Anda di halaman 1dari 30

UJI TOKSISITAS FRAKSI DARI SPONGS LAUT Xestospongia DENGAN METODE BRINE SHRIMP TEST (BST)

Oleh: FRANSISCHA GALUH KARTIKASARI 1506100002

Dosen Pembimbing: Awik Puji Dyah Nurhayati S.Si, M.Si Drs. Agus Wahyudi M.S

LATAR BELAKANG
keanekaragaman hayati laut Indonesia melimpah

Spons

Genus Xestospongia

metabolit sekunder

mempertahankan diri dari predator

memiliki aktivitas farmakologis

Alkaloid, polycyclic Quinones dan hydroquinones, derivate polyacetylenic, aminoalkohol, dan sterol (aragusterol) (Laurent et al,2006), oxaquinoleridinesl, Carbdine, terpenoid, laktones (Kondracki et al,1992)

dapat dipisahkan melalui metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Fraksi-fraksi

Uji pendahuluan antikanker

Menggunakan Artemia salina

Diuji ketoksikannya dengan metode Brine Shrimp Test (BST)

Permasalahan

Menguji toksisitas dari fraksi yang didapat dari ekstrak Xestospongia dengan metode Brine Shrimp Test (BST)
Batasan masalah Batasan masalah dalam penelitian ini antara lain: 1. menguji secara kualitatif senyawa Xestospongia 2. menguji toksisitas dari fraksi dari hasil KLT pada Xestospongia

Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini antara lain: 1. untuk mengetahui jenis senyawa dari Xestospongia secara kualitatif 2. untuk mengetahui toksisitas dari fraksi Xestospongia dengan menggunakan metode Brine Shrimp Test (BST)

Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai pengembangan alternatif pengobatan antikanker dengan menggunakan produk dari spons laut.

METODOLOGI

Waktu Dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan April-Juli 2010. Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan Kromatografi lapis Tipis Preparatif (KLTP) dilakukan di labolatorium Kimia Sintesis Fakultas Farmasi UNAIR, Uji kualitatif dilakukan diLabolatorium Farmakognosis Fakultas Farmasi UNAIR dan uji Brine Shrimp Test (BST) dilakukan di Labolatorium Zoologi Biologi ITS.

Cara Kerja 1. Isolasi Senyawa Bioaktif

Ekstrak kasar Xestospongia dari labolatorium zoologi biologi ITS yang telah kering diambil 1 gr

dilarutkan etanol 2 ml

Larutan ekstrak dalam etanol, ditotolkan pada pelat KLT menggunakan pipa kapiler dengan jarak 1 cm dari dasar

Setelah totolan kering,lempengan dimasukkan ke dalam bejana dan dielusi hingga jarak 1 cm dari tepi atas dengan fase gerak yang sesuai

kemudian di deteksi dengan sinar UV 254 nm dan UV 365 nm

2. Uji Kualitatif

senyawa yang terpisahkan.

disemprot dengan anisaldehid, uap amoniak, besi (III) klorida, Lieberman-Buchard dan Dragendorff.

Dihitung nilai Rf (Retardation Factor) dengan menggunakan rumus: Rf = Jarak yang ditempuh substansi Jarak yang ditempuh oleh pelarut

3. Isolasi Senyawa dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP)


ditotolkan pada Plat KLTP berupa garis lurus menggunakan pipa kapiler dengan jarak 2 cm dari dasar

Ekstrak Xestospongia sp. yang dilarutkan dalam ethanol

dielusi dengan fase gerak yang didapat dari Kromatografi lapis Tipis (KLT) hingga jarak 2 cm dari tepi atas

Senyawa yang berupa fraksi dikerok dengan menggunakan spatula berdasarkan nilai Rf yang didapat dari KLT

Hasil berupa fraksi

Hasil penyaringan dikeringkan dalam aerator

dilarutkan dalam etanol dan disaring dengen kertas saring

2. Uji Toksisitas

Fraksi yang didapat dari hasil Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP)

ditimbang

dibuat dalam konsentrasi 1000 ppm, 500 ppm, 250 ppm, 100 ppm, 10 ppm dan 0 ppm (kontrol)

kontrol

1000 ppm

500 ppm

250 ppm

100 ppm

10 ppm

50 ml+50 ml

25 ml+75 ml

10 ml+90 ml 1 ml+99 ml

Telur Artemia salina ditetaskan dalam wadah yang berisi 500 ml air laut dengan kepadatan 5 g/L Telur menetas dalam jangka waktu 24-36 jam Setelah menetas, diberi pakan berupa ragi dengan konsentrasi 3 mg dalam 5 ml air laut sebanyak 1 tetes Larva umur 48 jam

diaerasi selama 48 jam

Digunakan dalam uji BST

3. Uji Brine Shrimp Test (BST) Pada fraksi hasil Kromatografi lapis Tipis (KLT)

kontrol

1000 ppm

500 ppm

250 ppm

100 ppm

10 ppm

diambil 1 ml

diambil 1 ml

diambil 1 ml

diambil 1 ml

diambil 1 ml

diambil 1 ml

5 ml air laut

5 ml air laut

5 ml air laut

5 ml air laut

5 ml air laut

5 ml air laut

masing-masing tabung reaksi

dimasukkan 10 ekor larva Artemia salina umur 48 jam

diamati jumlah Artemia salina yang mati dengan kaca pembesar selama 24 jam

dilakukan 3 kali ulangan

dihitung % kematian

Bila pada kontrol tidak ada larva yang mati

Bila pada kontrol ada larva yang mati

Rumus yang digunakan:


Jumlah Larva yang mati %Kematian = Jumlah hewan yang diuji
(Meyer et al.,1982)

x 100%

Rumus yang digunakan:


Jumlah larva yang mati jumlah larva yang mati pada kontrol %kematian = Jumlah Hewan uji x 100%

(Meyer et al.,1982)

ditentukan besarnya LC50 yang dihitung dengan analisis probit menggunakan MINITAB

hasil

Rancangan Penelitian dan Analisis Data Penelitian menggunakan rancangan eksploratif dengan memberi perlakuan konsentrasi ekstrak spons sebesar 1000 ppm, 500 ppm, 250 ppm, 100 ppm,10 ppm dan 0 ppm sebagai kontrol. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 3 kali. Data Hasil Tabel Analisa Kualitatif Jenis Senyawa
Jenis Senyawa terpenoid steroid fenolik flavonoid alkaloid Warna Merah atau ungu biru biru ungu warna jingga sampai merah orange sampai merah bata

Analisa Data

Persentase kematian A. salina kemudian dilakukan analisis probit untuk mengetahui nilai LC50. Analisis probit menggunakan program MINITAB. Suatu ekstrak dianggap memiliki aktivitas toksik dan berpotensi untuk diteliti lebih lanjut jika harga LC50 < 1000 ppm (Meyer et al.,1982).

Hasil Dan pembahasan


Hasil KLT diperoleh spot fraksi sebanyak 4, dengan pelarut kloroform dan aseton (5:1) (v/v)

Kloroform memiliki tingkat kepolaran yang lebih rendah dari pada aseton sehingga gabungan keduanya menghasilkan kepolaran yang berbeda Kepolaran yang dihasilkan dari gabungan kedua pelarut rendah sehingga senyawa yang dapat larut pada pelarut tersebut juga memiliki tingkat kepolaran yang rendah
Plat KLT yang telah dielusi dengan pelarut kloroform dan aceton (5:1) (v/v) berpendar ketika diamati dengan UV pada panjang gelombang 254 nm memiliki energi relatif lebih kuat daripada 365 nm

Hasil pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Fraksi 4 Fraksi 3

Fraksi 2 Fraksi 1

Spot noda (fraksi) berpendar pada panjang Spot noda (fraksi) tidak berpendar pada gelombang 254 nm panjang gelombang 365 nm

Hasil pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Jenis senyawa pada spot fraksi yang telah diperoleh adalah senyawa terpenoid yang ditandai dengan adanya warna ungu setelah dilakukan penyemprotan dengan reagen anisaldehid (Tabel 4.1).
Tabel 4.1. Hasil kualitatif jenis senyawa
Jenis Senyawa
terpenoid steroid fenolik flavonoid alkaloid

Warna
Merah atau ungu biru biru ungu warna jingga sampai merah orange sampai merah bata

Hasil Uji
+ -

Hasil pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Hasil penyemprotan dengan Liberman Buchart

Hasil penyemprotan dengan Dragendroff

Hasil penyemprotan dengan anisaldehid

Hasil penyemprotan dengan besi (III) klorida

Hasil penyemprotan dengan uap amonia

Hasil pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Dari harga Rf yang di dapat dari KLT yaitu


Nilai Rf yang didapat dari KLT sama dengan Nilai Rf pada Kromatografi lapis Tipis preparatif (KLTP) yang digunakan untuk mengambil senyawa pada KLTP Rf menunjukkan perjalanan senyawa yang dipisahkan relative terhadap perjalanan pelarut

Hasil uji Toksisitas Fraksi Xestospongia sp. dengan Metode Brine Shrimp Test (BST)

Hasil uji toksisitas fraksi spons laut Xestospongia menujukkan % kematian terhadap larva Artemia salina yang ditunjukkan dalam Tabel 4.2 Tabel 4.2. Hasil Uji Brine Shrimp Test (BST) untuk fraksi yang didapat dari Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Konsentrasi Pengulangan Jumlah larva Artemia yang diuji Jumlah Larva Artemia yang Mati jumlah rata-rata % kematian

0 0 0 10 10 10 100 100 100 250 250 250 500 500 500 1000 1000 1000

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

0 1 2 2 5 3 3 4 4 5 4 4 6 4 4 5 6 6

1.00

10

10

3.33

23.3

11

3.67

26.7

13

4.33

33.3

14

4.67

36.67

17

5.67

46.67

Hasil uji Toksisitas Fraksi Xestospongia sp. dengan Metode Brine Shrimp Test (BST)

Probability Plot for Jumlah Larva Artemia yang Mati


Normal - 95% CI Probit Data - ML Estimates

99 95 90 80 70 60 50 40 30 20 10 5 1

Table of Statistics Mean 692.329 StDev 1027.53 Median 692.329 IQ R 1386.11

Percent

-5000

-2500

0 2500 Konsentrasi

5000

7500

Grafik 4.1 Probability plot untuk jumlah larva Artemia yang mati

Hasil uji Toksisitas Fraksi Xestospongia sp. dengan Metode Brine Shrimp Test (BST)

Larva Artemia yang mati pada kontrol larva pada kondisi yang lemah tidak dapat beradaptasi saat dipindahkan dari media air laut dari tempat penetasan ke dalam media air laut di botol ampul. Larva Artemia yang mati pada kontrol mengalami penurunan aktivitas. Semakin lama, Artemia dalam kontrol semakin lemah dan terus berada di dasar tabung. Larva Artemia dengan perlakuan fraksi (ppm) gerak (gerakannya tidak teratur) Semakin tinggi nilai konsentrasi fraksi ekstrak semakin tinggi (Tabel 4.1) mengalami disorientasi

mortalitas Artemia juga

Harbourne (1994) semakin tinggi konsentrasi ekstrak, maka sifat toksiknya akan semakin tinggi.

Hasil uji Toksisitas Fraksi Xestospongia sp. dengan Metode Brine Shrimp Test (BST)

Dari hasil perhitungan Analisa Probit dengan menggunakan MINITAB,


didapat nilai LC50 pada ekstrak fraksi Xestospongia ini adalah 692.329 ppm.

Meyer (1982)

suatu ekstrak bersifat toksik bila nilai LC50 1000 ppm

sehingga ekstrak dari fraksi Xestospongia dapat dikatakan toksik.

Terpenoid bersifat toksik

pada sebagian besar komponen terpenoid memiliki

struktur lipofilik
menyebabkan kematian sel.

menyebabkan kerusakan membran sel sehingga

Hasil uji Toksisitas Fraksi Xestospongia sp. dengan Metode Brine Shrimp Test (BST)

Sifat nonpolar terpenoid mudah menembus membran sel atau membran organel dalam sel pada sisi hidrofobik membentuk struktur misel terbentuknya ikatan antara senyawa nonpolar (terpenoid) dengan bagian nonpolar dari membran sel menyebabkan permeabilitas membran sel terganggu.
Terpenoid memiliki efek sinergis bagi toksin lain dengan bertindak sebagai solven untuk memfasilitasi toksin bergerak melalui membran (Dudareva dan Gershenzon, 2007 dalam Imaria,2008).

Hasil uji Toksisitas Fraksi Xestospongia sp. dengan Metode Brine Shrimp Test (BST)

Terpenoid merusak DNA merusak ikatan dalam DNA menjadi DNA Single-strand dan dapat menghambat proses mitosis sel (Sladi dan
Gai, 2006)

Senyawa bioaktif sebagai zat toksik dapat masuk melalui membran sel larva Artemia (secara difusi), membran sel : untuk mengatur perpindahan zat ke dalam dan keluar sel pada organela sel
Senyawa toksik masuk menyebabkan terjadinya perusakan atau modifikasi permeabilitas membrane dan mengacaukan system perpindahan zat dengan cara turut campur dalam pembawa dan produksi ATP mengganggu proses biokimiawi dan fisiologi (Connell dan
Miller,1995)

Hasil uji Toksisitas Fraksi Xestospongia sp. dengan Metode Brine Shrimp Test (BST)

Masuknya zat toksik melalui saluran pencernaan Artemia bersifat penyaring tidak selektif (non selective filter feeder) sehingga apa saja yang dapat masuk mulut artemia seakan-akan menjadi makanannya
(Isnansetyo dan Kurniastuty,1995 dalam Widyastuti,2005)

Senyawa yang masuk dapat berinteraksi dengan target (misalnya enzim,lemak, membran sel, asam nukleat) mempengaruhi mekanisme tubuh yang akhirnya dapat menyebabkan kematian (Connell dan
Miller,1995)

Hasil uji Toksisitas Fraksi Xestospongia sp. dengan Metode Brine Shrimp Test (BST)

Masuknya senyawa toksik melalui pernafasan saat pertukaran gas melewati permukaan permeable pada bagian tengah tempat keluarnya di thoraciz appendages Metabolisme sekunder yang bersifat polar relatif lebih toksik daripada yang bersifat non polar (Nurhayati et al.,2006)
Senyawa metabolit sekunder yang bersifat polar flavonoid Senyawa yang bersifat non polar
dalam Nurhayati et al.,2006)

alkaloid dan

terpenoid dan steroid (Sastroamidjojo

Kesimpulan dan Saran


Kesimpulan Hasil dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa hasil kualitatif pada Rf merupakan terpenoid. Fraksi tersebut mempunyai nilai LC50 sebesar 692.329 ppm

Saran Perlu diadakan penelitian terhadap sel kanker untuk mengetahui potensi senyawa tersebut sebagai anti kanker