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Bioqumica - Case Study O Case Study consiste numa simulao, durante as aulas terico-prticas, dos procedimentos experimentais necessrios

para atingir o objectivo do estudo. Ou seja, embora cada passo ou mtodo no seja realizado fisicamente num laboratrio, sero fornecidos os resultados que obteriam em cada procedimento, e estes resultados sero analisados. Pretende-se com este trabalho aplicar os conhecimentos obtidos nas aulas tericas, particularmente sobre purificao de protenas e manipulao de DNA recombinante a um caso prtico, que levaria dias ou semanas de trabalho intensivo laboratorial para ser atingido. Tal como numa aula prtica, os alunos devero preparar um relatrio do trabalho (individual) em que descrevem cada passo realizado, apresentam os resultados obtidos e discutem-nos. O prazo de entrega do relatrio dia 5 de Maio de 2011. O relatrio deve ter no mximo 10 pginas, e tamanho de letra ACIMA de 10 e deve incluir Material e Mtodos (com a base terica sucinta do mtodo), Resultados e Discusso. O relatrio do Case Study pode contribuir 20 % da nota final, mas no obrigatrio.

Objectivo: Produo, purificao e caracterizao de um enzima de E. coli com possvel actividade como NADPH oxidoredutase. Introduo: Embora a bactria Escherichia coli seja um dos microorganismos mais bem estudados, o nmero de genes de funo desconhecida quase 50 %. Durante um estudo sobre a resposta da bactria ao xido ntrico, o gene ytfE foi identificado por microarray como sendo o mais induzido em resposta ao stress nitrosativo. Na organizao genmica o gene ytfE fica perto e co-transcrito num opero com o gene ytfG que exibe semelhanas com oxidoreductases dependentes de NADPH. Pretende-se avaliar se este gene codifica uma protena que possa actuar como reductase da protena YtfE, utilizando NADPH como dador de electres. Para tal sero efectuados os seguintes passos: 1. 2. 3. 4. Clonagem do gene ytfG de E. coli num plasmdeo de expresso pET24a Expresso da protena recombinante em clulas de expresso E. coli BL21(DE3)Gold Purificao da protena recombinante por cromatografia Caracterizao da actividade enzimtica da protena pura

Material e Tcnicas disponveis: Aparelho de PCR, Taq DNA polimerase, Enzimas de restrio NdeI e EcoRI , outras enzimas e reagentes necessrios a tnicas de biologia molecular. Sistemas de purificao de protenas, e colunas j empacotadas Q-Sepharose (70 ml), Superdex-75 (300mL) Espectrofotometro de UV-vis.