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3 Bacterias Fitopatgenas
Yonis Hemndez Las bacterias son organismos microscpicos sumamente pequeos. Se conocen alrededor de 1600 especies de ellas. La inmensa mayora son organismos estrictamente saprfitos y como tales benefician al hombre ya que ayudan a descomponer las cantidades enormes de materia orgnica que produce anualmente el hombre y sus fbricas en forma de productos de desecho o que son el resultado de la muerte de las plantas y los animales. Varias especies producen enfermedades en el hombre, entre ellas la Tuberculosis, la Neumona y la Fiebre Tifoidea, y otras producen enfermedades en los animales, como es el caso de la Brucelosis y del Antrax. En relacin con las bacteriosis, el reconocimiento de las mismas como agentes causantes de enfermedades en plantas, comenz recin desde hace alrededor de 100 aos. En una dcada (18771887) T.J.Burril y J.C.Arthur en Estados Unidos, trabajando con tizn violento o fogn de las pomaceas; J.H.Walker en Holanda, trabajando con la amarillez del jacinto y L.Savastano en Italia, trabajando con el mal negro de la vid, demostraron que dichas enfermedades tenan una bacteria como agente causal. A pesar de estos trabajos, muchos patlogos vegetales, no reconocieron la existencia de las bacteriosis y solamente a comienzos del siglo XX las evidencias existentes, permitieron convencer y aceptar universalmente la existencia de enfermedades causadas por bacterias y esto se debe a las numerosas y excelentes aportaciones de E.F.Smith desde 1895. Caractersticas de las Bacterias Fitopatgenas Morfologa: La mayora de las bacterias fitopatgenas tienen forma de bastn, la nicas excepciones son un par de especies de Stheptomyces las cuales son filamentosas. Los bastones son ms o menos cortos y cilndricos y en los cultivos jvenes tienen una longitud que va de 0.6 a 3.5 mm y un dimetro de 0.5 a 1.0 mm. En los cultivos viejos o en altas temperaturas los bastones de muchas especies son mucho ms largos e incluso pueden tener forma filamentosa. En ocasiones se dan variaciones de la forma de bastn en la forma de una masa, una Y o una V y otras formas ramificadas. Las paredes celulares de la mayora de las especies de bacterias estn cubiertas por un material viscoso y gomoso que puede ser delgado (caso en el cual se le denomina capa mucilaginoso) o denso, formando una masa relativamente amplia en torno a la clula (en cuyo caso se le denomina cpsula). La mayora de las bacterias fitopatgenas poseen delicados flagelos en forma de filamentos que a menudo son considerablemente ms largos que las clulas que formaron. En algunas especies bacterianas, cada bacteria presenta un solo flagelo, mientras que otras poseen un ramillete de flagelos en uno de sus extremos, algunas tienen un flagelo simple o un ramillete de ellos en cada extremo y todava otras poseen flagelos peritrcos, es decir, distribuidos sobre toda la superficie. En las especies filamentosas de Stheptomyces, las clulas constan de filamentos ramificados cenocticos (no septados), los cuales a menudo tienen forma espiral y producen conodios en cadena sobre hifas areas.

Las clulas bacterianas presentan paredes celulares delgadas, relativamente firmes y un poco rgidas que al parecer son bastante distintas a la membrana citoplasmtica interna pero que en ocasiones parece integrarse y fusionarse en la capa mucilaginoso externa o la cpsula. La pared celular incluye el contenido de la clula y permite la entrada al flujo de nutrientes y la salida de desechos, enzimas digestivas y otros productos emitidos por la clula bacteriana. Todas las sustancias contenidas en el interior de la pared celular constituyen el protoplasto. Este est formado por una membrana citoplsmica o membrana del protoplasto, la cual determina el grado de permeabilidad selectiva de las distintas sustancias que fluyen hacia el interior y desde el exterior de la clula; por el citoplasma que es una mezcla compleja de protenas, lpidos, carbohidratos, muchos otros compuestos orgnicos, minerales y agua, y por el material nuclear, que aparece como corpsculos esfricos, elipsoidales o en forma de pesas que se encuentran dentro del citoplasma. Reproduccin: Las bacterias fitopatgenas en forma de bastn se reproducen mediante el proceso asexual conocido como fisin binaria o fisin . Esta se produce por la invaginacin de la membrana citoplasmtica hacia la parte central de la clula, formando un tabique membranoso transversal, que divide al citoplasma en dos partes aproximadamente iguales. Durante el proceso, se secretan o sintetizan dos capas del material de la pared celular (continuando con la pared celular externa) entre las dos capas de la membrana. Cuando concluye la formacin de dichas paredes celulares, las dos capas se separan dando como resultado un par de clulas. Mientras que la pared celular y el citoplasma estn sufriendo fisin, el material nuclear se organiza en una estructura circular en forma de cromosoma la cual se autoduplica y se distribuye por partes iguales entre las dos clulas formadas a partir de la clula en divisin. Ecologa y Diseminacin: La mayora de las bacterias fitopatgenas se desarrollan principalmente como organismos parsitos en las plantas hospedantes y parcialmente en el suelo como saprfitos. Sin embargo hay grandes diferencias entre especies en cuanto al grado de desarrollo en uno u otro ambiente. Algunas bacterias patgenas, tales como Erwinla amylovora que produce el tizn del fuego, producen sus poblaciones en la planta hospedantes, mientras que en el suelo su nmero disminuye con rapidez y a menudo no participa en el avance de la enfermedad de una estacin a otra. Estos patgenos han desarrollado ciclos de infeccin sostenidos de planta en planta, con frecuencia a travs de insectos vectores y, ya sea debido a la naturaleza perenne del hospedero o a la asociacin que se establezca entre las bacterias y sus rganos de propagacin vegetativa o semilla, han perdido los requerimientos necesarios para sobrevivir en el suelo. Algunas otras bacterias patgenas, tales como Agrobacterium tumefaciens , la cual produce de la agalla de corona, forman sus poblaciones en el interior de las plantas hospedantes, pero estas poblaciones slo disminuyen gradualmente cuando se liberan en el suelo. En caso de que hospedantes susceptibles se desarrollen en ese suelo durante varios aos, podra liberarse una cantidad suficientemente alta de bacterias para causar un incremento neto en su nmero poblacional en el suelo

de una estacin a otra. Por ltimo otras bacterias patgenas, tales como Erwinias y Pseudomonas causantes de pudriciones blandas producen parte de sus poblaciones en el suelo. Cuando habitan en el suelo, las bacterias viven principalmente sobre los rganos vegetales y con menos frecuencia libre o saprofticamente o en su muclago bacteriano natural el cual las protege de varios factores adversos. Las bacterias pueden sobrevivir en o sobre las semillas, otros rganos de las plantas, insectos, etc., que se encuentran en el suelo. Sobre las plantas, las bacterias pueden sobrevivir epifticamente en yemas, en heridas, en sus exudados o en el interior de varios tejidos u rganos que infectan. La diseminacin de las bacterias fitopatgenas de una planta a otra o a otra parte de la misma planta, se lleva a cabo principalmente a travs del agua, los insectos, diversos animales y el hombre. An bacterias que poseen flagelos se desplazan slo a distancias muy cortas. La lluvia por su efecto de lavado o salpicado, lleva y distribuye bacterias de una planta a otra, de uno de sus rganos a otro y del suelo a las partes inferiores. Gnero de Bacterias Causantes de Enfermedades Los principales gneros de bacterias fitopatgenas son los siguientes: Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia, Agrobacterium y el anteriormente llamado Corynebacterium que se dividi en 4 gneros Rhodococcus, Arthrobacter, Clavibacter y Cuitobacterium. Existen otros gneros que tambin causan enfermedades, entre ellos Xilella, Clostridium y Bacillus. Sntomas Producidos por Bacterias Fitopatgenas Manchas y tizones: Las cuales pueden aparecer sobre hojas, tallos, inflorescencias y frutos como manchas de varios tamaos o como necrosis continuas de rpido avance (tizones). La mayora de las manchas bacterianas son causadas por bacterias de los gneros Xantomonas y Pseudomonas mientras que los tizones verdaderos son causados por especies de Erwinia y Pseudomonas. Marchitamientos vasculares: Afectan plantas herbceas como hortalizas, cultivos mayores y a plantas tropicales y ornamentales. Entre los gneros de bacterias que producen este tipo de enfermedad se encuentran especies de los gneros Clavibacter, Curtobacterium (antes Corynebactorium), Erwinia, Pseudomonas y Xanthomonas. Pudriciones blandas: Generalmente desprenden un olor desagradable por la produccin de sustancias voltiles en el tejido, cuando ste es degradado por la bacteria. Los gneros bacterianos involucrados en este tipo de sntomas son Erwinia, Pseudomonas y Ciostridium. Agallas y proliferacin de raicillas: Las agallas se forman en los tallos y races de plantas infectadas, principalmente por bacterias pertenecientes al gnero Agrobacterium. Adems est involucrado en esta sintomatologa una bacteria del gnero Pseudomonas. La proliferacin de raicillas puede ser ocasionada por bacterias tambin del gnero Agrobacterium y Rhodococcus .

Cnceres: Son producidos por bacterias del gnero Clavibacter, Xanthomonas y Pseudomonas. Sarnas: Estos son sntomas ocasionados por bacterias del gnero Streptomices principalmente. Diagnstico de Bacterias Fitopatgenas La discusin del diagnstico de bacterias fitopatgenas (Toma de muestras, aislamiento e identificacin) es tomada del libro Manual de Laboratorio. Diagnstico de hongos, bacterias y nemtodos fitopatgenos. Toma de muestras: Cundo deben analizarse las muestras vegetales en busca de posibles bacterias fitopatgenas? . La respuesta, evidentemente compleja, no puede ser resumida en una proposicin concisa y su ambigedad es tal que resultara obvio aconsejar: "Cuando se sospeche la existencia de estos microorganismos". En efecto, la aparicin sobre diversas partes vegetales de marchitamientos, oscurecimientos vasculares, podredumbres, enanismos, agallas o distorsiones, corresponde a un conjunto de sntomas que pueden tener su orgen en causas diversas: Fisiopatas, ataques de hongos fitfagos, reacciones ante lesiones producidas por nemtodos, por insectos y, desde luego, tambin por bacterias. No obstante, hay una sintomatologa clsica provocada por determinadas infecciones bacterianas en los vegetales que supone: alteraciones de los tejidos con presencia de zonas acuosas o de aspecto aceitoso, exudados y manchas o necrosis angulares. Por otra parte, existen creencias bastante difundidas, basadas en fenmenos organolpticos, que atribuyen a las bacterias fitopatgenas un protagonismo, por lo general, inexistente. De forma ms precisa se est aludiendo al mal olor, desprendido por algunos vegetales enfermos, y sobre todo por aquellos que presentan una podredumbre blanda. Sin embargo, en gran nmero de ocasiones, la fetidez se debe a bacterias no fitopatgenas, saprfitas o parsitos secundarios, que crecen sobre tejidos ya muertos o tan viejos y dbiles que estando prximos a su fin fisiolgico, son incapaces de resistir el ataque de otro organismo; el olor desagradable es producido generalmente por sustancias voltiles originadas durante la desintegracin de los tejidos de las plantas cuando son atacadas por saprfitos. Por tanto, el mal olor no implica necesariamente la actuacin de una bacteria fitopatgena, aunque en algunos casos pueda ser debido a ella. La toma de muestras constituye un pilar fundamental no slo para la emisin de dignsticos correctos, sino tambin para la elaboracin de cartografas que permiten un conocimiento general de los patgenos existentes en cualquier pas, de sus reas de dispersin, de los cultivos afectados o de la intensidad de sus daos. Por ello se recomienda la elaboracin de fichas de campo lo ms completas posible. la localizacin cartogrfica de los lugares muestreados y una seleccin cuidadosa del material a estudiar.

Consejos Prcticos para Recoleccin y Transporte de Muestras Si bien la experiencia dictar la forma ms adecuada de efectuar la toma de muestras en cada caso particular, se van a indicar unos consejos que pueden resultar muy prcticos para la ejecucin de esta actividad. Equipo bsico: La recogida de muestras de campo, sea cual sea la metodologa de muestreo elegida, precisa un equipo mnimo sencillo compuesto, en la mayor parte de los casos, por los siguientes elementos: tijeras de podar, navaja, pinzas, recipiente isotrmico, guantes y protectores del calzado de un slo uso, bolsas de papel y de plstico, papel o aluminio, etiquetas, lpices, rotuladores, fichas o cuaderno de campo, algodn y un recipiente irrompible con alcohol de 96. Cmo realizar el muestreo: Cuando nos encontremos en el lugar indicado para iniciar el muestreo es conveniente observar la rutina siguiente: 1. Comprobar la localizacin cartogrfica realizando las anotaciones pertinentes en las fichas o cuaderno de campo. Debern quedar bien reflejados todos los antecedentes planta/anomala y en este sentido los agricultores de la zona, al conocer la historia del campo y del inicio de la enfermedad, sern una fuente de informacin muy valiosa. Podra significar gran ayuda para realizar el muestreo en el terreno y orientar los anlisis de laboratorio, el saber, por ejemplo, si se ha aplicado algn tratamiento cuyos residuos resulten nocivos en el cultivo actual, si las siembras se han efectuado en el momento oportuno, si han existido condiciones ambientales; lluvias, tormentas- relacionabas con la aparicin o expansin de la enfermedad o si las primeras plantas afectadas presentaban caractersticas comunes (determinada variedad, lote de semillas, procedencia). Las fichas de campo son aconsejables que se adapten a un modelo nico, hecho que no impedir ampliar determinadas informaciones de acuerdo con problemas especficos. 2. Realizar una toma de muestras representativa de todos los sntomas de la enfermedad que incluya, de forma preferente, los estados iniciales de infeccin. Esta recomendacin resulta vlida incluso en muestreos prefijados estadsticamente en los que, sin prejuicio de ser efectuados segn el protocolo, se adjuntar como anexo la muestra recogida en las condiciones sealadas. El proceso de toma de muestra deber realizarse con toda meticulosidad pues una seleccin incorrecta podra llevar a diagnsticos equivocados. Con el fin de evitar problemas que suelen presentarse al realizar las observaciones y anlisis de laboratorio, indicamos que las anomalas sintomatolgicas se apreciarn mejor si se comparan con material sano recogido en el mismo estado de crecimiento y los aislamientos se obtendrn con ms facilidad si las muestras no presentan estados avanzados de descomposicin. Por ello, en el campo, si los sntomas observados son manchas y necrosis en hojas o frutos, debern seleccionarse hojas y

frutos, incluso de plantas vecinas a una fuertemente atacada, que tenga zonas acuosas o puntos translcidos, ya que estas reas necrticas son lugares con baja densidad de inculo para intentar los aislamientos y, adems estn normalmente colonizadas por saprfitos: cuando se aprecien marchitamientos de hojas y/o tallos, o un oscurecimiento del sistema vascular, se recoger, si es posible, la planta entera puesto que puede haberse producido un bloqueo de los vasos del xilema y no encontrarse el patgeno en la parte de la planta con sntomas (as un aislamiento del agente productor del chancro bateriano del tomate, Clavibacter mchiganense subsp, michiganensis no va a lograrse fcilmente a partir de vasos muy atacado debido a las migraciones del patgeno); en los casos de chancros y desecamientos la muestra tendr que incluir el borde de la lesin y varios centmetros de tejido sano, pues lo ms probable es que el patgeno ya no exista en los tejidos viejos o cancerosos (si se intenta analizar un brote quemado de peral para averiguar un posible ataque de Erwinia amylovora, agente productor del fuego bacteriano, se detectar con ms facilidad a varios cm de distancia del frente desecado); cuando se trate de podredumbres blandas, ya sean plantas o tubrculos, slo se conseguir un aislamiento relativamente fcil a partir de muestras casi sanas; indicamos tambin que en los tumores o agallas bien desarrolladas no existen patgenos y slo cuando son muy jvenes puede encontrarse en su interior la causa de su formacin. Empacar de forma adecuada cada muestra con su etiqueta de identificacin correspondiente Las muestras para anlisis bacteriolgicos suelen introducirse en bolsas de plstico y, dado que este material crea condiciones ambientales favorecedoras de la multiplicacin de saprfitos indeseados, es importante que antes de su empaquetado estn libres de humedad superficial. Se aconseja, siempre que sea factible, sustituir el plstico por papel aluminio. Adems no deber utilizarse plstico (las bolsas de papel son ms aconsejables) cuando se envuelvan tejidos con sntomas de podredumbre blanda o con alta probabilidad de sufrir alteraciones de ese tipo, como ocurre con la papa y las cebollas. Para una mejor conservacin de las muestras, recomendamos guardarlas en neveras porttiles o, por lo menos, mantenerlas protegidas de calores excesivos y desecaciones que se originan, por ejemplo, cuando se dejan expuestas a pleno sol. Evitar cualquier peligro de contaminacin. As cuando las races formen parte de una muestra deber impedirse que la tierra manche al resto de la misma, para ello conviene colocar una bolsa de plstico cerrada alrededor de las races y de la parte inferior del tallo e introducir todo a continuacin en una segunda bolsa. Si una muestra incluye agallas radiculares debe procurarse no daarlas, puesto que se contaminaran probablemente con saprfitos del suelo. Al terminar de recoger cada muestra es preciso desinfectarse con alcohol las manos y todos aquellos instrumentos que pudieran haber estado en contacto con agentes nocivos. Esto se hace tanto para evitar la contaminacin de nuevas plantas y la diseminacin de las enfermedades como para protegernos ante un posible patgeno humano. Si se ha actuado con guantes de plstico y protectores del calzado habr que recogerlos en una bolsa para su posterior eliminacin.

Tratamientos previos Cuando las muestras lleguen al laboratorio debern colocarse entre 2- 5 C, hasta el momento de realizar los correspondientes anlisis. En caso de muestras con podredumbre blanda se efectuar lo antes posible para evitar la proliferacin de organismos secundarios. Si se trata de manchas foliares puede procederse a herborizar parte de la muestra, sirviendo as como fuente de referencia al sobrevivir muchas bacterias meses o aos en material desecado guardado a temperatura ambiente. Si las muestras van a ser enviadas a otro laboratorio es fundamental empaquetarlas adecuadamente para que sufran el menor deterioro posible. Como hemos dicho envolvindolas en papel de aluminio, normalmente, llegan en unas condiciones ptimas. Si el envo incluye casos de patgenos invasores radiculares, conviene lavar algunas de las muestras dejndola libre de tierra y eliminando el exceso de humedad mediante un secado con papel de filtro; otra parte ir con tierra adherida por si fuese preciso realizar el aislamiento del suelo, pero procurando siempre que la tierra no manche el resto de la planta. Bases del Diagnstico Antes de proceder a un anlisis bacteriolgico, en especial cuando no se tiene experiencia con la muestra problema, es importante recabar la mxima informacin bibliogrfica sobre las fitobacterias que pueden atacarla. Se cataloga as una serie restringida de microorganismos. A continuacin deber realizarse una segunda seleccin en concordancia con la sintomatologa observada. Estos pasos previos no se hacen con el fin de emitir un diagnstico sintomatolgico, sino para sacar el mximo partido de las experiencias que legan los investigadores y obtener resultados certeros con un mnimo esfuerzo. Por esta razn se aconseja que una vez efectuadas ambas selecciones, con la idea preconcebida de la posible causa de la enfermedad (uno o dos patgenos normalmente), se proceda segn se especifica en captulos sucesivos. Si los mtodos que se utilizan en un proceso de identificacin fueran similares o muy parecidos sera ms correcto hacer un anlisis general y, de acuerdo con el mismo, emitir un diagnstico. Pero los mtodos, lo mismo que los patgenos, son diferentes. Como por ejemplo podremos citar anlisis de tubrculos de la patata: en nada se parecen los protocolos que deben seguirse para detectar e identificar las bacterias causantes de podredumbres blandas con los de Clavibacter michiganense subsp. sepedonicum productor de la podredumbre anular de la patata. En ste captulo se indican de forma general, los pasos previos y los procedimientos que con mayor frecuencia se emplean para un diagnstico. Su lectura y comprensin constituyen una base imprescindible en cualquier tipo de anlisis. Informacin Inicial: Al encontrarnos en una poca en la que el empleo de nuevas tcnicas de anlisis permite modificar la actual clasificacin bacteriana y el aislamiento de nuevos patgenos, se hace indispensable recabar la mxima informacin actualizada sobre las posibles bacterias que pueden atacar a la muestra problema.

Para facilitar los diagnsticos ms usuales se han recopilado en la tabla siguiente, las bacterias que con mayor frecuencia afectan a diversas especies vegetales. La nomenclatura que normalmente se emplea es aquella que figura en la Approved list of bacterial names (SKERMAN et.al.; 1980). Debemos sealar que en la tabla no estn todos los que son, sino slo los patgenos ms frecuentes, y an as se ha omitido, en algunos casos, bacterias que tienen una gama muy grande de hospedantes, como pueden ser causantes de tumores o de podredumbres blandas. Tampoco se citan bacterias que se encuentran en todas partes y normalmente no producen daos, pero que, en determinadas ocasiones, especialmente cuando las plantas crecen o se almacenan en condiciones inadecuadas, pueden convertirse en patgenos oportunistas, as ocurre con agentes pectinolticos que se localizan normalmente en el suelo, en las races, o en la superficie de las hojas.(Pseudomonas marginalis, P. virdiflava, P. fluorescens, Erwinia spp.) Se mencionan, sin embargo, algunos patgenos clasificados recientemente, como el agente causante de la Enfermedad de Pierce de la via, o el productor del Corkeyroof de la lechuga, aunque la gama de sus hospedantes, al igual que otros aspectos de su ciclo biolgico, no est todava determinada. Una vez enumerados los posibles patgenos se deber procederse a su seleccin, de acuerdo con la sintomatologa inducida en las plantas, sin olvidar que en lugares o microclimas determinados pueden aparecer sntomas no citados en la literatura y que un mismo sntoma puede tener orgenes muy diversos. A modo de ejemplo, y limitndonos exclusivamente a bacteriologa, citamos los casos de Pseudomonas syringae pv. syringae, P. s. pv. phaseolicola y Xanthomonas campestris pv. phaseol Productores todos ellos de manchas grasas en hojas de frijol. Seleccin del material y de los puntos de anlisis: Si se quiere efectuar con rapidez un diagnstico se deber seleccionar correctamente la parte o partes de la muestra que vayan a analizarse, siendo las ideales aquellas que presenten un nico tipo de poblacin: la patgena. Para ello se precisa disponer en el laboratorio de material fresco con sntomas de ataque incipiente. Si la muestra contiene material descompuesto, es vieja, procede de suelo, o se ha empaquetado hmeda, pueden encontrarse muchos saprfitos que dificulten o impidan el aislamiento del patgeno, no slo por su desarrollo ms rpido, sino tambin por su capacidad competitiva que origina luchas biolgicas no deseadas en placas de cultivos. El simple lavado de la muestra con agua del grifo, su introduccin en hipoclorito sdico al 0,5% durante dos o tres minutos seguido de un lavado con agua, o el paso de un algodn embebido en alcohol y un ligero flameado, ayudar a eliminar los saprfitos superficiales. Con una desinfeccin excesiva se corre el riesgo de destruir a la vez saprfitos y patgenos. Se comprende que cuando se busca un patgeno en una mancha foliar debern tan solo realizarse ligeras desinfecciones (incluso un simple lavado con agua), mientras que si la localizacin es en el interior de vasos podr llegarse a la introduccin directa de pequeos trozos de muestra en alcohol y su paso por la llama. Contrariamente la desinfeccin no podr realizarse cuando se busquen patgenos sobre las superficies (por ejemplo, cubierta de las semillas). A veces resulta prctico efectuar los anlisis con y sin desinfeccin.

Como lugar o lugares de anlisis se elegirn aquellos en los que se sospeche una multiplicacin inicial del patgeno. Si se observan, por ejemplo, manchas sobre las hojas, se buscar en primer lugar la existencia de pequeos puntos, de tipo acuoso preferentemente y tal vez slo observables al trasluz, que se seleccionarn, aunque se realicen otros anlisis sobre manchas ms desarrolladas. En caso de necrosis en tallos, puede resultar prctico analizar independientemente tanto los lmites superior e inferior de la necrosis visible, como diversas zonas colindantes de apariencia totalmente sana, debido a que el frente de avance de la bacteria puede encontrarse a varios centmetros del lugar donde se observan los daos, tal ocurre, como ya se ha dicho, en los casos de Erwinia amylovora en su ataque a brotes de rosceas. Estas dificultades para la localizacin del patgeno pueden solventarse mediante un examen microscpico de los diversos tejidos. As, en los casos de manchas, basta coger un pequeo fragmento de las misma, colocarlo en un porta objetos con una gota de agua y despus de taparlo con un cubreobjetos, observarlos a 400 u 800 aumentos; se podr apreciar como una masa bacteriana fluye y se difunde en el agua a partir de la seccin del tejido. Cuando se trata de anlisis vasculares, conviene separar y presionar cuidadosamente los vasos para permitir que las bacterias salgan de su interior, observndose de forma similar. Si bien este examen microscpico es importante, la simple deteccin' de clulas bacterianas no es suficiente para un diagnstico. Por una parte, las bacterias pueden confundirse con restos de clulas de la planta o con grnulos de almidn o clorofila y, por otra parte, la observacin microscpica no permite diferenciar saprfitos de patgenos. Extraccin bacteriana: Una vez seleccionados los lugares de anlisis, para conseguir que las bacterias abandonen las clulas de la muestra, se procede a disgregar los tejidos de la planta en un medio lquido. Este proceso deber realizarse de la forma ms asptica posible, si bien la tcnica de extraccin depender del tipo de tejido y el lugar en que se encuentre ubicado el patgeno. Con frecuencia, especialmente en casos de manchas foliares la disgregacin se realiza colocando los tejidos en cajas de Petri (a ser posible de vidrio) y partindolos finamente con la ayuda de bistures. Otras veces, por ejemplo para extraer patgenos del interior de semillas, se procede a la molienda de las muestras. Como medio lquido a menudo se utiliza agua estril pero en algunas ocasiones es preciso recurrir a determinados tampones o caldos nutritivos que facilitan la extraccin y multiplicacin del microorganismo. El paso de las bacterias al medio lquido se favorece al agitar los recipientes, placas, matraces, o vasos, que contienen las mezclas; el tiempo ptimo de maceracin es variable segn el proceso que se realice. As, por ejemplo, en anlisis de semillas cuando se buscan bacterias en su interior, es frecuente proceder a triturar las muestras en molinos y mezclar la harina resultante con un medio lquido. En este caso, no es necesario, ni conveniente, que la muestra permanezca tiempo en remojo, pues la finura de la trituracin permite el paso casi instantneo de las bacterias al lquido, por lo que la permanencia de la harina en remojo va a favorecer sobre todo la multiplicacin de saprfitos. Contrariamente, cuando las semillas no se trituran y las bacterias deban salir por s mismas del interior de las cubiertas el tiempo que precisan es mucho mayor e incluso puede ser necesario emplear un medio lquido tamponado que evite

las alteraciones del pH adems de efectuar siembras progresivas del mismo para determinar el tiempo ptimo de remojo. Siembra, interpretacin de cajas y aislamientos: Antes de sembrar debe comprobarse que en las cajas con medio de cultivo no existan contaminaciones. Es fundamental que la superficie del medio no tenga agua libre, ya que la mayor parte de las bacterias puede desplazarse nadando, forma un tapiz de organismos entremezclados en lugar de colonias separadas. Normalmente, si el medio no se ha vertido muy caliente y las cajas se han dejado secar a temperatura del laboratorio, en 24 o 48 horas estn en condiciones de uso. Ante una necesidad urgente se forzar el secado, para lo cual se colocan abiertas boca abajo durante 20 o 30 minutos en estufa a 400C o bien se dejan el mismo tiempo abiertas en posicin normal, dentro de una cmara de flujo laminar. Para efectuar la siembra se deposita sobre la capa de agar, con ayuda de pipeta Pasteur, asa de inoculacin u otro instrumento adecuado, una gota de lquido procedente de la maceracin de los tejidos, y se extiende sobre la superficie del medio formando estras en 4 direcciones perpendiculares. Esta operacin puede efectuarse con el asa deslizndola suavemente en posicin vertical sobre la superficie del medio; el asa se quemar y enfriar (tocando por ejemplo la superficie del agar entre las estras) antes de efectuar las extensiones en una nueva direccin, con el fin de favorecer la aparicin de colonias separadas. Todo el proceso debe realizarse en mximas condiciones aspticas evitando cualquier corriente de aire incluidas las que origina el operario con sus movimientos. Una vez sembradas las cajas se ponen a incubar en posicin invertida, para evitar condensaciones indeseables de agua en la tapa a una temperatura normalmente comprendida entre 25 y 27C, aunque en ocasiones, por ejemplo, con determinadas bacterias corineformes, resultan ms apropiadas temperaturas inferiores de 21 a 23 C. Si se sospecha que el organismo que se va buscando puede tardar en aparecer (tal como Clavibacter michiganensis subsp. sepedonkum, Xanthomonas ampelina, Xanthomonas fragariae) es aconsejable sellar las placas con papel poroso y elstico. Se consigue as una menor desecacin del medio, al mismo tiempo que se protegen de la entrada de caros u otras posibles contaminaciones. Las placas de Petri ya sembradas debern examinarse diariamente, observando y anotando la aparicin y las caractersticas de las colonias. Estos detalles van a proporcionar una clave para emitir u orientar el diagnstico. As las colonias macroscpicas visibles a 24- 36 horas suelen corresponder a saprfitos mientras que la mayor parte de las Pseudomonas fitopatgenas y los distintos patovares de Xanthomonas campestris producen colonias visibles a simple vista a las 48-72 horas. Cuando se espera la aparicin de organismos de crecimiento lento es aconsejable utilizar una lupa para ayudar a su deteccin y recorrer visualmente tanto el lugar donde se ha depositado la gota, como las diversas estras. As pues, el primer dato que hay que anotar es el tiempo de aparicin de las colonias y, en sucesivas lecturas, otros detalles como su dimetro variable desde fraccin de milmetros a varios centmetros, forma (reticulares, ovaladas, irregulares, con bordes enteros, ondulados, estrellados, llanas sobre el agar, levantadas, acuminadas, lisas o rugosas), color (opacas, translcidas u opalescentes). Estas anotaciones morfolgicas se refieren a colonias que se encuentran bien separadas e idealmente creciendo en cultivo puro. Sin embargo, el hecho real es que muy pocas veces se consigue ste y la

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interferencia de la flora acompaante es un obstculo. El patgeno deber ser el organismo predominante en la placa de aislamiento. Si esto no ocurre, y sobre las placas aparece todo un mosaico bacteriano, el intentar localizar el tipo de colonias correspondientes al patgeno es como buscar una aguja en un pajar. Nuestro mejor consejo es que se efecten nuevas siembras. Cuando en las placas se observe la presencia de colonias sospechosas de pertenecer al patgeno, entremezcladas con saprfitos, de tal forma que no se localicen colonias solitarias, conviene tomar unas cuantas colonias, diluirlas en agua estril y efectuar una resiembra con objeto de garantizar la pureza de los aislamientos y comprobar la fidelidad de las anotaciones. Entre la flora acompaante que aparece con mayor frecuencia figura Erwinia herbicola. El aspecto inicial de sus colonias puede recordar al de algunos Pseudomonas, pero al crecer produce un exudado de aspecto mucoide con un pigmento amarillo o naranja no difusible que la asemeja a un Xanthomonas u otro patgeno. Tambin se presentan a menudo saprfitos con colocaciones amarillas o rojizas (pigmentos carotenoideos) o con pigmentaciones verdes fluorescentes en medios deficientes en hierro que pueden corresponder a Pseudomonas patgenos o no patgenos. Como se ha dicho, el examen de las cajas orienta el diagnstico pero adems, algunas veces, es suficiente como tal. Supongamos, por ejemplo, que se han analizado unas plantas de tomate, las lecturas de los 3 primeros das han llevado a describir diferentes tipos de colonias, y al revisarlas nuevamente se observa la presencia de abundantes colonias amarillas puntiformes que surgen entre las estras. Casi con toda certeza se puede diagnosticar Clavbacter michiganensis subsp michiganensis., ms si los sntomas observados sobre las muestras coinciden con los originados por este patgeno. Otro resultado que al observar las plantas puede obtenerse es que las anomalas observadas no se deben a un agente bacteriano. Para afirmar esto debe tenerse mucha seguridad en los anlisis, siendo tal vez ms prudente afirmar que no se han logrado aislar bacterias fitopatgenas. En ocasiones al estudiar las caractersticas de algunos aislamientos pueden indicarnos que se trata de una fitopatgena, por ejemplo, Pseudomonas syringae. Sobre esta bacteria, u otras que tienen una fase de vida epfita, se quiere llamar la atencin por el hecho de que no es suficiente la simple localizacin de colonias aisladas para atribuirle la causa de una enfermedad. Insistimos en que el patgeno debe figurar entre los organismos predominantes en las placas de aislamiento. Es por tanto necesario, despus de todo lo dicho, considerar en la lectura de las placas de anlisis la concentracin de colonias bacterianas de un supuesto patgeno para continuar con la identificacin y centrar el diagnstico. El aislamiento de la colonia deber realizarse tocndola ligeramente con la punta de una aguja enmangada y sembrando una estra en un tubo con agar inclinado o en otra caja de Petri. La ventaja de utilizar placa es que ahorra manipulacin de tubos, pudiendo una misma caja servir para varios aislamientos. Llamamos la atencin sobre esta forma de actuar que, aunque no es realmente ortodoxa, puede resultar prctica, pero existe el peligro tanto de mezcla de aislamientos como de competencia de los mismos por el medio nutritivo. La forma ms correcta de realizarlos y al mismo tiempo estudiar las caractersticas de las colonias, es coger las que se localizan solitarias, suspenderlas en agua estril y resembrar. Ello va a permitir comprobar la pureza del cultivo, hecho imprescindible cuando se han usado medios selectivos, puesto que aunque en la placa se observen colonias perfectamente aisladas

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pueden contener entremezcladas clulas de otras bacterias cuyo desarrollo se ha inhibido, pero se mantienen viables. Por otra parte conviene sealar que la morfologa de las colonias puede sufrir variaciones estables o inestables, y que los pigmentos se ponen de manifiesto en medios concretos segn la edad de los cultivos y el estado nutricional, lo cual puede dificultar el encaje de esas colonias en un "patrn taxonmico" concreto. Seleccin de cultivos bacterianos: Dado que hoy en da la identificacin bacteriana implica realizar una serie de test, ms o menos fiables, pero largos y laboriosos en todo momento, resulta ms prctico normalmente, iniciar los ensayos comprobando en primer lugar la patogenicidad de los aislamientos para saber si el organismo aislado es el causante de la enfermedad y, en caso afirmativo, proceder a su posterior identificacin. Desde un punto de vista "terico-real" los bioensayos deben efectuarse sobre la misma especie hospedante (e incluso cultivar) de la que se ha aislado el patgeno. Ello implica tener invernaderos, o cmaras climatizadas que permitan disponer de una amplia gama de plantas cuyo estado fenolgico puede ser importante para algunas inoculaciones. Estas exigencias constituyen un factor limitante y, en general, sin solucin, mxime si se tiene en cuenta la necesidad tan frecuente de emitir un diagnstico de forma rpida. En la prctica slo en casos muy especficos y concretos, un laboratorio de diagnstico tiene planificadas y listas para uso las plantas hospedantes. El problema de la provisin de plantas se soluciona parcialmente efectuando cierto tipo de ensayos, que si bien no constituyen autnticos exmenes de patogenia, si proporcionan una ayuda inicial de gran valor en la seleccin previa de aislamientos. Entre los ms difundidos figura el test de hipersensibilidad realizado frecuentemente sobre hojas de tabaco; la amplia utilizacin de esta prueba, rutinaria en los laboratorios, se debe a que la mayor parte de las bacterias fitopatgenas tiene la propiedad de inducir la reaccin de hipersensibilidad mientras que los saprfitas no la tienen. El ensayo, tal como se realiza actualmente, es muy prctico con patgenos cuya gama de hospedantes es restringida, mientras que carece de valor significativo ante bacterias muy polfagas, por ejemplo Agrobacterium induce tumores o algunas Erwinias ssp. causantes de podredumbres blandas. Otro tipo de pruebas, tambin de amplio uso, consiste en hacer las inoculaciones sobre fragmentos de plantas. Se aplican no slo para comprobar el poder patgeno de cultivos puros, sino tambin como medio de crecimiento ms propicio o selectivo para el desarrollo de fitopatgenos que de saprfitos; sta ltima caracterstica posibilita su empleo como fuente de aislamientos indirectos de los patgenos. Diagnstico e Identificacin: El objetivo fundamental de todo laboratorio de diagnstico es si una muestra est o no enferma y cul es la causa o causas de la enfermedad. Factores limitantes, como pueden ser el tiempo o los medios disponibles, hacen que la mayor parte de las veces los problemas haya que resolverlos emitiendo un diagnstico presumible, por ejemplo, cuando dentro de una zona determinada se estn presentando daos similares a otros estudiados previamente, basta con efectuar algunas pruebas para emitir con bastantes garantas un diagnstico que permitir la accin contra el agente causante. La confirmacin del diagnstico, para el cual se requiere el aislamiento, la comprobacin del poder patgeno y la identificacin bacteriana, se efectuar siempre que sea posible

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pero necesariamente cuando aparezca un problema ya sea en una nueva rea o sobre una especie diferente. Un grado ms avanzado de dificultad, que sobrepasa las posibilidades de un laboratorio normal, es la clasificacin de nuevos patgenos. Estos captulos de bacteriologa estn orientados exclusivamente hacia el diagnstico e identificacin de fitopatgenos que pueden aislarse en medios normales de cultivo, dejando a un lado, a pesar de su enorme importancia, otros que necesitan requisitos muy especiales para su aislamiento y cultivo, tal como es, y por mencionar alguno, el agente productor sobre las vias de la enfermedad de PIERCE. Xylella fastidiosa, perteneciente a un nuevo gnero de bacterias de reciente descripcin. As pues, nuestras orientaciones van dirigidas al diagnstico e identificacin de las fitobacterias tradicionalmente enclavadas dentro de los gneros Agrobacterium, Corynebacterium, Erwinia, Pseudomonas y Xanthomonas, cuya identificacin suele ser muy sencilla aunque, por supuesto, hay algunas excepciones. Las normas previas que se dan a continuacin provienen en parte del "Bergey's Manual of Determinativo Bacteriology" y se basan en el estudio de ciertos caracteres fenotpicos fciles de comprobar. Las bacterias presentan una serie de caractersticas que por su constancia, se consideran de valor taxonmico. Entre ellas figuran el Gram, el tipo de respiracin aerbica, anaerbica, anaerbicafacultativa, existencia de citocromo c-oxidasa, arginina dihidrolasa o catalasa. Existen otras propiedades, tales como la utilizacin o produccin de cidos a partir de azcares, cidos orgnicos o aminocidos, a veces empleadas en la identificacin, que pueden variar de un aislado a otro y estar en clara dependencia con las condiciones de trabajo. Cuando se establece una clasificacin es fundamental que los caracteres elegidos no slo sean constantes sino tambin que al estudiarlos se obtengan resultados claros. Sin embargo, a veces las dudas son inevitables. Como ejemplo, se admite la existencia de un primer criterio de divisin bacteriana en Gram (+) y Gram (-), pero Qu hacer cuando el Gram es variable, o cuando aparecen aislamientos con la oxidasa incierta o dbilmente positiva?. En primer lugar, hay que asegurarse que se trabaja con un cultivo puro y tener en cuenta que los resultados pueden depender, entre otros factores, de la cantidad de inculo, de la temperatura y perodo de incubacin, de la composicin del medio o de la versatilidad de interpretacin de resultados. Todo lo anterior pone de relieve la necesidad tanto de disponer de cepas de referencia como de mtodos de diagnsticos tipificados que puedan aplicarse por igual en los laboratorios. Muchos mtodos para el diagnstico de enfermedades bacterianas se basan en tcnicas de deteccin que no requieren el aislamiento del patgeno. Las siguientes son las normas bsicas a seguir en una correcta identificacin bacteriana: Estar seguros de la pureza del cultivo. Trabajar de mayor a menor categora (gnero, especie). Usar toda la informacin disponible para limitar el rango de los patgenos.

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Aplicar el sentido comn a cada etapa. Usar el nmero mnimo de tests para hacer la identificacin. Comparar los aislamientos con cepas de referencia.

Mtodos Serolgicos Otra manera de realizar el diagnstico de bacterias fitopatgenas en una determinada muestra, es a travs del uso de la Serologa. Las tcnicas serolgicas permiten la deteccin e identificacin de estos patgenos en menor tiempo que el usado por el mtodo tradicional de aislamiento e identificacin, a travs de pruebas morfolgicas, fisiolgicas y bioqumicas (ya discutido) y en forma precisa, lo que hace que estas tcnicas sean de uso frecuente en los laboratorios de diagnstico. (La discusin de estas tcnicas son tomadas del libro "Manual de laboratorio. Diagnstico de hongos, bacterias y nematodos fitopatgenos. 1991). Caractersticas antignicas de las bacterias: Las clulas bacterianas no son antgenos homogneos sino que estn compuestas por numerosos antgenos, a modo de mosaico, distribuidos en la pared celular, y en los flagelos. Por otro lado, los constituyentes de la pared celular varan segn que la bacteria sea Gram(+) o Gram(-). As, las bacterias Gram(+) pueden poseer dos tipos de constituyentes antignicos: los debidos a la pared, de gran poder antignico entre los que figuran algunas protenas, polisacridos y cidos teicoicos. Los capsulares slo se encuentran en aquellas bacterias provistas de ella, estando formados por polmeros de azcares. En las bacterias Gram(-), los antgenos de la pared tienen como constituyente principal, un complejo polisacardico cuya especificidad antignica viene en funcin de la naturaleza y variabilidad de las cadenas de azcares que lo componen, no de la pared lipdica. Estos antgenos somticos de la bacterias Gram(-) se denominan antgenos-O, debido al tipo de enlace y la posicin en las cadenas de los azcares, siendo especficos de cada grupo de bacterias. Los antgenos flagelares son molculas de protenas fibrosas que constituyen los cilios de las bacterias flageladas y se les denomina antgenos-H, aunque los determinantes antignicos responsables de su especificidad son desconocidos. En algunos casos existen antgenos capsulares, aunque a veces se tratan de estructuras externas de la pared, formadas por polisacridos altamente polimerizados. Estas sutancias son inmungenas y en general especficas de tipo. Test de aglutinacin: Al poner un antgeno en presencia de sus anticuerpos especficos se produce la combinacin entre ellos, dando lugar a la formacin de un agregado, que a lo largo del proceso va hacindose ms voluminoso y se observa ms claramente al flocular en la suspensin que lo contiene. En las soluciones acuosas, las bacterias se mantienen dispersas gracias a los grupos hidrfilos que poseen en su pared. La aglutinacin se va a producir por medio de los anticuerpos especficos y sus determinantes antgenos. Al agregar un antisuero, los determinantes antignicos de la pared bacteriana se bloquean por la fijacin de los anticuerpos. Como stos tienen dos sitios de combinacin, pueden reaccionar con dos unidades bacterianas diferentes formando redes tridimencionales que dan lugar a agregados, los cuales reunindose por aproximacin entre s forman aglutinados ms o menos

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voluminosos. Su tamao y velocidad de formacin estn en funcin de la concentracin srica, del pH, de la temperatura, de la agitacin y de la relacin entre las cantidades de antgenos y anticuerpos puestos en contacto. Este test, por su sencillez, se utiliza frecuentemente para la diagnosis y deteccin rpida de muchas bacterias fitopatgenas. Para su ejecucin no se necesita ni gran experiencia ni aparatos complicados, sino todo lo contrario. Puede efectuarse en portaobjetos o en tubo de ensayo. a. Aglutinacin en portaobjetos: Podemos afirmar que este ensayo serolgico es la prueba ms sencilla de realizar de todas cuantas van a exponerse. Aunque el mtodo fue puesto a punto por TIPOGRAF (1941) en la URSS para el diagnstico directo de Conybacterium sepedonicum sobre plantas, no obstante no suele aplicarse actualmente a detecciones directas sobre material vegetal debido a la elevada concentracin bacteriana necesaria para poder visualizar la reaccin, por lo que tan solo se utiliza con cultivos de bacterias previamente aisladas. Una de sus mltiples aplicaciones en laboratorio la constituye su inestimable utilidad en la identificacin de Erwinia amylovora cuyos aislados (al menos por el momento) son por un lado antignicamente homogneos y por el otro muy diferentes de los de las bacterias asociadas normalmente en infecciones mixtas con ella. El proceso de ejecucin del test es el siguiente: Extraer con un asa una parte de un cultivo y suspenderla uniformemente en agua fisiolgica (0.85% CINA), o en tampn fosfato salino 0.05M pH 7,2, o en casos de necesidad simplemente agua destilada estril. Colocar en un porta objetos una gota de la suspensin anterior, procurando que sea densa. En ocasiones esta suspensin se prepara directamente en el porta objetos, depositando en l una gota de tampn y emulsionando el contenido de una asa con la que se ha extrado parte de un cultivo. Depositar prxima a la gota anterior, otra de volumen similar, de antisuero a la disolucin adecuada (normalmente comprendida entre 1110 y 1150) en agua fisiolgica. Poner cuidadosamente en contacto ambas gotas para que vayan mezclndose. Para ello se toma el porta objetos con los dedos, balancendolo muy suavemente hasta producir el contacto entre ambas (por tanto, de antgeno y anticuerpo) y dar lugar al comienzo de la reaccin. sta se hace visible al cabo de un cierto perodo de tiempo mnimo de unos 3-5 minutos. Los casos difciles o dudosos pueden resolverse con ayuda de una lupa, aunque siempre es conveniente hacerlo de este modo.

El test debe plantearse con los siguientes ensayos:

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a. La cepa problema con el antisuero. b. La cepa problema y el suero fisiolgico. c. Un testigo positivo homlogo del antisuero. El establecimiento de este sistema tiene por objeto la comprobacin de si la bacteria en estudio presenta por s misma capacidad de aglutinacin directa con el suero fisiolgico al tiempo de detectar una posible contaminacin por descuido o error del operario. La prueba c debe efectuarse previamente para tratar de conocer la dilusin ptima del antisuero que debe emplearse, efectuando ensayos de dilucin de agua fisiolgica, a escalas de 112, 114, 118, 1116, 1132, 1164, etc., para una concentracin del antgeno de 100 bactlml, observando el lmite de dilusin que es visible la reaccin. Entonces para trabajar se elige el nmero de dilusin anterior al lmite encontrado antes (si por ejemplo se observa aglutinacin hasta 1164, se adopta para trabajar 1132). b. Aglutinacin en tubo: Este mtodo es ms sensible que el anterior, siendo su ejecucin de la forma siguiente: Colocar en la gradilla de 10 a 12 tubos de aglutinacin o Waserman. Depositar 1,8 ml en el primer tubo y 1 ml en los restantes, de agua fisiolgica tamponada (solucin salina 0,85%), diluida 10 veces en el momento de su empleo. Preparar la dilucin adecuada del antisuero con agua fisiolgica, tomando como referencia la dilucin ptima, que deber haberse efectuado previamente. Depositar con una pipeta 0,2 ml de la dilucin del antisuero anterior, en el primer tubo, mezclando ambas mediante succin y descargas sucesivas del lquido con la pipeta, hasta producir una mezcla homognea. Pipetear 1 ml de la mezcla anterior y depositarla en el segundo tubo, repitiendo la operacin anterior hasta su homogeneizacin. Repetir la serie de pipetos y mezclas hasta el penltimo tubo, tirando la parte correspondiente a ste y quedando el ltimo como control (sin antisuero). Depositar en cada tubo 1 ml de suspensin bacteriana de 9 bact/ml en suero fisiolgico. Mezclar bien los contenidos de los tubos para lograr una perfecta homogeneizacin. Incubar los tubos a temperatura ambiente durante media hora. Observar la aparicin de la aglutinacin semitransparente o blanquecina a modo de humo blanco, siendo la ltima aquella en que se percibe en el interior de la mezcla depositada en el tubo.

La suspensin bacteriana anteriormente citada puede prepararse con clulas bacterianas, tanto vivas como muertas. Se ha demostrado que en algunos casos, tales como las bacterias de los gneros Pseudomonas y Xanthomonas, los antgenos termostables son ms especficos que los termolbiles. Por ello muchas veces resulta aconsejable coagular los antgenos termolbiles, lo cual puede llevarse a cabo mediante ebullicin en un bao de Mara de la suspensin bacteriana durante dos horas.

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Test de doble difusin de agar: Es un mtodo de precipitacin, entendiendo como tal el proceso de reaccin entre antgenos y anticuerpos especficos, en que primeramente se produce una combinacin entre ambos, formando agregados de alto peso molecular que mediante procesos fsico-qumicos (distribucin de cargas elctricas, etc.) dan lugar a macro-molculas insolubles que precipitan. Este mtodo es ms sensible que los de aglutinacin, teniendo la ventaja de que pueden estudiarse y compararse simultnea e independientemente varios antgenos y antisueros. Para ello se emplazan ambos separadamente en pocillos efectuados en una capa de gel de agarosa y al difundirse a travs de sus poros y entrar en contacto entre s dan lugar a una reaccin de precipitacin en forma de lneas visibles. La cantidad de cualquiera de los reactivos en un punto dado del precipitado, es funcin de dos factores principales: a. Su concentracin inicial. Una vez emplazado el reactivo en el pocillo correspondiente, comienza su difusin en el gel en sentido radial, formndose a partir del centro un gradiente continuo pero de concentracin decreciente. b. La velocidad de difusin en el medio. El ms utilizado es el gel de agar. Siendo ste un polisacrido extrado de algas marinas. Es soluble en el agua a 95 C y forma un gel cuando se enfra a 37 C. Al gelificar, las molculas forman poros cuyo tamao vara inversamente a la concentracin del agar. Una vez que los reactivos se difunden en el medio gelosado, se produce la reaccin serolgica de precipitacin en aquellos puntos en que las concentraciones de antgeno y anticuerpo estn en equilibrio. La banda de precipitacin ser tanto ms marcada cuanto mayor sea la cantidad de antgenos y anticuerpos reaccionantes, siendo ms ntida y precisa, sin alargarse exageradamente, cuando los reactantes estn en equilibrio. Teniendo en cuenta que la velocidad de difusin de los diferentes antgenos y anticuerpos en el medio gelificado es variable segn su tamao, si se investiga organismos compuestos por diversos antgenos, como en el caso de las bacterias, se formarn bandas de precipitacin sucesivas de manera ordenada. Por lo tanto cada banda formada determinar una estructura antignica especfica, por lo que el serotipo de la bacteria en estudio estar representado por el nmero total de bandas que componen la reaccin, o sea la suma de estructuras antignicas que componen la bacteria. El test de doble difusin en agar fue descrito en 1946 y desarrollado por OUCHTER LONY (1958). La sencillez del mtodo, al no requerir manipulaciones ni aparatos complicados, ha hecho que sea altamente utilizado para diagnosis de numerosos agentes patgenos. Su nico inconveniente es que la cantidad de antisuero utilizada es mayor que en otros mtodos. Para la correcta aplicacin del mtodo, debe tipificarse la concentracin de antgeno en 109 clulas/ml con objeto que las comparaciones con antgenos frente a una concentracin dada de antisuero sea uniforme. Algunos autores destruyen los componentes antignicos no especficos, pasando las suspensiones bacterianas por autoclave a 121 C durante dos horas.

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La realizacin del test se lleva acabo de la manera siguiente: Se prepara una suspensin de agar purificado al 0,8 por 100 contenido de 0,85 por cien de CINA y 0,02 por cien de azida de sodio como conservante, en agua destilada, hasta total disolucin del agar para lo cual debe hervir la solucin. Si se utilizan cajas de Petri de 100 x 15 mm, se depositan en ellas con ayuda de una pipeta 15 ml de la solucin an caliente, dejando enfriar hasta la solidificacin y cerrando a continuacin la placa. Si se utilizan portaobjetos, stos deben emplazarse sobre bastidores de plstico exprofeso, bien equilibrados hasta conseguir una perfecta horizontalidad. A continuacin con la ayuda de una pipeta Pasteur o similar se depositan gotas o pequeas cantidades de solucin caliente entre los bordes de los portas y el del bastidor, con el objeto de que al enfriarse gelifique y deje sellados ambos entre s. Una vez solidificado el gel de unin se deposita encima de los portas de nuevo solucin caliente, con ayuda de una pipeta hasta conseguir llenar el bastidor entero, con lo que se obtendr tras solidificacin del gel por enfriamiento una capa de 1 mm de espesor. Los bastidores pueden conservarse hasta su utilizacin en cajas de plstico hmedas a 4 C. La formacin de pocillos en el gel, puede efectuarse con una plantilla agujereada segn un esquema previsto (nmero de pocillos) y con ayuda de una sacabocados del dimetro a utilizar deseado. Este esquema se utiliza generalmente para caja de Petri empleando las siguientes medidas: dimetro del pocillo 5 mm, distancia entre pocillos 10 mm. Si por el contrario se utilizan bastidores con portaobjetos, existe un aparato manual que efecta el agujereado del gel de los portas asimismo segn el esquema elegido. En este caso el dimetro del pocillo es de 2 mm y la distancia entre pocillos es de 6 mm. Una vez efectuados los cortes en el gel para conformar los pocillos, mediante una pipeta Pasteur acoplada a travs de una goma a una bomba de vaco, se succionan las porciones circulares cortadas, quedando as listos para poder ser llenados con los reactantes. Esta operacin de extraccin conviene hacerla inmediatamente antes de proceder a su rellenado. El esquema normalmente utilizado es el del de seis agujeros perifricos equidistantes entre s (situados en los vrtices de un hexgono) y de otro central. No obstante pueden emplearse modelos de cuatro y ocho agujeros, segn la complejidad y nmero de muestras a estudiar. En el pocillo central se deposita el antisuero que normalmente es de un volumen de 50 ul, a la distribucin conveniente. En los perifricos se depositan los antgenos involucrados en el estudio: la suspensin problema y sus dilusiones, los testigos, etctera, en el mismo volumen que el anterior.

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Cerrar las placas de Petri o bien colocar los bastidores en un chasis de tres alturas y depositarlo en una caja de plstico con un poco de agua en el fondo para obtener una atmsfera hmeda. Dejar reposar a temperatura ambiente unas horas. Observar las bandas de precipitacin formadas.

Test de Aglutinacin pasiva al Ltex: La realizacin del test se lleva a cabo en placas de perplex grueso, recuperables, o bien en lminas finas de plstico, desechables, pero en ambos casos provistas de pocillos semiesfricos en los que se depositan los reactivos y se lleva a cabo la reaccin. Diversos factores afectan al buen funcionamiento de la tcnica. En primer lugar, la concentracin del antisuero influye en la fijacin de los anticuerpos o de las inmunoglobulinas, o las partculas del ltex por lo que deber determinarse su ptimo ya que ste es un factor considerado crtico. En la aplicacin del mtodo se obtienen mejores resultados mediante la utilizacin de inmunoglobulinas purificadas que con antisueros brutos, o simplemente purificados. No obstante hay que tener presente que no todas las preparaciones de IgG obtenidas por precipitacin con sulfato de amonio, son igualmente efectivas para "sensibilizacin" de partculas de ltex, debido principalmente al grado variable de contaminacin con albminas y globulinas, etc. Algunos autores observan que estos hechos no tienen lugar cuando la preparacin de inmunoglobulinas se lleva a cabo mediante electroforesis o por fraccionamiento por el mtodo de Cohn, encontrado que el test resulta ms especfico y sensitivo. Nuestra experiencia nos muestra que una suspensin de suero-ltex bien hecha permite efectuar un gran nmero de pruebas serolgicas con una sensibilidad adecuada, evitando reacciones no especficas. Este producto es, normalmente, bastante estable si se conserva a 4 C, al menos durante unos meses. Laboratorios Sintomatologa: Familiarizarse con la sintomatologa producida por las bacterias fitopatgenas, compara diferentes mtodos de aislamiento de bacterias fitopatgenas. 1. Seleccione al menos 2 muestras sospechosas de estar afectadas por bacterias fitopatgenas, describa la sintomatologa, tratando de diferenciar sntomas jvenes, de viejos. 2. Observacin del flujo bacteriano: En el caso de manchas, marchitamientos o quemazones selecciones un pedazo de tejido foliar, crtelo aspticamente con su escalpelo, (mm.), y colquelo en un portaobjetos, con una gotita de agua destilada y djela por espacio de 1-3 minutos. Cubra la gota con el cubreobjetos y observe el lente de inmersin, (es necesario el uso de aceite), la aparicin del flujo bacteriano. 3. Estarn a disposicin del estudiante cajas de cultivos con los siguientes medios: YCA: 10 gr. de levadura, 5 gr. de CaCO3 en 1 000cc de agua destilada, con 16 gr. de agar bacteriolgico. Colquelo en la autoclave por 15 minutos. YDCA: El mismo medio anterior agregando 10 gr. de dextrosa.

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AN: Agar nutritivo. Extracto de carne 3 gr., peptona de carne 5 gr. y 15 gr. de agar bacteriolgico en 1 000cc de agua destilada. Estas cajas sern utilizadas para realizar los aislamientos del material a su disposicin, las metodologas a usar sern discutidas en el momento del laboratorio. Cultivo puro, preservacin y mantenimiento: Para la obtencin de cultivos puros, tres (3) diferentes le sern discutidos (Na = agar nutritivo, YCA = agar levadura, CaCO3 y YCDA = agar levadura dextrosa y CaCO3) la composicin exacta de los mismos le fue dada en el laboratorio anterior. 1. De sus placas donde se realiz sus aislamientos iniciales, seleccione una colonia aislada sospechosa de ser patognica (creci despus de 24 horas en el medio, es la ms frecuente) con su asa de platino, previamente flameada y enfriada, repita el procedimiento de estriado para nuevamente obtener colonias aisladas, realiclo en los tres diferentes medios, dos placas de cada medio, previamente anote color de la colonia, brillo, elevacin y forma, luego de dos o tres das tome nuevamente una colonia para dar inicio a su cultivo puro. 2. De las segundas placas se da inicio al cultivo puro, se le suministra tubos con agar inclinado y diferentes medios (YCDA - YCA). Tubos con slo agua destilada, tubos con glicerol. 3. Siembre su cultivo puro tomando las precauciones en sus diferentes tubos de agar inclinado, dos tubos por cada medio por aislamiento, djelo crecer hasta que sea visible el crecimiento de la bacteria, dos o tres das, luego cbralo con: a.- Aceite mineral, b.- glicerina; un tubo cubierto de cada una de stas maneras. Los tubos con agua destilada sern tratados en dos formas; una dilucin de la bacteria bastante trbida (3 ml) se agrega a 4 ml de agua destilada estril, se mezclar y se guardar. Un ltimo procedimiento ser con la bacteria disuelta en agua destilada. Cultivo de 48 horas (trbido). Tome tres ml y colquelos en un tubo, luego aada la misma cantidad de glicerol y gurdelo. Todos pueden ser guardados a 4 C con excepcin del tubo con glicerol que se colocar a temperaturas de congelacin. El objetivo es comparar stos 4 medios de guardar o preservar bacterias, la penltima semana de clases, el material ser tomado y sembrado para realizar las comparaciones respectivas. Tincin de Gram: Este tipo de tincin nos diferencia las bacterias en dos amplios grupos: Gram positiva y Gram negativa. Gram positiva: retiene la tincin primaria dando una apariencia prpura a negro azulosa. Gram negativa: pierde la tincin primaria y toman un color rosado suave.

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Procedimiento: En una lmina porta objetos limpia, coloca una gota de suspensin bacteriana (48 horas de crecimiento) y realice un frotis con su asa de platino, squelo al aire (sin calentarlo), suavemente pase por la llama la parte opuesta del porta objetos, para fijar la bacteria al porta objetos. Llene el frotis preparado y fijado con la solucin cristal violeta por un minuto. Lave en agua corriente el exceso (pocos segundos), drene el exceso de agua, y suavemente seque mediante toalla de papel. Llene el frotis (o cbralo), con una solucin de lodine por un minuto. Lave en agua corriente por pocos segundos, squelo. Decolore con solvente (alcohol - etlico), por 30 segundos, seque (si el descolorizador es utilizado por mayor tiempo, la bacteria Gram (+) puede perder color). Lave con agua corriente por 2 segundos. Coloque la solucin de safranina por 10 segundos. y- Lave rpidamente en agua corriente, seque y observe.

Tincin con rojo congo: Coloque una gota de rojo congo en una lmina portaobjetos, con su asa de platino, coloque la suspensin bacteriana (48 horas de crecimiento), y mzclela con rojo congo, haga un frotis y deje secar al aire, una vez seco el frotis agregue unas gotas de alcohol cido (3 gotas) de tal manera que cubra bien el frotis, deje secar al aire. Agregue una gota de aceite de inmersin y observe al microscopio con aumento de 1 00 x (lente de inmersin). KOH al 3%: coloque en el portaobjetos una gota de KOH al 3%, tome de su preparado bacteriano (caja de cultivo, 48 horas de crecimiento) con su ansa de platino, una pequea porcin de bacteria y mzclela bien, tome un palillo o una aguja de diseccin, introdzcala en la preparacin y trate de suspenderla, si se forma una suspensin mucoide, que se suspende 0,95 cm del portaobjeto, se est en presencia de una bacteria Gram (-), si no se forma esto, se est en presencia de una bacteria Gram (+) Pruebas de Patogenicidad: Antes de realizar las pruebas bioqumicas o paralelamente a las mismas, debemos tener la seguridad de que estamos trabajando con un patgeno de plantas, para lo cual las pruebas de patogenicidad y el reaislamiento nuevamente de las colonias bacterianas es una necesidad. Antes de entrar en materia debemos recordar que las bacterias a diferencia de numerosos hongos no secretan sustancias que disuelven la cutcula de la planta, no emiten haustorios u otros. Las bacterias slo pueden penetrar en forma pasiva, algunas lo hacen a travs de aperturas naturales como estomas, hidtodos y lenticelas, otras a travs de heridas o daos sufridos por la planta. Las bacterias no penetran la pared celular o crecen dentro de las clulas de la planta hospedante, ellas crecen en los espacios intercelulares o en los sistemas vasculares. Tipos de Inoculacin: Para conocer si nuestra bacteria es patognica, pueden realizarse diferentes tipos de inoculacin, aspersin de la bacteria sospechosa es un mtodo muy usado y efectivo, con aquellas enfermedades bacterianas que producen manchas, ya que por lo general stas son bacterias que penetran por las aperturas naturales, como lo es el caso de la Xanthomonas y muchas

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Pseudomonas, pero es una metodologa poco eficaz en el caso de bacterias que penetran por heridas y provocan pudriciones, aqu deber emplearse cualquier metodologa que involucro heridas, pinchado con la bacteria, inyeccin, heridas cortantes con material embebido en la bacteria, macerado con carborudum y la bacteria en suspensin y luego frotamiento de las hojas, en fin existen muchas posibilidades. En nuestro laboratorio combinaremos: aspersin y heridas a las hojas con alfileres, cubriendo de este modo todos los patgenos posibles. La planta a usar: Deben estar en estado de crecimiento, jvenes, con buen follaje y deben eliminarse cualquiera que presente anomalas, sntomas de deficiencia, etc., deben ser regadas y abonadas regularmente. Preparacin del inoculo: El inculo debe provenir de cultivos puros con 24 - 48 horas de crecimiento, con una concentracin 103 - 105 cl/ml para aspersin y de cerca de 106 cl/ml cuando es inyeccin, se disuelve en agua destilada, o en solucin buffer fosfato con pH 7.0, debemos tener en cuenta que concentraciones muy elevadas de inculo causan sntomas atpicos, por lo general necrosis seca alrededor del sitio de inyeccin, los sntomas tpicos bacterianos son por lo general en su etapa inicial acuosos (water soaking), esos sntomas atpicos se presentan como una respuesta de defensa de la planta, y pueden confundir al investigador, Al principio nuestro inters es de que las plantas se enfermen, para conocer si nuestra bacteria es patognica, pero luego nos interesa repetir exactamente los sntomas producidos en condiciones de campo. Post - Tratamiento: Mantendremos las plantas por un perodo de 24 - 48 horas en cmara hmeda (100%) despus de la inoculacin, para asegurar las mejores condiciones a la penetracin de las bacterias. Aspersin: Existen numerosos aparatos que pueden ser utilizados, desde una bombita de barbero, hasta un atomizador de alta presin, en pruebas de campo asperjadoras cumplen un buen trabajo y es recomendable la inoculacin en la tarde (6 pm) para darle a las plantas al menos 12 horas de mayor humedad, una inoculacin en el campo en la maana (8 am) seguida de unas 10 horas de sol contina est condenada al fracaso. Observacin de las plantas: Las plantas deben ser observadas diariamente por un tiempo de 14 das, en los cuales se comparan con los controles, plantas inoculadas solo con agua, o con un contaminante bacteriano. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA AGRIOS, G. 1978. Plant Pathology. 2 ed. Academic Press. New York. 703 p. JAUCH, C. 1985. Patologa Vegetal. 3 de. El Ateneo. Buenos Aires. 320 p.

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Manual de Laboratorio Diagnstico de Hongos, bacterias y nemtodos fitopatgenos. 1991. Ministerio de Agricultura, pesca y alimentacin. Direccin general de Sanidad de la Produccin Agraria. Madrid. 485 p. Manual para Patlogos Vegetales. 1985. Common Wealth Mycological Institute. England. 438 p. Kew Surrey

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