Anda di halaman 1dari 79

LEMBAGA KAJIAN DAN PENGEMBANGAN PENDIDIKAN (LKPP)

LAPORAN MODUL PEMBELAJARAN BERBASIS SCL

Judul : Aplikasi Konsep Teknologi DNA Rekombinan pada Transfer Genetik Tanaman Oleh : Ir. Rinaldi Sjahril, MAgr., PhD.
Dibiayai oleh Dana DIPA Universitas Hasanuddin sesuai dengan Surat Perjanjian Pelaksanaan Pekerjaan Nomor: 469/H4.23/PM.05/2008 Tanggal 04 Januari 2008

JURUSAN BUDIDAYA TANAMAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS HASANUDDIN FEBRUARI 2008

LEMBAGA KAJIAN DAN PENGEMBANGAN PENDIDIKAN


Lantai Dasar Gedung Perpustakaan Universitas Hasanuddin

HALAMAN PENGESAHAN LAPORAN MODUL PEMBELAJARAN PROGRAM TRANSFORMASI DARI TEACHING KE LEARNING UNIVERSITAS HASANUDDIN 2008
Judul Nama Lengkap NIP Pangkat/Golongan Telp. / HP Pengusul Jadwal Waktu Kegiatan Biaya yang diusulkan : Aplikasi Konsep Teknologi DNA Rekombinan pada Transfer genetik Tanaman : Ir. Rinaldi Sjahril, MAgr., PhD : 132 126 029 : Asisten Ahli / IIIb : (0411) 589900/ 08194140992 : 1 (satu) bulan Mulai 04 Januari 2008 s/d 04 Februari 2008 : Rp. 4.000.000,- ( Empat juta rupiah) Dibiayai oleh Dana DIPA Universitas Hasanuddin
sesuai dengan Surat Perjanjian Pelaksanaan Pekerjaan Nomor: 469/H4.23/PM.05/2008 Tanggal 04 Januari 2008

Makassar, 04 Februari 2008 Mengetahui : Fakultas Pertanian Universitas Hasanuddin Dekan,

Pembuat Modul

(Prof. Dr. Ir. Mursalim) NIP. 131 657 135

(Ir. Rinaldi Sjahril, MAgr., PhD) NIP. 132 126 029

ii

KATA PENGANTAR Perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi yang kian pesat telah mengubah berbagai aspek kehidupan manusia secara revolusioner. Demikian pula pada bidang pertanian khususnya pemuliaan tanaman. Kemajuan teknologi telah memungkinkan dilakukannya rekayasa sifat tumbuhan secara terarah dengan menerapkan bioteknologi modern. Riset mengenai rekayasa tanaman secara genetis terus berkembang pesat. Bioteknologi tanaman dan aspek-aspeknya sangat penting untuk dipahami, agar pemanfaatan bioteknologi dapat dilakukan secara optimal. Modul ini mencoba membahas mengenai Bioteknologi tanaman khususnya DNA rekombinan pada transfer genetik tanaman dan berbagai aspek yang terkait. Kami berharap modul ini dapat bermanfaat bagi penggunanya.

Makassar, 04 Februari, 2008

iii

RINGKASAN
Bioteknologi secara sempit didefinisikan sebagai penerapan prinsip-prinsip dasar biologi, biokimia, serta rekayasa untuk mengubah dan mendapatkan nilai tambah dari suatu organisme atau bagian dari organisme melalui pemanfaatan agensia biologis. Bioteknologi modern ditandai dengan penggunaan teknik biologi molekuler sehingga rekayasa yang dilakukan dapat jauh lebih terarah sehingga hasil yang diperoleh dapat lebih atau sepenuhnya dikendalikan. Sel merupakan bahan dasar penyusun utama makhluk hidup. Sel juga mengandung materi informasi genetik serta dapat menggandakan diri. Yang membedakan antara sel prokariotik dengan sel eukariotik adalah pada sel prokaritotik tidak memiliki membran nukleus dan sistem endomembran (organel-organel bermembran). Sel tersusun atas dinding sel, membran plasma, sitoplasma, serta organel-organel sel yang memiliki fungsi masing-masing. Dalam bioteknologi, rekayasa dapat dilakukan hingga pada aras DNA yang merupakan bahan informasi genetik. Struktur primer dari DNA terdiri atas, Gula berkarbon lima (Pentosa), Basa organik heterosiklik (Purin dan Pirimidin), dan Gugus fosfat bermuatan negatif yang terikat dalam ikatan fosfodiester. RNA dan DNA mempunyai struktur primer yang mirip. Keduanya terdiri atas suatu rantai lurus dari nukleotida purin dan pirimidin yang terikat satu sama lain dengan ikatan fosfodiester dari posisi 3 ke posisi 5. Pada keduanya ditemukan adenin, guanin dan sitosin. Dalam RNA, urasil menggantikan timin. Gula yang terdapat pada RNA adalah Ribosa. Molekul RNA berupa single-stranded. Ekspresi genetik merupakan proses penerjemahan informasi genetik (dalam bentuk urutan basa) menjadi protein, dan lebih jauh lagi: karakter. Ada tiga proses dasar yang tercakup dalam dogma inti yaitu replikasi DNA, Transkripsi DNA menjadi RNA, dan Translasi RNA menjadi protein atau polipeptida. Proses ekspresi gen merupakan aspek fundamental dalam setiap organisme hidup.

iv

Teknologi DNA rekombinaan merupakan kumpulan teknik atau metode yang digunakan untuk menggabungkan molekul-molekul DNA secara in vitro. Tahapan dasar dalam melakukan rekombinasi DNA secara in vitro adalah Isolasi molekul DNA, pemotongan DNA menggunakan enzim endonuklease restriksi, penyambungan molekul-molekul DNA menggunakan enzim DNA ligase ke dalam suatu molekul DNA vektor, transformasi sel inang dengan DNA rekombinaan dalam sel karakterisasi fungsional gen yang diklon. Dalam rekombinasi DNA maka dibutuhkan berbagai enzim untuk memotong dan menyambung DNA. Enzim endonuklease restriksi atau enzim restriksi merupakan enzim yang diproduksi oleh mikroba yang dapat memotong DNA utas ganda, sedangkan enzim ligase merupakan enzim yang digunakan untuk menyambung potongan-potongan fragmen DNA. Transfer DNA ke dalam bakteri dapat dilakukan dengan tiga cara yaitu, konjugasi, tarnsformasi, dan transduksi. DNA yang masuk ke dalam sel bakteri kemudian dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom bakteri sehingga terbentuk kromosom rekombinaan. Amplifikasi (perbanyakan) sekuens DNA dapat dilakukan dengan metode PCR (Polymerase chain reaction). Amplifikasi DNA ini dilakukan dengan menggunakan enzim DNA polimerase, dNTP (dinukleotida triphosphat) oligonukleotida primer, dan DNA template (DNA cetakan). Transfer gen dapat dilakukan baik dengan teknik transformasi protoplas maupun transformasi sel atau jaringan tanaman. Terdapat berbagai metode transfer gen diantaranya yaitu: Penggunaan A. tumefaciens, biolistik gun, elektroporasi, dan oenggunaan senyawa kimia. Analisis DNA rekombinaan di dalam sel yang tertransformasi dapat dilakukan dengan:Analisis restriksi DNA, hibridisasi dengan pelacak DNA, analisis ekspresi gen asing yang diklon, amplifikasi DNA dengan PCR, dan penentuan urutan nukleotida. inang, analisis dan konfirmasi keberadaan DNA rekombinaan dalam sel inang, dan

PETA KEDUDUKAN MODUL Pendahuluan, definisi, sejarah, klasifikasi dan ruang lingkup bioteknologi

Struktur dan komponen biomolekuler sel, struktur dan organisasi bahan genetik: kromosom, DNA, RNA, Plasmid, Genom

Perubahan konstitusi genetik, replikasi DNA dan Ekspresi Genetik

Teknik kultur in vitro, mutasi, rekombinasi, transposisi, metabolit sekunder - Hibridisasi somatik (Bila waktu tidak mencukupi maka dibahas pada matakuliah pembiakan in vitro)

Aplikasi Konsep Teknologi DNA Rekombinan pada Transfer genetikTanaman

Metode transfer gen

Uji Kompetensi dan Remedial

vi

DAFTAR ISI
Halaman HALAMAN JUDUL ................................................................................ HALAMAN PENGESAHAN .................................................................. KATA PENGANTAR ............................................................................. RINGKASAN .......................................................................................... PETA KEDUDUKAN MODUL ............................................................. DAFTAR ISI ............................................................................................ MODUL I.................................................................................................. MODUL II ................................................................................................ MODUL III ............................................................................................... MODUL IV............................................................................................... MODUL V ................................................................................................ LAMPIRAN : RANCANGAN PEMBELAJARAN BERBASIS SCL Mata Kuliah : Bioteknologi Tanaman i ii iii iv vi vii 1 6 23 48 63

vii

LAMPIRAN RANCANGAN PEMBELAJARAN MATA KULIAH

RANCANGAN PEMBELAJARAN BERBASIS KBK MATA KULIAH : BIOTEKNOLOGI TANAMAN (206 G113)
Kompetensi Utama : Mengerti dan memahami sains dasar genetika DNA dan bioteknologi (Nomor 1) serta menjelaskan dan merekayasa teknik-teknik yang ada dalam bioteknologi tanaman, ekstraksi dan isolasi DNA dan menguraikan langkah-langkah teknik PCR, transformasi genetik tanaman serta Pro dan Kontra. (Nomor 4)

Kompensi Pendukung : Kemampuan dalam penguasaan bahasa Inggris (Nomor 6); Kemampuan dalam penguasaan software dan internet (Nomor 7); Kemampuan bekerjasama, baik sebagai pimpinan maupun sebagai anggota dalam tim kerja (Nomor 8); serta Kemampuan mengevaluasi permasalahan lingkungan dari sudut pandang bioteknologi (Nomor 11). Kompetensi lainnya : Kemampuan mengembangkan diri berdasarkan pengetahuan dan pengalaman yang diperoleh selama menempuh studi Bentuk Pembelajaran (Metode SCL) Kompetensi Akhir Sesi Pembelajaran Mengetahui pengertian, perkembangan dan peran Bioteknologi dalam pertanian dan Menyusun poster tentang Proses pembuatan pupuk atau pestisida alami serta mekanisme reaksinya.

Minggu ke: 1-2

Materi Pembelajaran

Pendahuluan, sejarah singkat 1. Penjelasan Kontrak dan pengertian dasar Pembelajaran 2. Kuliah & Diskusi 3. Kajian Pustaka

3-5

Struktur dan komponen biomolekuler sel, struktur dan organisasi bahan

Kuliah & Tugas Kajian Pustaka + Kerja Kelompok +

Menyusun poster yang menjelaskan keanekaragaman molekul dalam sel melalui proses

viii

genetik: kromosom, DNA, RNA, Plasmid, Genom

Presentasi (Collaborative Learning)

pengenalan biomolekuler serta struktur, sifat kimia dan peran DNA/RNA sebagai bahan genetik pada organisme Eukariotik dan Prokariotik

6-8

Perubahan konstitusi genetik, Kuliah + Kerja Menyusun portfolio tentang: replikasi DNA dan Ekspresi kelompok & Tutorial Konstitusi genetik tanaman Genetik melalui pemahaman terhadap dogma genetik, kode genetik & ekspresi genetik Dogma genetik dan kode genetik Ekspresi genetik, Mutasi, mutagenesis, Rekombinasi, Transposisi, Replikasi, Transkripsi dan Translasi DNA Somaklonal vs Gametoklonal Interaksi genetik tanaman dan lingkungan Teknik kultur in vitro, mutasi, rekombinasi, transposisi, metabolit sekunder, Hibridisasi somatik Kuliah & Diskusi + Tugas Kajian Pustaka (Cooperative Learning) Menemukan paling sedikit 10 contoh aplikasi pada setiap pokok bahasan yang menjelaskan teknikteknik Bioteknologi Tanaman, dan rekayasa genetika untuk transformasi genetika tanaman dan prospek pengembangan tanaman melalui bioteknologi Menyusun presentasi oral dan poster yang memuat langkahlangkah proses: Identifikasi dan isolasi DNA/gen hingga kloning gen. Amplifikasi DNA dengan PCR, Pemotongan dan Penyambungan DNA (ligasi) dengan mekanisme kerja enzimenzim nuklease dan endonuklease restriksi; Vektor dalam kloning gen pada tanaman; Pemindahan DNA ke vektor (plasmid/ bakteriophage/hibrid); Transformasi ke sel inang E.coli; Analisis DNA rekombinan;

9-10

11 - 15

Konsep Teknologi DNA Rekombinan dan Aplikasinya pada Transfer genetik Tanaman

Kuliah & Diskusi + Kerja kelompok; Presentasi (Collaborative Learning) dan Project Based Learning untuk Praktikum.

ix

Karakterisasi fungsional gen yang diklon; Penampakan ekspresi gen dan evaluasi stabilitas genetik Pemindahan DNA ke tanaman; Metode transfer gen dengan Agrobakterium, Biolistik, PEG dan Elektroporasi; Metode seleksi sel/tanaman transforman dan rekombinasi Pro dan Kontra Tanaman transgenik dan GMO.

16

Uji Kompetensi dan Remedial

Review dan Diskusi + Presentasi (Problem Solving Learnig)

Menjelaskan jawaban atas pemecahan kasus-kasus atau pertanyaan yang muncul selama pembelajaran Bioteknologi Tanaman.

MODUL I

DEFINISI, KLASIFIKASI, RUANG LINGKUP, SEJARAH, DAN APLIKASI BIOTEKNOLOGI

BAB I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Bioteknologi telah memainkan peranan penting dalam peningkatan produksi tanaman dalam beberapa dasawarsa terakhir. Paradigma pengembangan pertanian saat ini terus berkembang ke arah penerapan bioteknologi modern yang memungkinkan manipulasi genetik pada tanaman dapat dilakukan secara sangat terarah. Dengan demikian dapat dihasilkan tanaman dengan sifat unggul spesifik secara lebih cepat.

B. Ruang Lingkup Isi Modul ini membahas mengenai definisi, klasifikasi, ruang lingkup, sejarah, aplikasi bioteknologi khususnya dalam bidang pertanian, serta kelebihan dan kekurangan bioteknologi modern.

C. Kaitan Modul Modul ini merupakan modul pertama yang memberikan pengantar bagi mahasiswa sebelum mempelajari aspek-aspek bioteknologi lebih lanjut.

D. Sasaran Pembelajaran Modul Mahasiswa diharapkan mampu menjelaskan mengenai, definisi, klasifikasi, ruang lingkup, sejarah, aplikasi, serta keuntungan dan kelemahan bioteknologi modern.

xi

BAB II. PEMBAHASAN

A. Definisi Bioteknologi secara sempit didefinisikan sebagai penerapan prinsip-prinsip dasar biologi, biokimia, serta rekayasa untuk mengubah dan mendapatkan nilai tambah dari suatu organisme atau bagian dari organisme melalui pemanfaatan agensia biologis. Sedangkan dalam arti luas bioteknologi dapat didefinisikan sebagai teknologi untuk mendayagunakan organisme hidup atau bagian dari organisme untuk menghasilkan atau memodifikasi produk-produk tertentu, serta untuk perbaikan dan pemuliaan mikroorganisme, tanaman, atau hewan.

B. Klasifikasi, dan ruang lingkup Bioteknologi. Bioteknologi dapat diklasifikasikan menjadi bioteknologi konvensional dan bioteknologi modern. Bioteknologi modern ditandai dengan penggunaan teknik biologi molekuler sehingga rekayasa yang dilakukan dapat jauh lebih terarah sehingga hasil yang diperoleh dapat lebih atau sepenuhnya dikendalikan. Dalam biologi konvensional, agensia biologis yang digunakan masih apa adanya sehingga hasil yang diperoleh belum sepenuhnya dapat dikemdalikan. Bioteknologi sebagai ilmu multidisiplin dalam kajian dan penerapannya memiliki ruang lingkup yang luas. Banyak bidang ilmu yang terkait, di antaranya adalah : 1. Biologi (Mikrobiologi dan Biologi Sel Molekuler) 2. Biokimia (Kimia) 3. Genetika (Genetika Molekuler) 4. Rekayasa Genetik 5. Rekayasa Bioproses 6. Teknologi Enzim 7. Teknologi Pangan dan Fermentasi 8. Teknik Komputerisasi ( Teknik Bioinformatika)

xii

C. Sejarah Perkembangan Bioteknologi Bioteknologi secara umum telah dikenal sejak ribuan tahun yang lalu. Penggunaan mikrobia untuk fermentasi dalam pembuatan minuman beralkohol misalnya telah dilakukan sejak 30 abad sebelum masehi. Namun Sejarah Bioteknologi modern dimulai ketika ditemukan kembali kemampuan bakteri Streptococcus pneumoniae yang telah kehilangan virulensinya yaitu dengan mencampurkannya dengan bakteri yang virulen, Avery dkk (1944) telah membuktikan bahwa pada tingkat organogenesis yang paling rendah pun terjadi transaksi genetik (Brown 1991). Selanjutnya diketahui konstruksi plasmid, penyisipan gen antar organisme yang menghasilkan DNA rekombinan. adanya bakteri tanah Agrobacterium tumafaciens yang dapat mentransfer gen secara alami dan akhirnya didapat mekanisme transfer gen antar tanaman maka muncullah tanaman transgenik (Maniatis dkk, 1982) Tanaman transgenik, yaitu tanaman yang sudah disusupi oleh DNA asing sebagai pembawa sifat yang diinginkan.

D. Aplikasi Penerapan Bioteknologi dalam Bidang Pertanian Bioteknologi telah diterapkan secara luas dalam bidang pertanian, antara lain yaitu: a. Pupuk Hayati (biofertiliser) yaitu suatu bahan yang berasal dari jasad hidup, khususnya mikrobia yang digunakan untuk meningkatkan kuantitas dan kualitas produksi tanaman. b. Kultur in vitro, yaitu pembiakan tanaman dengan menggunakan bagian tanaman yang ditumbuhkan pada media bernutrisi dalam kondisi aseptik. Kultur in vitro memungkinkan perbanyakan tanaman secara massal dalam waktu yang singkat. c. Teknologi DNA Rekombinaan, pengembangan tanaman transgenik, misalnya galur tanaman transgenik yang membawa gen cry dari Bacillus thuringiensis untuk pengendalian hama.

xiii

Kelebihan dan kekurangan bioteknologi modern Kelebihan dan kekurangn Bioteknologi modern antara lain: perbaikan sifat genetik dapat dilakukan secara sangat terarah dapat mengatasi kendala ketidaksesuaian genetik dapat memeperpendek jangka waktu pengembangan galur tanaman baru relatif mahal dan memerlukan kecanggihan teknologi pengaruh jangka panjang belum diketahui

E. Latihan dan Tugas Untuk memantapkan pemahaman anda mengenai definisi, sejarah, , klasifikasi, ruang lingkup, aplikasi, dan kelebihan maupun kekurangan Bioteknologi maka anda perlu mengerjakan tugas di bawah ini: 1. Buatlah definisi mengenai Bioteknologi dengan menggunakan kata-kata anda sendiri! 2. Jelaskan dengan contoh bagaimana kemajuan berbagai disiplin ilmu lain dapat menunjang kemajuan di bidang Bioteknologi! 3. Jelaskan keuntungan dan kelemahan penerapan Bioteknologi Modern! 4. Susunlah poster tentang proses pembuatan pupuk atau pestisida alami serta mekanisme reaksinya.

F. Indikator Penilaian Kemampuan menyelesaikan latihan, ketepatan konsep dengan contoh, kejelasan uraian,kemutakhiran tugas pustaka, ketuntasan gagasan pada poster dari model yang dipilih, kreativitas, kerja sama tim pada presentasi.

BAB III. PENUTUP Rangkuman Bioteknologi didefinisikan sebagai penerapan prinsip-prinsip dasar biologi, biokimia, serta rekayasa untuk mengubah dan mendapatkan nilai tambah dari suatu organisme atau bagian dari organisme melalui pemanfaatan agensia biologis.

xiv

Bioteknologi diklasifikasikan menjadi bioteknologi konvensional dan bioteknologi modern. Bioteknologi konvensional telag dimulai berabad-abad yang lalu, namun bioteknologi modern sendiri ditandai dengan penemuan Avery (1944) yang menemukan terjadinya transaksi genetic pada tingkat oeganogenesis yang paling rendah. Contoh aplikasi bioteknologi pertanian yaitu penggunaan biofertiliser, kultur in vitro, dan tanaman transgenik.

DAFTAR PUSTAKA 1. George, E.F. dan P.D. Sherrington, 1984. Plant Propagation by Tissue Culture. Handbook and Directory of Commercial Laboratories. Einstein Press, UK 2. Hari Hartiko, 1995. DNA Rekombinan. PAU Bioteknologi, Universitas Gadjah Mada. Yogayakarta 3. Mantell, S.H., J.A. Mattheus dan R.A. McKee, 1985. Principles of Plant Biotechnology. Blackwell Scientific Publication. Oxford, London 4. Nasir, 2001. Bioteknologi Pertanian. PT. Grafindo Jakarta. 5. Prentio, S., 1984. Biotechnology, A New Revolution. Gurge Brazller Inc. New York. 6. Soemartono, Nasrullah dan Hari Hartiko, 1992. Genetika Kuantitatif dan Bioteknologi. Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. 7. Wattimena, G.A1992. Bioteknologi Tanaman. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan, Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi. PAU Bioteknologi, IPB. Bogor 8. Yusuf, M., 1998. Genetika Molekular. Program Studi Bioteknologi, IPB. Bogor 9. Yuwono TriWibowo, 2006. Bioteknologi Pertanian. Seri Pertanian. Gadjah Mada University Press.

xv

MODUL II
STRUKTUR DAN KOMPONEN BIOMOLEKULER

BAB I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Bioteknologi modern ditandai dengan manipulasi atau rekayasa jasad hidup pada aras molekuler. Inti sel dengan DNA yang dikandungnya menjadi objek rekayasa yang substansial. Pemahaman mengenai sel sebagai unit terkecil penyusun makhluk hidup yang masih dapat berdiri sendiri serta komponen-komponennya merupakan dasar penting bagi bioteknologi.

B. Ruang Lingkup Isi Modul ini membahas mengenai pengertian dan komponen penyusun sel, struktur DNA dan RNA, perbedaan antara DNA prokariotik dengan eukariotik serta
definisi DNA supercoil, topoisomerase, nukleosom, histon, eukromatin dan heterokromatin, serta pengenalan secara garis besar DNA Virus dan RNA Virus.

C. Kaitan Modul Modul ini merupakan modul pertama yang memberikan pemahaman bagi mahasiswa mengenai sel, dan komponen penyusunnya, serta DNA dan RNA organisme prokariotik dan eukariotik .

D. Sasaran Pembelajaran Modul Mahasiswa diharapkan mampu menjelaskan mengenai pengertian dan komponen penyusun sel, struktur DNA dan RNA, mengetahui perbedaan antara DNA
prokariotik dengan eukariotik serta definisi DNA supercoil, topoisomerase, nukleosom, histon, eukromatin dan heterokromatin, serta mengenal secara garis besar DNA Virus dan RNA Virus.

xvi

BAB II. PEMBAHASAN

A. SEL Pengertian Sel Sel merupakan bahan dasar penyusun utama makhluk hidup. Sel membentuk rangka atau struktur tubuh makhluk hidup, mengambil nutrisi dari makanan kemudian mengkonversi nutrisi tersebut menjadi energi dan melaksanak spesifikasi fungsi. Sel juga mengandung materi informasi genetik serta dapat menggandakan diri. Yang membedakan antara sel prokariotik dengan sel eukariotik adalah pada sel prokaritotik tidak memiliki membran nukleus dan sistem endomembran (organelorganel bermembran). Sel terdiri atas beberapa bagian, beberapa bagian ini disebut organel yang mempunyai fungsi tertentu di dalam sel.

gambar 1. Sel tumbuhan

Fungsi berbagai komponen struktur sel 1. Dinding sel Dinding sel pada sel muda terbuat dari zat pektin sedang pada sel dewasa terbentuk dari bahan selulosa. Dinding sel pada tumbuhan berfungsi untuk memberi bentuk pada sel tumbuhan.

xvii

2.

Membran Plasma Membran plasma mengelilingi bagian luar sel dan terdiri atas karbohidrat, lipid dan protein. Membran plasma bekerja sebagai sawar yang membatasi pertukaran molekul antara bagian dalam sel dengan dunia luar, mengatur transportasi antar sel, melindungi isi sel dan penerima rangsangan. Membran plasma bersifat selektif permeable.

3.

Sitoplasma Sitoplasma mencakup segala sesuatu yang ada di sebelah dalam dari membran plasma kecuali inti sel atau nukleus. Sitoplasma mengandung berbagai garam, enzim dan aneka macam substrat untuk berbagai reaksi seluler.

4.

Mitokhondria Mitokhondria memiliki membran ganda. Berfungsi sebagai tempat proses respirasi sel, oksidasi zat makanan dan penghasil energi.

5.

Retikulum Endoplasma Retikulum endoplasma merupakan penghubung sistem membran (membran plasma dan membran inti). Retikulum Endoplasma berfungsi dalam transportasi di dalam sel, penetralan racun, dan tempat sintesis lemak.

6.

Badan Golgi Badan golgi yang pada sel tumbuhan dikenal sebagai diktiosom merupakan komponen terbesar dalam sel. Berfungsi sebagai organel sekretori, membentuk lisosom, dan membentuk dinding sel tumbuhan.

7.

Ribosom Ribosom terdapat bebas di sitoplasma dan sebagaian melekat pada Retikulum Endoplasma. Tidak bermembran dan tersusun atas protein dan RNA. Berfungsi sebagai tempat sintesis protein.

8.

Lisosom Lisosom mengandung enzim hidrolitik untuk pencernaan intrasel. Berfungsi endositosis, eksositosis, autofagi dan autolisis.

xviii

9.

Sitoskeleton Berfungsi untuk memberikan kekuatan mekanik pada sel dan membantu gerakan substansi dari satu bagian sel ke bagian yang lain.

10.

Badan mikro Badan mikro yang pada tumbuhan berupa glioksisom mengandung enzim pengubah lemak menjadi gula.

11.

Plastida Plastida terdiri atas komponen tidak berwarna (amiloplas, proteoplas dan elaioplas) dan komponen berarna (kloroplas dan kromoplas). Kloroplas tersusun atas sistem berikut : Tilakoid (lamela) : kantung-kantung pipih berisi klorofil Grana : Merupakan tumpukan tilakoid (tempat reaksi terang fotosintesis) Stroma : Mengandung enzim yang penting untuk reaksi gelap fotosintesis.

12.

Vakuola Vakuola bermembran tungal yang disbut tonoplas. Berfungsi sebagai tempat cadangan makanan, pigmen, penyimpanan metabolit sekunder, sisa metabolisme dan pencernaan.

13.

Inti (Nukleus) Nukleus merupakan organel terbesar. Didalam initi terdapat DNA, RNA dan Protein namun hanya DNA dan RNA saja yang disintesis disana. DNA dan RNA inilah yang membentuk bahan-bahan genetik di dalam sel.

B. SUSUNAN STRUKTUR DNA DNA merupakan polimer lurus dari nukleotida yang terdapat dalam inti selsel eukariotik, dalam mitokhondria dan dalam kloroplas tumbuh-tumbuhan. Perbedaan di antara ketiganya adalah: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas

xix

berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua.DNA juga merupakan bahan genetik dari sel-sel prokariotik dan banyak virus. Dengan beberapa pengecualian, seluruh sel dari individu yang sama mempunyai jumlah serta penataan nukleotida yang sama dalam DNA tiap sel. Sel-sel kelamin mempunyai jumlah DNA separuh dari sel-sel somatik. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. (Human Genome Project 2005: 1) Struktur Primer DNA Struktur primer dari DNA ialah polimer linier yang tersusun atas urutan nukleotida. Adapun nukleotida itu sendiri tersusun atas : Gula berkarbon lima (Pentosa) Basa organik heterosiklik (Purin dan Pirimidin) yang mengandung nitrogen dan berbentuk datar. Basa nitrogen pada tiap-tiap nukleotida berikatan dengan gula melalui ikatan glikosiklik Gugus fosfat bermuatan negatif yang membuat polimer bersifat asam. Gugus fosfat ini juga akan berikatan kovalen dengan gula.] Dalam DNA, 2 deoksinukleotida terikat satu sama lain melalui ikatan fosfodiester, dimana gugus 0H-3 dari suatu nukleotida berikatan secara kovalen ke gugus fosfat-5.

xx

Gambar 2. Rumus bangun dari sepotong untaian DNA

Struktur Sekunder DNA Bentuk B DNA mempunyai struktur sekunder yang memanjang. Bila susunan basanya diperiksa, konsentrasi adenin akan selalu sama dengan konsentrasi timin ; sedangkan konsentrasi guanin akan selalu sama dengan konsentrasi sitosin. Jadi jumlah keseluruhan Purin (A+G) sama dengan jumlah keseluruhan Pirimidin (C+T), ratio Purin : Pirimidin = 1. Dengan menggunakan keterangan tentang kandungan dasar ini, disertai data hasil penelitian dengan menggunakan difraksi sinar-X, Watson and Crick mengajukan suatu model struktur sekunder DNA yang dilukiskan sebagai berikut ;

Gambar 3. DNA dalam bentuk B Watson-Crick

xxi

Struktur tersebut dinamakan bentuk B dari DNA. Dalam bentuk ini, dua untaian lurus DNA saling membelit bersama-sama, membentuk suatu heliks berganda berputar ke kanan. Kedua untaian DNA tadi berjalan dalam arah yang berlawanan. Struktur seperti ini disebut sebagai anti paralel. Ada perulangan jarak sebesar 34 dengan 10 pasang basa untuk tiap putaran heliks. Ikatan hidrogen merupakan salah satu kekuatan utama yang mempertahankan bentuk Heliks DNA. Residu adenin membentuk dua ikatan hidrogen dengan timin. Guanin membentuk tiga ikatan hidrogen dengan sitosin. Bentuk B dari DNA juga mempunyai dua alur, yaitu alur besar dan kecil. Protein-protein yang berhubungan dengan fungsi DNA yang khas , misalnya replikasi atau reparasi, dapat berada dalam alur-alur ini. Bentuk A Bentuk B adalah bentuk utama dari DNA di dalam sel. Bentuk A terjadi bila bentuk B mengalami dehidrasi. Bentuk ini lebih padat, tiap putaran terdiri atas 11 residu basa. Pada bentuk A ini, basa berada dalam kedudukan 13o sampai 19o dari possisi tegak lurus. Selain itu alur yang terbentuk pun berubah, Alur kecil menjadi sangat dangkal, sedangkan alur besar menjadi sangat dalam. Perubahan ini mengakibatkan interaksi khas antara protein dengan DNA menjadi tidak mungkin. Bentuk Z Bentuk DNA yang secara nisbi masih baru ialah bentuk Z (dari zigzag). Bentuk Z merupakan heliks berputar ke kiri. Dan tiap putaran terdiri atas 12 residu basa. Pada mulanya bentuk ini ditemukan pada suatu polimer sintetik yang tersusun dari perulangan residu G dan C. Kemudian ternyata bahwa bentuk Z juga ditemukan pada sejumlah spesies. Bentuk Z ini dimantapkan oleh metilasi basa-basa yang ada di daalm DNA tersebut, suatu peristia yang terjadi pada gen inaktif.

xxii

Gambar 4. Bentuk A dan Z dari suatu DNA

Denaturasi Berbagai Keadaan yang menyebabkan denaturasi Struktur Primer tidaklah berubah pada denaturasi. Struktur sekunder dari DNA akan mantap bila ikatan hidrogen tidak tergangu. Bila ikatan ikatan ini terganggu maka kedua untaian DNA akan terpisah. Adapun keadaan yang dapat menyebabkan terjadinya hal terebut adalah Kenaikan suhu, pH yang berbeda dari pH alamiah, dan adanya senyawa-senyawa yang dapat memutuskan ikatan hidrogen antar untaian tadi, atau yang dapat menyisipkan dirinya diantara basa. Struktur DNA akan mantap pada rentangan pH 4-10, diluar dari itu dapat terjadi protonisasi atau ionisasi atom-atom nitrogen atau atom oksigen yang membentuk ikatan hidrogen sehingga menyebabkan denaturasi. Selain itu senyawa-senyawa semisal urea dan formida dapat pula mengganggu ikatan hidrogen sedangkan senyawa dengan cincin aromatik yang datar dan besar,semisal senyawa etidium bromida dan berbagai zat warna golongan akridin, dapat menyisipkan dirinya antara dua basa DNA sehingga menimbulkan denaturasi.

xxiii

Perubahan sifat-sifat fisik dari denaturasi Bila terjadi denaturasi, maka banyak sifat fisik dari molekul tadi yang berubah. Antara lain ialah serapan cahaya pada panjang gelombang 260 nm, viskositas atau kekentalan, densitas pengapungan (buoyant density) dan afinitas terhadap hidroksilapit. Nukleotida terutama purin, menyerap cahaya pada panjang gelombang 260 nm dengan kuat. Bila DNA mengalami denaturasi, penyerapan cahaya pada panjang gelombang 260 nm akan meningkat. Peningkatan ini disebut hiperkromitas. Viskositas DNA akan berkurang bila mengalami denaturasi. Densitas pengapungan dari DNA ditentukan oleh jumlah residu guanin yg dikandungnya, semakin tinggi guanin yang dikandungnya maka semakin tinggi pula densitas pengapungannya. Renaturasi Proses renaturasi atau reannealing pada DNA merupakan suatu proses yang berlangsung lambat. Proses renaturasi ini menyangkut proses penataan kembali basabasa nitrogen untuk membentuk Heliks ganda kembali. Penataan ini hanya dapat terjadi melalui cara tumbukan molekul yang berlangsung secara sembarang dari untaian-untaian tunggal DNA. Bila sesudah tumbukan tadi berbagai basa berada dalam penataan yang tepat seperti yang seharusnya, maka renaturasi terjadi karena heliks berganda terbentuk dengan segera. Makin pekat suatu larutan DNA, makin besar peluang dari untaian-untaian tunggal itu untuk berbenturan sesama mereka dan makin besar pula peluang mereka untuk saling menempatkan diri dngan tepat. Makin tinggi tingkat kompleksitas dari suatu DNA, artinya makin besar jumlah urutan nukleotida yang dikandungnya, makin lama waktu yang diperlukan untuk memberi kesempatan kepada dua untaian yang bersesuaian mengambil penataan yang tepat.

xxiv

C.

PERBEDAAN ANTARA KROMOSOM PROARIOTIK DAN EUKARIOTIK

Kromosom Prokariotik Kromosom prokariotik, atau nukleoid, adalah suatu bentuk B dari DNA yang merupakan molekul dengan lingkaran tertutup (sirkular). Hampir semua spesies bakteri mempunyai kromosom berbentuk sirkular. Bentuk sirkular memberikan perlindungan bagi DNA dari aksi-aksi enzim endonuklease (yang memotong ujungujung DNA). Struktur tersier dari DNA prokariotik akan terbentuk apabila DNA terpuntir sebelum lingkaran itu tertutup. Gelung tambahan yang terbentuk dinamakan supercoiling.

Gambar 5. Proses terbentuknya struktur supercoil

Supercoil adalah bentuk penggulungan DNA. Bentuk supercoil ditemukan pada tahun 1963 oleh Jerome Vinegrad dengan mengisolasi virus Polyoma. Dimana Bentuk supercoil merupakan isomer topologi dari bentuk relaks. Enzim yang berperan dalam pembentukannya adalah enzim topoisomerase yang bekerja mengatur perubahan topologi DNA dengan cara meningkatkan atau menurunkan jumlah pilinan pada heliks ganda. Enzim ini, dengan bantuan energi yang diperoleh dari hidrolisis ATP akan memecah ikatan fosfodiester yang membentuk tulang punggung kedua DNA, menyisipkan suatu gelungan, dan kembali menyegel tulang punggung tadi. Perbedaan bentuk molekul ini dapat dengan jelas terlihat dengan menggunakan teknik elektroforesis. Kromosom Eukariotik DNA inti sel eukariotik mempunyai struktur kromosom yang lebih rumit lagi. Semua kromosom inti eukariot berbentuk linier. Bila dilihat dengan mikroskop elektron, kromosom inti sel eukariotik yang diekastraksi dengan larutan garam

xxv

menyerupai butiran-butiran yang terikat pada suatu benang. Butiran-butiran tadi disebut nukleosom, mengandung suatu segmen DNA yang panjangnya kira-kira 140 basepair dan dua dari tiap empat molekul protein kecil yang bersifat basa, yang dinamai histon. Keempat histon yang ada pada nukleosom ialah H2A, H2B, H3 dan H4 mengandung 100-135 asam amino, kaya akan lisin dan arginin. Karena rantai DNA sangat panjang maka nanti akan mengalami pengepakan dengan bantuan protein histon. Sebenarnya letak DNA diantara kromosom adalah sebagai berikut : kromosom menipis menjadi benang kromatin yang terdiri dari rangkaian nukleosom.satu nukleosom terdiri dari 8 protein histon. Kromosom eukariot yang linier akan melindungi dirinya dengan berasosiasi dengan protein histon. Gen-gen yang aktif mempunyai struktur nukleosom yang berbeda dan lebih mudah dihancurkan oleh enzim-enzim nuclease. DNA seperti ini disebut eukromatin. DNA yang tidak aktif lebih padat dan tidak mudah diolah oleh enzimenzim nuclease, dan dinamakan heterokromatin.

D. SUSUNAN STRUKTUR RNA Sifat-sifat Fisik dan Kimia RNA RNA dan DNA mempunyai struktur primer yang mirip. Keduanya terdiri atas suatu rantai lurus dari nukleotida purin dan pirimidin yang terikat satu sama lain dengan ikatan fosfodiester dari posisi 3 ke posisi 5. Pada keduanya ditemukan adenin, guanin dan sitosin. Dalam RNA, urasil menggantikan timin. Gula yang terdapat pada RNA adalah Ribosa. Molekul RNA berupa single-stranded. RNA adalah suatu salinan dari suatu penggal tertentu saja dari sebuah untaian DNA. Karena itu tidak mempunyai untaian komplementer dalam sel dan tidak membentuk struktur heliks berganda yang panjang. Struktur sekundernya kerapkali berupa coil atau dalam hal eukariot, ditentukan oleh interaksinya dengan protein. Karena tidak berada dalam bentuk heliks berganda, RNA tidaklah memperlihatkan hiperkromitas yang banyak dalam keadaan terdenaturasi. Juga tidak memperlihatkan suatu titik lebur yang jelas ataupun perubahan viskositas yang

xxvi

mencolok serta perubahan densitas pengapungan dalam keadaan terdenaturasi. Oleh karena RNA hanyalah suatu salinan belaka dari seuntai DNA, maka jumlah A dari suatu RNA tidaklah sama dengan U, begitu pula jumlah G tidaklah sama dengan C.

Gambar 6. Rumus bangun dari sepotong untaian RNA

Tiga tipe RNA Utama Dalam Sel Genetika molekular klasik mengajarkan adanya tiga tipe RNA yang terlibat dalam proses sintesis protein: 1. RNA-kurir (messenger-RNA, mRNA), 2. RNA-ribosom(ribosomal-RNA, rRNA), 3. RNA-transfer (transfer-RNA, tRNA). Pada akhir abad ke-20 dan awal abad ke-21 diketahui bahwa RNA hadir dalam berbagai macam bentuk dan terlibat dalam proses pascatranslasi. Dalam pengaturan ekspresi genetik orang sekarang mengenal RNA-mikro (miRNA) yang terlibat dalam "peredaman gen" atau gene silencing dan small-interfering RNA (siRNA) yang terlibat dalam proses pertahanan terhadap serangan virus. Messenger RNA mRNA adalah RNA yang paling beragam diantara berbagai RNA utama. mRNA merupakan RNA terpanjang. Selain, itu mRNA mempunyai konsentrasi yang paling rendah dan yang paling tidak stabil. Biasanya mRNA mengandung 5% dari

xxvii

seluruh RNA yang terdapat di dalam sitoplasma sel eukariotik. Pada prokariot, suatu mRNA tunggal dapat mengandung informasi untuk beberapa protein yang berbeda. mRNA serupa itu disebut sebagai pesan polisistronik. Pada eukariot, tiap mRNA matang menyandikan satu, dan hanya satu itu saja polipeptida dan karena itu pula dikatakan bersifat monosistronik. Ribosomal-RNA Sel mengandung rRNA lebih dari yang lain. rRNA adalah bentuk RNA yang paling mantap. Ia membentuk kompleks dengan protein dan disebut ribosom. rRNA berupa pita tunggal, tidak bercabang dan fleksibel. rRNA berfungsi sebagai mesin perakit dalam sintesis protein. Transfer-RNA Kira-kira 15% RNA sitoplasma dari suatu sel eukariotik adalah tRNA. tRNA merupaka RNA terkecil, hanya mengandung 75-100 nukleotida. Paling sedikit ada 20 macam tRNA yang berbeda di dalam semua sel, yang masing-masing berpautan dengan satu asam amino yang secara alamiah ditemukan di dalam molekul protein. Mekipun beraneka ragam, semua tRNA ini mempunyai ciri umum yang sama yaitu mempunyai daerah yang menjadi akseptor asam amino. Daerah-daerah yang bervariasi perlu untuk mengikat berbagai macam asam amino yang berbeda. Selain itu juga untuk mengenali kodon yang tepat pada mRNA.

E. DNA dan RNA VIRUS Berlawanan dengan sel-sel eukariotik normal, virus hanya mengandung asam nukleat dan sejumlah kecil enzim essential, yang dikelilingi oleh suatu mantel yang terutama tersusun dari protein. Bahan genetik dari virus dapat berupa DNA dan RNA, dalam bentuk untaian tunggal atau ganda, melingkar ataupun lurus. Masing-maing bentuk ini memerlukan suatu cara penggandaan dan penyalinan sedikit berbeda. Meskipun begitu, untuk penerjemahan dan pengubahan protein yang telah dibentuk menjadi bentuk lain yang berfungsi, virus sama sekali tergantung kepada enzim yang tersedia dalam sel yang diinfeksinya.

xxviii

Pengenalan mengenai DNA dan RNA virus dianggap penting karena mekanisme yang digunakan bakteri untuk melindungi dirinya dari infeksi virus ini telah memberikan suatu alat yang perlu untuk kita membuat DNA rekombinan. Lagipula,
virus seringkali digunakan sebagai pengemban dalam memproduksi DNA rekombinan. Virus DNA Untai Ganda

Virus yang paling banyak dipelajari ialah virus yang menginfeksi bakteri. Virus virus ini disebut bakteriofaga. Seri T dari bakteriofaga mengandung kira-kira 150 gen dalam bentuk DNA untai ganda sebagai bahan genetik mereka. Bakteriofag bersifat lisis, artinya ia memecah sel tuan rumah. Sesudah memasukkan DNA mereka sendiri, bakteriofag T mengambil alih seluruh mekanisme seluler dari tuan rumah. Virus DNA untai lain yang juga telah banyak dipelajari ialah bakteriofag lambda (). Virus ini sesudah menginfeksi suatu sel, mungkin menimbulkan salah satu dari dua keadaan. Yang pertama ialah terjadinya lisis, yang kedua ialah terjadinya tanggap lisogenik. Di antara virus (virus DNA dua untai) yang penting, beberapa di antaranya mampu mengubah sel menjadi ganas. Termasuk dalam kelompok virus ini adalah virus Polyoma yang merupakan virus yang sangat kecil yang hanya mengandung empat sampai enam virus. Virus DNA Untai Tunggal Yang paling banyak dipelajari ialah suatu bakteriofag lain, yaitu bakteriofag x 174. Ini adalah suatu virus dengan DNA sirkular dan hanya mengandung 5375 nukleotida. Keseluruhan urutan DNA virus ini sudah diketahui. Virus RNA Untai Tunggal Termasuk ke dalam virus dengan RNA sebagai bahan genetik ialah bakteriofag (Q, MS2, dan R17). Juga virus tumbuh-tumbuhan (seperti virus mosaik tembakau dan virus yang menyebabkan tanaman tembakau tumbuh kerdil dan menyemak). Retrovirus adalah suatu jenis khusus dari virus RNA untai tunggal. Tidak seperti halnya virus RNA untai tunggal yang lain, retrovirus tidaklah membentuk RNA untai ganda sesudah menginfeksi sel akan tetapi membentuk suatu enzim pada virus ini, yaitu reverse transcriptase atau polimerase DNA yang diarahkan oleh RNA.

xxix

Virus RNA Untai Ganda Reovirus adalah salah satu contoh dari virus yang mengandung RNA untai ganda sebagai bahan genetik. Dengan menggunakan enzim virus itu sendiri, reovirus dapat menghasilkan mRNA dari suatu Virus RNA Untai Ganda acuan RNA.
Kemudian sengan bantuan enzim tuan rumah, dibuatlah protein virus. Salah satunya ialah replikase yang diperlukan untuk sintesis lebih banyak lagi RNA virus yang dapat menginfeksi sel.

F. Tugas dan Latihan

Untuk memantapkan pemahaman anda mengenai materi dalam modul ini maka anda perlu mengerjakan tugas di bawah ini 1. Jelaskan secara singkat pengertian sel dan komponen penyusun sel! 2. Jelaskan mengenai struktur DNA dan RNA! 3. Jelaskan mengenai DNA dan RNA virus! 4. Susunlah sebuah poster yang menjelaskan keanekaragaman molekul dalam sel melalui proses pengenalanbiomolekuler serta struktur, sifat kimia dan peran DNA/RNA sebagai bahan genetik pada organisme Eukariotik dan Prokariotik.

G. Indikator Penilaian Kemampuan menyelesaikan latihan, ketepatan konsep dengan contoh, kejelasan uraian,kemutakhiran tugas pustaka, ketuntasan gagasan pada poster berdasarkan topik yang dipilih, kreativitas, kerja sama tim pada presentasi.

BAB III. PENUTUP Rangkuman Sel merupakan bahan dasar penyusun utama makhluk hidup. Sel juga mengandung materi informasi genetik serta dapat menggandakan diri. Yang membedakan antara sel prokariotik dengan sel eukariotik adalah pada sel prokaritotik

xxx

tidak memiliki membran nukleus dan sistem endomembran (organel-organel bermembran). Sel tersusun atas dinding sel, membran plasma, sitoplasma, serta organel-organel sel yang memiliki fungsi masing-masing. Struktur primer dari DNA terdiri atas, Gula berkarbon lima (Pentosa), Basa organik heterosiklik (Purin dan Pirimidin), dan Gugus fosfat bermuatan negatif yang terikat dalam ikatan fosfodiester. RNA dan DNA mempunyai struktur primer yang mirip. Keduanya terdiri atas suatu rantai lurus dari nukleotida purin dan pirimidin yang terikat satu sama lain dengan ikatan fosfodiester dari posisi 3 ke posisi 5. Pada keduanya ditemukan adenin, guanin dan sitosin. Dalam RNA, urasil menggantikan timin. Gula yang terdapat pada RNA adalah Ribosa. Molekul RNA berupa singlestranded. Berlawanan dengan sel-sel eukariotik normal, virus hanya mengandung asam nukleat dan sejumlah kecil enzim essential, yang dikelilingi oleh suatu mantel yang terutama tersusun dari protein. Bahan genetik dari virus dapat berupa DNA dan RNA, dalam bentuk untaian tunggal atau ganda, melingkar ataupun lurus. Pengenalan mengenai DNA dan RNA virus penting karena mekanisme yang digunakan bakteri untuk melindungi dirinya dari infeksi virus ini telah memberikan suatu alat yang perlu untuk membuat DNA rekombinan, di samping itu virus seringkali digunakan sebagai pengemban dalam memproduksi DNA rekombinan.

xxxi

DAFTAR PUSTAKA 1. http: //id.Wikipedia.org/DNA/ 2. Molecular biology of the cell, 4th edition, The Benyamin/Cummings Publishing Co.inc) 3. PPT Bahan Ajar Gene Expression Protein Synthesis). www. Brawijaya.Ac.id 4. PPT Bahan Ajar Dna Sebagai Bahan Genetik, UGM. http//ghr.nlm.nih.gov/ 5. Schumm E. Dorothy.1992. Essential ofBiochemistry. Department of Physiologica Chemistry. F.A.Davis company. Ohio

xxxii

MODUL III EKSPRESI GENETIK BAB I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang DNA mengandung informasi genetik yang tetap dari suatu sel, maka perlu sekali ia memperbanyak diri dengan ketelitian dan ketetapan yang tinggi, dibagi rata antara sel-sel yang timbul pada saat pembelahan, dan dengan tepat diperbaiki manakala ada kerusakan. Karena proses ini sangat penting untuk kelangsungan hidup organisme, maka iapun berlangsung dengan pengendalian yang sangat ketat. Bahan genetik (Inggris: genetic material) adalah material atau substansi yang menyimpan informasi genetik dari suatu organisme hidup. Bahan ini diwariskan secara generatif dari satu individu ke individu lain. Dalam transmisi ini, bahan genetik harus kekal (tidak berubah). Informasi yang dibawa bahan genetik tidak bermakna apa pun apabila tidak diekspresikan menjadi fenotipe. Fenotipe adalah suatu karakteristik (baik struktural, biokimiawi, fisiologis, dan perilaku) yang dapatdiamati dari suatu organisme yang diatur oleh genotipe dan lingkungan serta interaksi keduanya. B. Ruang Lingkup Isi Modul ini membahas mengenai pengertian ekspresi gen, model replikasi DNA, tiga proses dasar yang tercakup dalam central dogma pada ekspresi genetik yaitu replikasi transkripsi dan translasi, serta regulasi gen pada organisme prokaryotik dan eukaryotik.

C. Kaitan Modul Modul ini adalah modul ketiga setelah mahasiswa memahami modul-modul sebelumnya yang meliputi pengenalan bioteknlogi, dan struktur serta komponen biomolekuler sel.

xxxiii

D. Sasaran Pembelajaran Modul Mahasiswa diharapkan mampu menjelaskan konstitusi genetik tanaman melalui pemahaman terhadap dogma genetik, kode genetik dan ekspresi genetik.

BAB II. PEMBAHASAN

A. Pengertian Eskpresi Genetik Ekspresi genetik merupakan proses penerjemahan informasi genetik (dalam bentuk urutan basa) menjadi protein, dan lebih jauh lagi: karakter. Proses ekspresi genetik mengikuti tahapan yang sama untuk semua bentuk kehidupan, dan disebut dogma inti (central dogma) dalam genetika. Ada tiga proses dasar yang tercakup dalam dogma inti yaitu replikasi DNA, Transkripsi DNA menjadi RNA, dan Translasi RNA menjadi protein atau polipeptida. Proses ekspresi gen merupakan aspek fundamental dalam setiap organisme hidup. Proses ini diduga dikontrol oleh suatu mekanisme yang ada pada aliran informasi genetik. Pada awalnya para ilmuwan menduga bahwa protein merupakan satu-satunya molekul yang berperan dalam meregulasi ekspresi gen pada manusia dan organisme kompleks lainnya (eukariot), seperti halnya pada organisme tingkat rendah atau mikroorganisme (prokariot).

Gambar 1. Proses penerjemahan informasi genetik menjadi asam amino

xxxiv

F. MODEL REPLIKASI DNA Model Konservatif Sebelum mekanisme replikasi DNA dapat dibuktikan secara eksperimental oleh Matthew Messelson dan Franklin Stahl pada tahun 1958, ada tiga hipotesis yang berkembang mengenai mekanisme replikasi DNA. Salah satunya adalah model replikasi secara konservatif. Menurut model konservatif, molekul DNA untai ganda induk akan tetap bergabung sedangkan kedua untaian DNA anakan terdiri atas molekul hasil sintesis baru. Dengan kata lain, molekul awal tetap terpelihara dan molekul baru semua disusun dari bahan baru. Model Dispersif Pada model replikasi DNA secara dispersif dinyatakan bahwa molekul DNA induk akan mengalami fragmentasi sehingga DNA anakan akan terdiri atas campuran molekul lama (berasal dari DNA induk dan molekul hasil sintesis baru. Model Semi konservatif Pada model replikasi DNA secara semi konservatif, Watson dan Crick dalam hipotesisnya mengemukakan bahwa setiap molekul untai ganda DNA anakan terdiri atas satu untai tunggal DNA induk dan satu untai tunggal lainnya merupakan untai tunggal DNA hasil sintesis baru. Dengan kata lain, bahwa dalam pembentukan DNA baru, yang disintesis tidak kedua utas tetapi hanya satu, sedang utas yang lainnya berasal dari molekul DNA terdahulu. Replikasi DNA mengikuti pola semi konservatif terbukti secara empiris pada tahun 1958 oleh eksperimen yang dilakukan oleh Matthew Messelson dan Franklin Stahl dengan menggunakan bakteri Escherichia coli untuk mengetahui mekanisme replikasi DNA. Hasil Eksperimen tersebut membuktikan bahwa replikasi DNA mengikuti pola semi konservatif. Meskipun demikian, bukti-bukti baru menunjukkan adanya penyimpangan dari teori replikasi semacam ini. Diketahui bahwamekanisme replikasi DNA pada virus tertentu, misalnya virus x 174, yang genomnya berupa DNA untai tunggal, melibatkan tahapan proses repliasi DNA dengan mekanisme yang berbeda yaitu model konservatif.

xxxv

Gambar 2. Tiga Hipotesis mengenai replikasi DNA

G. TIGA PROSES DASAR DALAM CENTRAL DOGMA PADA EKSPRESI GENETIK Materi genetik, DNA selalu dalam keadaan aktif. Aktivitas ini berhubungan dengan ekspresi gen dan juga aktivitas tambahan seperti replikasi, perbaikan dan rekombinasi. Ekspresi gen berkaitan dengan proses transkripsi dan translasi untuk mensintesis protein. Sedangkan proses replikasi, perbaikan dan rekombinasi berkaitan dengan perbanyakan terarah terhadap DNA yang ada pada makhluk hidup. Proses penyimpanan dan pemindahan informasi genetik dinyatakan dalam dalil disebut dogma sentral oleh Francis Crick dan George Gamov pada tahun 1957. Prinsip dogma sentral adalah DNA menjadi penentu jenis RNA, kemudian jenis RNA menentukan macam protein yang disintesis.

xxxvi

Dogma ini berlaku universal dan menyatakan bahwa sekali informasi telah diteruskan menjadi protein, maka tidak dapat dikembalikan lagi menjadi bentuk asalnya. Aliran informasi dari asam nukleat ke asam nukleat memang memungkinkan, tetapi aliran informasi dari protein ke asam nukleat atau protein ke protein tidak memungkinkan. Dimana tahap-tahap yang terjadi pada ekspresi genetik dan faktor-faktor yang terlibat dapat digambarkan seperti berikut;

Gambar 3. Proses aliran informasi genetik menjadi protein beserta tahap-tahap dan faktor-faktor yang terlibat

Replikasi DNA Salah satu tahapan penting dalam proses pertumbuhan jasad hidup adalah proses perbanyakan bahan genetik. Proses perbanyakan bahan genetik dikenal sebagai proses replikasi. Pada replikasi DNA, rantai DNA baru dibentuk berdasarkan urutan nukleotida pada DNA yang digandakan. Replikasi merupakan proses pelipatgandaan DNA. Replikasi DNA adalah proses penggandaan molekul DNA untai ganda. Pada sel, replikasi DNA terjadi sebelum pembelahan sel. Prokariota terus-menerus melakukan replikasi DNA. Pada eukariota, waktu terjadinya replikasi DNA sangatlah diatur, yaitu pada fase S daur sel, sebelum mitosis atau meiosis I. Penggandaan tersebut memanfaatkan enzim DNA polimerase yang membantu pembentukan ikatan antara nukleotida-nukleotida penyusun polimer DNA. Proses replikasi DNA dapat pula dilakukan in vitro dalam proses yang disebut reaksi berantai polimerase (PCR).

xxxvii

Tahapan-tahapan dalam proses replikasi Inisiasi, DNA dalam sel-sel eukaryotik memiliki ARCs (autonomously replicating sequence) yang berperan sebagai asal muasal replikasi dan mereka saling berlawanan dari asal bakterial (ori). ARCs terdiri atas 11 pasangan landasan rentetan tambah dua atau tiga rentetan nucleotida pendek tambahan dengan 100 hingga 200 pasangan landasan sepanjang area DNA. Grup utama dari enam protein, secara kolektif dikenal dikenal sebagai ORC (Origin Recognition Complex), mengikat asal muasal replikasi, menandai replikasi DNA dengan tepat pada saat waktu yang sesuai melalui siklus sel.Pengenalan situs awal replikasi, oleh suatu protein komponen polymerase DnaA yang dihasilkan oleg gen dnaA. Terbentuknya Garpu replikasi. Garpu replikasi atau cabang replikasi (replication fork) ialah struktur yang terbentuk ketika DNA bereplikasi. Garpu replikasi ini dibentuk akibat enzim helikase yang memutus ikatan-ikatan hidrogen yang menyatukan kedua untaian DNA, membuat terbukanya untaian ganda tersebut menjadi dua cabang yang masing-masing terdiri dari sebuah untaian tunggal DNA. Masing-masing cabang tersebut menjadi "cetakan" untuk pembentukan dua untaian DNA baru berdasarkan urutan nukleotida komplementernya. DNA polimerase membentuk untaian DNA baru dengan memperpanjang oligonukleotida (RNA) yang dibentuk oleh enzim primase dan disebut primer. Pemanjangan Untaian DNA. DNA polimerase membentuk untaian DNA baru dengan menambahkan nukleotidadalam hal ini, deoksiribonukleotidake ujung 3'-hidroksil bebas nukleotida rantai DNA yang sedang tumbuh. Dengan kata lain, rantai DNA baru (DNA "anak") disintesis dari arah 5'3', sedangkan DNA polimerase bergerak pada DNA "induk" dengan arah 3'5'. Namun demikian, salah satu untaian DNA induk pada garpu replikasi berorientasi

xxxviii

3'5', sementara untaian lainnya berorientasi 5'3', dan helikase bergerak membuka untaian rangkap DNA dengan arah 5'3'. Oleh karena itu, replikasi harus berlangsung pada kedua arah berlawanan tersebut Pembentukan Leading strand. Pada replikasi DNA, untaian pengawal (leading strand) ialah untaian DNA yang disintesis dengan arah 5'3' secara berkesinambungan. Pada untaian ini, DNA polimerase mampu membentuk DNA menggunakan ujung 3'-OH bebas dari sebuah primer RNA dan sintesis DNA berlangsung secara berkesinambungan, searah dengan arah pergerakan garpu replikasi. Pembentukan Lagging strand. Lagging strand ialah untaian DNA yang terletak pada sisi yang berseberangan dengan leading strand pada garpu replikasi. Untaian ini disintesis dalam segmen-segmen yang disebut fragmen Okazaki. Panjang fragmen okazaki mencapai sekitar 2.000 nukleotides panjang dalam sel-sel bakterial dan sekitar 200 panjang nukelotides dalam sel-sel eukaryotic. Pada untaian ini, primase membentuk primer RNA. DNA polimerase dengan demikian dapat menggunakan gugus OH 3' bebas pada primer RNA tersebut untuk mensintesis DNA dengan arah 5'3'. Fragmen primer RNA tersebut lalu disingkirkan (misalnya dengan RNase H dan DNA Polimerase I) dan deoksiribonukleotida baru ditambahkan untuk mengisi celah yang tadinya ditempati oleh RNA. DNA ligase lalu menyambungkan fragmenfragmen Okazaki tersebut sehingga sintesis lagging strand menjadi lengkap. DNA polymerases tidak mampu mengisi ikatan covalent yang hilang. Celah yang tersisa direkat oleh DNA ligase. Enzim ini mengkatalis pembentukan ikatan phosphodiester antara 3 OH dari salah satu helaian dari 5-P dari halaian yang lain.DNA ligase diaktifkan oleh AMP (adenosine monophosphate) sebagai cofactor (faktor pengendali). Dalam E.coli, AMP dibawa dari nucleotide NAD+. Dalam sel-sel eukaryotik, AMP ditandai dari ATP. Ligaseligase tidak dilibatkan dalam pemanjangan rantai; melainkan, mereka berperan pemasang enzim-enzim untuk perekatan celah melalui molekul DNA.

xxxix

Modifikasi Post-Replikasi DNA, Setelah DNA direplikasikan, dua helaian tersintesis terbaru dipasangkan ke modifikasi enzimatik. Perubahan-perubahan ini biasanya melibatkan penambahan molekul-molekul tertentu untuk mekhususkan titik-titk sepanjang helix ganda. Pada cara ini, tags sel, atau labellabel, DNA, sehingga ini bisa membedakan material genetiknya sendiri dari berbagai DNA asing yang mungkin bisa masuk ke dalam sel. Modifikasi postreplikasi DNA mungkin juga mempengaruhi cara molekul diikat.DNA merupakan faktor utama modifikasi dengan penambahan kelompok methyl ke beberapa adenine dan residu-residu cytosine. Grup methyl ditambahkan oleh DNA methylasess setelah nucleotides telah digabungkan dengan DNA polymerases. Penambahan methyl ke cytosine membentuk 5-methylcytosine dan methylasi dari adenine membentuk 6-methyladine. Methyladine lebih umum daripada methylcytosine dalam sel-sel bakterial, di mana dalam sel-sel eukaryotik, grup methyl paling banyak ditambahkan ke cytosine. Methylase muncul hanya pada beberapa rentetan nucleotide khusus. Dalam sel-sel eukaryotik, sebagai contoh, methylasi secara umum muncul pada saat cytosine berdampingan ke guanine di sisi 3-OH (5 P-CG-3OH).Pola methylasi bersifat spesifik untuk spesies yang diberikan, berperan seperti tanda tangan untuk DNA spesies tersebut. Hal ini patut diperhatikan karena grup methy melindungi DNA melawan perlawanan enzim-emzim tertentu disebut restriction endonucleases Oleh karena itu DNA asing melalui sebuah sel dicerna dengan restriction endonucleases. Dalam sel tertentu, restriction endonucleases bisa memotong DNA di titik khusus tertentu di mana DNA methylase menambah sebuah grup methyl. Pola methylasi melindungi DNA dari cernaan oleh sel yang memiliki endonucleases tapi tidak melawan pembatasan enzim-enzim yang diproduksi sel-sel spesies yang lain. Pembatasan ini menyederhanakan pertukaran DNA antar sel dari spesies yang diproduksi sel-sel spesies yang berbeda. Methylasi DNA pada titik-titik tertentu mungkin akan berakhir pada konversi terdekat dari B-DNA ke bentuk-bentuk Z-DNA. Dalam bentuk B-DNA, grup-grup hydropholic methyl dari alur utama, menghasilkan pengaturan yang tepat..

xl

Dengan mengubahnya ke bentuk Z, grup-grup methyl membentuk area hydropholik yang membantu menstabilkan DNA. Konversi lokal ini (dari BDNA ke Z-DNA) mungkin mempengaruhi fungsi beberapa gen. Secara singkat, replikasi DNA dapat digambarkan sebagai berikut :

Gambar 4. Proses replikasi DNA Penjelasan gambar : Mula-mula, heliks ganda DNA (merah) dibuka menjadi dua untai tunggal oleh enzim helikase (9) dengan bantuan topoisomerase (11) yang mengurangi tegangan untai DNA. Untaian DNA tunggal dilekati oleh protein-protein pengikat untaian tunggal (10) untuk mencegahnya membentuk heliks ganda kembali. Primase (6) membentuk oligonukleotida RNA yang disebut primer (5) dan molekul DNA polimerase (3 & 8) melekat pada seuntai tunggal DNA dan bergerak sepanjang untai tersebut memperpanjang primer, membentuk untaian tunggal DNA baru yang disebut leading strand (2) dan lagging strand (1). DNA polimerase yang membentuk lagging strand harus mensintesis segmen-segmen polinukleotida diskontinu (disebut fragmen Okazaki (7)). Enzim DNA ligase (4) kemudian menyambungkan potongan-potongan lagging strand tersebut. Proses replikasi DNA ini merupakan proses yang rumit namun teliti. Proses sintesis rantai DNA baru memiliki suatu mekanisme yang mencegah terjadinya kesalahan pemasukan monomer yang dapat berakibat fatal. Karena mekanisme inilah kemungkinan terjadinya kesalahan sintesis amatlah kecil.

xli

Komponen-komponen Penting dalam Replikasi 1. 2. 3. DNA cetakan, yaitu molekul DNA yang akan direplikasi Molekul nukleotida ; dATP, dTTP, dCPT, Dgtp Enzim DNA Polimerase, enzim utama yang mengkatalis proses polimemerisasi nukleotida menjadi untaian DNA. Lima tipe DNA polymerases antara lain , , , , dan , yang diidentifikasi dalam sel-sel eukaryotic. , , dan pada DNA polymerases berfungsi dalam replikasi DNA melalui nucleus. DNA polymerases berfungsi dalam replikasi mitochondrial DNA, dan bentuk muncul dilibatkan dalam pemasangan DNA. DNA polymerases I, II dan III, merupakan DNA polymerase pada Prokaryotik. 4. Enzim primase, enzim yang mengkatalisis sintesis primer untuk memulai replikasi DNA. 5. Enzim Helikase, enzim pembuka ikatanuntaian DNA induk. Enzim lain yang juga berperan dalam proses tersebut adalah enzim girase. 6. Protein SSB (Single Strand Binding protein). Molekul yang menstabilkan molekul DNA yang terbuka. 7. Enzim DNA ligase, suatu enzim yang berfungsi untuk menyambung fragmen-fragmen DNA. Transkripsi DNA Menjadi RNA Proses trankripsi pada dasarnya adalah sintesis suatu molekul RNA. Molekul RNA adalah suatu polimer yang terbentuk dari berbagai gugus ribonukleotid. RNA polimerase adalah suatu enzim yang bertugas mengenali tempat tertentu pada rantai DNA yang menentukan mulainya transkripsi. Transkripsi adalah proses penyimpanan informasi dalam DNA digunakan untuk menandai sintesis RNA. Transkripsi sama dalam beberapa cara ke replikasi DNA tapi ada beberapa perbedaan utama antara

xlii

sintesis RNA dan DNA. RNA yang disintesiskan adalah helaian-helaian tunggal. Selanjutnya, untuk area yang diberikan, hanya satu helaian dari DNA ditandai untuk sintesis RNA yang dikenal sebagai sense strand. Area-area yang berbeda dari masing-masing helaian dari DNA, bagaimanapun, bisa berperan sebagai sense strands. Istilah ini diaplikasikan hanya ke area tertentu dari DNA yang sedang ditranskripsikan. Dalam transkripsi, sense strand DNA mencapai pemindahan informasi penting untuk ekspresi kejadian dari informasi genetik.

gambar 5. Skema transkripsi DNA dimana transkripsi DNA berakhir dalam produksi tiga kelas dari RNA: rRNA, tRNA, dan mRNA

Proses transkripsi terdiri atas inisiasi, pemanjangan dan terminasi. Untuk memulai transkripsi, RNA polimerase harus bisa membedakan suatu gen dari pasangan basa lainnya. Bagian DNA yang menjadi tempat melekatnya RNA polimerase adalah promotor. Setelah transkripsi dimulai, RNA polimerase bergerak sepanjang molekul DNA untuk membuka DNA utas ganda sambil menempelkan ribonukleotida pada ujung molekul RNA yang sedang tumbuh. Dalam semua sel makhluk hidup, makromolekul RNA berperan sebagai mediator informasi antara DNA di mana informasi genetik disimpan dan protein-protein yang secara langsung

xliii

mengekspresi informasi. Lalu RNA dilibatkan sebagai pembawa informasi genetik bersama sel. Transkripsi DNA berakhir dalam produksi tiga kelas dari RNA:rRNA, tRNA, dan mRNA. Proses transkripsi dilakukan oleh enzim RNA polimerase. Pada organisme prokaryot, hanya ada satu macam RNA polimerase yang melakukan transkripsi gen rRNA, gen yang mengkode protein, dan gen yang mengkode tRNA. Pada organisme eukaryot , ada 3 macam RNA polimerase yaitu RNA polimerase I (menyalin gen yang mengkode rRNA), RNA polymerase II (menyalin semua gen pengkode protein), RNA polymerase III (menyalin gen yang mengkode tRNA dan rRNA berukuran 5S). Urutan DNA yang akan ditranskripsi adalah gen yang akan diekspresikan. Gen yang lengkap terdiri atas tiga bagian utama, yaitu; (1) daerah pengendali (regulatory region) yang secara umum disebut promoter, (2) bagian structural, (3) terminator. Promoter adalah bagian yang berperanan dalam mengendalikan proses transkripsi dan terletak pada ujung 5. Bagian structural adalah bagian gen yang terletak sebelah hilir (downstream) dari promoter. Bagian inilah yang mengandung urutan DNA spesifik (kode-kode genetic) yang akan ditranskripsi. Terminator adalah bagian gen yang terletak di sebelah hilir dari bagian structural yang berperan dalam pengakhiran (terminasi) proses transkripsi. Adapun tahapan tahapan dari transkripsi (sintesis RNA) adalah sebagai berikut : Inisiasi Transkripsi, DNA mengandung rentetan khusus nucleotide, dikenal sebagai pomoter regions, yang berperan sebagai penanda untuk inisiasi transkripsi. Area pendukung DNA adalah lokasi di mana RNA polymerase mengikat untuk transkripsi. Keaktifan promoter region mengkhususkan [1] lokasi inisiasi transkripsi, dan [2] di mana dari dua helaian DNA bakteria berfungsi sebagai sense strand untuk transkripsi di area tersebut. Pembentukan open promoter kompleks, Pada tahap ini RNA polymerase II akan mengenali daerah regulator element dari gen yang akan ditranskripsi. Kemudian RNA polymerase ini akan menempel (binding) di daerah promoter

xliv

spesifik dari gene yang akan disintesis proteinnya, daerah promoter ini merupakan daerah consesus sequences, pada urutan -10 dan -35 dari titik inisiasi (+1) yang mengandung urutan TATA-Box sebagai basal promoter. Setelah itu, polimerase ini akan membuka titik inisiasi (kodon ATG) dari gene tersebut dan mengkopi semua informasi secara utuh baik daerah exon maupun intron, dalam bentuk molekul immature mRNA (messenger RNA). Kemudian immature mRNA ini diolah pada proses splicing dengan menggunakan smallnuclearRNA (snRNA) complex yang akan memotong hanya daerah intron, dan semua exon akan disambungkan menjadi satu urutan gen utuh tanpa non-coding area dan disebut sebagai mature mRNA. Pemanjangan selama proses transkripsi, Ketiga kawasan penting promoters yang berdampak pada bagaimana berfungsi dan efisiensi dari transkripsi adalah kawasan konsensus -35, rententan konsensus Pribnow -10, dan lokasi inisiasi. Rentetan konsesus -35 merupakan lokasi pengenalan inisial antara RNA polymerase dan DNA, dan rentetan konsensus Pribnow -10 merupakan pusat dari kawasan DNA yang tidak diikat. Inisiasi transkripsi mungkin juga mempengaruhi inisiasi dan betapa cepatnya RNA polymerase meninggalkan lokasi promoter. Semua fitur-fitur ini memiliki sebuah pengaruh kepada tingkat efisiensi RNA polymerase untuk transkripsi. Penambahan dari rentetan nucleotide pada tiga kawasan penting juga dipengaruhi oleh kemampuan memisahkan helaian-helaian DNA. Pemisahan helaian secara langsung dipengaruhi oleh komposisi nucleotide (kawasan ATrich lebih mudah dipisahkan daripada kawasan GC-rich) dan dengan tingkatan supercoiling dari helix ganda. Tingkat kecepatan polymerisasi RNA selama transkripsi mungkin tidak akan berjalan lancar, penambahan berkelanjutan atas ribonucleotides. Di dalam operons yang mengandung sebuah area attenuator, terdapat lokasi khusus sepanjang DNA yang menyebabkan RNA polymerase berhenti atau diam sejenak sampai kondisi-kondisi tertentu dipertemukan. Jika kondisi terpenuhi,

xlv

RNA polymerase bisa memproses dengan pemanjangan. Jika kondisi tidak terpenuhi, RNA polymerase menghentikan transkripsi. Terminasi, Setelah terjadi proses pemanjangan untaian RNA hasil sintesis, selanjutnya diikuti dengan pengakhiran (terminasi) transkripsi yang ditandai dengan pelepasan RNA polymerase dari sense strand DNA yang ditranskripsi. Ada beberapa lokasi terminasi khusus yang berperan sebagai sebuah sinyal untuk menghentikan transkripsi.

gambar 6 . Grafik tahapan transkripsi

Tranlasi RNA menjadi protein atau polipeptida Translasi adalah proses penerjemahan kode-kode genetic (kodon) yang ada pada molekul mRNA urutan-urutan asam amino. Hanya molekul mRNA yang ditranslasi, sedangkan rRNA dan tRNA tidak ditranslasi. Pembacaan dari sebuah molekul mRNA mulai dari sebuah titik permulaan yang tepat. Codon pertama yang dibaca adalah AUG, yang memberi tanda asam amino methionine. Dalam sel-sel bakterial, codon AUG memberi tanda methionine (Met) ketika muncul di mana pun dalam molekul mRNA. Pada beberapa bakteria, codon AUG bertindak sebagai inisiator codon yang mengkhususkan f-Met untuk memulai rantai polypeptide, meskipun ketika GUC muncul pada posis internal dalam molekul mRNA, memberi kode untuk valine. Baik itu Met atau f-Met merupakan bagian pertama dari asam amino dalam semua rantai peptide ketika mereka disintesiskan secara inisial, terminal

xlvi

asam amino bisa dimodifikasi secara enzimatis kemudian. Deformylase bisa memindahkan grup formyl dari formylmethionine, dan methionine amino peptidase bisa memindahkan methionine dari amino terminus dari peptide. Olehkarena itu, tidak semua polypeptides dalam mikroorganisme memiliki f-Met pada ujung terminal amino mereka. Bagian pangkal codon menentukan reading frame (rentetan tiga-nucleotide) untuk bagian selebihnya dari molekul mRNA , sebab, landasan-landasan nucleotide dibaca tiga pada satu waktu sepanjang rentai berkelanjutan dari nucleotides, mengubah posisi kerangka membaca dengan memasukan atau menghapus landasan nucleotide tunggal dalam sebuah gen bisa mempengaruhi secara dramatis rentetan asam amino dari protein yang bisa diproduksinya. Karena terjemahan bisa dimulai secara teoritis dengan berbagai nucleotide melalui triplet codons, terdapat tiga kerangka membaca potensial dalam berbagai kawasan di DNA. Sebuah protein diterjemahkan dengan kerangka yang mulai dengan codon inisiasi AUG, memperluas melalui satu seri codon-codon yang mengkhususkan asam amino, dan berakhir ketika terminasi codon dicapai. Sebuah kerangka membaca yang mengandung codon-codon yang secara eksklusif mengkode asam amino disebut open reading frame (ORF). Kerangka membaca yang terkunci tidak bisa dibaca menjadi protein karena kehadiran terminasi codon-codon. Deteksi dari sebuah ORF, yang bisa dilakukan dengan menguji rentetan nucleotide diterjemahkan menjadi sebuah protein. Melacak database dari rentetan nucleotide yang telah ditunjuk untuk memberi kode protein-protein yang dikenali bisa membantu mengidentifikasi fungsi dari kerangka membaca terbuka. Homologies tinggi ditemukan sepanjang spesies-spesies untuk rentetan nucleotides yang telah melibatkan dan mengode protein-protein dengan fungsi-fungsi identik. Beberapa protein dibutuhkan sebagai faktor-faktor inisiasi untuk memulai proses terjemahan. Dalam sel-sel bakterial, tiga faktor inisiasi, IF1, IF2 dan IF3 dibutuhkan. Sedikit informasi yang diketahui mengenai faktor-faktor inisiasi eukaryotik 4D (eIF4D). Dalam sel-sel eukaryotik, paling tidak sembilan faktor-faktor inisiasi eukaryotik (eIF1 ke eIF6) dibutuhkan untuk memulai sintesis protein.

xlvii

Translasi berlansung di dalam ribosom. Pada organisme prokaryot, translasi sudah dimulai sebelum transkripsi (sintesis mRNA) selesai dilakukan. Dengan demikian proses transkripsi dan translasi pada prokaryot berlangsung secara hampir serentak. Sebaliknya pada eukaryot, proses translasi baru dapat berlangsung jika proses transkripsi (sintesis mRNA yang matang) sudah selesai dilakukan. Dalam proses translasi diperlukan molekul tRNA yang berfungsi membawa asam amino spesifik. Terdapat 1 sampai 6 t-RNA untuk masing-masing asam amino dari 20 asam amino yang dikenal pembentuk protein. Ribosom mengkatalisis pembentukan ikatan peptida di antara dua asam amino yangberdekatan.Terdapat sekitar 20 macam tRNA yang masing-masing membawa asam amino spesifik, karena di alam terdapat 20 asam amino yang menyusun protein alami.

Gambar 7. Struktur molekul 20 asam amino Sintesis protein terdiri atas 3 tahap, inisiasi, elongasi, dan terminasi. Pada tahap inisiasi, dibentuklah kompleks inisiasi untuk kemudian memulai sintesis dan berikatan dengan start kodon pada mRNA . Suatu bagian dari rantai mRNA yang menjadi tempat mulainya translasi adalah Ribosome Binding Sites (RBS) atau sekuen Shine Dalgarno. Proses translasi dimulai dari menempelnya ribosom pada RBS. Setelah subunit 30S dari ribosom menempel pada RBS. Subunit itu bergerak

xlviii

sepanjang mRNA hingga mencapai kodon awal (kodon AUG). Selama elongasi asam amino membentuk ikatan kovalen secara berurutan mengikuti gerakan ribosom sepanjang mRNA. Terminasi sintesis potein terjadi jika ribosom sampai kepada kodon nonsens (UAA, UGA, UAG). Peptida selanjutnya terlepas dari ikatan tRNA dan ribosom berdisosiasi menjadi sub unitnya. Translasi adalah penerjemahan kodon pada mRNA menjadi suatu polipetida. Kode genetika adalah triplet, karena masing-masing kode terbentuk dari tiga nukleotida yang disebut kodon. Kodon terdiri dari tiga dari empat kemungkinan nukleotida (A, U, C dan G). Ini berarti akan terdapat 43 = 64 kodon. Keenam puluh empat kodon ini dikenal oleh t RNA kecuali tiga yang disebut kodon nonsens.

Gambar 8. Kode genetic Marshall Nirenberg dan Gobin Khorana berjasa dalam hal menemukan kode genetika ini. Dan kode genetika ini berlalu universal untuk semua organisme dari bakteri sampai manusia.

xlix

Ciri-ciri kode genetic adalah sebagai berikut ; 1) Kode genetic adalah triplet. Setiap kodon mRNA yang mengkode asam amino dalam rantai polipeptida mengandung tiga nukleotida. 2) Kode genetic adalah kode yang bebas koma, mRNA dibaca terus, tiga nukleotida (satu kodon) pada satu waktu, tanpa melompati nukleotida yang lain. 3) Kode genetic tidak tumpang tindih. mRNA dibaca dalam kelompok berurutan tiga nukleotida (triplet). Artinya tiada satu basa tunggal pun yang dapat mengambil bagian dalam pembentukan lebih dari satu kodon. 4) Kode genetic bersifat degenerasi pengecualian (AUG, metionin dan UGG, triptofan), lebih dari satu kodon mengkode untuk beberapa asam amino. 5) Kode genetic mempunyai signal mulai dan signal berhenti. Signal mulai dan signal berhenti untuk sintesis protein berada dalam kode genetic ini. 6) Kode genetic dapat mempunyai dua arti, yaitu kodon yang sama dapat memperinci lebih dari satu asam amino. Ex: Kodon UUU kode untuk phenylalanin tetapi bila ada streptomisin dapat pula merupakan kode untuk isoleusin, leusin atau serin. Perubahan Pasca Penerjemahan (Mutasi) Telah diketahui betapa penambahan sebuah basa saja sudah cukup untuk mengacaukan pembacaan pesan genetic. Penambahan dua basa ataupun penghapusan satu atau dua basa mempunyai akibat yang sama. Perubahan seperti itu dinamakan mutasi pergeseran bingkai (frameshift mutation). Hanya penambahan atau penghapusan pergandaan dari tiga basa yang menyebabkan pembacaan bingkai secara nisbi tidak berubah. Perubahan satu basa saja mungkin tidak menimbulkan perubahan pada protein yang dihasilkan, mungkin terjadi protein yang aktif sebagian saja atau bahkan protein yang tidak aktif sama sekali, atau bahkan tidak terbentuk protein sama sekali.

Penggantian satu poromidin dengan pirimidin yang lain (misalnya C dengan T) atau satu purin dengan yang lain (G dengan A) disebut mutasi transisional. Penggantian suatu purin dengan suatu pirimidin atau sebaliknya disebut mutasi transversional. Karena terjadi degenerasi sandi, hasilnya mungkin tidak ada perubahan dalam molekul protein yang terbentuk (mutasi diam). Mutasi jenis ini hanya dapat dilacak dengan menyelidiki urutan basa mRNA atau gen. Suatu missense mutation mengganti suatu asam amino dengan asam amino yang lain. Bila asam amino pengganti mirip, mungkin terjadi suatu protein yang masih berfungsi. Bila asam amino pengganti berbeda sekali, protein yang dihasilkan mungkin tidak aktif sama sekali. Kemungkinan ketiga ialah tidak terbentuk protein sama sekali. Hal ini dapat terjadi misalnya bila mutasi mengganti kodon suatu asam amino dengan suatu kodon yang mengisyaratkan penghentian sintesis. Peristiwa ini disebut mutasi nonsens (nonsense mutation). Beberapa prokariot dan eukariot mengandung tRNA yang telah berubah yang dapat menyisipkan suatu asam amino pada suatu tempat yang telah menglami mutasi nonsense ataupun pada tempat yang biasanya mengandung kodon untuk menghentikan sintesis. Ini disebut mutasi supresor. Pada dasarnya, tRNA supresor ini salah dalam membaca sandi. Lagi pula untuk menekan suatu mutasi nonsense, beberapa tRNA membalikkan efek dari missense dan bahkan mutasi pergeseran bingkai. Yang terakhir ini terjadi bila suatu tRNA membaca empat basa, bukannya tiga basa, sebagai kodon.

li

H. REGULASI

GEN

PADA

ORGANISME

PROKARYOTIK

DAN

EUKARYOTIK Regulasi Gen Pada Organisme Prokaryot Pada umumnya, gen yang mengkode protein pada prokaryot berupa gen dengan kopi tunggal (single copy), sedangkan gen yang mengkode tRNA dan rRNA berupa gen dengan jumlah kopi banyak (multiple copies). Gen-gen pada prokaryot yang bertanggung jawab dalam jalur biokimia tertentu pada umumnya diorganisasikan dalam struktur operon . Suatu operon adalah organisasi beberapa gen struktural yang ekspresinya dikendalikan oleh satu promoter yang sama. Sebagai contoh adalah operon lac, yaitu operon yang mengendalikan kemampuan metabolisme laktosa pada bakteri Escherichia coli. Dimana terlibat di dalam suatu rangkaian reaksi metabolisme yang sama.misal laktosa, arabinosa dll, maka dalam operon membuat sel menjadi lebih efisien dalam proses ekspresi genetik. Sebaliknya pada sel eukaryot sistim organisasi operon tidak ada, karena setiap gen ( struktural ) diatur oleh satu promoter tersendiri. Dikenal adanya dua sistem pengaturan ekspresi gen yaitu pengaturan/ pengendaian positip yang berarti operon tersebut dapat diaktifkan oleh produk ekspresi gen regulator. dan pengaturan/pengendalian negatip maka operon dinonaktifkan oleh produk ekspresi gen regulator yang terdiri dua macam yaitu aktivator yang berperan dalam pengendalian secara positif dan represor yang berperan dalam pengendalian secaranegatip. Produk gen regulator ( Aktivator dan Represor ) bekerja dengan cara menempel pada sel pengikatan protein regulator pada daerah promoter gen yang diaturnya. Pengikatan aktivator pada promoter ditentukan oleh mlekul kecil ( asam amino, gula ). Molekul aktivator yang mengaktifkan ekspresi gen disebut induser, teteapi yang bersifat menekan ekspresi gen disebut represor.Pengaturan operon laktosa ( Lac )Sistem Operon lac adalah sistem pengendalia ekspresi gen yang bertanggung jawab di dalam metabolisme laktosa, yag ditemukan oleh Francois Jacob dan Jacques Monod 1950, pada bacteri Escherichia coli. Sistem ini dilakukan oleh

lii

protein represor yang dikode oleh genlaktose yaitu suatu protein yang tersusun atas empat polipeptida yang identik menempel pada daerah operator ( Lac O ), yang terletak disebelah hilir dari promoter, yang menyebabkan RNA polimerase tidak dapat melakukan transkripsi gen-gen struktural lac Z, lac Y dan lac A, sehingga operon lactosa mengalami represi, dan terjadi terus menerus selama tidak ada laktosa, sehingga energi seluler dapat dihemat. Induksi operon laktosa terjadi jika ada laktosa di dalam sel laktosa yang berada dalam medim pertubuhan sel diangkut ke dalam sel dengan meggunakan enzim permiase galaktosidase. Enzim tersebut mengangkut laktosa ke dalam sel,juga adanya enzim -galaktosidase di dalam sel yang terbatas jumlahnya, maka meskipun belum ada induksi sepeuhnya dapat mengubah laktosa menjadi allolaktosa ( mempunyai ikatan -1.6 Allolaktosa yang merupakan induser untuk mengaktifkan operon laktosa. Sedang laktosa adalah disakarida glukosagaktosa yang terikat melalui ikatan -1,4. Pada waktu ditranskripsi, operon lac akan menghasilkan satu mRNA yang membawa kode-kode genetik untuk tiga macam polipeptida yang berbeda (oleh karena itu disebut mRNA polisistronik).

Gambar 9. Ekspresi gen pada prokaryotic

Regulasi Gen Pada Organisme Eukaryotik Pada organisme eukaryot, satu gen struktural yang mengkode suatu protein akan dikendalikan ekspresinya oleh satu promotor yang spesifik sehingga mRNA

liii

yang dihasilkan berupa mRNA yang monosistronik. Molekul mRNA semacam ini hanya membawa rangkaian kode genetik untuk satu macam protein. Pada tahun 1941 George W. Beadle dan Edward L. Tatum mengemukakan konsep yang dikenal sebagai teori satu gen - satu enzim. Akan tetapi penelitian penelitian menunjukkan bahwa banyak protein atau enzim yang molekul lengkap semua polipeptidanya dapat dikode oleh lebih dari satu gen struktural. Sebagai contoh, molekul hemoglobin yang lengkap dikode oleh dua gen. Oleh karena itu sekarang dikenal teori satu gen- satu polipeptida. Perbedaan lain antara regulasi gen pada prokaryot dan eukaryot terletak pada organisasi bagian struktural gen-gen yang mengkode protein. Pada prokaryot, semua urutan nukleotida ditranskripsi menjadi mRNA. Selanjutnya, semua urutan nukleotida mRNA mulai urutan kodon awal (ATG) sampai kodon sebelum urutan kodon terminasi (TAA,TAG, atau TGA) ditranslasi menjadi urutan asam-asam amino. Sebaliknya, pada banyak gen eukaryot seringkali terdapat urutan-urutan nukleotida (kodon) yang tidak diketemukan terjemahannya dalam urutan asam amino. Pada organisme eukaryotik dikenal adanya bagian gen struktural yang disebut intron (intervening squences). Intron adalah bagian struktural yang pada awalnya ditranskripsi tetapi selanjutnya mengalami pemotongan sehingga transkrip mRNA yang sudah matang tidak lagi mengandung urutan tersebut. Oleh karena itu, bagian yang hilang dari mRNA tersebut tidak akan ditranslasi menjadi urutan asam amino. Sebaliknya, bagian gen struktural yang ditranskripsi menjadi mRNA disebut exon.

Gambar 10. Skema pemrosesan mRNA pada organisme Eukaryot.

liv

Dalam proses transkripsi gen eukaryotik, exon-exon akan ditranskripsi. Setelah terjadi pmotongan intron, selanjutnyaexon-exon disambung (disebut sebagai proses splicing) menjadi molekul mRNA yang matang. Molekul mRNA yang matang inilah (tidak mengandung intron lagi) yang selanjutnya akan ditranslasi menjadi urutan asam amino.

Gambar 11. Skema ekspresi genetic pada organisme Eukaryot.

D. Tugas dan Latihan Untuk memantapkan pemahaman anda mengenai topik ini maka anda diharapkan mengerjakan tugas dan latihan di bawah ini 1. Jelaskan mengenai dogma sentral 2. Jelaskan secara singkat urutan hingga suatu informasi genetik dapat diekspresikan! 3. Jelaskan secara singkat perbedaan regulasi gen organisme prokariot dan eukariot! 4. Plihlah salah satu topik di bawah ini kemudian susunlan portofolia berkaitan dengan topik tersebut! Konstitusi genetik tanaman melalui pemahaman terhadap dogma genetik, kode genetik & ekspresi genetik Dogma genetik dan kode genetik Ekspresi genetik Mutasi, mutagenesis, Rekombinasi, Transposisi

lv

Replikasi, Transkripsi dan Translasi DNA Somaklonal vs Gametoklonal Interaksi genetik tanaman dan lingkungan

F. Indikator Penilaian Kemampuan menyelesaikan latihan, ketepatan konsep dengan contoh, kejelasan uraian,kemutakhiran tugas pustaka, ketuntasan gagasan pada portofolio berdasarkan topik yang dipilih, kreativitas, kerja sama tim pada presentasi.

BAB III. PENUTUP Rangkuman Ekspresi genetik merupakan proses penerjemahan informasi genetik (dalam bentuk urutan basa) menjadi protein, dan lebih jauh lagi: karakter. Ada tiga proses dasar yang tercakup dalam dogma inti yaitu replikasi DNA, Transkripsi DNA menjadi RNA, dan Translasi RNA menjadi protein atau polipeptida. Proses ekspresi gen merupakan aspek fundamental dalam setiap organisme hidup. Proses perbanyakan bahan genetik dikenal sebagai proses replikasi. Pada replikasi DNA, rantai DNA baru dibentuk berdasarkan urutan nukleotida pada DNA yang digandakan. Proses trankripsi pada dasarnya adalah sintesis suatu molekul RNA, Transkripsi adalah proses penyimpanan informasi dalam DNA digunakan untuk menandai sintesis RNA. Translasi adalah proses penerjemahan kode-kode genetic (kodon) yang ada pada molekul mRNA urutan-urutan asam amino. Hanya molekul mRNA yang ditranslasi, sedangkan rRNA dan tRNA tidak ditranslasi. Pada umumnya, gen yang mengkode protein pada prokaryot berupa gen dengan kopi tunggal (single copy), sedangkan gen yang mengkode tRNA dan rRNA berupa gen dengan jumlah kopi banyak (multiple copies). Pada organisme eukaryot, satu gen struktural yang mengkode suatu protein akan dikendalikan ekspresinya oleh

lvi

satu promotor yang spesifik sehingga mRNA yang dihasilkan berupa mRNA yang monosistronik. Molekul mRNA semacam ini hanya membawa rangkaian kode genetik untuk satu macam protein.

DAFTAR PUSTAKA 1. http: //id.Wikipedia.org/DNA/ 2. Molecular biology of the cell, 4th edition, The Benyamin/Cummings Publishing Co.inc) 3. PPT Bahan Ajar Gene Expression Protein Synthesis). www. Brawijaya.Ac.id 4. PPT Bahan Ajar Dna Sebagai Bahan Genetik, UGM. http//ghr.nlm.nih.gov/ 5. Schumm E. Dorothy.1992. Essential ofBiochemistry. Department of Physiologica Chemistry. F.A.Davis company. Ohio

lvii

MODUL IV

Aplikasi Konsep Teknologi DNA Rekombinan pada Transfer genetik Tanaman


BAB I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang Bioteknologi telah memainkan peranan penting dalam peningkatan produksi tanaman dalam beberapa dasawarsa terakhir. Paradigma pengembangan pertanian saat ini terus berkembang ke arah penerapan bioteknologi modern yang memungkinkan manipulasi genetik pada tanaman dapat dilakukan secara sangat terarah. Salah satu teknik bioteknologi modern yang memungkinkan dilakukannya manipulasi genetik secara terarah yaitu teknologi DNA rekombinan. Pada prinsipnya teknologi DNA rekombinan merupakan suatu teknik untuk menggabungkan molekulmolekul DNA secara in vitro, teknik ini memungkinkan terjadinya penggabungan DNA antara organisme yang hubungan kekerabatannya sangat jauh. Pengembangan dan penerapan teknologi DNA rekombinan memiliki dampak yang sangat besar dalam bidang pertanian. Berbagai tanaman dengan sifat-sifat fisiologis yang lebih baik maupun resistensi yang lebih tinggi terhadap hama dan penyakit telah dihasilkan melalui pemanfaatan teknologi ini. Melihat besarnya implikasi teknik ini dan prospek pengembangannya di masa depan maka pengetahuan mengenai aplikasi konsep teknologi DNA rekombinan pada transfer genetik tanaman sangat penting dipahami.

B. Ruang Lingkup Isi Modul ini membahas mengenai metode transfer gen ke tanaman. Pengenalan teknik DNA rekombinan, identifikasi, isolasi, dan amplifikasi DNA dengan PCR, DNA vektor, dan berbagai

lviii

C. Kaitan Modul Modul ini merupakan modul keempat setelah mahasiswa memahami modulmodul sebelumnya yang meliputi struktur dan komponen biomolekuler sel, perubahan konstitusi genetik, replikasi DNA, dan ekspresi genetik.

D. Sasaran Pembelajaran Modul Setelah mempelajari modul ini, mahasiswa diharapkan dapat menjelaskan mengenai teknologi rekombinan dan berbagai dampak yang ditimbulkan. Mengetahui tahapan identifikasi, isolasi, dan amplifikasi DNA beserta metode yang digunakan.Mengetahui berbagai DNA vektor dan proses introduksi DNA asing ke dalam tanaman target. Mengetahui berbagai metode transfer gen ke tanaman.

BAB II. PEMBAHASAN

A. Pengenalan teknologi DNA rekombinan Teknologi DNA rekombinaan merupakan kumpulan teknik atau metode yang digunakan untuk menggabungkan molekul-molekul DNA secara in vitro. Teknologi DNA rekombinaan ini juga dikenal sebagai rekayasa genetik atau genetic engineering. Konsep mengenai teknologi DNA rekombinaan didasarkan pada mekanisme seksual yang terdapat pada bakteri. Mekanisme seksual pada bakteri ditemukan oleh Ledersberg dan Tatum pada tahun 1946. Mekanisme seksual pada bakteri tidak bersifat reproduktif atau menghasilkan anak. Mekanisme ini memungkinkan terjadinya pertukaran DNA atau gen dari satu sel ke sel lainnya, sehingga dapat terbentuk kombinasi gen-gen yang berasal dari dua sel yang berbeda. Tahapan dasar dalam melakukan rekombinasi DNA secara in vitro adalah sebagai berikut: 1. Isolasi molekul DNA

lix

2. Pemotongan DNA menggunakan enzim endonuklease restriksi 3. Penyambungan molekul-molekul DNA menggunakan enzim DNA ligase ke dalam suatu molekul DNA vektor. 4. Transformasi sel inang dengan DNA rekombinaan dalam sel inang 5. Analisis dan konfirmasi keberadaan DNA rekombinaan dalam sel inang 6. Karakterisasi fungsional gen yang diklon.

B. Isolasi DNA DNA merupakan material genetik yang terdapat dalam sel oleh karena itu langkah pertama dalam mengisolasi DNA yaitu memecahkan dinding sel. Dinding sel dapat dipecahkan dengan memberikan perlakuan baik fisik, kimia, ataupun gabungan dari keduanya. Perlakuan Fisik Sel dapat dipecahkan secara fisik dengan menggunakan alat sonikator(sonicator). Pada prinsipnya alat ini menghasilkan suara dengan frekuensi ultra tinggi sehingga dapat memecahkan dinding sel. Perlakuan Kimiawi Secara kimiawi pemecahan dinding sel dapat dilakukan dengan menggunakan enzim. Enzim yang dapat digunakan untuk pemecahan dinding sel yaitu enzim lisozim.

Enzim Restriksi Enzim endonuklease restriksi atau enzim restriksi merupakan enzim yang diproduksi oleh mikroba yang dapat memotong DNA utas ganda. Enzim ini pertama kali ditemukan oleh Werner Arber dan Hamilton Smith pada tahun 1960. Bakteri secara alami menghasilkan enzim restriksi untuk menghancurkan DNA fage yang menginfeksinya. Enzim restriksi mengenal dan memotong DNA pada sekuens spesifik yang panjangnya 4 sampai dengan 6 pasang basa. Enzim restriksi memotong pada bagian tertentu , bagian DNA yang dipotong oleh enzim ini disebut sebagai sekuens

lx

pengenal ( recognition site). Sekuens pengenal adalah urutan nukleotida (urutan basa) tertentu yang dikenali oleh enzim restriksi sebagai bagian yang akan dipotongnya. Sedangkan titik potong (restricion site) merupakan bagian dari nukleotida yang merupakan tempat pemotongan dilakukan. Nama enzim EcoRI HindIII HhaI TaqI BsuRI BalI Sekuens Pengenal GAATTC A AGCTT GCG C T CGA GG CC TGG CCA Organisme asal Escherichia coli Haemophilus influenzae Haemophilus haemolyticus Thermis aquaticus Bacillus subtilis Brevibacterium albidum

Tabel 1. enzim restriksi dengan sekuens pengenal dan organisme asalnya

Salah satu contoh enzim restriksi adalah enzim Ecori yang diisolasi pertama kali oleh Herbert Boyer pada tahun 1969 dari bakteri Escherichia coli. Enzim ini memotong DNA pada urutaan nukleotida 5 GAATTC-3. Pada sekuens ini Ecori hanya memotong pada bagian antara G dan A. Pada DNA utas ganda, sekuens GATTC ini berpasangan dengan sekuens yang sama tetapi berlawanan arah, sifat ini disebut sebagai palindromik. Enzim Ecori ini memotong setiap utas dari utas ganda tersebut pada bagian yang sama yaitu pada bagian antara G dan A. Akibatnya potongan-potongan atau fragmen DNA utas ganda yang dihasilkan akan memiliki ujung berutas tunggal. Ujung seperti ini dikenal sebagai ujung lekat, ujung runcing, atau ujung kohesive. Pemotongan oleh enzim restriksi juga dapat menghasilkan ujnug yuang tumpul (blunt end). Misalnya enzim PvuII, enzim ini mengenali dan memotong DNA pada urutan CAGCTG, dan memoptong pada titik antar G dan C. Ujung-ujung tumpul akan lebih sulit disambung dibandingkan dengan ujung runcing. Enzim restriksi yang diisolasi dari spesies bakteri yang berbeda namun mempunyai titik pengenalan dan pemotongan yang sama disebut isokisomer.

lxi

Enzim Ligase Enzim ligase merupakan enzim yang digunakan untuk menyambung potongan-potongan fragmen DNA. Enzim yang sering digunakan untuk menyambung DNA adalah enzim yang genomnya berasal dari genom virus (bakteriofag) T4 sehingga disebut T4 DNA ligase. Enzim ini mampu menyambung DNA yang ujungnya kohesif maupun runcing. Hal ini berbeda dari enzim ligase yang genomnya berasal dari genom bakteri Escheria coli. Enzim yang diperoleh dari bakteri Ecoli hanya mampu menyambung DNA ujung kohesif. Selain itu, T4 DNA ligase juga mampu menyambung molekul DNA dengan RNA sedangkan enzim dari Ecoli tidak dapat melakukan hal tersebut. Hal inilah yang menyebabkan enzim T4 DNA Ligase lebih sering digunakan untuk kloning DNA. Penyambungan ujung-ujung DNA yang kohesif lebih mudah dilakukan dibandingkan DNA berujung tumpul. Penyambungan DNA dilakukan dengan mencampur dua macam molekul DNA yang akan disambung dengan emzim DNA ligase. Campuran ini kemudian diinkubasikan pada suhu 12 C 15 C selama semalam. Untuk menyambung DNA yang mempunyai ujung-ujung yang tidak sama karena berasal dari hasil pemotongan oleh enzim restriksi yang berbeda dilakukan beberapa modifikasi,antara lain (a) penambanhan adaptor atau penyambung (linker), (b) pembentukan akar homopolimer pada ujung DNA, (c) pengisian ujung-ujung DNA kohesif, (d) penghilangan ujung DNA kohesif. Adaptor adalah suatu molekul oligonukleotida sintetik yang urutan oligonukleotidanya dirancang sedemikian rupa sehingga masing-masing ujung adaptor bersifat komplementer dengan masing-masing ujung DNA yang akan disambung. Linker adalah molekul oligonukleotida sintetik yang dapat mengalami penyambungan sendiri (self ligation). Linker dapat membentuk molekul untai ganda berujung tumpul tetapi mempunyai urutan nukleotida yang dikenali oleh enzim restriksi tertentu. Linker digunakan untuk menyambung DNA berujung tumpul,

lxii

sehingga DNA berujung tumpul dapat mempunyai sisi pengenalan oleh enzsim reztriksi tertentu. Ekor homopolimer merupakan molekul deoksiribonukleotida yang terdiri atas satu macam nukleotida dan ditambahkan pada ujung 3 suatu molekul DNA untai tunggal atau ganda sehingga DNA tersebut dapat membentuk rekombinaan dengan DNA lain yang mempunyai ekor homopolimer yang komplementer. Penambahan ekor homopolimer dilakukan dengan menggunakan enzim calf thymus terminal deoxynucleotidyl transferase.

C. VEKTOR DNA Vektor DNA atau DNA vektor adalah molekul DNA yang secara khusus dirancang untuk membawa molekul DNA asing yang akan dimasukkan ke dalam jasad target. DNA vektor memiliki komponen viatal ayng meliputi ori (origin of replication, titik awla replikasi), sisi penyisipan fragmen DNA asing, penanda genetik, sinyal transkripsi dan translasi. 1. Titik awal replikasi Titik awal replikasi (ori) adalah suatu urtan nukleotiada pada vektor yang digunakan untuk mengawali proses replikasi DNA vektor tersebut. Replikasi suatu DNA vektor untuk memperthankan keberadaan vektor tersebut di dalam sel. 2. Sisi penyisipan fragmen DNA asing Sisi penyisipan fragmen DNA asing adalah sekuens DNA pada vektor yang dapat dipotong oleh suatu enzim restriksi tertentu sehingga dapat digunakan untuk menyisipkan fragmen DNA asing yang diklon. Sisi penyisipan tersebut sering disebut sebagai sisi kloning (clonning site) yang dapat terdiri atas beberapa urutan nukleotida khusus yang dapat dipotong oleh beberapa macam enzim restriksi yang berbeda. 3. Penanda genetik (genetic marker) Penanda gnetik adalah suatu gen tertentu pada vektor yang dapat digunakan untuk menentukan koloni sel yang memebawa DNA vektor atau DNA

lxiii

rekombinaan. Beberapa gen yang dapat digunakan sebagai penanda genetik misalnya gen ketahanan terhadap antibiotik, gen yang berperan dalam sintesis asam amino, atau gen yang jika diekspresikan memberikan kenampakan visual tertentu ( misalnya gen luciferase yang memberikan pendar warna hijau pada sel). 4. Sinyal transkripsi dan translasi Sinyal transkripsi dan translasi adalah urutan nukleotida yang ditambahkan pada vektor secara khusus digunakan untuk mengekspresikan ghen asing yang disisipkan. Sinyal transkripsi dan translasi tidak selalu ada pada setiap vektor karena ada vektor yang dibuat khusus hanya untuk memperbanyak DNA asing saja. Vektor yang digunakan untuk kloning DNA dapat dibedakan ke dalam 3 (tiga) kelompok, yaitu: 1. Vektor DNA plasmid 2. Vektor DNA bakteriofag, dimodifikasi lebih lanjut. 3. Vektor hibrid DNA plasmid dan bakteriofag Vektor Dna hibrid adalah vektor yang dikonstruksi menggunakan komponen DNA suatu plasmid dan DNA dari bakteriofag. Karakteristik vektor DNA yang baik antara lain stabil, dapat menggandakan diri sendiri, berukuran kecil, mudah diisolasi, memiliki variasi sisi pemotongan tunggal, mudah dideteksi.. Lebih lanjut kita akan membahas lebih jauh mengenai vektor DNA plasmid karena vektor inilah yang paling umum digunakan dalam teknologi DNA rekombinaan. 1. Vektor DNA plasmid Plasmid merupakan DNA bakteri yang terpisah dari kromosom bakteri. Plasmid dapat bereplikasi sendiri. Plasmid juga mengandung berbagai gen. Jenis, Vektor DNA bakteriofag adalah vektor yang struktur dasarnya berasal dari DNA genom bakteriofag yang kemudian

lxiv

jumlah jenis, dan jumlah tiap jenis (copy) plasmid bervariasi antar sel bahkan antar sel dalam satu spesies bakteri.

Gambar 1. Vektor DNA plasmid

Vektor DNA plasmid merupakan vektor yang paling umum digunakan untuk kloning DNA. Struktur dasar vektor ini berasal dari DNA plasmid yang secara alami ditemukan di dalam beberapa jasad prokaryot dan eukaryot. Plasmid yang digunakan sebagai vektor pada umumnya merupakan hasil modifikasi plasmid alami dengan cara menambahkan komponen-komponen genetik dari berbagai sumber, misalnya sisi kloning, ori tambahan, promoter,. Terminator transkripsi serta penanda genetik. Vektor yang berupa plasmid umumnya berukuran kecil yaitu sekitar 2-8 kb meskipun ada juga yang berukuran sekitar 12 kb. Hal inilah yang menyebabkan vektor plasmid hanya dapat digunakan untuk membawa fragmen DNA asing yang berukuran kecil maksimum sampai mencapai sekitar 3-5 kb. Vektor DNA plasmid secara umum dapat dikelompokkan menjadi (a) vektor untuk amplifikasi fragmen DNA asing (b) vektor ekspresi (c) vektor ulang-alik (shuttle vector). Vektor untuk amplifikasi merupakan vektor plasmid yang biasanya digunakan hanya untuk memperbanyak fragmen DNA asing yang disisipkan ke dalam plasmid tersebut. Vektor ekspresi adalah kelompok vektor yang selain dapat digunakan untuk memperbanyak gen yang disisipkan juga dapat mengekspresikan gen yang disisipkan

lxv

tersebut. Beberapa vektor ekspresi juga dapat dimasukkan ke dalam vektor ulangalik. Vektor ulang-alik (shuttle vector) adalah vektor yang dapat direplikasikan pada sel prokaryot dan eukaryot. Vektor ini digunakan untuk mengekspresikan gen asing di dalam sel eukaryot, namun sebelumnya gen asing yang diklon tersebut diperbanyak terlebih dahulu di dalam sel prokaryot.

D. Transfer DNA Transfer DNA ke dalam bakteri dapat dilakukan dengan tiga cara yaitu, konjugasi, tarnsformasi, dan transduksi. DNA yang masuk ke dalam sel bakteri kemudian dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom bakteri sehingga terbentuk kromosom rekombinaan. Konjugasi merupakan perpindahan DNA dari satu sel ke dalam sel bakteri lain mnelalui kontak fisik antara kedua sel. Sela donor (jantan) memasukkan sebagian DNA nya ke dalam sel resepien (sel betina). Transfer DNA berlangsung melalui pili seks yang dimiliki oleh sel jantan. Sel betina tidak memiliki pili seks. DNA dari sel jantan berpindak ke dalam sel betina secara replikatif. Oleh karena itu setelah konjugasi, sel jantan tidak kehilangan DNA. Setelah konjugasi selesai kedua sel akan berpisah kembali dan jumlah sel tidak bertambah. Setelah konjugasi tidak dihasilkan anak. Oleh karena itu proses konjugasi ini disebut juga sebagai proses seksual yang tidak reproduktif. Transformasi merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di sekelilingnya. DNA yang berada di sekitar bakteri (DNA asing) dapat berupa potongan DNA atau fragmen DNA ysng berasal dari bakteri lainnya atau dari organiosme lainnya. Masuknya DNA dari lingkungan ke dalam sel bakteri dapat terjadi secara alami. Fenomena transformasi ini diamati oleh Griffith (1928), dan kelompok Averry (1944). Griffith (1928) telah menemukan bahwa strain bakteri yang tidak virulen (strain yang penampilan koloninya kasar) dapat berubah sifatnya menjadi strain yang virulen (penampilan koloninya halus) . Perubahan sifat ini disebabkan karena strain yang tidak virulen menjadi strain yang virulen. Perubahan

lxvi

sifat ini disebabkan karena strai yang tidak virulen dicampur dengan strain virulen yang telah dimatikan. Avery, McCleod, dan McCarty (1944) menemukan bahwa perubahan sifat atau transformasi dari bakteri avirulen menjadi virulen disebabkan oleh adanya DNA dari sel bakteri virulen yang masuk ke dalam sel bakteri avirulen . Berdasarkan mekanisme transformasi alami ini maka dapat dilakukan mekanisme transformasi buatan. Dengan perlakuan tertentu kita dapat memasukkan potongan DNA ke dalam sel bakteri. Pada prinsipnya ahal ,ini sangat sederhana yaitu mencampurkan sel-sel bakteri hidup dengan potongan DNA tertentu di dalam tabung reaksi. Beberapa waktu kemudian kita dapat menyeleksi sel-sel bakteri yang sudah mengandung potongan DNA tertentu tersebut. Transduksi adalah cara pemindahan DNA dari satu sel ke sel lain melalui perantaraan fage. Beberapa jenis virus berkembang biak di dalam sel bakteri. Virusvirus yang inangnya adalah bakteri disebut bakteriofage atau fage. Pada waktu fage menginfeksi bakteri, fage memasukkan DNA nya ke dalam bakteri. DNA fage ini kemudian bereplikasi di dalam sel bakteri atau berintegrasi dengan kromosom bakteri. Pada waktu DNA fage dikemas di dalam pembungkusnya untuk membentuk partikel-partikel fage baru, DNA fage tersebut dapat membawa sebagian dari DNA baktei yang menjadi inangnya. Selanjutnya bila fage menginfeksi bakteri lainnya maka fage akan memasukkan DNA nya yang mengandung sebagian dari DNA bakteri inangnya sebelumnya. Dengan demikian fage tidak hanya memasukkan DNA nya sendiri ke dalam sel bakteri yang diseranganya tetapi juga memasukkan DNA dari sel bakteri lainnya yang ikut terbawa pada DNA fage. Hal ini berarti secara alami fage memindahkan DNA dari satu sel bakteri ke sel bakteri lainnya.

E. Amplifikasi DNA Dengan Teknik PCR Amplifikasi (perbanyakan) sekuens DNA dapat dilakukan dengan metode PCR (Polymerase chain reaction). menggunakan enzim DNA Amplifikasi DNA ini dilakukan dengan dNTP (dinukleotida triphosphat) polimerase,

oligonukleotida primer, dan DNA template (DNA cetakan).

lxvii

Enzim DNA polimerase Enzim DNA polimerase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi polimerisasi

nukleotida menjadi untaian DNA. Dalam teknik PCR biasanya digunakan enzim DNA polimerase yang berasal dari bakteri termotoleran yang berasal dari laut, yaitu Thermus aquaticus, enzim tersebut disebut Taq DNA polymerase. Enzim ini memiliki kelebihan yaitu dapt tahan terhadap suhu yang sangat tinggi, yaitu mencapai suhu 95100 C. Suhu setinggi itu diperlukan sebab untuk menyalin urutan basa DNA cetakan dalam metode PCR. Maka DNA cetakan harus didenaturasi (dipisahkan ikatan antara untaiannya) dengan perlakuan panas. Saat ini telah dikembangkan banyak DNA polimerase termotoleran lain yang dikembangkan untuk PCR, misalnya Tth DNA polymerase, dan Pwo DNA polymerase. dNTP (dinukleotida triphosphat) Molekul dNTP (yaitu dATP, dTTP, dCTP, dan dGTP) diperlukan dalm teknik PCR sebagai bahan dasar untuk membuat untaian DNA karena molekul DNA disusun oleh keempat nukleotida tersebut. Oligonukleotida primer Oligonukleotida primer adalah molekul nukleotida berukuran pendek (sekitar 10-30 basa nukleotida) yang diperlukan dalam mengawali proses sintesis DNA. Proses sintesis DNA baik secara in vivo maupun in vitro memerlukan molekul primer. Urutan basa nukleotida pada primer ditentukan agar dapat menempel (komplementer) pada bagian molekul DNA cetakan yang akan disalin atau diamplifikasi. Molekul primer dapat dibuat dengan cara sintesis kimiawi. Molekul DNA cetakan Molekul DNA cetakan merupakan molekul DNA yang urutan nukleotidanya akan disalin. DNA cetakan diisolasi dari sel dan selanjutnya digunakan sebagai cetakan yang akan dibaca oleh enzim DNA polimerase untuk membuat salinan urutan nukleotidanya.

lxviii

PCR dilakukan dengan mencampurkan keempat komponen tersebut di dalam tabung Eppendorf kemudian dimasukkan ke dalam thermocycler. Volume total campuran reaksi yang diperlukan biasanya berkisar antara 25-100 mikroliter. Thermocycler adalah alat yang dapat diatur untuk membuat suatu siklus perubahan suhu yang diperlukan dalam proses amplifikasi DNA. Tahap pertama suhu alat diatur sehingga mencapai 95-100 C selama bebrapa menit (biasanya sekitar 5 menit). Pada saat ini, molekul DNA cetakan mengalami denaturasi sehingga kedua untaiannya terpisah. Pemisahan untaian ini diperlukan agar nukleotida primer dapat menempel, karena primer tidak akan dapat menempel pada DNA cetakan yang masih dalam bentuk untaian ganda (double stranded). Setelah beberapa menit pada suhu denaturasi, suhu alat diturunkan sehingga mencapai suhu yang sesuai untuk penempelan primer (primer annealing) pada DNA cetakan. Biasanya suhu yang diperlukan adalah sekitar 50-60 C, tetapi suhu yang tepat harus ditemukan secara empiris tergantung pada urutan basa nukleotida primer yang digunakan. Pada suhu yang tepat, molekul primer akan menempel pada daerah DNA yang komplementer. Sebagai contoh, jika urutan nukleotida primer adalah GATCTTCG, maka primer tersebut akan menempel pada daerah DNA cetakan yang mempunyai urutan CTAGAAGC. Molekul primer yang menempel tersebut berfungsi sebagai molekul awal dalam proses polimerasi DNA. Nukleotida-nukleotida baru akan ditempelkan di ujung primer tersebut sesuai dengan urutan nukleotida pada DNA cetakan. Proses penempelan primer biasanya memerlukan waktu beberapa menit sekitar 2-3 menit, selanjutnya suhu alat dinaikkan ke suhu yang optimum untuk aktivitas polimerisasi DNA oleh DNA polimerisasi. Jika digunakan Taq DNA polymerase maka biasanya suhu dinaikkan menjadi 72 C. Pada suhu inilah terjadi proses polimerisasi (sintesis) DNA baru dengan adanya aktivitas DNA polimerase, dNTP, primer, dan DNA cetakan. Proses polimerisasi biasanya berlangsung selam 25 menit. Setelah proses polimerisasi, kemudian dilakukan lagi siklus seperti semula, yaitu dengan menaikkan suhu menjadi 95-100 c (denaturasi) kemudian diturunkan

lxix

menjadi 50-60 C (penempelan primer) , dan kemudian dinaikkan lagi menjadi 72 C (polimerisasi). Siklus perubahan semacam ini dilakukan berulang-ulang sekitar 25-35 kali. Dengan demikian dalam proses PCR terjadi sintesis DNA secara berulang-ulang sekitar 25-35 kali. Dengan demikian dalam proses PCR terjadi sintesis DNA secara berulang-ulang sehingga diperoleh molekul DNA baru dengan jumlah yang jauh berlipat ganda dibanding denagn molekul DNA cetakannya. Inilah yang disebut sebagai proses reaksi berantai polimerase atau PCR. Dengan teknik ini dimungkinkan mengamplifikasi suatu fragmen DNA denagn cepat dalam jumlah yang banyak. Selain itu amplifikasi juga dapat diarahkan hanya pada bagian-bagian tertentu suatu gen sehingga dapat dikembangkan untuk tujuan rekayasa struktur suatu gen atau protein.

F. TRANSFORMASI SEL INANG Setelah menyisipkan DNA asing ke dalam DNA vektor, selanjutnya DNA rekombinan tersebut dimasukkan ke dalam sel inang yang sesuai. Proses ini disebut sebagai transfomasi. Berdasarkan tujuan transformasi tersebut, secara umum sel inang dapat dibedakan menjadi 2 kelompok, yaitu: 1. Sel inang sementara ( temporer), sel yang digunakan hanya untuk memperbanyak jumlah sel DNA rekombinan, biasanya digunakan baktei E. Coli karena mudah dac cepat pertumbuhannya. 2. Sel inang tetap, sel inang yang digunakan untuk mengekspresikan gen asing yang diklon tersebut

G. Latihan dan Tugas Untuk memantapkan pemahaman anda mengenai materi dalam modul ini maka anda perlu mengerjakan tugas di bawah ini 1. Jelaskan secara singkat tahapan dasar dalam melakukan rekombinasi DNA secara in vitro! 2. Jelaskan secara singkat berbagai mekanisme perpindahan material genetik pada bakteri!

lxx

3. Jelaskan secara singkat urutan siklus amplifikasi DNA dengan menggunakan PCR! 4. Susunlah sebuah poster mengenai salah satu materi pada modul ini kemudian presentasikan secara oral!

H. Indikator Penilaian Kemampuan menyelesaikan latihan, ketepatan konsep dgn contoh, kejelasan uraian,kemutakhiran tugas pustaka, ketuntasan gagasan pada poster dari model yang dipilih, kreativitas, kerja sama tim pada presentasi.

BAB III. PENUTUP Rangkuman Teknologi DNA rekombinaan merupakan kumpulan teknik atau metode yang digunakan untuk menggabungkan molekul-molekul DNA secara in vitro. Tahapan dasar dalam melakukan rekombinasi DNA secara in vitro adalah Isolasi molekul DNA, pemotongan DNA menggunakan enzim endonuklease restriksi, penyambungan molekul-molekul DNA menggunakan enzim DNA ligase ke dalam suatu molekul DNA vektor, transformasi sel inang dengan DNA rekombinaan dalam sel karakterisasi fungsional gen yang diklon. Enzim endonuklease restriksi atau enzim restriksi merupakan enzim yang diproduksi oleh mikroba yang dapat memotong DNA utas ganda, sedangkan enzim ligase merupakan enzim yang digunakan untuk menyambung potongan-potongan fragmen DNA. Transfer DNA ke dalam bakteri dapat dilakukan dengan tiga cara yaitu, konjugasi, tarnsformasi, dan transduksi. DNA yang masuk ke dalam sel bakteri kemudian dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom bakteri sehingga terbentuk kromosom rekombinaan. Amplifikasi (perbanyakan) sekuens DNA dapat dilakukan dengan metode PCR (Polymerase chain reaction). Amplifikasi DNA ini dilakukan dengan menggunakan enzim DNA polimerase, dNTP (dinukleotida triphosphat) oligonukleotida primer, dan DNA template (DNA cetakan). inang, analisis dan konfirmasi keberadaan DNA rekombinaan dalam sel inang, dan

lxxi

DAFTAR PUSTAKA 1. George, E.F. dan P.D. Sherrington, 1984. Plant Propagation by Tissue Culture. Handbook and Directory of Commercial Laboratories. Einstein Press, UK 2. Hari Hartiko, 1995. DNA Rekombinan. PAU Bioteknologi, Universitas Gadjah Mada. Yogayakarta 3. Mantell, S.H., J.A. Mattheus dan R.A. McKee, 1985. Principles of Plant Biotechnology. Blackwell Scientific Publication. Oxford, London 4. Nasir, 2001. Bioteknologi Pertanian. PT. Grafindo Jakarta. 5. Prentio, S., 1984. Biotechnology, A New Revolution. Gurge Brazller Inc. New York. 6. Soemartono, Nasrullah dan Hari Hartiko, 1992. Genetika Kuantitatif dan Bioteknologi. Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. 7. Wattimena, G.A1992. Bioteknologi Tanaman. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan, Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi. PAU Bioteknologi, IPB. Bogor 8. Yusuf, M., 1998. Genetika Molekular. Program Studi Bioteknologi, IPB. Bogor 9. Yuwono TriWibowo, 2006. Bioteknologi Pertanian. Seri Pertanian. Gadjah Mada University Press.

lxxii

MODUL V METODE TRANSFER GEN

BAB I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang Terdapat berbagai metode dalam mekanisme transfer gen. Pemilihan metode

yang tepat akan sangat penting sehingga proses perakitan varietas tanaman dengan sifat yang diinginkan dapat berjalan efisien dan efektif. Berikut akan disajikan berbagai metode dalam transfer gen tanaman.

B. Ruang Lingkup Isi Modul ini membahas mengenai berbagai metode transfer gen pada tanaman baik melalui transformasi biologis maupun fisis.

C. Kaitan Modul Modul ini merupakan modul terakhir setelah mahasiswa memahami modulmodul sebelumnya yang meliputi struktur dan komponen biomolekuler sel, perubahan konstitusi genetik, replikasi DNA, ekspresi genetik, teknik kultur in vitro, mutasi, rekombinasi, transposisi, metabolit sekunder, hibridisasi somatik, dan konsep serta aplikasi DNA rekombinaan.

D. Sasaran Pembelajaran Modul Setelah mempelajari modul ini, mahasiswa diharapkan dapat menjelaskan mengenai berbagai metode transfer gen ke tanaman.

BAB II. PEMBAHASAN Transfer gen dapat dilakukan baik dengan teknik transformasi protoplas maupun transformasi sel atau jaringan tanaman. Lebih lanjut akan dibahas mengenai transformasi sel atau jaringan tanaman. Transformasi sel atau jaringan tanaman dapat dilakukan melalui transformasi biologis maupun transformasi kimia dan fisika.

lxxiii

Transformasi biologis menggunakan agensia biologis, misalnya bakteri. Transformasi fisika menggunakan metode-metode mekanis untuk transfer gen, misalnya penggunaan mikroprojektile bombardment. Sedangkan transformasi kimia menggunakan senyawa kimia tertentu untuk transfer gen.

A. Transformasi Biologis Transformasi biologis

dalam

memanipulasi

sel

tanaman

umumnya

menggunakan spesies Agrobakterium. Agrobakterium merupakan bakteri tular tanah yang menginfeksi tajuk akar atau tepat di bawah tanah, dapat bertahan tanpa tanaman inang dalam tanah dan menginfeksi tanaman melalui kerusakan atau luka. Merupakan penyakit umum pada tanaman semak berkayu, tanaman herbaceus, dan tanaman dikotil, membentuk struktur galls menyerupai bola-bola kutil yang mirip tumor. Tanaman dapat ditransformasi dengan DNA rekombinaan menggunakan p lasmid Ti yang berasal dari Agrobacterium tumefaciens. Transformasi tanaman dengan plasmid rekombinaan dapat dilakukan dengan menggunkan teknik kokultivasi dengan sel yang membawa plasmid rekombinaan. Langkah awal yang dilakukan yaitu pembuatan plasmid rekombinan dengan menyisipkan gen asing ke dalam T-DNA yang ada plasmid Ti. Setelah plasmid rekombinan dibuat maka plasmid tersebutr dipindahkan ke dalm sel bakteri A. tumefaciens. Hal ini dapt dilakukan dengan menggunakan teknik konjugasi antara bakteri E. coli yang membawa plasmid rekonbinan dengan bakteri A. tumefaciens yang membawa plasmid pembantu (helper plasmid). Sel A. tumefaciens yang sudah membawa gen rekombinan selanjutnya ditumbuhkan bersama dengan jaringan tanaman yang akan ditransformasi (teknik ini disebut juga teknik ko-kultivasi). Penumbuhan jaringan tanaman dilakukan pada media seleksi yang mengandug antibiotic yang sesuai. Skema transfer gen dengan agrobakterium dapat dilihat pada gambar berikut.

lxxiv

Gambar 1. Skema mekanisme transformasi biologis oleh Agrobakterium tumefaciens

B. Transformasi fisik Transformasi genetis juga dapa dilakukan secara fisik, contohnya dengan menggunakan biolistik gun. Pada teknik ini, sel atau jaringan tanaman ditembaki dengan alat penembak mikroproyektil yang membawa DNA rekombinaan. Teknik ini sesuai diterapkan untuk tanaman yang sukar kompatibel dengan pengunaan A. tumefaciens. beregenerasi atau yang tidak

Gambar 2. Skema dan gambar biolistik gun

lxxv

Teknik Biolistik dilakukan dengan menggunakan alat seperti terlihat pada skema. Alat ini terdiri atas suatu ruangan yang dihubungkan dengan pompa vakum. Bagian atas silinder secara temporer ditutupi disk plastic tipis (rupture disk). Plastik mikrocarier diletakkan dekat denagn disk plastic tersebut. Microcarier tersebut mengandung partikel tungsten yang dilapisi dengan DNA yang ditembakkan. Sel atau jaringan yang akan ditembaki diletakkan di dalam alat tersebut yaitu pada posisi di bawah stopping plate yang berada di bawah disk plastic tipis. Penembakan dilakukan dengan mengalirkan gas helium pada kecepatan tinggi . Tekanan gas tersebut akan mendorong microcarier yang mengandung DNA pada partikel tungsten. Pellet mikro yang mengandung DNA tersebut kemudian dapat melewati stopping plate dan menembus sel atau jaringan yang ada dibawahnya. Sel atau jaringan yang sudah ditembaki kemudian diregenerasikan pada medium yang sesuai.

C. Transformasi Kimiawi Polietilen Gikol (PEG) pada pH yang tinggi dapat digunakan dalam menginduksi fusi protoplas dan digunakan dalam mempelopori studi transfer plasmid Ti dan plasmid E. coli ke dalam potoplas. Penggunaan PEG untuk mentransfer DNA ke dalam protoplas meningkat sejak metodenya terus diperbaiki.

D. Elektroporasi Elektroporasi merupakan metode transfer gen atau transformasi tanaman yang memanfaatkan energy listrik. DNA yang diinginkan berada dalam larutan diluar sel selanjutnya dialirkan. Energi tinggi hingga 50.000 volts untuk mengejutkan sel. Kejutan energy tinggi ini membuat pori-pori kecil membuka dan mengizinkan DNA memasuki sel.

lxxvi

E. Analisis DNA rekombinan Analisis DNA rekombinaan di dalm sel yang tertransformasi dapat dilakukan dengan: 1. Analisis restriksi DNA 2. Hibridisasi dengan p[elacak DNA 3. Analisis ekspresi gen asing yang diklon 4. Amplifikasi DNA dengan PCR 5. Penentuan urutan nukleotida

F. Latihan dan Tugas 1. Berikan contoh berbagai metode lain yang digunakan dalam transfer gen! 2. Jelaskan keuntungan dan kelemahan masing-masing metode yang telah anda ketahui! 3. Jelaskan bebarapa contoh tanaman hasil rekayasa genetic dan sifat unggulnya masing-masing! 4. Menurut anda bagaimana dampak kemajuan bioteknologi bagi negara-negara berkembang? H. Indikator Penilaian Kemampuan menyelesaikan latihan, ketepatan konsep dengan contoh, kejelasan uraian,kemutakhiran tugas pustaka, ketuntasan gagasan model yang dipilih, kreativitas, kerja sama tim pada presentasi. BAB III. PENUTUP Rangkuman Transfer gen dapat dilakukan baik dengan teknik transformasi protoplas maupun transformasi sel atau jaringan tanaman. Terdapat berbagai metode transfer gen diantaranya yaitu: Penggunaan A. tumefaciens, biolistik gun, elektroporasi, dan oenggunaan senyawa kimia. Analisis DNA rekombinaan di dalam sel yang

lxxvii

tertransformasi dapat dilakukan dengan:Analisis restriksi DNA, hibridisasi dengan pelacak DNA, analisis ekspresi gen asing yang diklon, amplifikasi DNA dengan PCR, dan penentuan urutan nukleotida.

DAFTAR PUSTAKA 1. George, E.F. dan P.D. Sherrington, 1984. Plant Propagation by Tissue Culture. Handbook and Directory of Commercial Laboratories. Einstein Press, UK 2. Hari Hartiko, 1995. DNA Rekombinan. PAU Bioteknologi, Universitas Gadjah Mada. Yogayakarta 3. Mantell, S.H., J.A. Mattheus dan R.A. McKee, 1985. Principles of Plant Biotechnology. Blackwell Scientific Publication. Oxford, London 4. Nasir, 2001. Bioteknologi Pertanian. PT. Grafindo Jakarta. 5. Prentio, S., 1984. Biotechnology, A New Revolution. Gurge Brazller Inc. New York. 6. Soemartono, Nasrullah dan Hari Hartiko, 1992. Genetika Kuantitatif dan Bioteknologi. Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. 7. Wattimena, G.A1992. Bioteknologi Tanaman. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan, Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi. PAU Bioteknologi, IPB. Bogor 8. Yusuf, M., 1998. Genetika Molekular. Program Studi Bioteknologi, IPB. Bogor 9. Yuwono TriWibowo, 2006. Bioteknologi Pertanian. Seri Pertanian. Gadjah Mada University Press.

lxxviii

lxxix

Anda mungkin juga menyukai