. O candidato vacinal de hoje pode ser incuo amanh, sendo difcil prever contra quais antgenos do vrus dirigir a vacina. Por isso, as vacinas contra a gripe so preparadas anualmente, escolhendo as linhagens que se supe causaro a prxima epidemia. A AMEAA DAS DOENAS EMERGENTES medida que eliminamos ou controlamos doenas, outras novas emergem e algumas das antigas reaparecem. Os microrganismos adquirem resistncia aos medicamentos e a destruio de habitats naturais deixa o homem a merc de agentes infecciosos com os quais no teve contato prvio. O crescimento da populao, as mudanas climticas, o incremento das viagens internacionais e do comrcio, assim como as mudanas comportamentais, so outros fatores determinantes para a disperso de agentes infecciosos. A gripe espanhola, a hepatite B, as febres hemorrgicas (Junin, Lassa, Marburg, Ebola etc.), a doena de Lyme, a doena dos Legionrios, a AIDS (do ingls, agude immunodeficiency sindrome), a Escherichia coli 0157:H7 contaminante dos alimentos, o vrus do Nilo ocidental, a BSE (encefalopatia espongiforme bovina) e a dengue so alguns dos exemplos de doenas emergentes. Vrias dessas doenas contam com testes diagnsticos, e, para algumas, j temos vacinas (hepatite B, doena de Lyme). Mas, desde a descrio ou a identificao do patgeno correspondente at a produo de uma vacina, passa um tempo considervel. Por enquanto, a mais insidiosa talvez seja a HIV/AIDS, porque destri a capacidade do sistema imune de responder a infeces oportunistas. Os primeiros casos apareceram em 1981 e se estenderam rapidamente pela populao. Estima-se que 3,1 milhes de pessoas morreram e que 5 milhes foram contaminadas em 2002, chegando ao total de 42 milhes de pessoas atingidas. Aproximadamente 90% das novas contaminaes ocorrem nos pases em desenvolvimento, especialmente o sul da frica e a sia. No rasto da HIV/AIDS (e da adio a drogas injetveis), a tuberculose reaparece com germes resistentes aos medicamentos.
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Apesar das medidas preventivas e dos grandes progressos alcanados no tratamento da HIV/AIDS, o ideal seria encontrar uma vacina. As dificuldades so enormes porque, para ativar a resposta imune, devem-se ativar as clulas T auxiliadoras que a coordenam, e so justamente estas as que o vrus destri. Como geralmente o vrus penetra no organismo por via anal ou vaginal, permanecendo um tempo na corrente sangunea antes de invadir as clulas, a vacina deveria estimular ambas as vias, a humoral e a celular, e se estender s mucosas. Na luta contra o HIV/AIDS, diversas estratgias so possveis; uma delas seria impedir a invaso do organismo pelo vrus, a outra, ajudar o organismo a impedir a progresso e/ou a transmisso da doena. A falta de um modelo animal adequado e as frequentes mutaes do vrus complicam a tarefa. Embora os resultados obtidos at agora tenham sido decepcionantes, esto sendo realizados os estudos clnicos correspondentes a vacinas de subunidades, de vetores virais recombinantes e de DNA. Talvez nos encontremos um pouco mais perto de controlar a doena. A primeira epidemia emergente do sculo XXI a SARS (do ingls, severe acute respiratory sindrome), uma doena de origem viral que apareceu na China (2003). Transmitida pelo ar, a SARS disseminou-se rapidamente por 30 pases, matando 10% a 15% das pessoas afetadas. Diferente dos vrus da pneumonia ou da influenza, o agente infeccioso da SARS uma linhagem patognica de coronavrus. Completado rapidamente o sequenciamento gentico, este pareceria ser o resultado de uma recombinao ocorrida naturalmente entre um vrus de ave e outro de camundongo. Espera-se que o progresso tecnolgico permita obter uma vacina rapidamente. O BIOTERRORISMO Esporos disseminados pelos correios causaram um surto de antraz, logo depois do atentado s torres do World Trade Center (Estados Unidos, setembro de 2001), alertando o mundo sobre a ameaa de bioterrorismo. No foi a primeira vez que as armas biolgicas foram utilizadas. Os romanos usavam animais mortos para infectar os poos de seus inimigos. Na Amrica (do Sul e do Norte) os colonizadores exterminaram tribos indgenas com cobertores contaminados deixados como presente. Antes de levantar o stio cidadela de Kaffa (Crimeia, 1346), o exrcito trtaro de Janibeg catapultou para dentro das muralhas os mortos de peste, iniciando uma terrvel epidemia que se difundiu na Europa e dizimou a populao. Ainda hoje, a peste mata 2.000 pessoas por ano, na frica e na sia. Em 1941, durante o conflito sino-japons, o exrcito do Japo disseminou a peste bubnica no norte da China, em cinco ocasies. Estima-se que uma dzia de pases teria armas biolgicas de destruio em massa, envolvendo aproximadamente 70 agentes infecciosos. Atualmente, ou em curto prazo, existem vacinas para alguns deles (Bacillus anthracis, Clostridium botulinicum, Yersinia pestis, Francisella tulariensis, varola e hantavrus). Entretanto, de um ponto de vista cientfico, sanitrio ou financeiro, a vacinao poderia no ser o mtodo de combate mais eficiente. Por isso, boa parte do esforo antiterrorista est sendo orientado atualmente para o melhoramento de diagnsticos e a procura de novos medicamentos antivirais e antibacterianos. Outro motivo de preocupao est na quantidade de informao referente ao genoma de patgenos disponvel nos bancos de dados pblicos, porque se teme que esse conhecimento possa ser utilizado para elaborar armas biolgicas. Em 2002, um grupo de pesquisadores americanos mostrou que partculas infecciosas sintticas de poliovrus podem ser obtidas a partir da sequncia genmica disponvel na Internet. Esses pesquisadores sintetizaram alguns fragmentos de DNA e encomendaram outros a empresas especializadas. Juntando os pedaos, eles construram uma molcula de DNA de 7.500 pares de bases. Depois de transcrever a informao e colocar o RNA em um meio com componentes celulares,
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eles obtiveram partculas virais. Recentemente, outro grupo de pesquisadores utilizou o mesmo mtodo para sintetizar o vrus da gripe espanhola. No fim do ano 2011, pesquisadores holandeses e norteamericanos noticiaram ter conseguido manipular o vrus H5N1 em laboratrio, tornando-o facilmente transmissvel em seres humanos. O trabalho, que poderia servir tanto para elaborar uma vacina como para criar uma arma letal, levanta o problema da liberao dos dados da pesquisa que, normalmente, so compartilhados por pesquisadores de todos os pases. O perigo do bioterrorismo no deve ser subestimado. Denomina-se biosseguridade a nova disciplina que lida com a utilizao inadequada do conhecimento biolgico e, particularmente com as pesquisas consideradas de uso duplo.

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18. BIOTECNOLOGIA E SADE / OS TESTES DIAGNSTICOS

OS TESTES DIAGNSTICOS O reconhecimento dos sintomas de uma doena exige do mdico conhecimento e experincia. O diagnstico estabelecido a partir de vrios elementos, tais como a histria clnica do paciente, a anamnese, os exames fsicos e uma bateria de anlises e/ou testes laboratoriais. Solicitados pelo mdico para monitorar o estado de sade do paciente, os testes de rastreio identificam fatores qumicos, microbianos ou genticos que possam causar uma doena ou estar-lhe associados. Constituem uma rotina que varia em funo do sexo e da idade do paciente. Os resultados sero avaliados em relao a um conjunto de valores que considerado o normal, e remetidos ao mdico como uma fonte objetiva de informao. Geralmente realizados em amostras de sangue e de urina, o objetivo desses testes detectar qualquer disfuno de maneira a induzir mudanas no estilo de vida do paciente e/ou iniciar rapidamente um tratamento. Como exemplos, o hemograma, a anlise de urina, o lipidograma e, tambm, a identificao do antgeno prosttico para diagnstico de cncer etc. Qualquer negligncia em relao adoo dos testes adequados pode ter consequncias graves para a sade pblica. Embora existisse no mercado um teste da empresa Abbott para o diagnstico de HIV, em 1985 a Frana postergou o rastreio das doaes de sangue, em uma medida protecionista visando favorecer o lanamento de um teste francs. Em poucos meses, 297 pessoas receberam transfuses de sangue contaminado e trs ministros de Estado tiveram que comparecer na Justia para responder pelo escndalo. Inserida nos setores mdico e veterinrio, estima-se que a indstria de diagnsticos in vitro ter um volume de vendas global de US$ 60 bilhes em 2014. O setor que cresce mais rapidamente o de diagnsticos moleculares (doenas infecciosas e cardiovasculares, oncologia e farmacogentica), em funo do crescimento dos mercados da Amrica Latina, do Leste Europeu, do Meio Oriente e do Leste Asitico. AS TENDNCIAS ATUAIS Uma das tendncias atuais centralizar os testes diagnsticos em um ambiente automatizado, de alta tecnologia, onde se integrem os reagentes, os instrumentos analticos e os produtos acessrios de controle de qualidade. Em consequncia, as anlises clnicas esto se concentrando em umas poucas empresas, com suficiente poder econmico para desenvolver a tecnologia e adquirir um volume de amostras que justifique a utilizao desses sistemas robotizados. Em outra vertente mercadolgica, kits comerciais relativamente simples permitem o diagnstico de gravidez e o monitoramento de algumas condies crnicas como a diabete, e so vendidos nas farmcias ou via Internet. A construo de dispositivos miniaturizados de arrays moleculares de protenas, anticorpos ou cidos nucleicos estimulou o desenvolvimento de vrias plataformas comerciais (Affymetrix, Illumina, Agilent, Applied Biosystems, Incyte / Stanford etc.). A chegada de materiais e dispositivos construdos em escala nanomtrica dever revolucionar os testes in vitro.
Copyright Maria Antonia Malajovich Biotecnologia: ensino e divulgao (www.bteduc.bio.br)

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FIGURA 18.1. Imagens comerciais de alguns dispositivos miniaturizados utilizados em testes diagnsticos.
A. Lab-on-a-chip de Agilent (lab-on-a-chip-loc-243049.jpg (http://www.directindustry.com) B. Chip de DNA para diagnstico de Toshiba (http://www.toshiba.co.jp/rdc/rd/fields/06_t29_e.htm) C. Gene chip de Affymetrix (http://www.pgbeautygroomingscience.com) A B C

FIGURA 18.2. Imagem comercial dos sistemas API de Biomrieux. (http://www.biomerieux.com.br/servlet/srt/bio/brazil/dynPage?doc=BRZ_CLN_PRD_G_PRD_CLN_12)

FIGURA 18.3. Uma microplaca de poliestireno.

TABELA 18.1. As qualidades de um bom teste de diagnstico.


QUALIDADE Sensibilidade Especificidade Exatido Reprodutibilidade DEFINIO Probabilidade de dar um resultado positivo quando a condio est presente Probabilidade de dar um resultado negativo quando a condio no est presente Dar o mesmo valor que o obtido com outro mtodo Em se tratando de um teste quantitativo, dar sempre o mesmo valor na mesma amostra.

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O desenvolvimento da tecnologia microfludica permitiu a miniaturizao de testes diagnsticos em dispositivos que realizam automaticamente as diversas etapas do procedimento. Com os biochips microfludicos ou lab-on-a-chip (LOC), resultados precisos so obtidos rapidamente no consultrio mdico, no hospital (emergncia, unidade de terapia intensiva) ou em algum lugar isolado, sem precisar recorrer ao laboratrio (Figura 18.1). Estima-se que, em 2014, o mercado global dos produtos lab-on-a-chip chegar a US$ 2,1 bilhes. O QUE UM BOM TESTE As tcnicas bioqumicas, imunolgicas e genticas ocupam um lugar preponderante no setor de diagnsticos, porque renem vrias qualidades (Tabela 18.1). Apesar ser aplicadas tambm na rea ambiental (anlise de solos, qualidade da gua) e na indstria de alimentos (deteco de contaminantes nos alimentos ou nas matrias-primas), neste captulo nos limitaremos a analisar sua utilizao na rea de sade. AS TCNICAS COM BASE BIOQUMICA Desde a dcada de 1970, as tcnicas clssicas de identificao microbiana tambm esto sendo substitudas por sistemas miniaturizados. Nos sistemas API da empresa Biomrieux, por exemplo, uma alquota de uma suspenso microbiana adicionada em minitubos contendo os reagentes necessrios para determinar as caractersticas fisiolgicas do microrganismo em questo (Figura 18.2). Algumas das reaes ocorrem em aerobiose, outras em anaerobiose. Diversos tipos de galerias conseguem identificar quase todas as bactrias (Gram positivas e Gram negativas) e as leveduras de interesse clnico. Alm de ser mais seguros, o sucesso desses dispositivos se deve reduo da quantidade de reagentes, do trabalho laboratorial e dos custos. AS TCNICAS COM BASE IMUNOLGICA Baseadas nas reaes de aglutinao e precipitao entre um antgeno e o anticorpo correspondente, as tcnicas imunolgicas receberam um grande impulso a partir de 1975, com o desenvolvimento da tecnologia de hibridomas. Desde ento, o principal avano est na construo de bibliotecas de bacterifagos produtores de fragmentos de anticorpos humanos, obtidos por fuso do gene de uma protena viral com o gene correspondente regio varivel de um anticorpo isolado em linfcitos B humanos. Apesar de complexa, demorada e cara, a tecnologia de hibridomas abastece os laboratrios com reagentes standard, especficos e sensveis. Associados a molculas radiativas ou fluorescentes, os anticorpos monoclonais detectam os antgenos especficos em clulas, tecidos, soros e corridas eletroforticas (imunofluorescncia, radioimunoensaio, Western Blot etc.). So utilizados tambm para separar diferentes populaes celulares (CellSorter) e localizar tumores. Em outro tipo de testes, os anticorpos se encontram acoplados a enzimas que formam um produto colorido em presena do substrato (ELISA, do ingls Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Estes testes no s detectam como quantificam a concentrao de anticorpos (infeces, doenas autoimunes) e de antgenos (hormnios, antgenos cancerosos, alrgenos nos alimentos e na poeira caseira, toxinas alimentares, esteroides usados ilicitamente por atletas, drogas como a cocana e os opiceos etc.).

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FIGURA 18.4. Os mtodos direto e indireto de um teste positivo de ELISA.


MTODO DIRETO O anticorpo fixado na placa de microtitulao. MTODO INDIRETO O antgeno fixado na placa de microtitulao.

Coloca-se uma amostra de sangue como fonte de antgeno. Este se fixa nos anticorpos. Retira-se o excesso por lavado.

Coloca-se uma amostra de soro como fonte de anticorpos. Estes se fixam no antgeno.Retira-se o excesso por lavado.

Acrescentam-se anticorpos ligados a uma enzima E, que se fixam no antgeno.Retira-se o excesso por lavado.

Acrescentam-se anticorpos especficos para a imunoglobulina humana, ligados a uma enzima E, que se fixam nos anticorpos do soro, fixados previamente no antgeno.Retira-se o excesso por lavado.

Adiciona-se o substrato da enzima, formando-se um produto colorido P.

Adiciona-se o substrato da enzima, formando-se um produto colorido P.

A cor proporcional quantidade de antgeno no sangue.

A cor proporcional quantidade de anticorpos no soro.

FIGURA 18.5: Imagem mostrando a identificao dos 46 pares de cromossomos humanos mediante a tcnica de SKY, segundo o National Human Genome Research Institute (http://www.genome.gov).

FIGURA 18.6: Imagem comercial de um termociclador para a reao em cadeia da polimerase, de Applied Biosystems (http://appliedbiosystems.com).

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Os testes podem ser processados em microplacas de poliestireno com um nmero varivel de pequenas cavidades que cumprem a funo de um tubo de ensaio (Figura 18.3). Estas placas permitem realizar simultaneamente numerosos testes, utilizando uma quantidade mnima de reagentes e automatizando a leitura dos resultados. Os mtodos, direto e indireto, dependem da molcula fixada nos poos da microplaca (Figuras 18.3 e 18.4). Existem tambm microarrays proteicos em pequenas lminas, contendo pouco mais de 100 diferentes molculas, protenas ou anticorpos em um centmetro quadrado. Diferente dos chips microfludicos, que separam e processam protenas, os microarrays proteicos extraem as molculasalvo do meio e as fixam, possibilitando sua identificao. Estes dispositivos so de grande importncia nos estudos relativos ao proteoma. Estima-se que, em 2014, o mercado global de microarrays proteicos chegar a US$ 848 milhes. AS TCNICAS COM BASE GENTICA A utilizao das tecnologias genticas para o diagnstico clnico se v favorecida pelo acmulo de conhecimento sobre o genoma humano. Os estudos cromossmicos evoluram notavelmente com a utilizao de sondas acopladas a molculas fluorescentes (SKY, do ingls spectral karyotyping). O computador transforma a imagem microscpica em outra de cores brilhantes bem definidas, facilitando a identificao dos pares cromossmicos e de pequenas translocaes (Figura 18.5). Sondas especficas tambm possibilitam a localizao de sequncias gnicas nas clulas (FISH, do ingls fluorescence in situ hibridization, ASO, do ingls Allele-specific oligonucleotide) e nos fragmentos de cidos nucleicos, previamente separados por eletroforese em gel (Southern e Northern Blot, Fingerprint). Contudo, a grande estrela a reao em cadeia da polimerase ou PCR (do ingls, polymerase chain reaction), uma tecnologia que, por amplificar quantidades nfimas de DNA, facilita as anlises posteriores (Figura 18.6). Na rea clnica, a PCR aplicada na identificao de patgenos e na pesquisa de variaes genticas dos pacientes. Diversas variantes combinadas permitem detectar marcadores especficos e, por exemplo, verificar a desapario de um clone celular maligno ou determinar se um tratamento oncolgico deve ser prolongado. O monitoramento da reao mediante anticorpos fluorescentes consegue eliminar os estudos complementares de eletroforese, posteriores amplificao. Assim, obtm-se os resultados rapidamente em tempo real. A versatilidade da tcnica tem dado origem a numerosos procedimentos bem diversificados. Contudo, os maiores avanos vm da construo de sistemas miniaturizados, os biochips microfludicos (lab-on-a-chip) e os microarrays e biochips de DNA. Um biochip microfludico rene, em um nico dispositivo, as diferentes etapas de um procedimento de diagnstico complexo: extrao da amostra, separao eletrofortica, colorao/descolorao e identificao. O lab-on-a-chip demanda uma interveno humana mnima e d rapidamente um resultado preciso que pode ser arquivado facilmente. Um segundo tipo de dispositivo o microarray, que consta de at 100.000 sondas de DNA por centmetro quadrado, fixadas a uma lmina. A hibridizao dessas sondas com as molculas de cidos nucleicos (cDNA) marcados ser visualizada por varredura (scanner) como pontos fluorescentes. Os microarrays so utilizados nos estudos de expresso gnica e para o sequenciamento rpido de oligonucleotdeos. O estudo simultneo de centenas de genes um caminho para desvendar as interrelaes existentes entre eles e vrios aspectos do funcionamento do genoma.

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Esperam-se destes dispositivos grandes avanos no diagnstico do cncer e das doenas cardacas e neuropsiquitricas (Figura 18.7). Tambm possibilitaro a escolha de tratamentos farmacolgicos adequados ao perfil do paciente. Estima-se que, em 2014, o mercado global de microarrays de DNA chegar a US$ 2,7 bilhes. FIGURA 18.7. O uso de arrays no diagnstico de mutaes nos genes BRCA1 e BRCA2.
Compara-se o padro obtido na hibridizao dos fragmentos de DNA marcados de uma paciente e os de um controle normal. A hibridizao de ambos DNAs, do DNA da paciente ou do DNA do controle com as sondas, detectada por varredura (scanner), sinalizada com cores diferentes em uma imagem computadorizada.

Tecido da paciente

Tecido controle

Extrao de mRNA

Extrao de mRNA

Preparao de cDNA (transcriptase reversa)

Preparao de cDNA (transcriptase reversa)

Amplificao do DNA e marcao com substncias com diferente fluorescncia

Amplificao do DNA e marcao com substncias com diferente fluorescncia

Mistura de ambos os cDNAs marcados

Hibridizao com as sondas fixadas na placa do microarray e rinsagem

Varredura e leitura

Diagnstico

Os pontos verdes e vermelhos identificam, respectivamente, os stios de hibridizao de cada um dos DNAs testados. Os pontos amarelos identificam os stios de hibridizao de ambas as amostras, e os pontos pretos os de nenhuma das duas amostras.

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O DIAGNSTICO DAS DOENAS INFECCIOSAS A disseminao de uma doena detida com o tratamento, posterior ao diagnstico. Nos pases desenvolvidos, assim como em alguns setores dos pases em desenvolvimento, os novos testes de diagnstico se encontram ao alcance da populao. Essa no a realidade dos pases mais pobres, sem acesso a esta tecnologia, que exige material e equipamentos especializados. Nesses pases, uma das principais causas de mortalidade continua sendo a alta incidncia de doenas infecciosas, entre as quais devemos incluir as emergentes (HIV/AIDS), as re-emergentes (tuberculose) e as pertencentes ao vasto grupo das doenas negligenciadas (malria etc.). O diagnstico de HIV est baseado no reconhecimento de uma protena (p24) do vrus e na presena de anticorpos (ELISA, Western Blot), dois testes que atualmente podem ser combinados em um s. Para chegar a todos, a grande inovao seria a complementao ou substituio dos testes atuais por outros rpidos, que no requeiram uma infraestrutura laboratorial. Diagnosticada a infeco por HIV, dois testes acompanham sua evoluo: a carga viral, medida por PCR quantitativa, e a contagem de clulas CD4. Dependendo dos resultados, d-se incio ao tratamento. A resistncia da linhagem viral aos medicamentos avaliada mediante testes genticos. Em alguns pases encontram-se venda kits para HIV/AIDS. Contudo, a necessidade de apoio psicolgico para enfrentar o diagnstico e a dificuldade para o leigo de lidar com os resultados falso positivo ou falso negativo limitam muito sua utilizao individual. Nas mos de pessoal treinado, os testes de diagnstico rpido so uma ferramenta preciosa no s para o diagnstico de HIV/AIDS como para o de outras doenas de importncia epidemiolgica, como hepatite, sfilis e malria. O diagnstico da tuberculose envolve vrias etapas, lentas e trabalhosas. Descobre-se a infeco latente pela reao tuberculina e diagnostica-se a doena a partir de radiografias, observaes microscpicas e cultivos microbianos. Testes mais recentes identificam rapidamente os anticorpos no sangue (ELISA) e o Mycobacterium tuberculosis diretamente no esputo (sondas genticas). Contudo, a difuso desses testes ainda se encontra limitada pelo custo. O diagnstico de malria depende de observaes clnicas confirmadas por microscopia, uma tcnica que, apesar de ser relativamente econmica, exige pessoal treinado. Apesar da existncia de testes genticos, os testes imunolgicos rpidos resultam mais convenientes nas regies remotas, onde no h laboratrios nem equipamentos apropriados. A um custo menor, estes reconhecem o Plasmodium falciparum, resistente a cloroquina, dentre as espcies que podem causar a doena, facilitando a escolha do tratamento. Os pases emergentes precisam tambm de testes de diagnstico adaptados s doenas que os afetam como, por exemplo, a doena de Chagas, a Leischmaniose, a malria, a leptospirose, a dengue, as infeces por rotavrus etc. Vrias empresas latino-americanas desenvolvem tecnologias avanadas e comercializam kits de diagnstico em vrios pases (Argentina, Brasil, Chile, Colmbia, Cuba, Venezuela e Uruguai). Alguns produtos so inovadores como, por exemplo, os kits para diagnstico de hidatidose, de doena celaca e da doena de Chagas de trs empresas argentinas. A TIPIFICAO DE TECIDOS SANGUE A tipificao das hemcias classifica as pessoas em quatro grupos para os marcadores ABO (A, B, AB e O) e dois para o sistema Rh (Rh+ e Rh-). A caracterizao rotineira deste ltimo durante a gravidez permite tomar medidas em caso de incompatibilidade sangunea me-feto.
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Tambm necessria a tipificao dos sistemas ABO e Rh antes de uma transfuso sangunea. Esta interveno salva vidas em pacientes que sofreram uma hemorragia (acidente, cirurgia, doenas digestivas etc.) ou que apresentam um quadro de anemia sria (quimioterapia, cncer, doenas hematolgicas). Nem sempre basta a tipificao dos antgenos ABO e RH da superfcie das hemcias, porque existem vrios outros sistemas de grupos sanguneos que podem desencadear uma reao grave. Em pacientes que tenham passado por uma gravidez ou uma transfuso prvia, os anticorpos a esses sistemas so pesquisados mediante kits de hemcias especficas. A palavra final corresponde aos testes de compatibilidade, em que se coloca o soro do receptor em presena das hemcias do doador. Indispensveis na rotina de um banco de sangue, estes testes personalizados so realizados por pessoal mdico ou tcnico. Nos centros hospitalares que processam um nmero alto de amostras de sangue, os testes sorolgicos clssicos em tubos de vidro esto sendo substitudos por novas tecnologias, em estaes de trabalho automatizadas: Gel Tests para tipificao de hemcias, ACT (do ingls affinity column technology) para identificar subclasses de imunoglobulinas em hemcias sensibilizadas, tecnologia para pesquisa de anticorpos em placas de microtitulao. OUTROS TECIDOS E RGOS A rejeio de um rgo transplantado de uma pessoa a outra se deve incompatibilidade entre os respectivos tecidos. Alm dos antgenos do grupo sanguneo (ABO), outros marcadores de identidade tambm se expressam nas clulas de um organismo. O sistema imune os utiliza para diferenciar as clulas que fazem parte do organismo (eu) das que no pertencem a ele (no eu). Esses antgenos de identidade so codificados por um conjunto de genes estreitamente ligados, localizados no cromossomo 6. Os genes HLA, HLB e HLC determinam os antgenos de classe I, presentes em todas as clulas, excetuando as hemcias. J o locus HLD determina outros trs antgenos (DR, DQ e DP), denominados de Classe II, que so encontrados em algumas clulas (macrfagos, moncitos, clulas dendrticas e clulas endoteliais). Os de maior importncia clnica so os antgenos de classe I codificados pelos alelos de HLA e HLB e os de classe II, relativos a DR. FIGURA 18.8. O sistema HLA. A herana dos hapltipos

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A herana do sistema HLA segue um padro de codominncia, ou seja, ambos os alelos se expressam nas clulas. Quando uma pessoa caracterizada como HLA - A1 A3 B8 B14 DR2 DR10, isto significa que, em um cromossomo, leva os alelos A1 B8 DR2 herdados de um dos pais, e, no outro, A3 B14 DR10, herdados do outro. Por estarem estreitamente ligados, esses genes se transmitem em blocos, denominados hapltipos (Figura 18.8). Como esses genes contam com mais de 450 alelos, milhes de combinaes seriam possveis e cada pessoa teria uma identidade nica. Contudo, alguns hapltipos so mais frequentes que outros, especialmente em diferentes grupos raciais. Para tipificar os tecidos, os antgenos celulares devem ser identificados mediante baterias de anticorpos e instrumentao laboratorial. A incompatibilidade entre os linfcitos ou tecidos do doador e os linfcitos do receptor evidenciada pela proliferao celular in vitro (reao mista). Utiliza-se tambm a PCR para caracterizar os genes HLA-DP do doador e do receptor (testes de DNA). Antes de um transplante, tambm estudada a compatibilidade entre o soro do receptor e os tecidos do doador, para verificar a ausncia de anticorpos contra o rgo a transplantar (crossmatch), que podem aparecer devido a gravidezes, transplantes anteriores ou transfuses. A PRTICA FORENSE Com exceo dos gmeos idnticos, nenhuma pessoa geneticamente idntica outra. Durante quase um sculo, a identificao das pessoas dependeu das impresses digitais. E muitos crimes foram resolvidos graas a estudos bioqumicos e imunolgicos, apesar das enormes dificuldades em encontrar uma quantidade suficiente de material em estado de conservao adequado. A anlise do DNA para a identificao das pessoas utilizada a partir da dcada de 1980, quando A. Jeffreys idealizou a tcnica do Fingerprint, estabelecendo uma relao nica entre um indivduo e sua sequncia gnica. A identificao recorre a pequenas sequncias no codificadoras dispersas no DNA, denominadas VNTRs ou vinters (do ingls, variable-number tandem repeats). Essas sequncias polimrficas repetem-se um nmero de vezes que pode variar de um cromossomo ao seu homlogo, de modo que os fragmentos de restrio tero tamanhos diferentes (Figura 8.5). Sondas genticas especficas identificam at 20 tipos diferentes de sequncias VNTRs. No gel de eletroforese aparecer um padro de bandas individual, parecido com os cdigos de barras usados no comrcio. Como a probabilidade de duas pessoas escolhidas ao acaso terem o mesmo perfil de DNA menor a um em um trilho, o resultado praticamente nico para cada indivduo. Os VNTRs tambm podem ser amplificados por PCR. Na determinao da paternidade, os estudos de grupos sanguneos e de protenas do soro tm sido complementados ou substitudos pelos testes de DNA, que se transformaram no eixo de varias investigaes muito comentadas na mdia. No Brasil, o jogador de futebol Pel teve que reconhecer a paternidade de Sandra Regina, e o menino Pedrinho, sequestrado na maternidade logo aps seu nascimento pde, anos mais tarde, reencontrar sua verdadeira famlia. Apesar das crticas levantadas em relao s possibilidades de erros laboratoriais devidos contaminao de amostras, ao risco da participao de pessoal treinado inadequadamente e s dificuldades de interpretar estatisticamente os dados, em poucos anos a anlise de DNA se transformou em uma ferramenta indispensvel na prtica forense. Depois de anos de mistrios e rumores, os cadveres enterrados em uma fossa comum perto de Jekaterinburg foram reconhecidos, em 1994, como sendo os do tzar Nicolau II, sua famlia e servidores, assassinados durante a Revoluo Russa (1918). Em 1992, os ossos encontrados, anos antes, em uma tumba no Brasil, foram identificados como pertencentes ao comandante do campo de extermnio de Auschwitz, Joseph Mengele, um dos homens mais procurados aps a Segunda Guerra Mundial. Mais recentemente, nos Estados Unidos, uma mancha no vestido azul de uma
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estagiria se transformou em uma pea essencial para solicitar o impeachment do Presidente Clinton. A anlise de DNA a nica forma de reconhecer as vtimas de catstrofes, conflitos blicos e atentados como o do World Trade Center (Nova York, 2001) ou da estao de Atocha (Madrid, 2004). E, anos mais tarde, de seu instigador, Osama Bin Laden. Quando as amostras esto muito degradadas, analisa-se o DNA mitocondrial. Transmitido por via materna, esse DNA conta com uma regio muito varivel, apta para identificar pessoas. Esta metodologia tem sido aplicada na Argentina. Durante o regime militar que governou o pas entre 1976 e 1985, foram exterminadas (desaparecidas) de 9.000 a 30.000 pessoas. Muitas crianas foram ento separadas de suas famlias e entregues para adoo, sob uma nova identidade. A comparao entre o seu DNA e o de suas avs maternas possibilitou a muitos filhos de desaparecidos recuperarem sua identidade. O DIAGNSTICO DE DOENAS DE ORIGEM GENTICA AS LIMITAES DOS TESTES As doenas de origem gentica representam um grupo heterogneo de patologias que obedecem a causas diversas: alteraes no nmero e na estrutura dos cromossomos, ao de um gene determinando a sntese de uma protena ou sua ausncia, ao de vrios genes interagindo com fatores ambientais, tais como o fumo, a dieta, o estresse etc. (Tabela 18.2). O diagnstico das doenas genticas est baseado em observaes clnicas e testes laboratoriais (metabolismo, cromossomos, DNA). A localizao e o sequenciamento dos genes responsveis pelas principais doenas monognicas possibilitaram o desenvolvimento de testes genticos. Contudo, devido prpria heterogeneidade do determinismo gentico, esses testes apresentam algumas limitaes: o o o o Algumas mutaes so incuas para a sade do portador (polimorfismos). Mutaes em genes diferentes podem causar a mesma doena. Mutaes diferentes dentro de um mesmo gene podem causar a mesma doena. Mutaes diferentes dentro do mesmo gene podem causar doenas parecidas, mas com prognstico diferente (benigno ou grave).

Um teste gentico pode no detectar todas as mutaes capazes de causar uma doena. Por outro lado, sua sensibilidade depende da incluso da informao mais recente resultante da pesquisa gentica. Existem doenas genticas que aparecem em uma famlia devido a mutaes em algum gene desconhecido, de modo que no possvel sua identificao. O caso no pode ser resolvido, a no ser que se encontre uma ligao com outro gene prximo e bem conhecido, que funcionar como um marcador. A transmisso do gene marcador permite inferir como transmitido o gene desconhecido. Um estudo desenvolvido por 50 grupos de pesquisa (Wellcome Trust Case Control Consortium) identificou recentemente 24 regies do genoma humano fortemente relacionadas com 7 doenas diferentes (Doena de Crohn, diabete tipo 1 e 2, doena cardiovascular, hipertenso, artrite reumatoide e doena bipolar). Tambm difcil determinar qual a contribuio dos genes para doenas que apresentam um padro de herana complexo, com vrios genes interagindo com fatores ambientais. A no ser que haja um gene com um efeito muito maior que os restantes, os testes genticos so de difcil elaborao.

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A presena de determinados alelos, como BRCA1 e BRCA2, est associada a uma predisposio familiar ao cncer de mama. Contudo, esses alelos no so detectados na maioria dos outros casos da mesma doena. Em outros termos, nem todas as doenas de origem gentica so familiares, podendo aparecer devido a mutaes ou alteraes cromossmicas ocorridas ao longo da vida. AS ESTRATGIAS SEGUIDAS Apesar de suas limitaes, os testes genticos representam um avano significativo do ponto de vista mdico e individual. Aplicados em qualquer momento da vida de uma pessoa, respondem a diferentes objetivos. O rastreio de portadores realizado quando um casal planeja ter filhos e deseja saber se tem ou no um determinado alelo. Geralmente, solicitado quando h casos de doena na famlia ou quando o casal pertence a uma populao em que a frequncia da doena alta. Nas famlias afetadas, os testes genticos identificam os indivduos portadores de um gene ou de uma alterao cromossmica que possa trazer problemas para eles ou para sua descendncia. Rastreio de portadores e aconselhamento gentico so duas medidas que conseguiram diminuir a incidncia de vrias doenas em algumas comunidades: a anemia falciforme entre os afroamericanos, a doena de Tay-Sachs entre os judeus ashkenazim, a fibrose cstica entre os irlandeses. O rastreio de erros inatos do metabolismo no recm-nascido possibilita o tratamento de algumas condies hereditrias, evitando danos e leses irreparveis. Aproximadamente 5% das crianas nascem com problemas congnitos ou hereditrios, alguns dos quais podem ser previstos mediante testes genticos de rastreio. A partir da dcada de 1960, diminuram as deficincias mentais causadas pela fenilcetonria, graas implantao do Teste de Guthrie ou do pezinho, que mede a quantidade de fenilalanina no sangue. Uma tcnica nova, derivada da espectrometria de massa, capaz de detectar 20 transtornos metablicos em um nico teste. O diagnstico pr-natal realizado quando h algum risco ou indcio de doena gentica no feto. Por exemplo, uma concentrao elevada de -fetoprotena no sangue materno, entre a 15a e a 20a semana de gravidez, indica a possibilidade de o feto apresentar anomalias, como a sndrome de Down. Neste caso, a me poder ser aconselhada a fazer uma amniocentese, extraindo-se uma pequena quantidade de lquido amnitico e estudando as clulas do feto para confirmar ou excluir vrios diagnsticos. A me poder optar tambm por uma biopsia de vilosidades corinicas, em que se retiram algumas clulas da placenta (crion) para anlise. Em uma fecundao in vitro, o diagnstico pr-natal pode preceder a implantao do embrio. Aps trs divises celulares, quando o embrio se encontra num estado de oito clulas, uma delas removida para a determinao do sexo e das caractersticas genticas. O procedimento no causa dano ao embrio. No adulto, os testes genticos so feitos a partir de alguma evidncia clnica, para confirmar ou descartar um diagnstico. Realizam-se tambm para prever se uma pessoa que no apresenta sintomas ir desenvolver uma doena da qual j existem casos na famlia (doena de Huntington, doena de Alzheimer) ou para detectar a presena de algumas mutaes gnicas associadas predisposio a alguma doena.

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TABELA 18.2. Algumas das mais de 8.000 doenas genticas descritas.


Nas doenas monognicas, a transmisso mostra um padro claro de herana que no sempre fcil de evidenciar nas doenas espordicas ou multifatoriais. Os exemplos que figuram na tabela correspondem a mutaes no genoma nuclear. Fonte: Issues in Human genetics (EIBE). TIPO DE DOENA HERANA EXEMPLO CARACTERSTICAS APARIO DOS SINTOMAS Nascimento Nascimento Nascimento 1-2 anos

Sndrome de Down Cromossmica Espordica Sndrome de Turner Sndrome de Klinefelter Fibrose cstica

Grau varivel de atraso mental etc. Alteraes da diferenciao sexual (mulheres) Alteraes da diferenciao sexual (homens) Diversas complicaes devidas secreo de muco excessivamente espesso Deficincia mental Anemia crnica, infeces, crises dolorosas ou hemolticas Surdez, cegueira, contraturas, espasticidade Anemia severa, deformaes esquelticas. Nvel de colesterol alto causando doena coronria juvenil Movimentos involuntrios, demncia Cistos no fgado, no pncreas, no bao e no rim Alteraes da coagulao sangunea, sangramento excessivo dos ferimentos de Degenerao muscular Atraso mental, automutilao Dificuldade em respirar Entupimento das artrias, ataques cardacos

Fenilcetonria Autossmica recessiva Anemia falciforme

Nascimento A partir dos 6 meses 3-6 meses A partir dos 6 meses 20-30 anos

Doena de Tay-Sachs Monognica Talassemias Hipercolesterolemia familiar Autossmica dominante Doena de Huntington Rim policstico Hemofilias Ligada ao X Distrofia muscular Duchenne

35-45 anos 40-60 anos A partir de 1 ano 1-3 anos Nascimento Nascimento Idade adulta

Sndrome de Lesch-Nyan Asma Multifatorial Contribuio gentica varivel Doena cardiovascular

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BIOTECNOLOGIA 2011 / Captulo 18: Biotecnologia e sade - Testes diagnsticos

DIAGNSTICO PREVENTIVO E PREDITIVO Ao associar um gene a uma doena, os testes genticos marcam o incio de um tratamento apropriado, que trata os sintomas ou retarda sua apario (hemofilia, distrofia muscular de BeckerDuchenne, fibrose cstica etc.). Mas nem sempre resultam claras quais as vantagens do diagnstico de uma alterao gnica para a qual no existe nem cura nem alvio. Neste caso, a existncia de um teste de diagnstico pode exigir escolhas muito complexas. Consideremos, por exemplo, a Coreia de Huntington, uma doena de difcil tratamento, que se manifesta tardiamente e se transmite de modo autossmico dominante. A deciso de fazer o teste depende da prpria pessoa, mas atinge seus familiares, porque um diagnstico pode ser informativo sobre a constituio gentica dos outros integrantes da famlia. Outro exemplo o da transmisso familiar da doena de Alzheimer, em que algumas pessoas querem saber se vo a desenvolver os sintomas e outras no. Os avanos tecnolgicos recentes abrem caminho para o estudo das doenas que resultam da interao de fatores genticos e ambientais. J no se trata de prever uma doena, mas de calcular qual a probabilidade de vir a desenvolv-la. A funo de um diagnstico preditivo de dar ao paciente a possibilidade de fazer escolhas saudveis, eventualmente modificando seu modo de vida e aumentando a vigilncia frente a determinados sintomas. Hoje existem testes para a predisposio a doenas cardiovasculares, doena periodontal, predisposio ao cncer de mama, de ovrio, de clon e de endomtrio. E esto sendo desenvolvidos testes preditivos de resposta a medicamentos. A predio tem suas limitaes. Por exemplo, as mulheres com o gene BRCA1 tm 80% de chances de desenvolver cncer de mama aos 65 anos de idade; um risco que considerado alto, mas sem que exista uma certeza absoluta. Graas ao diagnstico preditivo, elas podero aumentar as medidas preventivas, isto , mamografias, controles mdicos, etc. Mas do ponto de vista preventivo, no se pode ignorar que a predisposio familiar responde s por 5 a 10% dos casos de cncer, sendo os 90 a 95% restantes devidos a mutaes adquiridas ao longo da vida. Calcula-se que em 20 anos, nos pases desenvolvidos, a expanso do mercado dos testes genticos e dos medicamentos relacionados possibilitar os tratamentos de sade pr-sintomticos. Quantos destes sero necessrios? Quantas pessoas se sentiro erroneamente seguras em relao ao estilo de vida que adotarem? A implementao da medicina preditiva deve ser analisada criteriosamente por todos os setores da sociedade. Quem controlar a aplicao dos testes genticos? Como garantir que a deciso de se submeter a um teste obedea exclusivamente a uma escolha pessoal? Quem teria acesso informao resultante? Seria possvel formar uma subclasse de indivduos sem seguros de sade nem empregos, discriminados em funo de seus genes?

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19. BIOTECNOLOGIA E SADE / OS MEDICAMENTOS

A INDSTRIA DE MEDICAMENTOS A origem da farmcia atribuda a Galeno (sculo II), um mdico romano que, combinando elementos dos trs reinos do mundo natural, elaborara numerosas preparaes medicinais. Durante a Idade Mdia, conservou-se seu legado, a denominada farmcia galnica, em conventos e monastrios. No sculo XVI, o mdico e alquimista suo Paracelso estabeleceu as bases da farmacologia, ao postular que os agentes curativos do mundo interior (microcosmo) devem ser procurados nas substncias qumicas do mundo exterior (macrocosmo). Devemos a ele outros importantes conceitos: existe um remdio especfico para cada doena e qualquer remdio pode ser txico, dependendo da dose. O desenvolvimento da qumica, no sculo XVIII, possibilitou a evoluo das tcnicas farmacolgicas. Na primeira metade do sculo XIX, fundaram-se os primeiros laboratrios farmacuticos. Rapidamente, os mtodos artesanais foram substitudos por sistemas de produo industrial. A indstria farmacutica cresceu solidamente ao longo do sculo XX. O setor compreende os fabricantes de diversas categorias de medicamentos (de marca, genricos e de venda liberada), alm das empresas que elaboram produtos novos e das que desenvolvem pesquisas, geralmente terceirizadas. A indstria sustenta numerosas atividades de pesquisa e desenvolvimento de novos produtos. De 5.000 a 10.000 compostos que passam pelo crivo de uma primeira triagem, s um chegar ao mercado, em um processo que leva de 10 a 15 anos, a um custo aproximado de US$ 800 milhes. O retorno do investimento garantido pelos lucros e por um sistema de patentes vlido por 20 anos (Figura 19.1). O controle da produo de medicamentos depende das grandes corporaes multinacionais em contnuos ciclos de fuso, consolidao e expanso. Extremamente competitivo e dinmico, o setor capaz de absorver rapidamente os avanos cientficos e tecnolgicos. Na disputa por um mercado em crescimento, destacam-se como empresas lderes: Pfizer, Novartis, Sanofi-Aventis, Merck, Roche, GlaxoSmithKline, AstraZeneca, Johnson & Johnson, Eli Lilly e Abbott. Em 2010, o mercado global de medicamentos movimentou US$ 850 bilhes, contabilizando, cada uma dessas empresas, vendas em valores superiores aos US$ 19 bilhes. No mesmo ano, os medicamentos mais vendidos foram os oncolgicos, os agentes respiratrios, os reguladores de lipdios, os antidiabticos e os antipsicticos. Estima-se que, em 2014, o volume global de vendas de medicamentos ser de US$ 1 trilho. Apesar do nmero de medicamentos novos colocados no mercado ter diminudo nos ltimos anos, o nmero de compostos em testes pr-clnicos ou clnicos aumentou. A estrutura do setor poder ser reorganizada nos prximos anos em funo da chegada de novas tecnologias robticas, informticas e biolgicas.

Copyright Maria Antonia Malajovich Biotecnologia: ensino e divulgao (www.bteduc.bio.br)

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FIGURA 19.1. As etapas do desenvolvimento de um medicamento.

5.000 compostos
Descoberta Fase pr-clnica 5 compostos

0
2 4 6 8

Incio das pesquisas. Estudos laboratoriais e testes em animais para avaliar a atividade biolgica e a segurana. Pedido de patente (3,5 a 4,5 anos). Pedido de aprovao para dar incio aos testes em seres humanos. Fase I: Acompanhamento farmacocintico e primeiros estudos sobre segurana e dosagem em 20 a 100 voluntrios sadios (1 ano). Fase II: Eficincia e efeitos colaterais em 100 a 500 pacientes voluntrios (2 anos). Fase III: Monitoramento das reaes ao uso prolongado do medicamento em 1.000 a 5.000 pacientes voluntrios (3 anos). Processo de aprovao do novo medicamento (2,5 anos) Fase IV: Vigilncia farmacolgica

Testes clnicos

10 12

1 composto

14 16

18

Procedimentos administrativos

20 22 24
Anos

Vencimento da patente Genricos

OS PRINCPIOS ATIVOS DAS PLANTAS O CASO DA ASPIRINA Devido a seu poder de curar febres e acalmar dores, a casca do salgueiro (Salix Alba) era utilizada na preparao de poes medicamentosas, j no sculo XVIII. Dos cristais de salicilina, que era o princpio ativo, extraa-se o cido saliclico, esclarecendo-se rapidamente sua frmula qumica. Em 1874, fundou-se a primeira empresa para sintetizar cido saliclico, uma substncia capaz de aliviar eficazmente a dor, mas com o inconveniente de causar problemas estomacais e ter um gosto muito amargo. Por acetilao do cido saliclico, Felix Hoffman obteve o cido acetilsaliclico, um produto com menos efeitos colaterais que comeou a ser comercializado em 1900 pela Bayer, sob o nome de aspirina. Vendem-se hoje, aproximadamente, 10 bilhes de comprimidos por ano. (Figura 19.2). Embora a aspirina alcanasse uma popularizao extraordinria, o seu modo de ao permaneceu desconhecido por muito tempo. Isso no impediu que fosse utilizada pelos astronautas da Apolo I, durante o primeiro voo lua, em 1969. Dois anos mais tarde descobriu-se que a ligao entre o cido acetilsaliclico e algumas enzimas dificulta a sntese de prostaglandinas, um grupo de substncias produzidas naturalmente, durante as infeces ou na ocasio de ferimentos, que tornam os nervos mais sensveis dor. Por impedir a agregao das plaquetas, a aspirina tambm ajuda a prevenir problemas de coagulao sangunea e ataques cardacos.

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BIOTECNOLOGIA 2011 / Captulo 19: Biotecnologia e sade - Medicamentos

OS FITOTERPICOS At o momento, foram identificadas mais de 50.000 espcies de plantas medicinais. Para a populao mais pobre, muitas delas representam a nica fonte de tratamento acessvel. Tambm so utilizadas por outra parcela da populao, adepta das medicinas alternativas e do consumo de medicamentos fitoterpicos tradicionais, considerados mais suaves e com menos efeitos colaterais. Nessa corrente de pensamento, o natural percebido como bom, admitindo-se que o extrato vegetal seja mais eficiente que alguma de suas partes (princpio biologicamente ativo). Os fitoterpicos so produtos relativamente baratos, de venda livre e com poucas oportunidades de patentes. Contudo, sua eficcia varia com as condies de cultivo das plantas, j que a sntese das substncias ativas depende do solo, da estao e at do momento do dia. Outras limitaes importantes so a falta de conhecimento sobre os efeitos secundrios, a ausncia de estudos clnicos em grande escala e a carncia de controles de qualidade estritos. A promoo da medicina tradicional pela WHO (World Health Organization), enunciada na declarao de Alma-Ata (1978) sobre a ateno primria a sade, marca uma mudana de atitude em relao aos fitoterpicos. A partir de 1990, o uso dos fitoterpicos aumentou significativamente, estimando-se que o mercado global seja de US$ 62 bilhes por ano. Com a publicao de um manual relativo ao controle de qualidade dos materiais extrados das plantas medicinais (WHO, 1998) e o estabelecimento de diretrizes gerais sobre metodologias de pesquisa e avaliao das medicinas tradicionais (WHO, 2000), o mercado dos fitoterpicos entra em uma nova etapa. AS NOVAS TECNOLOGIAS Em uma linha totalmente diferente perfilam-se as grandes empresas de produtos farmacuticos. A descoberta recente de algumas substncias antitumorais (taxol, vinblastina, vincristina etc.) de origem vegetal estimulou a procura por princpios ativos em plantas, animais e microrganismos, especialmente em regies de grande biodiversidade. Contudo, as opinies no so unnimes em relao a possveis e eventuais descobertas de molculas com aplicaes teraputicas. Algumas empresas farmacuticas consideram que, em quase duzentos anos de prospeco, j teriam sido descobertos praticamente todos os princpios ativos de interesse, e preferem passar ao desenho de medicamentos por qumica combinatria e modelos computacionais. Outras ponderam que na diversidade dos microrganismos e das plantas que devem ser procuradas novas molculas, porque ainda existiriam numerosas fontes de princpios ativos desconhecidos na flora to diversa como mal estudada de muitas regies. FIGURA 19.2: A frmula da aspirina.

COOH

COOH

OH cido saliclico

O-CO-CH3 ci do acetilsaliclico

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Na ltima dcada, verificaram-se mudanas enormes no campo da pesquisa de produtos naturais, graas disponibilidade de tecnologias baseadas na robtica e na automao dos ensaios biolgicos. A anlise das substncias qumicas (alcaloides, terpenos, esteroides, glicosdeos etc.) presentes em uma planta ou em seu extrato depende de tcnicas analticas automatizadas e de bancos de dados nos quais armazenar os dados (Chemical Fingerprint). A robotizao permite realizar ensaios de atividade biolgica de at 200.000 produtos por dia (HTS, do ingls, high throughput systems). Por outro lado, os estudos quimioinformticos estabelecem correlaes entre estrutura e atividade, atravs de mtodos estatsticos. Uma vez identificado um princpio ativo, suas caractersticas farmacolgicas podero ser melhoradas mediante transformaes qumicas, chegando-se a substituir uma molcula natural por outra sinttica equivalente ou ligeiramente modificada. A IMPORTNCIA DE UM MARCO LEGAL Nos pases que contam com uma biodiversidade importante discute-se como desenvolver os estudos de bioprospeco e qual o papel que deveria ser desempenhado pelas instituies, nacionais e estrangeiras, e pelas empresas farmacuticas. O risco de biopirataria real. No sculo XIX plantas de seringueira foram levadas de modo sub-reptcio da Amaznia Malsia. O captopril, um medicamento derivado do veneno da cobra Bothrops, hoje importado pelo Brasil em uma verso sinttica. Na Costa Rica, o InBio (Instituto Nacional de Biodiversidade) negociou, a partir de 1991, acordos de bioprospeco no valor de US$ 1 milho com a Merck, e mais tarde com outras empresas farmacuticas. Estes acordos contriburam para aumentar a capacitao do pas desde vrios pontos de vista: cientfico, tecnolgico e institucional. No entanto, apesar de ter encontrado vrias molculas promissoras, at o momento nenhuma delas originara um medicamento novo. Aproximadamente na mesma poca teve incio um programa de prospeco de agentes bioativos em terras ridas da Amrica Latina. O programa envolveu instituies norte-americanas (Universidade do Arizona, National Institute of Health [NIH], United States Department of Agriculture [USDA]), argentinas (Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuria [INTA], Universidad de la Patagonia), chilenas (Pontificia Universidad Catlica de Chile) e mexicanas (Universidad Nacional Autnoma de Mxico). Os resultados das pesquisas desenvolvidas durante oito anos esto armazenadas em um banco de dados. As numerosas crticas levantadas por estas e outras iniciativas como o convnio NovartisFundao Bio-Amaznia (2000) mostram as dificuldades em estabelecer normas de trabalho dentro do marco legal para a proteo da biodiversidade, respeitando a Conveno da Diversidade Biolgica (1992).

FIGURA 19.3. A frmula da penicilina.


Na frmula da penicilina pode-se observar um anel lactmico e uma cadeia lateral (R). Algumas bactrias sintetizam -lactamases, enzimas que, ao destruir o anel correspondente, desativam as penicilinas naturais. Modificando a cadeia lateral, obtiveram-se as penicilinas semissintticas, resistentes a essas enzimas.

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BIOTECNOLOGIA 2011 / Captulo 19: Biotecnologia e sade - Medicamentos

AS SUBSTNCIAS ANTIBITICAS O CASO DA PENICILINA At a Segunda Guerra Mundial, as nicas armas disponveis na luta anti-infecciosa eram umas poucas vacinas e antitoxinas. No incio do sculo XX fora descoberto, no laboratrio de Paul Ehrlich, um derivado do arsnico para o tratamento da sfilis. Comercializado em 1910 pela empresa Hoechst, o Salvarsan resultou em um terrvel fracasso por duas razes: era txico e devia ser injetado, em uma poca em que no existiam seringas. Os primeiros inibidores bem sucedidos do crescimento microbiano foram as sulfas, derivados da sulfonamida, no final da dcada de 1930. Em 1928, o bacteriologista Alexander Fleming observou que, em um cultivo de estafilococos semeado em uma placa de Petri e contaminado por um fungo, as bactrias no cresciam ao redor do contaminante. Alm de isolar, cultivar e identificar esse fungo como sendo o Penicillium notatum, Fleming conseguiu extrair uma substncia, a penicilina, e test-la em animais. A penicilina revelou-se um antissptico eficaz que, no sendo txico nem causador de irritao, podia ser aplicado ou injetado em doses macias. Este resultado no teve repercusso alguma na comunidade cientfica. Durante quase 10 anos, Fleming tentou, sem sucesso, obter penicilina em estado puro. Em 1940, nos laboratrios da Universidade de Oxford, H. Florey e E. Chain obtiveram um sal sdico de penicilina com baixo grau de pureza (Figura 19.3). Este produto teve um efeito extraordinrio nos primeiros ensaios clnicos, mas a quantidade disponvel resultou pequena para o seu uso teraputico. Com o objetivo de iniciar sua produo em grande escala, Florey e Chain transferiram-se em 1941 para Peoria (Illinois, Estados Unidos), onde a participao da indstria farmacutica (Pfizer, Merck) foi decisiva para o sucesso da tarefa. Dois fatores possibilitaram a produo industrial de penicilina. O primeiro, a descoberta em um melo podre de uma linhagem de Penicillium chrysogenum, capaz de produzir 200 vezes mais penicilina que a linhagem original. O segundo foi o aumento da produtividade, que passou de 50 mg/l a 50-100g/l, mediante a substituio do cultivo em garrafas pelo cultivo submerso em biorreatores, com capacidade entre 40.000 e 200.000 litros. Graas a essas mudanas, as foras aliadas dispuseram de suficiente penicilina para o tratamento dos soldados feridos na invaso da Europa, em 1944. OS LIMITES AO USO DE ANTIBITICOS Aps o sucesso da penicilina, comeou a triagem de outros antibiticos nos microrganismos do solo, um ambiente muito competitivo onde essas substncias conferem uma vantagem seletiva. Assim, descobriram-se a actinomicina, a neomicina e a estreptomicina, esta o primeiro antibitico eficiente para o tratamento da tuberculose. Um pouco mais tarde os antibiticos de amplo espectro, como o cloranfenicol, a aureomicina e a terramicina, entraram no mercado. Paralelamente, a indstria procedeu ao aprimoramento dos mtodos de extrao e de purificao, assim como da pesquisa de formas moleculares alternativas que facilitassem sua utilizao na atividade clnica. Alm de produtos de origem natural (antibiticos), hoje contamos com outros de origem sinttica (antibacterianos). O cloranfenicol, extrado de Streptomyces venezuelae, tambm produzido por sntese qumica. A descoberta de novos produtos (eritromicina, vancomicina, ampicilina, meticilina, cefalosporina) possibilitou a cura de doentes e feridos para os quais, meio sculo atrs, a medicina no tinha tratamento.

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Contudo, o tempo mostrou o outro lado da moeda. O uso clnico indiscriminado de antibiticos favoreceu a apario de linhagens resistentes que se espalharam rapidamente. Os antibiticos agem de diversos modos, mas sempre alvejando algumas poucas funes vitais da clula, tais como a sntese da parede celular, dos cidos nucleicos, das protenas ou do cido flico. Para cada alvo atingido, aparece uma forma especfica de resistncia. O anel -lactmico das penicilinas e cefalosporinas desativado mediante a sntese de -lactamases. A inibio da sntese proteica pela estreptomicina desaparece com uma modificao do stio-alvo no ribossomo. A tetraciclina bombeada para fora das clulas se houver uma alterao da permeabilidade celular. Por outro lado, a transferncia horizontal de plasmdeos pode disseminar a resistncia mltipla s drogas. De fato, nessa corrida sem fim entre a utilizao de antibiticos e a apario de microrganismos resistentes, novos medicamentos devero ser descobertos, se quisermos manter alguma vantagem sobre as bactrias. A NECESSIDADE DE INOVAO As principais classes de antibiticos foram descobertas entre 1940 e 1962. Posteriormente, passaram-se vrias dcadas sem grandes inovaes neste campo, at a chegada das oxazolidinonas, que so molculas bloqueadoras da sntese de protenas bacterianas (Tabela 19.1). Existem muitas substncias com propriedades antibiticas, mas poucas so interessantes do ponto de vista clnico. Devido s dificuldades encontradas em descobrir molculas novas, e para contornar a apario de resistncia, a indstria investiu nas chamadas Me-too-Drugs, isto , substncias iguais com pequenas modificaes qumicas. Por outro lado, o vencimento de muitas das patentes possibilitou o aparecimento das formas genricas de alguns dos antibiticos mais difundidos, como o Augmentin (amoxacilina/clavulanato) ou o Cipro (ciproflaxin). Nos ltimos anos, muitas empresas abandonaram o mercado para atender o setor bem mais lucrativo das doenas crnicas. No obstante, cinco das maiores ainda continuam produzindo antibiticos: Abbott, Novartis, AstraZeneca, Merck, Pfizer e Johnson & Johnson. Outras firmas novas ocuparam o espao vacante, como Basilea Pharmaceutica LTd., que lanou o Ceftobiprole, uma cefalosporina de quinta gerao, eficaz contra os MRSA (do ingls, meticillin-resistent Staphylococcus aureus) e outros supermicrbios. TABELA 19.1. A linha do tempo de entrada dos antibiticos e antibacterianos no mercado.
ANTIBITICOS E ANTIBACTERIANOS Sulfonamidas (Sulfas) -lactmicos Cloranfenicol, tetraciclinas Aminoglicosdeos Macroldeos Quinolonas, estreptograminas Oxazolidinonas Lipopeptdeos Glicilciclinas Mutilinas DATA 1936 1940 1949 1950 1952 1962 2000 2003 2005 2007

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Os antibiticos representam 65% do mercado de medicamentos anti-infecciosos, que inclui tambm os antivirais e os antifngicos. Estima-se que, em 2015, o volume global de vendas de antiinfecciosos alcance os US$ 40 bilhes. Atualmente, existem vrias estratgias para o desenvolvimento de novos antibiticos. Podem-se procurar compostos ou extratos naturais com atividade inibitria do crescimento de microrganismos, em sistemas robotizados para triagens de alto desempenho (HTS, high-throughput screening). Ou pesquisar os peptdeos naturais, produzidos por seres vivos terrestres e marinhos, e incrementar sua ao antibitica mediante alteraes na estrutura molecular. A construo de peptdeos sintticos por qumica combinatria tambm uma alternativa interessante. Em outra linha de ao est a procura, no metabolismo do hospedeiro, de algum alvo que impea a infeco. Os novos mtodos in silico possibilitam a triagem de estruturas moleculares relacionadas com uma atividade biolgica determinada, assim como a utilizao dos dados genmicos para identificar um alvo medicamentoso. Esta estratgia pareceria ser mais interessante com bactrias que com vrus. No entanto, provvel que o sucesso no desenho de produtos novos dependa da genmica comparativa e funcional dos microrganismos, uma disciplina capaz de esclarecer a funo dos genes e de mostrar quais os alvos que poderiam ser atacados. Centenas de genomas bacterianos j tm sido sequenciadas. O caminho est sendo trilhado por algumas pequenas empresas biotecnolgicas, apesar de ser muito difcil enfrentar a etapa dos testes clnicos, que demanda inverses estimadas em US$ 150-200 milhes, valores altssimos que s podem ser cobertos pelas grandes empresas farmacuticas. Estima-se que os antibiticos baseados na genmica estejam disponveis na prxima dcada.

AS PRIMEIRAS MOLCULAS TERAPUTICAS O CASO DA INSULINA A insulina um hormnio, isto , um mensageiro qumico, que produzido no pncreas e regula o metabolismo do acar (glicose) no corpo (Figura 19.4). Quando a insulina secretada pelo pncreas baixa, o nvel de glicose no sangue aumenta e passa a ser excretada na urina, arrastando muita gua e causando sede excessiva. As complicaes resultantes incluem nefropatias, retinopatias, neuropatias e doenas cardiovasculares. O quadro descreve o diabetes mellitus, uma doena conhecida h sculos e que hoje pode ser tratada. Em 5 a 10% dos casos, a falta de insulina consequncia da destruio das clulas do pncreas pelo sistema imune. Trata-se de uma forma da doena que ataca crianas e adolescentes (diabete de tipo 1). Nos casos restantes, as pessoas precisam de mais insulina da que produzem (diabete de tipo 2). Esta forma costuma se manifestar em pessoas mais velhas, com sobrepeso, inativas e com uma histria familiar. O tratamento envolve dieta e exerccios moderados, alm de medicamentos, entre os quais, eventualmente, a insulina.

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FIGURA 19.4. A estrutura da molcula de insulina humana.

Cadeia B

Cadeia A

FIGURA 19.5. A sntese da insulina. A) A sntese in vivo da insulina, nas clulas pancreticas.
Peptdeo sinal

Traduo

Remoo do sinal e unio das cadeias A e B

Remoo da cadeia C

mRNA de insulina

Molcula precursora

Pr-insulina

Insulina

B) A sntese em Escherichia coli (1982).


Um organismo procarionte incapaz de realizar modificaes ps-traducionais. possvel sintetizar prinsulina para transform-la enzimaticamente em insulina, ou sintetizar cada uma das cadeias em separado e associ-las mais tarde, como ilustrado no esquema. Sntese da cadeia A

Insero no plasmdeo e clonagem em E.coli Sntese da cadeia B

Extrao da cadeia proteica A Unio qumica das cadeias A e B Extrao da cadeia proteica B

Insero no plasmdeo e clonagem em E.coli

Insulina

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Em 1920, F. Banting comprovou o efeito hipoglicemiante de extratos de pncreas de cachorro. Logo depois, deu-se incio comercializao de insulina extrada de pncreas bovinos e porcinos. Essas insulinas animais salvaram numerosas vidas, mas, por diferir da insulina humana em alguns aminocidos, acabavam causando reaes alrgicas. Do ponto de vista da estrutura qumica, as diferenas so pequenas. A molcula de insulina humana consta de 51 aminocidos distribudos em duas cadeias unidas entre si por pontes bissulfeto. A insulina bovina difere da humana nas posies 8 e 10 da cadeia A e na posio 30 da cadeia B, mas a insulina porcina s difere na posio 30 da cadeia B. O tamanho da molcula de insulina torna a sntese qumica economicamente invivel (Figura 19.4 A). Contudo, basta substituir um aminocido (alanina) por outro (treonina) na extremidade de uma das cadeias da insulina suna para que a sequncia molecular passe a ser a mesma da insulina humana. Esta insulina semissinttica representou um enorme progresso em relao s insulinas animais, apesar de permanecerem alguns problemas relacionados com a obteno da matria-prima e o tratamento de resduos. A tecnologia do DNA recombinante revolucionou a produo de insulina humana porque possibilitou sua sntese em microrganismos geneticamente modificados: primeiro em Escherichia coli (Eli Lilly, 1982), mais tarde em leveduras (Novo, 1987). Por ser um produto mais estvel e de melhor qualidade que os existentes no mercado, a insulina recombinante representa um dos primeiros e indiscutveis sucessos da biotecnologia (Figura 19.5 A e 19.5 B).

A SUBSTITUIO DO PRODUTO NATURAL Seja por influncia de fatores genticos, ambientais ou culturais, ou tambm pela existncia de melhores mtodos de diagnstico, milhes de pessoas no mundo inteiro dependem hoje de injees regulares de insulina.A incidncia da diabete de tipo 2 est aumentando em crianas e adolescentes, em alguns grupos tnicos que adotaram modos de vida e de alimentao diferente e, tambm, nas populaes urbanas de migrantes. E, segundo as estimativas, em 2025 o nmero de diabticos poderia chegar a 300 milhes. As insulinas humanas, recombinante e semissinttica, substituram as insulinas mistas (boi, porco) que, no entanto, permanecem no mercado a um preo inferior. Algumas inovaes, como o grau de pureza e o tempo de reao so de grande importncia para a eficcia do tratamento. Nos prximos anos, o mercado passar por reformulaes, ao expirar algumas patentes e serem disponibilizadas insulinas no injetveis, administradas oralmente ou por inalao. Atualmente, a produo de insulina humana recombinante se concentra em trs grandes conglomerados farmacuticos: Eli Lilly, Novo Nordisk e Aventis (uma fuso de Hoechst e Rhne Poulenc). No Brasil, a Novo Nordisk absorveu recentemente a rea de produo da Biobrs, uma empresa brasileira que durante mais de 20 anos abasteceu de insulina grande parte do mercado latinoamericano. Uma nova firma (Biomm) conservou a patente para a insulina humana, desenvolvida anteriormente pela Biobrs. Encontram-se em andamento vrios projetos visando reiniciar a produo nacional de insulina (Biomm e Unio Qumica; Farmanguinhos). Na Argentina, a insulina humana recombinante est sendo produzida por Laboratrios Denver Farma.

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TABELA 19.2. Alguns biofrmacos de interesse mdico.


Fonte: Nature Biotechnology, 2003, vol. 21, n8, em Porque Biotecnologia, Cuaderno n 49 PRODUTO FATORES DE COAGULAO Fator VIII Fator IX Fator VIIa ANTICOAGULANTES Fator ativador de plasminognio Fator ativador de plasminognio Hirudina HORMNIOS Insulina Hormnio de crescimento Hormnio folculo-estimulante Hormnio paratirideo Gonadotrofina corinica Tirotrofina Hormnio luteinizante Calcitonina Glucagon FATORES HEMATOPOITICOS Eritropoietina (EPO) Fator estimulante de colnias de granulcitos/macrfagos (GMCSF) Interferon e interleucinas Interferon alfa (IFN alfa) SISTEMA DE PRODUO Cultivo de clulas de mamfero Cultivo de clulas de mamfero Cultivo de clulas de mamfero Cultivo de clulas de mamfero Escherichia coli Leveduras INDICACO TERAPUTICA Hemofilia A Hemofilia B Certas formas de hemofilia Infarto de miocrdio Infarto de miocrdio Trombocitopenia e preveno de trombose Diabetes mellitus Deficincia do hormnio em crianas, acromegalia, sndrome de Turner Infertilidade, anovulao e superovulao Osteoporose Reproduo assistida Deteco /tratamento de cncer de tireide Algumas formas de infertilidade Doena de Paget Hipoglicemia Anemia Neutropenia, transplante autlogo de medula
0

Leveduras Escherichia coli Escherichia coli Cultivo de clulas de mamfero Escherichia coli Cultivo de clulas de mamfero Cultivo de clulas de mamfero Cultivo de clulas de mamfero Escherichia coli Leveduras Cultivo de clulas de mamfero Escherichia coli

Escherichia coli

Interferon beta (IFN beta) Cultivo de clulas de mamfero Interferon gamma (IFN gamma Escherichia coli 1b) Interleucina 2 (IL-2) Escherichia coli VACINAS Hepatite B Leveduras Hepatite A Leveduras Doena de Lyme Escherichia coli ANTICORPOS MONOCLONAIS RECOMBINANTES Anti-IgE (recombinante) Cultivo de clulas de mamfero Anti-TNF (recombinante) Cultivo de clulas de mamfero Anti-IL2 Cultivo de clulas de mamfero OUTROS PRODUTOS RECOMBINANTES Protena morfognica do osso-2 Cultivo de clulas de mamfero Galactosidase Cultivo de clulas de mamfero Iaronidase Protena C -glucocerebrosidase DNAse 238 Cultivo de clulas de mamfero Cultivo de clulas de mamfero Escherichia coli Cultivo de clulas de mamfero

Hepatite B e C, diferentes tipos de cncer Esclerose mltipla Granulomatose crnica Cncer de rim Imunizao contra a hepatite B Imunizao contra a hepatite A Imunizao contra a doena de Lyme Asma Artrite reumatoide Preveno da rejeio aguda do transplante de rim Fratura de tbia Doena de Fabry (deficincia de galactosidase) Mucopolissacaridose Sepse severa Doena de Gaucher Fibrose cstica

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AS PROTENAS RECOMBINANTES AS BASES TECNOLGICAS O tamanho das protenas de uso teraputico 100 vezes maior que o das molculas presentes nos medicamentos convencionais. Os mtodos extrativos fornecem quantidades mnimas que no chegariam nunca a satisfazer a demanda do mercado, de modo que a produo dessas protenas seria invivel sem a tecnologia do DNA-recombinante. A rpida incorporao das novas tecnologias nos mtodos de produo facilitou, j na dcada de 1980, a obteno de insulina e de interferon mediante bactrias e leveduras modificadas geneticamente, cultivadas em biorreatores. Em alguns casos, os microrganismos foram substitudos por clulas animais que, apesar de mais difceis de cultivar, so capazes de levar a cabo as modificaes ps-traducionais indispensveis. Com o objetivo de aumentar a produtividade e diminuir os custos, foram construdos plantas e animais transgnicos (vacas, cabras, ovelhas etc.) para uma centena de protenas de tipo recombinante, muitas das quais se encontram j na fase de testes clnicos. O primeiro anticoagulante extrado do leite de uma cabra transgnica entrou no mercado em 2009 (Atryn, GTC Biotherapeutics). A hostilidade da sociedade com as plantas e alimentos transgnicos no existe em relao aos animais transgnicos e os medicamentos. O princpio de equivalncia, contencioso no setor de agroalimentos, totalmente aceito em relao aos novos medicamentos. Uma atitude contraditria que nos incita reflexo. OS PRODUTOS E SUAS UTILIZAES As protenas teraputicas cumprem diversas funes (Tabela 19.2). Algumas substituem ou complementam molculas naturais: hormnios, interferons, interleucinas, fatores estimuladores do crescimento celular, fatores de coagulao sangunea, enzimas. Outras so produtos especialmente desenhados para cumprir uma funo medicamentosa: trombolticos (tPA ou fator ativador de plasminognio, estreptoquinase, uroquinase), anticorpos monoclonais e antgenos bacterianos para vacinas. Utilizam-se fundamentalmente nas reas mdicas de hematologia, oncologia, diabetes e endocrinologia, artrite, inflamao, doenas imunes e doenas genticas lisossmicas (Gaucher, Hurler, Fabry, Pompe). A INDSTRIA BIOTECNOLGICA Estima-se que o mercado global de produtos biotecnolgicos ser de US$ 103 bilhes em 2014, o que representa pouco mais da dcima parte do mercado farmacutico mundial. Mais de 300 protenas aprovadas e muitas outras em testes clnicos indicam um mercado em crescimento, do qual o setor mais dinmico o dos anticorpos monoclonais, com uma previso de mais de US$ 79 bilhes em 2015. Em funo dos avanos nos estudos genmicos, muitos outros biofrmacos sero descobertos e patenteados nos prximos anos. Os imensos bancos de dados e as tcnicas de triagem assistidas por computador permitiro diminuir o tempo necessrio para os estudos experimentais.

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Vrios dos biofrmacos lderes de vendas so anticorpos teraputicos (Tabela 19.3). A maioria se destina principalmente oncologia e ao tratamento de artrite e outras doenas imunes e inflamatrias. Contudo, existe pelo menos um que permite a obteno de imagens, e outro em que a molcula se encontra acoplada a uma toxina que destri a clula cancerosa. Quase uma centena se encontra na fase final do processo de aprovao. Na Amrica Latina existe uma indstria farmacutica que fabrica medicamentos para consumo interno e para exportao, destacando-se Argentina, Brasil, Cuba e Mxico. Os principais produtos biotecnolgicos so os anticoagulantes (eritropoietina), os hormnios, os interferons ( e ) e os fatores estimuladores do crescimento celular. A Argentina conta com um setor farmacutico slido e competitivo. Vrias protenas recombinantes so produzidas localmente, por trs empresas biotecnolgicas nacionais (Bio Sidus, PC-gen, Zelltek) que vendem seus produtos atravs de suas empresas farmacuticas correspondentes (Sidus, Pablo Cassar) e as exportam para diversos pases de sia, Oriente e Amrica Latina. Uma empresa estrangeira, Sanofi, produz vacinas contra a hepatite B. Bio Sidus obteve sucesso com seu tambo farmacutico, pequenos rebanhos de vacas transgnicas produtoras de hormnio de crescimento, de insulina ou de leite maternizado, um empreendimento que ir sem dvida lhe garantir uma posio de destaque no setor produtivo. TABELA 19.3. As principais protenas teraputicas comercializadas atualmente.
NOME GENRICO e Eritropoietina e Interferon Insulina Humana Granulcitos - Fator estimulante do crescimento de colnias G-CSF Rituximab Etarnecept Infliximab Trastuzumab Hormnio de crescimento Palivizumab Hormnio folculo estimulante FSH Glucocerebrosidase Adalimumab Fator VII Toxina botulnica Bevacizumab NOME COMERCIAL Epogen, Epogin, Procrit, NeoRecormon, Aranesp Eprex, EMPRESAS Amgen, Johnson & Johnson, Roche, Kirin, Sankyo Schering Plough, Roche, Biogen Idec, Serono, Schering AG, Chiron Novo Nordisk, Lilly Amgen, Roche, Schering Roche Amgen, Wyeth Johnson & Johnson Roche Humatrope, Serono, Biogen Idec, Roche, Novo Nordisk, Akzo Nobel, Lilly MedImmune Serono, AkzoNobel Genzyme Abbott Novo Nordisk Allergan Genentech, Roche

PEG ntron, Pegasys Avonex, Rebif, Betaseron, Novulin, Humalin, Humalog Neupogen, Neulasta Rituxan Enbrel Remicade Herceptin Serostim, Saizen, Protopin, Neutropin Synagis Gonal F, Folistim Cerezyme, Ceradase Humira Novo Seven Botox Avastin

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O Laboratrio Pablo Cassar outra empresa tradicional que proximamente ir colocar no mercado uma nova vacina em duas doses contra a hepatite B e, recentemente, obteve uma enzima recombinante capaz de reparar as leses causadas pela exposio aos raios X. Ambas as empresas distribuem seus produtos no Brasil. Diferente da Argentina, no Brasil as empresas pblicas como Farmanguinhos e Instituto Butant tem um papel determinante na produo de medicamentos, destacando-se respectivamente na produo de retrovirais e de eritropoietina. Contudo, depende-se ainda da importao de biofrmacos, alguns dos quais so inclusive distribudos pelo Sistema nico de Sade (eritropoietina, imunoglucerase, infliximab, interferon, somatotropina recombinante humana). Acordos de transferncia de tecnologia para 25 produtos, envolvendo laboratrios nacionais (pblicos e privados) e estrangeiros, visam reverter essa dependncia. No Mxico, a empresa ProBioMed tem desenvolvido com o setor universitrio uma dezena de protenas recombinantes (anticoagulantes, interferons, fatores estimuladores do crescimento celular) para uso interno e exportao para outros pases de Amrica Central e Amrica do Sul. Outros laboratrios (Silanes, Biocln) tm se destacado na produo de antitoxinas. Cuba tem registrados numerosos produtos biotecnolgicos, desenvolvidos por Centros de Pesquisa (Centro de Inmunologa Molecular, Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa, Centro Nacional de Biopreparados e Instituto Finlay) e comercializados por empresas farmacuticas associadas (Heber Biotec, CIMAB etc.). Hoje Cuba produz 11 vacinas, mais de 40 molculas teraputicas e vrios sistemas de imunodiagnstico. Esses produtos renderam aproximadamente 900 patentes no exterior e so exportados para 40 pases. Assim como o nquel, o tabaco e o acar, a biotecnologia um dos principais produtos de exportao da ilha. OS MEDICAMENTOS PERSONALIZADOS A FARMACOGENMICA O mapeamento do genoma foi o primeiro passo para o desenvolvimento de novos produtos e aes teraputicas, um terreno onde se afirma a farmacogenmica, uma disciplina nova que visa identificar as diferenas genticas associadas a diversas doenas. Dado que os seres humanos compartilham 99,9% do genoma, as variaes entre eles devem ser procuradas no 0,1% restante, quer dizer, entre os 30 milhes de polimorfismos de um nico nucleotdeo ou SNPs (do ingls, single nucleotide polymorphisms). Trata-se de variaes de uma base a cada 1.000 nucleotdeos, distribudas ao longo do genoma. As mais interessantes so as que ocorrem dentro de um gene ou em uma regio reguladora. O estudo de cada um desses SNPs est alm das capacidades tecnolgicas atuais, mas sabendo que dois pontos que se encontram muito prximos no cromossomo tendero a ser transmitidos juntos, pode-se dividir o cromossomo em blocos de aproximadamente 10.000 bases (hapltipos) e caracteriz-los por alguns dos SNPs de cada bloco (Figura 19.6). Este o objetivo do International HapMap, recentemente concludo e baseado no genoma de pessoas de origem europeia, asitica e africana. A importncia do mapeamento do genoma foi claramente percebida pelas empresas farmacuticas. Antes de se completar o sequenciamento, algumas das grandes empresas farmacuticas (Glaxo Wellcome, Novartis) comearam a compilar informaes sobre os genes que podiam ser associados a doenas e a localizar SNPs dentro de alguns genes previamente selecionados.

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FIGURA 19.6. Os fundamentos do projeto internacional HapMap..


Os SNPs so variaes de uma base na sequncia do DNA. Basta a presena de dois SNPs em um segmento de DNA para conseguir diferenciar trs indivduos.

Indivduo 1. A...C...A...T...G...T T...G...T...A...C...A Indivduo 2. A...C...A...G...G...T T...G...T ...C...C...A Indivduo 3. G...C...A...T...G...T C...G...T...A...C...A

Considerando que as doenas devem ser estudadas no contexto evolutivo e histrico de uma populao, em 1999 a empresa americana deCode obteve da Islndia, por US$ 200 milhes, a exclusividade para elaborar um gigantesco banco de dados incluindo os registros de sade, as genealogias e os perfis de DNA de seus habitantes. Povoada h 1.000 anos pelos viquingues e com poucos contatos com outras populaes, a Islndia (270.000 habitantes) conta com uma populao homognea especialmente apta para este tipo de estudos. O projeto suscitou controvrsia. Um acordo da deCode com a Hoffmann-La Roche visava identificar os genes responsveis por vrias doenas. No caso de serem obtidos resultados positivos, os habitantes de Islndia teriam direito, por cinco anos, gratuidade nos medicamentos desenvolvidos. Em funo dos problemas ticos e legais levantados oportunamente, a empresa enfrentou algumas dificuldades na construo de seu banco de dados de 140.000 islandeses. Apesar de ter descoberto uma dezena de alvos medicamentosos, entre os quais protenas envolvidas em doena cardaca, osteoporose e esquizofrenia, a empresa no obteve resultados suficientemente rpidos para satisfazer os seus investidores. Em bancarrota, a empresa acabou sendo vendida, em 2009, para a Saga Investments LLC e Illumina. Hoje, a nova deCode, chamada deCODEme, comercializa testes diagnsticos e estudos genmicos. Devido a impedimentos legais, os dados e as amostras biolgicas no puderam ser vendidos e permanecem na Islndia. Existem outros projetos na mesma linha de investigao, tais como Estonian Genome (Estonia), Galileo Genomics (Canad), Oxagen (Inglaterra), Rockefeller University (Micronsia), UK.Bank (Inglaterra). Wellcome Trust Case Control Consortium encontrou 24 associaes a 7 doenas (Crohn, diabetes 1 e 2, doena cardiovascular, hipertenso, artrite reumatoide e transtorno bipolar). A FARMACOGENTICA Outra disciplina nova a farmacogentica, que investiga, dentro da populao, as diferenas genticas que permitem prever diferentes respostas a um medicamento. As reaes adversas so temidas tanto pelos consumidores como pelos mdicos e a indstria farmacutica, que se protege mediante bulas cuidadosamente redigidas. S nos Estados Unidos, as reaes adversas causam 100.000 mortes e 2 milhes de hospitalizaes por ano.

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Os medicamentos passam por vrias fases de estudos clnicos antes de chegar ao mercado. Contudo, nem todas as pessoas reagem igualmente a um medicamento, de modo que este pode resultar eficiente para uns e txico para outros. Por exemplo, aproximadamente 60% dos medicamentos so metabolizados por uma famlia de enzimas (citocromo P450). Algumas pessoas os degradam rapidamente, e outras no, dependendo de suas caractersticas enzimticas individuais. Sabendo a qual dos dois grupos pertence um paciente, pode-se determinar qual a dose do anticoagulante que lhe dever ser administrada, minimizando os efeitos adversos. Quando ocorrem em uma frequncia baixa, as reaes adversas a um medicamento podem ser detectadas unicamente a partir da terceira fase dos estudos clnicos, que envolvem entre 1.000 e 5.000 voluntrios. Muitos medicamentos no conseguem super-la, e houve casos em que tiveram que ser retirados do mercado, mesmo aps serem comercializados. o caso do Vioxx (Merck), um medicamento sumamente eficaz para a artrite e a dor, mas que aumentava o risco de ataques cardacos e derrames, tendo que ser descontinuado em 2004. Associando marcadores genticos a respostas diferenciais a medicamentos, pode-se dividir a populao em subgrupos e oferecer um tratamento personalizado. Atualmente, antes de iniciar um tratamento de cncer de mama com a herceptina, deve-se realizar um teste gentico na paciente para saber se o medicamento se ajusta, ou no, ao seu caso. Em pacientes HIV positivos, procura-se determinar a presena do alelo HLA-B*5701 antes de iniciar o tratamento com abacavir, porque os portadores desse alelo podem ser hipersensitivos ao medicamento. O desenvolvimento da farmacogentica dar aos pacientes mais chances de receber a medicao adequada, na dose certa. Por outro lado, as empresas farmacuticas podero escolher seus voluntrios para os testes clnicos no subgrupo apropriado, evitando que um produto novo seja descartado por falta de resposta adequada. No futuro, em vez de um nico produto campeo de vendas, as empresas farmacuticas podero oferecer medicamentos diferentes, cada um dos quais respondendo s expectativas de um tipo de consumidor. O CUSTO DOS NOVOS MEDICAMENTOS Estima-se que s 3% dos medicamentos desenvolvidos entre 1975 e 1999 foram dedicados ao tratamento de doenas tropicais, e a metade fora incentivada pela Organizao Mundial da Sade. Apesar das empresas farmacuticas dedicarem algumas pesquisas s doenas negligenciadas dos pases em desenvolvimento, ainda faltam medicamentos adequados. Do consumo mundial de medicamentos, 88% correspondem a um bloco de regies formado por Amrica do Norte (49%), Europa (28%) e Japo (11%). Como a populao destes pases est envelhecendo, os principais alvos para o desenvolvimento de medicamentos novos so as doenas cardiovasculares, o cncer, as alteraes respiratrias assim como outras doenas que afetam a qualidade de vida (osteoporose, artrite, doenas de Parkinson e de Alzheimer). A maioria das grandes corporaes est instalada nos Estados Unidos, onde, alm de seu principal mercado, encontram uma legislao favorvel. Na Amrica Latina, o setor est dominado pelas empresas internacionais e, salvo algumas excees analisadas previamente (Bio Sidus, ProBioMed, Heber Biotec), h poucos investimentos na pesquisa e no desenvolvimento de novos produtos. O custo dos medicamentos depende em grande parte dos investimentos da indstria farmacutica na pesquisa e desenvolvimento de novos produtos (US$ 800 milhes em 2002). O tempo e o custo de desenvolvimento de um medicamento dependem da durao dos testes clnicos e do uso da tecnologia (robtica, bioinformtica, qumica combinatria, triagem de compostos biolgicos em alta velocidade, biochips e microarrays).
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Para as grandes empresas farmacuticas, uma medida do sucesso significa conseguir um medicamento que alcance um valor de vendas de US$ 1 bilho (blockbusters), o que no fcil. Em termos de pesquisa e desenvolvimento de medicamentos, qualquer doena que afete menos de 200.000 pessoas desinteressante para a indstria, se esta no receber algumas compensaes. Nos Estados Unidos, o Orphan Drug Act (1983) garante incentivos financeiros s empresas farmacuticas que desenvolvam produtos para essas doenas. Tambm garante que, durante sete anos, nenhum medicamento equivalente ser aprovado, a no ser que se trate de outro que lhe seja superior. Legislaes equivalentes foram promulgadas em outros pases (Japo, 1993; Austrlia, 1998; Cingapura, 1999; Unio Europeia, 2000). Abre-se assim um campo no qual as empresas de biotecnologia se inserem com sucesso, j que os seus produtos visam doenas de origem gentica, envolvendo alteraes de receptores celulares, enzimas e protenas estruturais. PATENTES E GENRICOS A patente sobre um medicamento confere empresa que o desenvolveu o direito de exclusividade sobre sua comercializao durante vinte anos. Ao vencer a patente de um medicamento, este se torna de domnio pblico, podendo ser copiado e comercializado a um preo 30 a 50% menor. Isto porque, alm de sustentar os custos de pesquisa e desenvolvimento de um medicamento, uma boa parte do oramento das empresas farmacuticas se dedica propaganda e marketing de seus produtos. A partir do vencimento da patente, os medicamentos genricos podem entrar no mercado. Estes so produtos que contm o mesmo princpio ativo e a mesma dose que o medicamento de referncia, assim como os mesmos efeitos teraputicos. As grandes empresas farmacuticas no descuidam do mercado global de medicamentos genricos, que chega a US$ 169 bilhes. No entanto, a produo de genricos possvel para qualquer empresa que domine as dificuldades tecnolgicas do processo produtivo. Alm de medicamentos de marca (inovadores), ou genricos (com o mesmo princpio ativo e bioequivalente ao inovador), na Amrica Latina se comercializam medicamentos similares, isto , com o mesmo princpio ativo que o inovador, mas sem nenhuma garantia de bioequivalncia. Estas cpias geralmente foram lanadas no mercado na falta de uma lei de patentes ou anteriormente a sua promulgao. Os genricos so identificados mediante uma denominao comum internacional, mas, em alguns pases, essa denominao usada para os similares, confundindo o consumidor. Por enquanto, o Brasil o nico com a exigncia legal de aprovao dos testes de bioequivalncia para que um medicamento possa ser rotulado como genrico. A produo de sete antivirais genricos para o tratamento de HIV/AIDS por Farmanguinhos, com igualdade de preo, e a preferncia destes sobre os medicamentos de marca para sua compra e distribuio na rede pblica de sade representam para o Brasil uma economia de mais de US$ 400 milhes por ano. Em relao aos produtos biotecnolgicos, proximamente estaro vencendo as patentes de vrias molculas: -interferon, insulina humana, hormnio de crescimento, vacina contra a hepatite B etc. Dado o custo que os novos medicamentos representam para os sistemas de sade, cogita-se a produo de genricos de vrias protenas teraputicas. Ainda que os Estados Unidos se mostrem relutantes ao respeito, no se descarta que proximamente a Unio Europeia entre no mercado de biomolculas genricas. Admite-se que, em alguns casos, como situaes de emergncias nacionais, circunstncias de extrema urgncia e prticas anticompetitivas, o uso de uma patente sem a autorizao do detentor do direito seja justificado.

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Esta salvaguarda se encontra no Acordo sobre Aspectos dos Direitos de Propriedade Intelectual Relacionados ao Comrcio (TRIPS Agreement), da Organizao Mundial do Comrcio, vigente desde 1995. O artigo 31 assinala que o uso da patente sem autorizao estaria justificado se tivessem sido feitos os esforos para sua utilizao em condies comerciais razoveis. Quando da ameaa terrorista de antraz, os Estados Unidos cogitaram quebrar a patente do antibitico Cipro. Nos pases em desenvolvimento, o acesso aos medicamentos considerado um direito fundamental dos pacientes de HIV/AIDS, porm, apesar das longas discusses no marco da Organizao Mundial de Comrcio, milhes de pessoas morrem anualmente por falta desses medicamentos.

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20. BIOTECNOLOGIA E SADE / OS TRATAMENTOS NOVOS


A APROVAO DE UM TRATAMENTO EXPERIMENTAL Assim como um medicamento novo, um tratamento passa por vrias etapas antes de se constituir em uma prtica mdica. Os estudos pr-clnicos de um tratamento experimental compreendem as pesquisas laboratoriais e a experimentao em animais, desenvolvidas em universidades ou empresas e financiadas com dinheiro pblico e/ou privado. Os resultados desses estudos so revisados, publicados e repetidos numerosas vezes pela comunidade cientfica, at que, em funo da quantidade de informao reunida, parea razovel estender o procedimento ao ser humano. Solicita-se ento, por meio de um processo formal, autorizao para dar incio aos testes clnicos, que fornecero informaes sobre a segurana, a eficcia e os efeitos colaterais desse tratamento experimental. Os ensaios ou testes clnicos seguem desenhos experimentais rigorosos e controles severos, que garantem a confiabilidade dos estudos. Abrangem um nmero pequeno de participantes que devero assinar previamente um termo de consentimento informado, no qual reconheam estarem cientes das opes de tratamento e dos riscos, assim como de seus direitos e responsabilidades. Durante os testes clnicos, o tratamento experimental pode se revelar melhor ou pior que os j existentes. Se os resultados forem satisfatrios, ser solicitada a aprovao da agncia reguladora correspondente (FDA, US Food and Drug Administration, nos Estados Unidos; EMA, European Medical Agency, na Unio Europeia; ANVISA, Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria, no Brasil; ANMAT, Administracin Nacional de medicamentos, Alimentos y Tecnologa Mdica, na Argentina). Uma vez autorizado, o tratamento experimental passa a ser uma prtica mdica de uso geral. Mesmo assim, para monitorar efeitos negativos que s possam ser detectados em uma populao de maior tamanho, o tratamento continuar a ser objeto de vigilncia. AS TERAPIAS BIOLGICAS Os termos terapia biolgica e imunoterapia se referem aos tratamentos que utilizam elementos do sistema imune no combate s doenas. As bases da imunoterapia foram estabelecidas na segunda metade do sculo XIX, com os experimentos de E. Von Behring e S. Kitasato. Estes extraram soro com antitoxina diftrica de um animal infectado e o administraram em outro animal, inoculado previamente com toxina diftrica. Obtiveram assim uma imunidade imediata, apesar de passiva e de curta durao. Estabelecidos os princpios da soroterapia, esta constitui ainda hoje a principal arma de defesa disponvel contra os venenos de cobras e outros animais peonhentos. O progresso da engenharia gentica permitiu a produo de protenas recombinantes e, consequentemente, de novas teraputicas. No paciente de cncer, por exemplo, a atividade imunolgica reforada com citoquinas, molculas moduladoras da comunicao celular, tais como o -interferon e a interleuquina IL-2. A produo de elementos sanguneos, afetada pelos tratamentos quimioterpicos e/ou radioterpicos, incrementada com fatores estimulantes do crescimento celular (CSF, eritropoietina).
Copyright Maria Antonia Malajovich Biotecnologia: ensino e divulgao (www.bteduc.bio.br)

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OS ANTICORPOS MONOCLONAIS A chegada da tecnologia de hibridomas despertou grandes esperanas, porque se tencionava que os anticorpos monoclonais cumprissem a funo da mtica bala mgica, no reconhecimento do alvo. Contudo, o sucesso chegou antes no campo das anlises clnicas que no mbito teraputico. Depois do muromonab CD3 (Orthoclone OK3), um anticorpo monoclonal que reduz a resposta imune, evitando a rejeio aos transplantes, passaram-se vrios anos antes que algum outro produto recebesse a aprovao das agncias reguladoras. A razo para o impasse era tcnica. Produzidos com clulas de roedores, os anticorpos monoclonais eram reconhecidos como non-self pelos seres humanos, o que desencadeava a resposta imune. A modificao e, eventualmente, a substituio de partes da molcula murina gerou molculas quimricas, humanizadas e, mais tarde, humanas, em linhagens microbianas ou em animais transgnicos. Uma vez solucionado esse problema, os anticorpos monoclonais entraram no mercado. TABELA 20.1. Os 10 anticorpos monoclonais de uso teraputico, lderes de venda em 2010.
Adaptado de http://knol.google.com/k/krishan-maggon/top-ten-monoclonal-antibodies2010/3fy5eowy8suq3/143# NOME GENRICO (MARCA) Infliximab (Remicade) EMPRESAS Johnson & Johnson Merck Mitsubishi Tanabe INDICAES Artrite reumatoide Colite ulcerativa Doena de Crohn Psorase Artrite psoritica Espondilose anquilosante Cncer de clon Linfoma no Hodgkins Artrite reumatoide Artrite reumatoide Psorase Artrite idioptica juvenil Artrite psoritica Espondilose anquilosante Doena de Crohn Cncer de mama Cncer de clon, cabea e pescoo Degenerao macular Esclerose mltipla Asma alrgica Vrus respiratrio sincicial VENDAS (2010) Em US$ BILHES 8.0

Bevacizumab (Avastin) Rituximab (Rituxan) Adalimumab (Humira)

Roche Roche Abbott

6.8 6.7 6.5

Trastuzumab (Herceptin) Cetuximab (Erbitux) Ranibizumab (Lucentis) Natalizumab (Tysabri) Omalizumab (Xolair) Palivizumab (Synagis)

Roche BMS Merck Serono Novartis Roche Biogen Idec Elan Roche Novartis Astra Zeneca

5.5 3.2 3.1 1.75 1.1 1.0

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BIOTECNOLOGIA 2011 / Captulo 20: Biotecnologia e sade - Tratamentos novos

Existem atualmente no mercado diversos produtos imunoterpicos para a preveno de infeces virais, bloqueio de IgE (asma alrgico), inibio de inflamaes (artrite reumatoide, doena de Crohn, psorase), tratamento de esclerose mltipla e outras doenas autoimunes (lpus), diversos tipos de cncer etc. Alguns esto associados a uma substncia citotxica (gemtuzumab ozogamicin Mylotarg, de Wyeth), ou a um radioistopo (Y-ibritumomab tiuxetan Zevalin, de Spectrum Pharmaceuticals, Inc.). Outras aplicaes podero ser encontradas, especialmente na luta contra as doenas emergentes e o bioterrorismo. O anticorpo especfico para o reconhecimento de um antgeno determinado seria selecionado rapidamente, em livrarias de anticorpos monoclonais preexistentes, por sistemas robotizados de alta eficincia. O mercado global dos novos anticorpos monoclonais de uso teraputico est em crescimento, calculando-se que atinja US$ 79 bilhes em 2015. Dez anticorpos monoclonais so blockbusters, alcanando nveis de venda superiores a US$ 1 bilho, em 2010 (Tabela 20.1). O principal entrave popularizao das terapias biolgicas o preo dos produtos. Consideremos o caso do trastuzumab (Herceptin), que reconhece e inativa o receptor de um fator de crescimento, presente em algumas clulas tumorais. Trata-se do nico anticorpo monoclonal eficiente no combate aos tumores slidos. O custo anual do tratamento de um paciente com Herceptin est estimado entre US$ 70.000 e US$ 100.000. O CNCER COMO DOENA GENTICA A palavra cncer designa um conjunto de mais de 100 doenas que podem se desenvolver em qualquer rgo do corpo e que afetam a uma pessoa em oito da populao. As terapias biolgicas so teraputicas complementares aos tratamentos clssicos do cncer, que continuam sendo a cirurgia, a quimioterapia e a radioterapia. As clulas cancerosas so clulas que, evadindo os sinais de controle da diviso celular, se dividem indefinidamente sem se diferenciar. Com a perda de alguns receptores da membrana celular, essas clulas se separam das clulas vizinhas e se espalham pelo corpo. Aproximadamente 1% do genoma humano est relacionado com o desenvolvimento do cncer. Na transformao de uma clula normal em cancerosa, participam dois tipos de genes: os protooncogenes e os genes supressores de tumor. Os proto-oncogenes codificam protenas que estimulam a diviso celular, inibindo a diferenciao e detendo a apoptose ou suicdio celular. A mutao que os transforma em oncogenes aumenta a sntese dessas protenas, induzindo as clulas a se multiplicar indefinidamente. Os genes supressores de tumores, que estimulam a autodestruio das clulas que sofreram mutao, encontram-se alterados ou ausentes nas clulas cancerosas. As mutaes geram antgenos especficos do tumor, como as protenas anormais dos genes ras e p53, a elevao significativa da quantidade da enzima tirosinase ou a reapario das protenas oncofetais (alfafetoprotena e antgeno carcinoembriognico). Alguns dos antgenos especficos do tumor se expressam exclusivamente no tumor de um nico indivduo, outros aparecem nas clulas tumorais dos indivduos afetados por determinado tipo de tumor. Em genes no associados diretamente formao tumoral, as mutaes podem originar antgenos associados ao tumor, que so utilizados como biomarcadores. As mutaes so ocasionadas por fatores ambientais (agentes qumicos, radiao, vrus) ou genticos (hereditrios ou adquiridos ao longo da vida). Quase sempre ocorrem nas clulas somticas, mas tambm acontecem nas clulas germinais. Algumas so pontuais, outras envolvem rearranjos cromossmicos. Vrias so necessrias para que a clula adquira as caractersticas cancerosas. Embora o processo possa levar mais de 50 anos, as mutaes herdadas (predisposio) possibilitaro um desenvolvimento prematuro do cncer (Figura 20.1).
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FIGURA 20.1. A transformao de uma clula normal em cancerosa por mutao (cncer de clon).

Clula normal

1a mutao (gene APC)

2a mutao (gene ras)

3a mutao (gene DCC)

4a mutao (gene p53) Clula cancerosa

FIGURA 20.2. O tratamento com sipuleucel-T (Provenge).


A. Extrao das clulas dendrticas

Leucoferese (3 horas) Clulas dendrticas

B. Incubao das clulas com Provenge

2 a 3 dias Clulas dendrticas + Provenge (PAP-GM-CSF)

Clulas dendrticas que incorporaram o antgeno tumoral PAP-GM-CSF

C. Reinfuso das clulas modificadas no paciente (3 vezes com 2 semanas de intervalo)

Estmulo da resposta das clulas-T contra o antgeno tumoral PAP-GM-CSF e, consequentemente, contra as clulas cancerosas

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AS VACINAS TERAPUTICAS As vacinas profilticas so aplicadas em indivduos saudveis para prevenir doenas. Dentro dessa linha, existem vacinas contra alguns dos agentes virais que, sabidamente, esto relacionados com o desenvolvimento do cncer. Trata-se das vacinas contra o vrus da hepatite B (VHB), associado ao cncer de fgado, e contra o papilomavrus (VPH), responsvel por 70% dos cnceres de tero (Gardasil, de Merck; Cevarix, de GlaxoSmithKline). Essas vacinas cumprem uma ao preventiva. Uma das primeiras terapias complementares do cncer, ainda usada atualmente, a inoculao com a vacina BCG (bacilo de Calmette e Gurin), para estimular no paciente uma reao imunolgica de tipo celular, que se estende s clulas cancerosas. As vacinas teraputicas visam o tratamento dos indivduos que j esto doentes. O objetivo estimular diretamente a resposta imune do organismo, para que este possa eliminar as clulas cancerosas. Apesar da enorme quantidade de procedimentos possveis, todos so experimentais. Uma possibilidade a aplicao de vacinas de antgenos sintticos, especficos ou associados ao tumor. Um dos principais problemas reside na escolha dos antgenos que deveriam entrar na composio da vacina, pois se alguns so comuns a vrios tipos de clulas cancerosas, outros s aparecem em cnceres especficos. A vacina ideal teria que ser eficaz em qualquer paciente com um determinado tipo de cncer. As vacinas de vetores (vrus, DNA nu) conseguem uma resposta imunolgica mais forte que as vacinas de antgenos. Vetores virais modificados poderiam infectar exclusivamente as clulas cancerosas, carregando molculas moduladoras da resposta imune, ou enzimas capazes de transformar uma droga inativa em ativa. Outra estratgia seria a elaborao de vacinas de tumores, com clulas cancerosas enfraquecidas ou mortas. Provenientes do mesmo paciente ou de algum outro, essas clulas expressariam antgenos associados a um tumor, estimulando a resposta imune. Uma variante de vacina tumoral envolve o estmulo ex vivo das clulas imunes de modo a que estas expressem o antgeno (Figura 20.2). Essa estratgia deu origem primeira vacina teraputica (sipuleucel-T ou Provenge, de Dendreon), contra o cncer de prstata hormonorefratrio, autorizada pelo FDA, nos Estados Unidos, em 2010. O empreendimento demandou empresa Dendreon um investimento de US $ 1 bilho. O sipuleucel-T uma protena de fuso entre uma enzima especfica das clulas prostticas cancerosas (PAP, do ingls prostatic alcaline phosphatase) e um modulador da resposta imune (GMCSF, do ingls granulocytes and macrophages colony stimulating factor). O tratamento deve ser adaptado a cada paciente. Comea com a extrao das clulas apresentadoras do antgeno do doente, segue com a incorporao in vitro dos antgenos tumorais e encerra-se com a reinfuso das clulas modificadas no paciente. No momento do lanamento, Dendreon estimava o preo de cada tratamento em US$ 93.000. Embora representem uma tecnologia promissora, dificilmente as vacinas teraputicas podero beneficiar um setor amplo da populao, devido complexidade tecnolgica e aos custos de um tratamento personalizado.

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AS TERAPIAS GNICAS TERAPIAS SOMTICAS E GERMINAIS A terapia gnica visa alterar o funcionamento de um gene, mediante a introduo de DNA nas clulas de um paciente. Se o gene se expressar, o objetivo da terapia ser o seu desligamento ou a inativao do produto. Se o gene no se expressar, a finalidade da terapia gnica ser sua substituio por uma cpia funcional que sintetize a protena faltante. Esta ltima pode ser uma enzima normal, uma molcula que torne a clula vulnervel ao ataque pelo sistema imune ou uma substncia txica que desencadeie a apoptose de uma clula cancerosa. As terapias gnicas visam modificar as clulas somticas de um indivduo, sem pretender que essa alterao seja transmitida gerao seguinte (Figura 20.3). Assim como em um transplante transferido um rgo ou um tecido, na terapia somtica transferido um gene e o efeito est limitado ao indivduo que o recebe. Diferente da terapia somtica, a terapia de clulas germinais visa a transmisso do gene descendncia. A terapia gnica de clulas germinais permitiria a eugenia atravs da seleo do gentipo ideal. Dentro desta tica, quais seriam os caracteres considerados saudveis? E por quem? A histria do sculo XX, com sua sequncia de horrores (esterilizao de deficientes e doentes mentais nos Estados Unidos, persecues na Alemanha nazista etc.), mostra que devem ser tomados todos os cuidados para impedir a discriminao gentica e a implantao de uma sociedade arbitrria. A terapia gnica da linhagem germinativa no est permitida em nenhum pas. OS ALTOS E BAIXOS DE UMA TECNOLOGIA De todas as novas biotecnologias, as terapias gnicas so as mais difceis de avaliar porque, alm de envolver aspectos cientficos, ticos e religiosos, passaram por altos e baixos ao longo dos ltimos 40 anos As primeiras experincias de terapia gnica para o tratamento ou a cura de uma doena, foram realizadas em 1980, por Martin Cline, nos Estados Unidos. Alm de fracassar, essas tentativas despertaram uma reao contrria unnime, porque os estudos experimentais prvios eram insuficientes e sua realizao no tinha sido devidamente autorizada pelo comit de tica correspondente. O episdio motivou o estabelecimento de regras estritas para este tipo de tratamento. A primeira terapia gnica foi autorizada, nos Estados Unidos (1990), para o tratamento de dois casos de Imunodeficincia Severa Combinada (SCID, do ingls severe combined immunodeficiency), uma doena em que a falta da enzima ADA (desaminase de adenosina) bloqueia um caminho metablico, causando o acmulo de uma substncia que destri os linfcitos. As crianas com SCID, chamadas crianas-bolha, sofrem continuamente de infeces e tm uma expectativa de vida curta. O tratamento habitual contempla a administrao de enzimas, mas os pacientes acabam desenvolvendo alergias aos componentes do produto injetado. Para essas crianas, a nica perspectiva restante um transplante de medula ssea, com a condio de encontrar um doador compatvel. A terapia aprovada pelo FDA consistia na extrao de linfcitos do sangue, sua modificao gentica por transferncia de um gene normal de ADA e a reinfuso dos linfcitos modificados na circulao sangunea do paciente. Aplicou-se esse procedimento na menina Ashanty DeSilva e, mais tarde, em outra menina, Cynthia, que experimentaram uma melhora significativa.

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Porm, como os linfcitos tm um perodo de vida curto, o procedimento foi repetido periodicamente, durante dois anos. Algumas das clulas modificadas sobreviveram e produziram ADA, mas a quantidade era insuficiente e nenhuma das meninas pde prescindir totalmente do tratamento enzimtico. O problema persistiu em estudos posteriores e nenhum dos pacientes pde abandonar o tratamento alternativo com a enzima, mesmo quando a modificao gentica passou a ser realizada em clulas-tronco da medula ou de cordo umbilical. Uma tragdia esfriou o interesse pelas pesquisas nesta rea. Em 1999, Jesse Gelsinger, um jovem de 18 anos afetado por uma deficincia de OTC (ornitina transcarbamilase), que se apresentara como voluntrio para um tratamento de terapia gnica na Universidade da Pensilvnia, morreu de uma reao imunolgica adversa ao vetor utilizado, que era um adenovrus. Em 2000, na Frana, a terapia gnica de uma variante de imunodeficincia (SCID-X1) pareceu alcanar sucesso em nove de dez crianas tratadas. Contudo, novamente uma tragdia aconteceu quando o vetor viral se inseriu em um lugar no esperado, inativando um gene supressor de tumor. Quatro das crianas desenvolveram leucemia e uma delas morreu. O fracasso mostrou que a terapia gnica ainda era uma tecnologia imperfeita, de difcil aplicao. Dois anos mais tarde, renovaram-se as esperanas dos pacientes de SCID e seus familiares devido ao descobrimento de uma nova tcnica de remoo parcial da medula ssea, que favorece o desenvolvimento de clulas-tronco modificadas geneticamente. Por outro lado, limitou-se a participao nos estudos experimentais de SCID a crianas que nunca tivessem recebido o tratamento enzimtico com ADA. A primeira criana tratada Salsabil, uma menina palestina de dois anos de idade, que hoje cresce saudvel.

FIGURA 20.3: O princpio da terapia gnica.

Cpias de um gene normal, previamente clonado em bactrias

Vrus

Insero em um vetor

Lipossomo

Introduo do gene normal nas clulas de um indivduo com uma doena gentica

Pulmo

Msculo

Fgado

Cultivo de clulas (medula ssea)


Reimplantao

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O ESTADO DA ARTE O campo das terapias gnicas conta hoje com numerosos estudos, em diferentes etapas de realizao. As dificuldades so enormes, porque se trata de transferir um gene a uma determinada clula em certo tecido e conseguir que esse gene funcione adequadamente e de maneira duradoura. Os dois grandes gargalos ainda so a necessidade de vetores seguros e de procedimentos mais eficientes. Muitas pesquisas fracassam na ltima etapa dos testes clnicos. Dos numerosos estudos em vias de realizao, aguardam-se resultados positivos em relao a sndromes genticas (hemofilia, talassemia, Huntington, Duchenne, fibrose cstica, SCID) e infeces virais (HIV/AIDS), alm de avanos nos estudos sobre doenas cardiovasculares, oneurolgicas e oncolgicas. O sucesso poderia estar muito prximo, tanto em relao ao SCID como a outras duas doenas genticas (amaurose congnita de Leber ou ALC, adrenoleucodistrofia ou ALD). Contudo, as trs demandam a modificao gentica ex vivo de clulas-tronco, o que significa um tratamento personalizado complexo. Estes empreendimentos para doenas de baixa frequncia entram na categoria de tratamentos/medicamentos rfos, garantindo incentivos financeiros s empresas farmacuticas. No combate s doenas infecciosas como o HIV/AIDS, existem diversas linhas de pesquisa. Uma delas visa bloquear a replicao do vrus e a outra os receptores que o HIV usa para entrar no linfcito T. Nenhum desses estudos superou ainda a fase correspondente aos testes clnicos. O futuro das terapias gnicas controverso. Do mesmo modo que em relao a qualquer tipo de terapia experimental, as objees se centram na utilizao de uma tecnologia ainda imperfeita, que envolve riscos e da qual se desconhecem os efeitos a longo prazo. Contudo, o grande nmero de pesquisas em andamento e de testes em fases I e II indicam que, em um futuro prximo, algumas das dificuldades encontradas podero ser superadas. No momento, s existe um nico produto comercial disponvel no mercado, que foi desenvolvido e autorizado na China, em 2004. A Gendicina (Shenzhen SiBiono GeneTech), um adenovrus com o gene supressor de tumores p53, utilizado no tratamento do carcinoma de clulas escamosas de cabea e pescoo. O progresso das terapias gnicas levanta tambm algumas inquietudes em relao ao esporte. Em 1998, uma equipe inteira de ciclistas foi eliminada do Tour de France devido ao uso indevido da eritropoietina, que aumenta o nmero de hemcias. Contudo, fraudes deste tipo no poderiam ser detectadas se o atleta fosse modificado geneticamente para aumentar naturalmente sua produo de eritropoietina. Em 2008, na Alemanha, um confuso caso de doping de atletas envolveu um treinador e um produto de terapia gnica em fase pr-clnica (Repoxygen, de Oxford Biomedica), que induz a liberao de eritropoietina em baixa concentrao de oxignio. AS PROMESSAS DO SILENCIAMENTO GNICO Ao longo dos ltimos trinta anos descobriram-se vrios mecanismos de silenciamento gnico, baseados nos diversos tipos de RNA e suas propriedades (Figura 20.4). As ribozimas so molculas de RNA, com propriedades catalticas, que cortam outras molculas de RNA que apresentem em sua sequncia alguns nucleotdeos complementares. Sua descoberta teve uma importncia extraordinria, porque deu origem a uma teoria sobre os primrdios da vida, em um mundo de RNA.

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FIGURA 20.4: As tecnologias de silenciamento gnico.

A. As ribozimas

Ribozima RNA RNA clivado

B. O RNA anti-sense

Sntese de protenas

Inibio da sntese proteica por RNA anti-sense Transcrio

DNA

Transcrio mRNA Traduo

Transcrio

RNA anti-sense

mRNA

No h traduo

C. O RNA interferente

Pequeno RNA interferente (siRNA)

mRNA

dsRNA (RNA de dois filamentos) Complexo enzimtico

Clivagem do mRNA

Exterior

Membrana celular

Citoplasma

Fragmentos de RNA

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Numerosas pesquisas foram desenvolvidas em relao ao uso de ribozimas como agentes biolgicos, seja para inativar um gene ou como inibidores da replicao do HIV em clulas infectadas. Apesar de laboratorialmente bem sucedidas, nenhum produto entrou at agora no mercado. Tambm trouxe grande expectativa a tecnologia anti-sense, que utiliza o mecanismo de transcrio para inativar um gene. Normalmente, o RNA transcrito complementar a um dos filamentos de DNA. Colocando um promotor no outro filamento, a transcrio ocorrer em sentido contrrio e se formar um asRNA (anti-sense RNA). Sendo complementares, os dois RNAs sintetizados (sense e anti-sense) iro se associar, formando uma molcula de dois filamentos que no conseguir se unir ao ribossomo ou ser destruda por ribonucleases celulares. A tecnologia anti-sense deu origem ao tomate FlavSavr, que amadurece na planta sem amolecer, devido inativao do gene da pectinase. Tambm deu bons resultados na supresso da sntese de etileno e na modificao da cor das flores. Em relao s terapias gnicas, a tecnologia anti-sense tornou possvel o desenvolvimento de um medicamento para o tratamento de infeces oculares por citomegalovrus, em pacientes com HIV/AIDS. O formivirsen (Vitravene, de Isis Pharmaceuticals) foi autorizado em 1998 pelo FDA, nos Estados Unidos. Atualmente, estariam sendo realizados testes clnicos de pelo menos uma dzia de medicamentos, nenhum deles disponvel antes de 2015. Outra tecnologia recente a do RNA interferente (iRNA), originada tambm em descobrimentos de fisiologia vegetal. Em 1990, descobrira-se que, introduzindo um gene extra em petnias, em vez de flores mais pigmentadas obtinham-se flores brancas. Casos semelhantes de cossupresso gnica tambm foram descritos no verme Caenorhabditis elegans e na mosca Drosophila melanogaster. Verificou-se mais tarde que bastam filamentos duplos de RNA com mais de 200 nucleotdeos para inativar a expresso gnica, uma vez realizada a transcrio. Fragmentados em pedaos menores (siRNA, do ingls small interfering RNA) e associados a um complexo enzimtico, esses filamentos de RNA destroem qualquer mRNA transcrito com uma sequncia parcialmente complementar. Acredita-se que a maquinaria celular envolvida no processo de interferncia tenha surgido, evolutivamente, como uma forma de defesa contra os vrus de RNA duplo. Contudo, hoje essa maquinaria um elemento importante na regulao da expresso dos genes. A tecnologia de RNA interferente (IRNA) constitui uma ferramenta de laboratrio poderosa para se entender a funo dos genes e a regulao da expresso gnica. As pesquisas laboratoriais tm dado informaes valiosssimas sobre genmica funcional. Tambm abriram novas perspectivas no tratamento de infeces virais e esclareceram diversos aspectos de vrias doenas genticas e neurolgicas. Em relao ao cncer permitiram a inativao in vitro de molculas associadas patologia e progresso da doena humana. O IRNA traz uma possibilidade nova de terapia para vrias doenas. Considera-se que os tecidos que poderiam ser mais facilmente tratados seriam o olho, a pele, as membranas mucosas e os tumores locais. Se bem que ainda em fase clnica, os testes mais avanados correspondem ao tratamento da degenerao macular e da infeco pelo vrus respiratrio sincicial. Antes de a tecnologia superar a fase experimental e chegar a ter uso clnico, diversos problemas tero que ser resolvidos. Os mais importantes so a introduo do cido nucleico na clula e o controle de seu raio de ao, de modo a restringir a interferncia molcula-alvo. Apesar do sucesso alcanado nos estudos in vitro, a tecnologia do IRNA ainda precisa melhorar a eficincia, a segurana e a confiabilidade. Muitos estudos sero necessrios antes que a tecnologia possa ser utilizada clinicamente.

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A MEDICINA REGENERATIVA OS TRANSPLANTES DE RGOS A primeira tentativa data de 1899, com o transplante de rim de um cachorro a outro. Desde ento ficou bvio que o fenmeno de rejeio era principal obstculo aos transplantes de rgos. Uma exceo a crnea, cujo primeiro transplante bem sucedido se realizara em 1905. O primeiro transplante de corao, realizado pelo cirurgio Christian Barnard (frica do Sul, 1967) teve uma repercusso enorme nos meios de comunicao. O mundo inteiro acompanhou os comunicados mdicos emitidos em Cidade do Cabo, at a morte do paciente, 18 dias mais tarde. Durante vrios anos os problemas de rejeio pareceram intransponveis. Na dcada de 1980, alm da melhoria das tcnicas cirrgicas e da caracterizao dos antgenos dos tecidos, aparecem os primeiros medicamentos imunossupressores (ciclosporinas), e os transplantes se tornam rotineiros. Em centros mdicos de todos os pases so substitudos, com sucesso, diversos rgos e tecidos: corao, rim, fgado, pulmo, intestino, timo, crneas, medula ssea, pele, pncreas, vlvulas cardacas, veias etc. Alguns procedimentos so relativamente simples. No isotransplante, a transferncia de um ovrio ou de um rim feita de um indivduo a seu gmeo idntico. No autotransplante, substitui-se uma artria coronria por uma safena do mesmo indivduo, ou um fragmento de pele danificado por outro. Contudo, no alotransplante, em que um rgo transferido a outro indivduo, requer-se a supresso do sistema imune, para que o organismo possa aceitar uma parte non-self. Caso contrrio o rgo ser rejeitado e, tambm, o rgo poder rejeitar o hospedeiro. dificuldade em encontrar um doador compatvel se soma a de encontrar doadores, j que o nmero de doaes muito menor do que seria necessrio. Por isso uma alternativa seria o xenotransplante, isto , a transferncia de um rgo de um animal ao homem. Devido ao tamanho e a estrutura de seus rgos, o porco parece o animal mais indicado. J em 1902, ligou-se o rim de uma paciente a um porco, uma experincia que resultou fatal. Hoje sabido que, devido presena nas clulas sunas de -1-3 galactose, um tipo de molcula que no se encontra em primatas, ocorrer um fenmeno de rejeio violento. a menos que se apliquem doses macias de medicamentos imunossupressores. O encapsulado das clulas animais em uma matriz inerte que as isole e, ao mesmo tempo, deixe passar os nutrientes e produtos celulares, poderia evitar a rejeio. Este procedimento foi utilizado recentemente em pacientes diabticos que receberam clulas sunas encapsuladas e passaram a secretar insulina. Tambm foi utilizado em uma centena de pacientes de cncer, para a secreo de molculas que aliviassem a dor. Em 2002, duas empresas (PPL Therapeutics e Immerge Bio Therapeutics) anunciaram a clonagem de porcos em que o gene para a -1-3 galactose fora desativado por knock out duplo. Esses porcos poderiam vir a ser uma fonte de rgos para um transplante temporrio em seres humanos. No entanto, mesmo eliminando o perigo da rejeio aguda, ainda falta resolver como evitar o processo de rejeio que seria desencadeado, um pouco mais lentamente, pelas protenas sunas. Existe, porm, uma objeo maior aos xenotransplantes, que o risco de introduzir retrovrus de outras espcies em seres humanos, com resultados imprevisveis.

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A ENGENHARIA DE TECIDOS Na interface da biologia celular, da medicina, da bioqumica e da bioengenharia, a engenharia de tecidos visa a substituio de rgos e tecidos. Faz anos que o cultivo de pele in vitro utilizado para reparar as leses causadas por queimaduras. Um pequeno fragmento de pele, isolado do prprio paciente, o bastante para formar em trs semanas uma superfcie 50 vezes maior. Amolda-se a nova pele a uma superfcie biodegradvel para evitar que rasgue quando aplicada no paciente. O procedimento se adapta ao tratamento de queimaduras e de leses de difcil cicatrizao. A biomimtica consegue reparar in vivo o tecido sseo, utilizando como molde um polmero, onde migram e se expandem as clulas regenerativas internas. A tecnologia se aplica na reparao de fraturas e de leses causadas por doena periodontal, assim como a reconstruo da cartilagem das articulaes. Recentemente, transplantou-se com sucesso uma traqueia, que fora construda com clulas-tronco do prprio paciente, cultivadas sobre um molde poroso. Este o primeiro passo na construo in vitro de estruturas tridimensionais anlogas aos rgos. No momento, as estruturas mecnicas parecem mais fceis de construir que rgos complexos, como um rim ou um pulmo. TABELA 20.2. As caractersticas comparadas das clulas-tronco adultas e embrionrias
CLULAS-TRONCO ADULTAS Pouqussimas, difceis de encontrar nos tecidos. Diferenciam-se em um nmero limitado de tipos celulares. Difceis de cultivar no laboratrio. Induzem rejeio se forem transplantadas em outra pessoa. Quando reintroduzidas na mesma pessoa, no induzem rejeio. CLULAS-TRONCO EMBRIONRIAS Trinta clulas, fceis de encontrar em um embrio de 3 a 5 dias. Diferenciam-se em qualquer um dos 220 tipos celulares do organismo (pluripotentes). Fceis de cultivar no laboratrio. Induzem rejeio.

FIGURA 20.4. A clonagem teraputica, uma forma de gerar clulas-tronco embrionrias com a informao gentica do doador do ncleo.
Paciente Clula saudvel

Transferncia nuclear

Ovcito

Fuso celular Ovcito anucleado

Embrio

Infuso

Clulas-tronco diferenciadas

Clulas-tronco recuperadas

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AS TERAPIAS CELULARES As clulas-tronco multipotentes Clulas-tronco multipotentes so encontradas em tecidos adultos, onde proliferam por longos perodos de tempo, conservando a capacidade de se diferenciar em diferentes tipos celulares, em resposta a estmulos adequados (Tabela 20.2). So responsveis pelo crescimento e a reparao dos tecidos. Sua presena em tecidos e rgos explica o sucesso alcanado pelos transplantes de pele, de crnea e de medula ssea. Este ltimo possibilita a regenerao dos elementos sanguneos no tratamento de leucemias e de linfomas, de doenas hereditrias hematolgicas e na recuperao dos pacientes que receberam quimioterapia. As clulas-tronco hematopoiticas so encontradas em frequncias baixssimas na medula ssea e no sangue perifrico. Embora no apresentem caractersticas morfolgicas que as distingam das outras clulas, a presena de marcadores moleculares especficos na membrana permite separ-las e infundi-las mais tarde na mesma pessoa ou em outra que for compatvel. Numerosos bancos de sangue, pblicos e privados, oferecem um servio de armazenamento de sangue de cordo umbilical que asseguraria a recuperao de clulas-tronco hematopoiticas, em caso de necessidade. Como a probabilidade de uma pessoa vir a precisar de suas prprias clulas baixssima (1/100.000), a existncia de grandes bancos pblicos representa a garantia de encontrar doadores compatveis. Pesquisas em andamento investigam a capacidade regenerativa das clulas-tronco adultas na cicatrizao de queimaduras, na substituio de clulas da crnea, na regenerao de osso e cartilagem, no tratamento da artrite e na reparao de fraturas. Embora alguns aspectos relativos ao seu modo de ao no estejam totalmente esclarecidos, os primeiros ensaios clnicos so promissores. As clulas-tronco pluripotentes Devido s limitaes na capacidade de diferenciao das clulas-tronco presentes nos tecidos adultos, muitos pesquisadores se interessaram pelas clulas-tronco embrionrias, capazes de se diferenciar em qualquer tipo de clula e muito mais fceis de cultivar no laboratrio (Tabela 20.2). Entender os mecanismos que controlam o crescimento e a diferenciao celular um dos maiores desafios atuais, porque as clulas-tronco embrionrias representam a possibilidade de novos tratamentos de regenerao celular para doenas cardacas, diabetes, leses da medula espinhal, distrofia de Duchenne, cegueira, surdez e doena de Parkinson. Nenhum procedimento teraputico com clulas-tronco embrionrias saiu do laboratrio. Recentemente, foram iniciados, nos Estados Unidos, os primeiros testes clnicos para o tratamento de duas formas de cegueira por Advanced Cell Technology e para a regenerao da medula espinhal e de clulas danificadas por derrame cerebral, por Geron e ReNeuron respectivamente. Explica-se o grande entusiasmo despertado, em seu momento, pelas clulas-tronco embrionrias porque se esperava que permitissem criar linhagens celulares personalizadas, por transferncia nuclear. Clulas-tronco embrionrias com a informao gentica de um paciente regenerariam os rgos lesionados, sem causar problemas de rejeio (Figura 20.4). As clulas tambm poderiam ser objeto de uma terapia gnica. O procedimento, denominado clonagem teraputica, abriria possibilidades para o tratamento de doenas para as quais os recursos teraputicos so escassos (Parkinson, Alzheimer, Duchenne etc.). Contudo, at serem estabelecidas as regulamentaes pertinentes, a clonagem teraputica ainda permanece no terreno experimental do laboratrio.
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Em 2007, a controversa filosfica e moral sobre a clonagem teraputica e o uso de embries pareceu definitivamente superada. A insero de alguns genes em clulas diferenciadas gerou as clulas-tronco iPSC (do ingls, induced pluripotent stem cells), com propriedades equivalentes s das clulas-tronco embrionrias. Com elas, desenvolve-se rapidamente a tecnologia de reprogramao celular, aumentando nosso conhecimento sobre o controle gentico da diferenciao e abrindo uma nova senda para a implementao de testes, medicamentos e tratamentos novos. Aspectos polmicos das clulas-tronco Na perspectiva de contar com clulas capazes de reconstruir qualquer tipo celular, nos ltimos anos do sculo XX, vrios ncleos de investigao tentaram obter linhagens de clulas-tronco embrionrias. As poucas existentes foram obtidas a partir de fetos abortados e de embries supranumerrios resultantes das fertilizaes in vitro. Do ponto de vista tcnico, essas linhagens eram cultivadas com soro bovino ou com fibroblastos de camundongo, portanto, no poderiam ter nenhuma aplicao clnica. Entre 2001 e 2009, nos Estados Unidos, no se outorgaram fundos pblicos para pesquisas com novas linhagens de clulas-tronco embrionrias. Contudo, a iniciativa privada no sofreu nenhuma restrio, e cada estado pde fixar suas regras. Paralelamente, vrios pases estabeleceram sua legislao, em funo de consideraes cientficas, ticas e religiosas. Em 2005, pesquisadores sul-coreanos declararam ter construdo, por transferncia nuclear, 11 linhagens de clulas-tronco embrionrias de pacientes de diversas doenas. Apesar do notvel entusiasmo levantado por estes trabalhos, pouco depois comearam a surgir dvidas sobre a veracidade dos resultados divulgados, confirmando posteriormente os mesmos pesquisadores que essas linhagens nunca existiram. Por outro lado, nessas pesquisas teriam sido utilizados ovcitos de mulheres que trabalhavam no laboratrio. O escndalo chamou a ateno sobre a fragilidade tica de algumas pesquisas cientficas. Outro aspecto controverso o uso dos embries supranumerrios das clnicas de fertilidade assistida, para a obteno das linhagens de clulas-tronco embrionrias. Um setor da sociedade argumenta que a extrao de clulas-tronco de embries se realiza estritamente de 4 a 14 dias aps a fecundao e que, depois de certo tempo de congelamento, os embries no podem ser reimplantados com segurana. Em vez de eliminar esses embries, seria melhor utiliz-los na pesquisa de novos tratamentos para doenas que, hoje, no tm cura. Em contraposio, outro setor considera que a vida comea com a fecundao e que as pesquisas desrespeitam o status legal e moral do embrio, considerando inadmissvel que embries sejam criados in vitro, com fins de pesquisa. Em uma terceira posio, encontram-se os que consideram as terapias celulares uma tecnologia promissora, mas que ainda precisa de muita pesquisa pr-clnica. Este grupo tende a postergar qualquer deciso at existirem mais evidncias concretas sobre a tecnologia em si e os seus benefcios, pedindo mais tempo para reflexo. Em princpio, a descoberta das iPSC pareceria ter lhes dado razo. Finalmente, outro motivo de preocupao a proliferao do turismo mdico atrs das promessas de curas milagrosas. Recentemente, um garoto israelense com ataxia-telangiectasia desenvolveu um tumor cerebral depois de um tratamento com clulas-tronco fetais realizado na Rssia. Os estudos com marcadores celulares mostraram que, na origem do tumor, estavam as clulas implantadas. O desenvolvimento de um tratamento novo um processo lento que se desenvolve em etapas bem definidas, com histrias de fracasso e de sucesso. Do laboratrio at a prtica mdica, muitos pequenos passos so necessrios.

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21. CONSIDERAES FINAIS

Nos captulos anteriores revisamos os fundamentos das biotecnologias e seu impacto na sociedade, destacando alguns exemplos de empreendimentos latino-americanos bem sucedidos: o desenvolvimento do setor agropecurio e da indstria de medicamentos da Argentina, a plataforma genmica e a produo de vacinas no Brasil, o alcance da biominerao no Chile, o sucesso da experincia de Cuba etc. Apesar das dificuldades econmicas e polticas, essas experincias foram possveis porque se cumpriu a condio fundamental de contar com instituies competentes, uma massa crtica de pesquisadores e pessoal tcnico treinado. Em alguns casos, estas existiam previamente, em outros, elas foram criadas. A biotecnologia uma disciplina baseada no conhecimento. Em todos os seus nveis, a educao tem um rol fundamental na formao dos quadros profissionais e na difuso dos conhecimentos bsicos indispensveis, para avaliar adequadamente os benefcios dessa tecnologia e estabelecer as normas para sua utilizao. No incio do sculo XXI, em um momento histrico mundial de conflitos e mudanas sociais, vrias so as incgnitas que nos cercam: o Como estimular o interesse das novas geraes pelo conhecimento cientfico e tecnolgico? o Como impedir o aumento do distanciamento cientfico e tecnolgico entre os pases desenvolvidos e os pases em desenvolvimento? o Como sero afetados os rumos da pesquisa cientfica e tecnolgica com a crise econmica mundial? o Como a privatizao da pesquisa cientfica e tecnolgica ir alterar, atravs de um sistema de patentes, a transparncia do processo de aquisio e divulgao do conhecimento? o Como passar da pesquisa cientfica ao desenvolvimento tecnolgico de um produto ou de um servio? o Como incubar e agrupar as empresas que esto dando os seus primeiros passos? o Como manter a comunicao e a transferncia de conhecimentos entre os pases em desenvolvimento? o Como evitar a manipulao da opinio pblica? o Como assegurar que os benefcios das biotecnologias cheguem aos povos mais desfavorecidos? o Como conciliar a cultura de segurana e o desenvolvimento de novas tecnologias? o Como lidar com as pesquisas de uso duplo, que podem ser usadas tanto para o bem como para o mal? o Como inserir as novas tecnologias em um contexto que garanta o respeito aos princpios ticos fundamentais de nossa sociedade? Para estas perguntas no h uma nica resposta. Discusso e consenso so fundamentais. Rio de Janeiro, dezembro de 2011.

Copyright Maria Antonia Malajovich Biotecnologia: ensino e divulgao (www.bteduc.bio.br)

Maria Antonia Malajovich

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NDICE REMISSIVO
AAT (-1-antitripsina), 176 Abbott, 215, 234, 240, 248, 280. Acetona, 3, 5, 6, 23, 24, 31, 59, 60, 109, 112. cido actico, 12, 24, 60, 109, 112. cido ascrbico (vitamina C), 70, 112, 113. cido ctrico, 5, 6, 7, 24, 26, 30, 59, 112, 187. cido glutmico, 24, 49, 113. cido lctico, 6, 24, 31, 112-115, 179, 181, 185, 187. cido succnico, 112. Adalimumab, 248, 240 Advanced Cell Technology, 259. Afeganisto, 149. Affymetrix, 7, 215, 216. frica do Sul, 6, 153, 161, 183, 257. Agenda 21, 125. Agilent, 215, 216, 285. AkzoNobel, 240. Alemanha, 57, 107, 109, 116, 121, 149, 163, 252, 254. Algodo Bollgard, 158. Allergan, 240. Amflora, 8, 127, 153, 163. Amgen, 95, 240. Angola, 193, 289 ANMAT, Administracin Nacional de medicamentos, Alimentos y Tecnologa Mdica, 247. ANVISA, Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria, 247. Applied Biosystems, 215, 218, 280. AquaBounty, 173, 272. AquaGestin, 175. Aranesp, 240. ARG Natural Beef, 171. Argentina, 4, 57, 68, 107, 121, 122, 132, 144, 153, 161-163, 165, 171, 172, 174-176, 183, 197, 207, 221, 224, 232, 237, 240, 241, 247, 261, 263, 264, 272-277, 280, 282, 283, 287. Arroz Bt, 161. Arroz com vitamina A, ver Golden Rice. Aspartame, 113, 188. Astra Zeneca, 229, 234. ATryn, 105, 176, 239. Austrlia, 107, 136, 144, 156, 165, 183, 244, 267. Avastin, ver bevacizumab. Aventis, 229, 237, 280. AviGenics, 176. Banting F., 237. BASF, 8, 110, 115, 127, 157. Basilea Pharmaceutica, 234. Bayer, 129, 159, 230. Berg P., 93 Betaseron, ver interferon. Bevacizumab, 8, 240, 248. Copyright Maria Antonia Malajovich Biotecnologia: ensino e divulgao (www.bteduc.bio.br)

Maria Antonia Malajovich BIO - Biotechnology Industry Organization, 2, 263, 272, 277, 281. Biobrs, 237. Biogen Idec, 240, 248. Biognesis, 174. Biolixvia, 23, 136, 270, 271. Biomanguinhos - Instituto de Tecnologia em Imunobiolgicos (Fiocruz), 208, 284. Biomrieux, 216, 217, 281. Biomm, 237. Biopol, ver PHB. Biopulping, 126. BiosChile, 174. Biosidus, 107, 171, 176. BioSigma, 137. BiosteelTM, 172. Bolvia, 4, 163. Borlaug N., 152, 272. Botox, 40. Ver tambm toxina botulnica. Boyer H. & S. Cohen, 1, 6, 93, 95. Braden Copper Co., 136. Branca e Neve, 171. Brasil, 4, 6, 7, 27, 57, 68, 103, 109, 116-118, 121-123, 126, 127, 129, 132, 136, 142, 144, 146, 148, 149, 153, 155, 156, 158, 159, 161-163, 165, 169, 171, 172, 174-176, 183, 189, 193, 197, 207-209, 221, 223, 232, 237, 240, 241, 244, 247, 261. Braskem, 115. Bristol-Myers Squibb, 74. Butanol, 3, 5, 6, 23, 24, 31, 59, 60, 109, 111, 112. Calgene Inc., 191. Canad, 109, 116, 122, 123, 151, 152, 161, 172, 173, 183, 190, 242, 271, 273, 284, Canola, 110, 115, 122, 140, 142, 143, 153, 157, 160, 164, 191, 192, 196, 273. Cargill, 160, 192. Carrefour, 193 Carson R., 128. Cartagena, Protocolo de de Biossegurana de, 150, 173. CDC - Center for Disease Control and Prevention, 210, 265, 281. Cefalexina, 110. Celera Inc., 7, 55, 90, 267, 268. Ceradase, ver glucocerebrosidase. Cerezyme, ver glucocerebrosidase. Cetus, Inc., 6, 88. Cetuximab , 248. Cevarix, 251. CGIAR - Consultative Group on International Agricultural Research, 149, 189, 273, 275, 276. Chakrabarty, 6, 135. Chile, 4, 25, 57, 68, 121, 132, 136, 163, 173-175, 183, 207, 221, 232, 261, 269, 271, 272, 275, 277, 278, 280. China, 4, 5, 116, 121, 122, 139, 140, 144, 146, 149, 153, 159, 160, 161, 167, 173, 207, 209, 211, 213, 254. Chiron, 6, 240. CIAT- Centro Internacional de Agricultura Tropical, 149. CIMMYT - Centro Internacional para el Mejoramiento del Maz y el Trigo, 149. CIP - Centro Internacional de la Papa, 149, 273. Cipro, 234, 245. Coca-Cola, 115. Codelco - Corporacin Nacional del Cobre, 136, 137, 269. 294

BIOTECNOLOGIA 2011 / ndice remissivo Cdigo de Nuremberg, 205. Collins P., 7. Colmbia, 4, 68, 144, 149, 163, 174, 221, 264, 268. Confdration Paysanne, 193. Conferncia de Asilomar, 1, 6, 95, 275. Conferncia de Rio de Janeiro, 156, 125 CONICET - Consejo de Investigaciones Cientficas y Tcnicas de la Argentina, 107, 263. Consrcio do Genoma Humano, 7. Conveno sobre a Diversidade Biolgica, 148, 150, 232. Coreia, 159, 227. Costa Rica, 4, 23, 148, 163, 232. Cruz O., 209. CTNBio - Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana, 103, 155, 159, 175, 273, 279. Cuba, 4, 28, 68, 76, 121, 129, 132,173, 174, 221, 240, 241, 261, 274, 286. Declarao de Alma-Ata, 231. deCode, 242, 282. Dendreon, 251. Dextranas, 24, 112, 113, 187. Dinamarca, 114, 121, 123, 133, 177, 266. Dipel, 129, 158. Dbereiner J., 127. Dolly, 7, 104, 105, 170, 171. Dow Agro Sciences, 159, 162, 207. DSM Life Sciences Products, 110, 271. DuPont, 115, 162. Eagle H., 77. EFB - European Federation of Biotechnology, 2, 278. Eli Lilly, 6, 95, 229, 237, 240. EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria, 57, 127, 129, 149, 157, 159, 163, 171, 189, 266, 274. Enbrel, ver etarnecept. EOR Enhanced oil recovery, 135. EPA - Environmental Protection Agency, 6, 163, 167, 265. Epogen, ver eritropoietina. Eprex, ver eritropoietina. Equador, 4. Erbitux, ver cetuximab. Ereky K., 1, 5. Eritropoietina, 79, 238, 240, 241, 247, 254, 239, 240, 241, 244, 247. Eslovaquia, 163. Espanha, 4, 123, 136, 163, 164, 211. Estados Unidos, 6, 7, 23, 30, 57, 107, 109, 116, 118, 121-123, 129, 132, 134, 137, 149, 151, 152, 156, 159, 161, 163, 166, 171-173, 176, 179, 183, 190, 191, 193, 195, 197, 204, 206, 207, 210, 213, 223, 233, 242-245, 247, 251, 252, 256, 259, 260. Etanol, 3, 24, 26, 30, 59, 60, 61, 68, 81, 110-112, 115, 116-119, 122, 123, 131, 132, 179, 180, 181, 187, 268, 269. Etarnecept, 240. FAO - Food and Agriculture Organization, 143, 149, 157, 167, 190, 196, 254, 265, 269, 271, 274, 276, 278. FAP - Fundao Ataulfo de Paiva, 208, 283. Fapesp - Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo, 57, 119, 263, 269, 283. Farmanguinhos, 237, 241, 244. FASS - Federation of Animal Science Societies, 167. 295

Maria Antonia Malajovich Fator de estimulao de colnias de granulcitos (hg-CSF), 176, 238, 240, 250, 251. Fator IX, 105, 170, 171, 176, 238. FDA -US Food and Drug Administration, 6, 7, 163, 167, 173, 197, 247, 251, 252, 256, 277, 279, 285, 290. Feijo resistente vrus, 161. Filipinas, 161. Fitase, 128, 160, 166, 167, 172. Fleischmann, C. & M., 179. Fleming A., H. Florey & E. Chain, 5, 233. Flores Colombianas S.A., 144. Florigene, 144, 274. Folistim, ver hormnio foliculo estimulante. Frana, 4, 5, 6, 57, 107, 116, 121, 147, 174, 209, 215, 253. Frankenfood, 193. Friends of Earth, 193. Fundao Oswaldo Cruz, 207, 275. Funed - Fundao Ezequiel Dias, 208. Future Harvest, 149. Gardasil, 251. Gendicina, 254. Gene Chip, 216, 268. Geneal, 171. Genencor, 7, 115. Genentech, 6, 95, 240. Genzyme, 240. Geron, 259. Gigantes Gnicos - Gene Giants, 161, 162. Glaxo, 207, 208, 229, 241, 251. GloFish, 8. Glucocerebrosidase, 238, 240. Golden Rice, 1, 160, 189, 192, 273. Goma xantana, 24, 112, 113, 135, 187. Granulcitos - Fator estimulante do crescimento de colnias G-CSF, 176, 238, 240, 250, 251. GRAS Generally Recognized as Safe, 189, 190. Greenpeace, 193, 274, 278. Groupe Limagrain, 162. Grupo de Empresas Farmacuticas Sidus, 107, 240, 284. GTC Biotherapeutics, 105, 176, 239. Guerra Mundial, Primeira, 5, 109, 110 Segunda, 93, 148, 166, 205, 223, 233. Haiti, 211. Heber Biotec, 241, 243. Hematech Inc., 176. Herceptin, 240, 243, 248, 249. Ver tambm trastuzumab. Hoffman F., 230 Hoffmann-La Roche, 6, 88, 242. Honduras, 163. Hormnio de crescimento Animal, 7, 107, 172, 173, 176, 240. Humano, 6, 31, 97, 107, 172, 238, 240, 244. Hormnio foliculo estimulante, 238, 240. 296

BIOTECNOLOGIA 2011 / ndice remissivo Houwink E.H., 2. Humalin, ver insulina. Humalog, ver insulina. Humatrope, ver hormnio de crescimento. Humira, ver adalimumab. Humulina, 6. Ver tambm insulina. Hyundai, 115. IASA, 174. IBP - Instituto de Biotecnologia de las Plantas, 76, 263. Illumina, 90, 215, 242. ILSI - International Life Science Institute, 196, 273, 274, 278. Immerge Bio Therapeutics, 257. InBio - Instituto Nacional de Biodiversidad, 232, 285. Incyte, 215. ndia, 4, 5, 109, 116, 121, 139, 145, 146, 148, 153, 159, 161, 207, 209. Infliximab, 240, 241, 248. Inglaterra, 5, 6, 109, 156, 209, 242. Ver tambm Reino Unido. Instituto Butantan, 208, 284. Instituto Craig Venter, 8, 92. Instituto Finlay, 208, 241. Instituto Pasteur, 5, 6, 207, 208, 280. Instituto Roslin Insulina Humana, 1, 6, 31, 97, 105, 107, 176, 235, 236-240, 244, 257, 288. INTA - Instituto Nacional de Tecnologia agropecuria, 144, 232, 273, 274, 276. Interferon, 31, 78, 79, 176, 238, 239, 240, 241, 244, 247. Interferon, 31, 78, 79, 176, 238. IPB - Instituto de Pesquisas Biolgicas, 208. IPCC - Painel Intergovernamental sobre Mudanas Climticas, 125. Iraque, 149. ISAAA -International Service for the Aquisition of Agri-Biotech Applications, 161, 265, 270, 277. Isis Pharmaceuticals, 256. Israel, 23, 109, 113, 206. Iugoslvia, 210. IVB - Instituto Vital Brazil, 208. Japo, 107, 121, 156, 209, 213, 243, 244. Jeffreys A., 6, 85, 223. Jenner E., 5, 199, 209. Johnson & Johnson, 95, 229, 234, 240, 248. Kelloggs, 160, 192. Kenecott Corporation, 136. Kirin, 240. Kyoto, Conferncia de, 125. Protocolo de, 132, 133. Laboratrio Bag, 174. Laboratrios Denver Farma, 237. Laboratrios Santa Elena, 174. Lacks H., 78. Laverlam, 174. 297

Maria Antonia Malajovich Lenda e Glria da Embrapa, 171. Leveduras ECMo01 e ML01, 183 Liberty Link, 157. Lucentis, ver Ranibizumab. Malaui, 193. Mamirau, 148, 274. Mark and Spencer, 193. McDonalds, 115. MedImmune, 240. Mendel G., 5, 15, 18, 151. Merck, 207, 229, 232, 233, 234, 243, 248, 251, 286. Mercosul, 68. Mxico, 4, 6, 57, 68, 121, 132, 136, 148, 149, 159, 163, 172, 174, 197, 209, 212, 232, 240, 241, 272, 273, 290. Milho Agrisure, 158. TM Genuity SmartStax , 159. Yieldgard, 158. Milstein C. & G.J.F. Kohler, 6, 44. MIP - Manejo Integrado de Pragas, 128, 129. Mitsubishi Tanabe, 248. Mitsui Petrochemical Ind. Ltd., 74. Moambique, 193. Monoglutamato de sdio, 3, 112, 187. Monsanto, 7, 157, 158, 159, 160, 167, 192, 275. Mullis K., 6, 88. andubay, 171. Natalizumab, 248. NeoRecormon, ver eritropoietina. Neulasta, ver Granulcitos - Fator estimulante do crescimento de colnias G-CSF. Neupogen, ver Granulcitos - Fator estimulante do crescimento de colnias G-CSF. Neutropin, ver hormnio de crescimento. Night pearls, 177. NIH -National Institute of Health, 6, 95, 232, 265, 268, 283, 284, 286. Nippon Mining & Metals, 137. Nitto Denko Corp., 74. Noruega, 149, 173. Nova Zelndia, 165, 172, 173. Novartis, 193, 207, 229, 232, 234, 241, 248. Novo Nordisk, 237, 240, 266, 287. Novozyme, 114, 207, 279. Novulin, ver insulin. OECD -Organization for Economic Cooperation and Development, 2, 6, 196, 264, 270, 287. Omalizumab, 240. Oostvaarderplassen, 148. Organizao Mundial de Comrcio, 245. Origen Therapeutics, 176. Orphan Drug Act, 244. OTA Office of Technology Assessment, 2. Oxford Biomedica, 254.

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BIOTECNOLOGIA 2011 / ndice remissivo Palivizumab, 240, 248. Pampa Mansa, 107. Panam, 173. Papaias UH Rainbow e UH SunUp, 151, 191. Paquistan, 161. Paraguai, 4, 57, 161, 163, 174. Paris-Texas, 171. Pasteur L., 13, 183. PEG ntron, 240. Pegasys Avonex, 240. Peru, 4, 68, 136, 140, 149, 159. Pfizer, 7, 229, 233, 234, 287. PHA - poli-hidroxialcanoatos (PHAs), 115, 132. Pharming BV, 176. PHB - poli-hidroxibutirato (PHB), 115. Pioneer Hi-Bred, 151, 273. PLA - polilactato, 115. Polly, 7, 105, 170, 171. Polnia, 148, 163. Por e Potira, 171. Portugal, 163. PPL Therapeutics, 105, 171, 176, 257. Pr-alcool - Programa Nacional do lcool, 6, 118. ProBioMed, 241, 243. Procrit, ver eritropoietina. Projeto Genoma, da cana, 119. humano, 55, 119. Prometea, 171. Proteo de Cultivares do Brasil, Servio de, 146. Protopin, ver hormnio de crescimento. Provenge, ver sipuleucel-T. Pusztai, A., 167, 195. Quorn, 187. RAC - Recombinant DNA Advisory Committee, 95. Ranibizumab, 240. Rebif, ver interfern. Recalcine, 175. Reino Unido, 7, 64, 107, 166, 167, 173, 174, 180, 192, 210. Remicade, ver Infliximab. ReNeuron, 259. Repoxygen, 254. Repblica Dominicana, 211. Repblica Tcheca, 163. RHM - Ranks Hovis McDougall, 187. Rituxan, ver rituximab. Rituximab, 240, 248. Roche, 6, 88, 90.240, 242, 248, 284, 288. Roosevelt F.D., 210. Roundup, 157, 192. Ruanda, 149. 299

Maria Antonia Malajovich Rumana, 163. Sabin A., 210. Saizen, ver hormnio de crescimento. Salk J., 210. Salmo AquAdvantageTM, 173, 272, 229. Samsung, 115. Sankyo, 240. Sanofi, 207, 208, 240, 290. Schering Plough, 95, 240. SCP - single cell protein, 166, 187. Serono, 240, 248. Serostim, ver hormnio de crescimento. Shenzhen SiBiono GeneTech, 254. Sipuleucel-T, 250, 251. Soja Cultivance, 157. RoundupReady, 157. Soymega, 192. Vistive, 160, 192, 197. Somlia, 210. Sorona 3GT, 115. Southern E.M., 85. Sumitomo, 129. Suntori, 144. Svalbard, 149. Synagis, ver Palivizumab. Syngenta, 158, 162, 163. Syntex Corporation, 6. Tambo farmacutico, 107, 176, 240. Taxol, 74, 231. Tecnovax S.A., 175. Tecnovax, 175. Tecpar - Instituto de Tecnologia do Paran, 208, 284. Thuricida, 158. Tomate FlavSavr, 7, 191, 256. Tour de France, 254. Toxina botulnica, 31, 240. TransOva, 176. Trastuzumab, 240, 248, 249. TRIPS Agreement, 245 Turfal, 127. Tysabri, ver natalizumab. UNEP - Programa das Naes Unidas para o Meio Ambiente, 148, 270. Unio Europeia, 8, 116, 118, 122, 144, 163, 167, 193, 197, 244, 247. Uruguai, 4, 57, 68, 121, 132, 161, 163, 174, 221. USDA - US Department of Agriculture, 163, 197, 232, 270.

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BIOTECNOLOGIA 2011 / ndice remissivo Vacina BCG bacilo de Calmette e Gurin, 202, 208, 251, 283. Sabin (OPV), 202, 210, 211. Salk (IPV), 202, 206, 210. DIVA - differentiating infected from vaccinated animals, 175. Valle, 174. Vavilov N.I., 147, 148. Vectobac, 158. Vectorcontrol, 129. VECTRO - Instituto para Preparaes Virais, 210. Venezuela, 4, 221, 233. Vitamina A - -caroteno, 1, 25, 113.141, 160, 189, 191, 192. Vitamina B12 - cianocobalamina, 112, 113. Vitamina B2 riboflavina, 70, 110, 112, 113. Vitria, 171. Vitrogen, 171. Von Behring E. & S. Kitasato, 247. Watson J. & Crick F., 1, 5, 47. Weizmann Ch., 5, 109. WHO - World Health Organization, 167, 190, 196, 199, 207, 231, 280, 291. World Trade Center, 213, 224. Wyeth, 207, 240, 249. Xolair, ver Omalizumab. Zmbia, 193. Zimbbue, 193.

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Maria Antonia Malajovich

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ORT - ORGANIZAO, RECONSTRUO E TRABALHO - uma instituio educacional de origem judaica que se dedica ao ensino e treinamento tecnolgico. Atua hoje em mais de 50 pases e suas escolas so frequentadas anualmente por cerca de 300.000 alunos. Sem fins lucrativos, concentra seus esforos em permitir o acesso a uma educao de elevado nvel ao maior contingente possvel de alunos, sem restries de qualquer espcie. Maior organizao no governamental de ensino e treinamento tecnolgico do mundo, o ORT desenvolve pesquisas educacionais e coloca seu conhecimento tcnico disposio de governos, indstrias e outras instituies de ensino. Desde sua fundao em 1880, um dos principais objetivos do ORT foi ajudar a ajudar-se, levando independncia e autossuficincia. E alcanou-o oferecendo educao e treinamento s pessoas para ajudarlhes a ganhar seu sustento com dignidade. Maria Antonia Malajovich biloga, com Licenciatura em Cincias Biolgicas pela Universidade de Buenos Aires, mestrado e doutorado em Gentica pela UFRJ (Brasil). Foi bolsista da CAPES e CNPq (Brasil), do Ministrio das Relaes Exteriores da Frana, de World ORT e da Universidade das Naes Unidas (UNUBIOLAC). Ao longo de mais de vinte anos dedicados ao ensino cientfico e tecnolgico, ministrou cursos de Biotecnologia em vrios pases latino-americanos (Argentina, Brasil, Peru, Uruguai, Venezuela). Desempenhase, desde 1992, como Professora e Coordenadora de Cincias e de Biotecnologia no Instituto de Tecnologia ORT do Rio de Janeiro. Conta com vrios artigos sobre o tema, e livros publicados no Brasil e na Argentina. Em 2008 recebeu o prmio Beatrice Wand-Polak, outorgado por World ORT aos Professores que se destacam no desenvolvimento de novos programas, materiais e tecnologias educacionais. Fundou o site Biotecnologia: ensino e divulgao (www.bteduc.bio.br). Em 2011, foi homenageada pelo Dia do Bilogo, na Assembleia Legislativa do Rio de Janeiro, em reconhecimento sua dedicao em defesa da Biodiversidade e do Meio Ambiente. Integra a direo cientfica da Associao Nacional de Biossegurana.

BIOTECNOLOGIA 2011 - MARIA ANTONIA MALAJOVICH Edies BIBLIOTECA MAX FEFFER do INSTITUTO DE TECNOLOGIA ORT do Rio de Janeiro Rua Dona Mariana 213 Rio de Janeiro, 22280-020 RJ - Brasil Tel.: (5521)2539-1842; FAX: (5521)2286-91 http://www.ort.org.br