Journal of Animal dan Uang Muka Hewan Tahun: 2010 | Volume: 9 | Issue: 1 | Halaman No: 199-204 DOI: 10.3923/javaa.2010.199.

204 Polimorfisme di Intron-1 dari ApoVLDL-II Gene dan Asosiasi dengan Kualitas Daging dan Sifat Kegemukan di Duck Zhang Yi-Yu, Chen Guo-Hong, Xu Qi, Zhang Hai-Bo, Duan Xiu-Jun, Sun Guo-Bo dan Zhao Wen-Ming Abstrak: Sangat Low Density apolipoprotein-II (apoVLDL-II) merupakan unsur utama Density Lipoprotein Sangat Rendah (VLDL) dan terlibat dalam transportasi lipid pada spesies burung. Studi ini dirancang untuk menyelidiki asosiasi dari polimorfisme apoVLDL-II intron-1 gen pada kualitas daging bebek dan sifat kegemukan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ada dua alel (A dan B) dan tiga genotipe (AA, AB dan BB) dalam populasi eksperimental. AA genotipe dan A frekuensi alel yang tertinggi. Delapan SNP (T667C, C669G, T673C, G674A, G683A, G688A, C708G dan T715G) dan dimasukkan / dihapus GT setelah posisi 764 bp yang ditemukan oleh sekuensing. The apoVLDL-II gen intron-1 polimorfisme dikaitkan dengan ciri-ciri beberapa kualitas daging dan kegemukan di 170 individu, termasuk pH-nilai,, kapasitas air nyeri holding, IMF, kolesterol serum total, trigliserida serum dan lemak perut. Penelitian ini menunjukkan bahwa apoVLDL-II intron-1 memiliki efek yang luas pada kualitas daging dan sifat kegemukan di bebek.

PENDAHULUAN Meskipun, seleksi intensif di bebek telah membuat peningkatan besar dalam laju pertumbuhan dan efisiensi pakan, strain modern bebek menunjukkan deposisi lemak tubuh yang berlebihan. Itu adalah salah satu masalah utama yang dihadapi oleh industri bebek saat ini, karena memiliki efek negatif yang signifikan pada efisiensi pakan dan menyebabkan kerugian ekonomi yang besar untuk pabrik pengolahan. Perhatian ekonomi dan pengakuan dari keengganan konsumen untuk deposisi kelebihan jaringan lemak telah menyebabkan peternak komersial untuk menggabungkan pemilihan signifikan untuk mengurangi kegemukan tubuh dalam program pemuliaan mereka. Oleh karena itu, upaya penelitian yang cukup besar telah diterapkan untuk mempelajari faktor-faktor yang berhubungan dengan penumpukan lemak dan metode untuk mengurangi itu (Wawro et al., 2004). Pendekatan gen kandidat adalah metode yang kuat untuk menemukan bertanggung jawab QTL untuk variasi genetik dalam sifat kepentingan dalam spesies hewan pertanian (Lamont et al, 1996;.. Bai et al, 2006). Ciri-ciri yang mirip dengan ciri-ciri ekonomi penting lainnya, sebagian besar daging bebek kualitas dan kebugaran dikendalikan oleh beberapa gen. Memahami kontrol genetik kualitas daging dan sifat kebugaran di bebek akan memberikan kesempatan untuk peningkatan genetik kinerja produksi (Deeb dan Lamont, 2002). Kombinasi metode genotic dan pemuliaan tradisional dan metode molekuler modern mungkin lebih disukai untuk perbaikan genotic dari

bebek di masa depan. Kepadatan Sangat Rendah apolipoprotein-II (ApoVLDL-II) adalah protein fosfolipid-binding kecil (Binder et al., 1990). Ini adalah komponen utama dari polipeptida Density Lipoprotein Sangat Rendah (VLDL) dan terlibat dalam transportasi lipid burung. Fungsinya adalah transportasi lipid netral dalam bentuk lipoprotein densitas sangat rendah dalam plasma. Gen apoVLDLII biasanya aktif pada laki-laki, tetapi dapat diaktifkan dengan pemberian estrogen dan secara khusus dinyatakan dalam hati (Pinchasov et al, 1994;.. Tejada et al, 1999). Ekspresi ApoVLDL-II melindungi ApoVLDL-II mengandung lipoprotein densitas sangat rendah sehingga dapat diangkut ke ovarium dan tidak dihidrolisa dengan lipoprotein lipase pada jaringan perifer lainnya di brids petelur. Meletakkan dapat mempengaruhi aspek-aspek tertentu dari metabolisme lipid, terutama Biochemica jalur l di mana ApoVLDL-II dan HMG-CoA reduktase terlibat (Yen et al., 2005). Dengan demikian, ApoVLDL-II adalah kandidat gen untuk sifat yang berkaitan dengan penumpukan lemak dan kemudian berpengaruh pada kualitas daging mungkin. Namun, sampai saat ini, penelitian tentang SNP dari gen ApoVLDL-II di bebek tidak dilaporkan. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi SNP di bebek ApoVLDL-II gen intron-1 dan untuk mengevaluasi hubungan antara polimorfisme dan kualitas daging dan sifat kegemukan dalam tiga populasi bebek. BAHAN DAN METODE Sampel pengumpulan dan persiapan: Sampel darah diambil dari 170 orang termasuk tiga populasi bebek: Cherry Valley bebek, (CV) (55), Bebek Jinding, (JD) (55) dan bebek Hybrid (CV x JD) (HB) ( 60). Sampel darah dikumpulkan dari College of Jiangsu Peternakan dan Kedokteran Hewan. Bebek yang dipelihara dalam sistem manajemen yang sama. The 170 itik dibantai pada akhir 70 hari. Kualitas daging dan ciri-ciri kegemukan seperti pH, nyeri (nilai geser) (kg cm-2), warna daging (OD540), kapasitas air holding (%), Intramuscular Fat (IMF) (%), total kolesterol serum (L mmol -1), trigliserida serum (mmol L-1) dan lemak perut (%) dalam itik dikumpulkan untuk analisis statistik. Genom DNA diperoleh dengan fenol dan kloroform (1:1) ekstraksi dan disimpan pada suhu -20 C. Primer desain dan amplifikasi PCR: Berdasarkan bebek ApoVLDL-II urutan gen (. Aksesi no GQ180104), sepasang primer empat (Tabel 1) yang dirancang dengan menggunakan Oligo 6.0 program untuk memperkuat bebek ApoVLDL-II gen intron-1 dan mendeteksi single nukleotida polimorfisme. Setelah optimasi, reaksi PCR dilakukan dalam volume total 25 uL dengan 100 ng DNA genomik, 5 pmol masing-masing primer maju dan mundur, 2,5 uL 10 penyangga x, 1,5 mM MgCl2 dari, 0,16 mM dNTP dan dari 1 U DNA polimerase Taq (Fermentas). Program PCR: denaturasi awal selama 10 menit pada 95 C, 30 siklus masing-masing 45 detik pada 94 C, 45 detik pada 58 C dan 45 detik pada 72 C dan 10 menit perpanjangan akhir pada 72 C. Tunggal Polimorfisme Sonformation Stranded (SSCP) dan sequencing: Adiquots

dari 5 produk PCR uL dicampur dengan larutan 10 denaturing uL (98% formamida, 25 mM EDTA, 0,025% xylene-cyanole dan biru bromofenol 0,025%), dipanaskan selama 10 menit pada 98 C dan didinginkan di atas es. Didenaturasi PCR produk menjadi sasaran akrilamida 10%: bisacrylamide (39:1) gel dalam 1x penyangga TBE dan tegangan konstan (130 V) untuk 12-14 jam. Gel diwarnai dengan perak nitrat 0,1%. Fragmen PCR dari pola SSCP yang berbeda pada populasi yang berbeda matahari-clone untuk T-vektor (Takara, Cina). Semua fragmen disekuensing di kedua arah. Tabel 1: Primer untuk ApoVLDL-II intron-1and gen parameter analisis PCR didirikan untuk bebek Analisis statistik: 2-tes digunakan untuk menentukan apakah varian individu adalah di Hardy-Weinberg ekuilibrium. Genotipe dan distribusi alel frekuensi dibandingkan dengan 2-test. Hubungan antara apoVLDL-II kualitas intron-1 dan daging gen dan sifat-sifat kegemukan dievaluasi sesuai dengan mengikuti model: Y=+G+B+GxB+e Dimana: Y = Variabel dependen (sifat dianalisis) = Keseluruhan berarti G = Genotipe dari apoVLDL-II intron-1 (AA, AB dan BB) B = Duck populasi G x B = Interaksi antara genotipe dan populasi bebek (semua efek fixed) e= Random error Perbedaan antara genotipe ditentukan dengan analisis kuadrat terkecil. HASIL DAN PEMBAHASAN SSCP di intron-1 dari gen apoVLDL-II: amplikon dari ukuran yang diharapkan diperoleh dari DNA bebek menggunakan primer yang berbeda. Ini diidentifikasi oleh PCR-SSCP mothed. Hasil primer A1, A3 dan A4 menunjukkan polimorfisme tidak. Para amplikon dari A2 primer adalah sekitar 285bp dalam ukuran dan dipamerkan polimorfisme pada individu yang berbeda dan populasi. Tiga pola pita dapat diidentifikasi dalam intrion-1 dari apoVLDL-II gen (Gambar 1), yang merupakan produk dari dua alel (A dan B). Sekuensing DNA: Hasil sekuensing dibandingkan dengan urutan-1 intron bebek (Aksesi no GQ180104.) Dan menunjukkan: urutan genotipe BB dan GQ180104 identik didefinisikan sebagai mutan-jenis, genotipe AA sebagai tipe liar.

Penyelarasan urutan Hasil penelitian menunjukkan bahwa delapan SNP, T667C, C669G, T673C, G674A, G683A, G688A, C708G dan T715G dan satu penyisipan / penghapusan (yang dimasukkan / dihapus GT setelah posisi 764 bp) ditemukan di intron-1 di 170 bebek dari tiga populasi (CV, JD dan HD) (Gambar 2). Oleh karena itu, ada beberapa mutasi di wilayah 667-764 bp. Gambar. 1: PCR-SSCP Band pola pada gel poliakrilamida non-denaturing 10%

Gambar. 2: Hasil urutan AA dan genotipe BB (The panah menunjukkan posisi mutasi, fragmen dimasukkan / dihapus yang berani dengan frame)

Tabel 2: Alel dan genotipe frekuensi SNP di intron-1 dari apoVLDL-II gen dalam tiga populasi bebek CV = Cherry Valley bebek, JD = Duck Jinding, HB = bebek Hybrid dari CV x JD, h = heterozigositas, Ne = jumlah efektif alel, PIC = Polimorfisme Konten Informasi, 2 (HWE) = Hardy-Weinberg Equilibrium 2 nilai, * * (p <0,01) Tabel 3: Least square analisis antara intron-1 dari apoVLDL-II dan kualitas daging dan sifat kegemukan di bebek abc: Secara signifikan berbeda (LSD test, p <0,05) pada genotipe AA, AB dan BB, n: Jumlah genotipe dalam populasi Alel dan distribusi genotipe: Dalam tiga populasi bebek, genotipe frekuensi AA adalah tertinggi. Frekuensi alel A untuk intron-1 dari apoVLDL-II gen dalam populasi dianalisis adalah 0,8455, 0,5273 dan 0,7750 untuk CV, JD dan populasi HD, masing-masing. Distribusi genotipe CV dan JD dalam perselisihan dengan Hardy-Weinberg equilibrium (p <0,05) kecuali HD populasi (Tabel 2). Lokus milik polimorfisme menengah di JD dan populasi HD (0,25 <PIC <0,5). Untuk populasi CV, itu polimorfisme rendah (PIC <0,25). Efek alelik dari apoVLDL-II gen intron-1 pada beberapa kualitas daging dan ciri kegemukan: Efek alelik dari apoVLDL-II Gene intron-1 pada beberapa kualitas daging dan sifat kegemukan di 170 sampel dari tiga populasi bebek ditunjukkan pada Tabel 3 . Untuk kualitas daging dan sifat kegemukan dengan perbedaan yang signifikan antara genotipe, efek alelik dari nilai pH, nilai geser, kapasitas memegang air, IMF, kolesterol serum total, trigliserida serum dan lemak perut bertindak dalam mode dominan. Burung dengan homozigot (AA) memiliki

signifikan lebih tinggi daripada heterozigot (AB) dan homozigot (BB) untuk waterholding kapasitas dan IMF. Tabel 4: Efek (P-value) dari polimorfisme apoVLDL-II gen intron-1 pada kualitas daging bebek dan sifat kegemukan Namun, untuk nilai geser, burung-burung dengan heterozigot (AB) memiliki homozigot signifikan lebih tinggi daripada (AA). Burung-burung dengan homozigot (BB) memiliki signifikan lebih tinggi daripada homozigot (AA) dan heterozigot (AB) untuk nilai pH, trigliserida serum dan kolesterol serum total. Untuk kolesterol total dan lemak perut serum, homozigot (AA) memiliki heterozigot signifikan lebih tinggi dari (AB). Selain itu, tidak ada hubungan yang signifikan genotipe yang berbeda dengan ciri-ciri lain yang terdeteksi (p> 0,05). Hasil menunjukkan bahwa lokus itu terkait dengan dengan kualitas daging QTL pengendalian dan sifat kegemukan. Oleh karena itu, dianggap bahwa hal itu mungkin memiliki kegemukan pengendali QTL dan kualitas daging di wilayah tersebut. Interaksi antara apoVLDL-II gen intron-1 dan latar belakang genetik dari tiga populasi itik: Interaksi antara genotipe apoVLDL-II gen intron-1 dan latar belakang genetik dari tiga populasi itik yang menunjukkan pada Tabel 4. Hanya warna daging belum genotipe dan pengaruh populasi (p> 0,05) dan kemudian sifat-sifat lainnya adalah genotipe signifikan dan populasi dan genotipe efek populasi x (p <0,05). The apoVLDL-II adalah anggota dari keluarga protein gen kuning burung (Wiskocil et al., 1981). Promotor gen apoVLDL-II mengandung unsur-unsur peraturan banyak yang sebelumnya telah berhubungan dengan ekspresi gen. Gen apoVLDL-II juga mengandung urutan dalam wilayah intron pertama yang meningkatkan transkripsi (Schippers et al., 1994). Dengan menggunakan di footprinting DNaseI vitro, 6 protein-binding situs yang mengungkapkan seluruh intron pertama dan mereka protein-binding situs efek ekspresi apoVLDL-II gen dan gen korelatif lainnya (Shuler et al., 1998). Pada saat yang sama, Li et al. (2005) menemukan mutasi G634A (GenBank aksesi no: V00448) dalam intron pertama dari gen apoVLDL-II dan G / mutasi A memiliki efek yang luas pada pertumbuhan dan pembangunan di ayam. Cheng et al. (2008) melaporkan empat mutasi (G950 A, A 2.522 C, A2705 C dan C2793T) di intron-1 dan 4 SNP memiliki efek genetik yang luar biasa untuk kualitas daging (kelembutan dan pH) di ayam. Dalam studi ini, kami menemukan 8 SNP, T667C, C669G, T673C, G674A, G683A, G688A, C708G dan T715G dan satu penyisipan / penghapusan (GT dimasukkan / dihapus setelah posisi 764 bp) di intron-1 dari apoVLDL-II gen tiga populasi bebek (170 individu), tetapi hanya yang mengakibatkan 3 genotipe: AA, AB dan BB. Dalam tiga populasi bebek, genotipe AA dan A frekuensi alel yang tertinggi. Distribusi genotipe CV dan JD dalam perselisihan dengan HardyWeinberg equilibrium (p <0,05). Lokus milik polimorfisme menengah di JD dan

populasi HD (0,25 <PIC <0,5). Untuk populasi CV, itu polimorfisme rendah (PIC <0,25). Salah satu penjelasan yang dapat mereka mengalami seleksi intensif selama pemuliaan komersial jangka panjang. Dalam populasi dipilih, penyimpangan frekuensi genotipe dari keseimbangan Hardy-Weinberg harus diharapkan untuk lokus dengan dampak pada sifat bawah seleksi. Daging unggas kualitas dan ciri-ciri kegemukan sangat penting untuk memenuhi permintaan konsumen. Oleh karena itu, metode yang berbeda telah digunakan untuk mengurangi kegemukan dan meningkatkan kualitas daging pada unggas (Mullen et al., 2006). Pendekatan gen kandidat adalah metode yang sangat ampuh untuk menyelidiki asosiasi dari polimorfisme gen dengan sifat ekonomis penting pada hewan ternak. Banyak penelitian menunjukkan bahwa apoVLDL-II gen memainkan peran penting dalam transportasi lipid pada unggas (Zsigmond et al, 1995;. Berkowitz dan Evans, 1992;. Schippers et al, 1994). Dalam penelitian ini, gen apoVLDL-II terpilih sebagai gen kandidat untuk menyelidiki asosiasi dari polimorfisme gen dengan beberapa kualitas daging dan sifat kegemukan dalam tiga populasi bebek. Hasil menunjukkan bahwa berkembang biak dan genotipe berpengaruh signifikan dalam indeks dangding kecuali warna daging dengan menggunakan model tetap. Untuk nilai pH, daya ikat air, Intramuscular Fat (IMF), kolesterol total serum dan trigliserida serum, ada memiliki perbedaan yang signifikan antara AA dan genotipe BB. Lokus polimorfisme terkait kuat dengan kualitas daging QTL pengendalian dan sifat kegemukan. Hasil ini konsisten dengan studi di ayam (Cheng et al., 2008). Jadi, kita dugaan gen apoVLDL-II mungkin gen kandidat utama atau terkait dengan gen kandidat utama yang mempengaruhi metabolisme lipid bebek dan SNP dapat digunakan dalam Seleksi Asisten Molekuler (MAS) sebagai penanda genetik untuk sifat kegemukan bebek. Namun, penjelasan untuk hasil ini juga mungkin karena jumlah hewan yang rendah. Kami akan terus menguji dan memverifikasi untuk memperbesar jumlah sampel di masa depan. KESIMPULAN Dalam studi ini, delapan SNP, T667C, C669G, T673C, G674A, G683A, G688A, C708G dan T715G dan satu penyisipan / penghapusan (GT dimasukkan / dihapus setelah posisi 764 bp) di apoVLDL-II gen intron 1 ditemukan di tiga bebek populatrions (CV, JD dan HD), yang menghasilkan tiga genotipe (AA, AB dan BB). Ada berkembang biak signifikan dan efek genotipe pada nilai pH, nilai geser, kapasitas air memegang, IMF, kolesterol serum total, trigliserida serum dan lemak perut kecuali warna daging dengan menggunakan model tetap. Hasil ini menunjukkan bahwa apoVLDL-II intron-1 memiliki efek yang luas pada kualitas daging dan metabolisme lemak pada bebek. UCAPAN TERIMA KASIH Penelitian ini didukung oleh Cina Program Kunci Nasional (2006BDA01A09 dan

2006BDA14B06) dan Modern Agro-industri Teknologi Sistem Penelitian (nycytx45-04).