Anda di halaman 1dari 16

ISOLASI DAN PEMISAHAN PROTEIN

Pendahuluan
Protein adalah molekul organik yang terbanyak di dalam sel. Lebih dari 50% berat kering sel terdiri atas protein. Selain itu, protein adalah biomolekul yang sesungguhnya, karena senyawa ini yang menjalankan berbagai fungsi dasar kehidupan, antara lain proses berkontraksi melakukan gerak, menjalankan berbagai proses metabolisme dalam bentuk enzim. Protein dapat pula berperan membawa informasi dari luar ke dalam sel dan di dalam bagian-bagian sel sendiri. Protein juga mengendalikan dapat tidaknya, serta waktu yang tepat untuk pengungkapan informasi yang terkandung di dalam DNA, yang diperlukan untuk sintesis protein itu sendiri. Jadi secara tidak langsung protein mengatur perbanyakan diri sendiri dengan mengatur DNA, yang merupakan alat perekam informasi untuk protein, sehingga dengan demikian operasinya di bawah kendali protein. Secara kimia, protein adalah heteropolimer dari asam-asam amino, yang terikat satu sama lain dengan ikatan peptida. Ada suatu universalisme di dalam molekul protein. Protein apapun dan berasal dari makhluk apapun juga ternyata hanya tersusun dari 20 macam asam amino saja. Perbedaan protein yang satu dengan yang lain disebabkan oleh jumlah dan kedudukan asam-asam amino tersebut di dalam tiap-tiap molekul. Kedua puluh asam-amino itu mempunyai ciri umum sebagai berikut. Pertama, semuanya mempunyai konfigurasi L. Kedua, sama-sama mempunyai 1 gugus COOH dan 1 gugus NH2 yang terikat ke atom C. Perbedaan individual dari asam-asam amino ini disebabkan

oleh perbedaan rantai samping. Yang menyebabkan perbedaan kimia antara asam-asam amino tersebut, pada gilirannya akan menyebabkan perbedaan sifat kimia dan biologis dari molekul protein yang disusunnya. Rantai samping R ini tidak ikut membentuk ikatan peptida. Muatan suatu protein dalam suatu larutan ditentukan oleh gugus NH2 bebas di suatu ujung dan gugus COOH bebas di ujung yang lain serta jumlah rantai yang bermuatan. Molekul protein, melalui ikatan hidrogen, berinteraksi dengan molekul air membentuk mantel air. Karena molekulnya besar, di dalam air protein membentuk larutan koloid. Adanya sejumlah elektrolit dengan konsentrasi encer sanat meningkatkan kelarutan suatu protein (salting in). Sifat ini, yaitu kelarutan dalam bentuk larutan koloid yang dipermudah oleh mantel air dan elektrolit encer, dimanfaatkan untuk pemisahan protein. Selain itu, sifat lain, yaitu ukuran molekul yang berbeda sebagai akibat dari jumlah asam amino yang menyusun dan muatan yang tidak sama antar protein yang satu dengan yang lain karena perbedaan jenis asam amino yang menyusunnya, menjadi dasar dari pemisahan protein yang akan dilakukan pada praktikum berikut ini.

Tujuan Praktikum :
1. Mengenal reaksi umum berdasarkan adanya beberapa ikatan peptida pada suatu protein dan mampu menggunakannya untuk melacak protein dalam suatu bahan 2. Melakukan pemisahan suatu protein dari kelompok protein lain secara reversibel dengan menggunakan larutan garam divalen konsentrasi tinggi (salting out) dan menerangkan mekanisme pemisahan tersebut. 3. Melakukan pemisahan protein secara reversibel, dengan menggunakan bahan higroskopis dan menerangkan mekanisme pemisahan tersebut. 4. Melakukan pemisahan protein secara denaturasi ireversibel dengan menggunakan pereaksi alkaloid, menerangkan mekanisme kerjanya dan mampu menggunakan untuk melacak protein. 5. Memperlihatkan kemampuan logam berat dalam mengendapkan dan mendenaturasi protein dan menjelaskan masalah yang ditimbulkan oleh logam berat sebagai pencemar lingkungan.

6. Mengetahui cara pemisahan suatu protein dari protein lain ataupun senyawa lain, berdasarkan perbedaan berat molekul, dengan menggunakan cara kromatografi gel penyaring molekul sederhana.

Percobaan Protein

1. Uji Biuret

Tujuan :
Memperlihatkan bahwa protein mempunyai ikatan peptida yang bereaksi positif dengan uji biuret. Reaksi ini tidak terjadi pada makromolekul lain.

Dasar :
Ikatan-ikatan peptida yang menyusun protein dan polipeptida, dalam larutan bersuasana alkali akan berwarna lembayung bila direaksikan dengan Cu++.

Bahan dan Pereaksi :


1. Larutan albumin atau putih telur 2. Air liur 3. Larutan pati 1% 4. Human serum 5. Aquades 6. NaOH 10% 7. Larutan CuSO4 0,1%

Cara Kerja dan Hasil :


Menyiapkan 5 tabung reaksi yang bersih. Mempipetkan ke dalam tabung reaksi, seperti pada tabel 1.

Tabel 1. Tabung Larutan albumin 1 1 mL 2 -

Prosedur Reaksi biuret 3 4 5 -

(putih telur) Air liur 1 mL Larutan pati 1 mL Air suling 1 mL Serum sapi 1ml NaOH 10% 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1ml * 1 tetes 1 tetes 1 tetes 1 tetes 1 tetes Larutan CuSO4 Warna lembayung Ya Ya Tidak Tidak Ya * Bila belum terbentuk warna lembayung, CuSO4 dapat ditambahkan lagi, sampai 10 tetes.

Kesimpulan :
Dari hasil percobaan di atas menunjukkan bahwa yang membentuk warna lembayung/ungu adalah tabung yang berisi larutan albumin (putih telur), air liur, dan serum sapi. Protein akan bereaksi positif pada uji biuret karena protein mengandung ikatan peptida. Ikatan peptida akan bereaksi dengan Cu++ dan menghasilkan warna lembayung (ungu) dalam suasana alkali. Dari percobaan diatas dapat disimpulkan bahwa larutan albumin dan air liur mengandung protein, sedangkan larutan pati dan air suling tidak mengandung protein.

Jawaban Pertanyaan :

1. 2.

Apakah uji ini akan positif untuk asam amino?

=Ya, uji ini akan positif terhadap asam amino yang mengandung protein dengan memiliki ikatan peptida.

Asam amino apa saja yang menyusun protein?

=Asam amino yang menyusun protein antara lain : Glisin, Alanin, Valin, Leusin, Isoleusin, Fenilalanin, Metionin, Prolin, Triptofan, Serin, Treonin, Tirosin, Asparagin, Glutamin, Sistein, Aspartat, Glutamat, Arginin, Lisin, Histidin.

3.

Bagaimana pengelompokan asam amino?

=Pengelompokan asam amino adalah: Asam amino dengan gugus R nonpolar, Asam amino dengan gugus polar R netral, Asam amino dengan gugus R bermuatan,yang terdapat dalam pengelompokan Simple dan Conjugated. 4. Apa yang dimaksud dengan asam amino essensial? Asam amino apa saja yang essensial? =Asam Amino esensial adalah asam amino yang dibutuhkan oleh tubuh tapi tidak diproduksi oleh tubuh. Contohnya : Arginin, Histidin, Isoleusin, Methionin, Phenylalanine, Threonin, Triptofan, Valin, Leusin. Sedangkan asam amino non esensial adalah asam amino yang tidak begitu dibutuhkan oleh tubuh. Contohnya : Hydroxiproline, Hydroxilisine, Glysine, Proline, Serin, Tyrosin, Aspargin, Glutamat, Glisin, Cystein, Alanine. 5. Gambarkan ikatan peptida! O H2N Residu N CH-C R1 H CH N R2 Residu C Ikatan peptida O C OH

2. Pengendapan Protein Dengan Larutan Garam Konsentrasi Tinggi (Salting Out)


Tujuan :
Memperlihatkan bahwa sebagai makromolekul yang larut dalam bentuk larutan koloid, protein dapat dipisahkan satu dari yang lain, dengan menggunakan larutan garam divalent konsentrasi tinggi.

Dasar :
Untuk larutan dalam air, suatu molekul harus dapat berinteraksi dengan molekul air dengan cara membentuk ikatan hidrogen sehingga molekul tersebut tersebar rata diantara molekul-molekul air. Adanya muatan listrik pada molekul terlarut sangat membantu kelarutan, karena muatan yang sama saling menjauhi, sehingga agregasi molekul tidak terjadi. Protein merupakan makromolekul karena memiliki BM (berat molekul) besar. Pada umumnya,protein mudah larut dalam air karena protein mempunyai kedua sifat berikut. Gugus -CO- dan NH- yang ada pada iktan peptida dapat berinteraksi dengan molekul air melalui ikatan hidrogen, sedangkan berbagai rantai samping, yang diantaranya ada yang hidrofilik,bahkan juga bermuatan, sangat mudah berinteraksi dengan molekul air. Selain itu, muatan listrik yang sama dalam 2 partikel molekul protein yang sama, akan bertolakan, sehingga membantu meningkatkan kelarutan protein (salting in). Setiap keadaan yang menyebabkan ditariknya air yang mengelilingi molekul protein, sangat mengurangi kelarutan protein, sehingga protein mengendap. Larutan garam berkonsentrasi tinggi bersifat demikian. Selain itu, larutan garam berkonsentrasi tinggi akan menetralkan muatan listrik, sehingga kelarutan akan makin berkurang.

Oleh karena pengendapan dengan cara ini hanya bersifat menarik air di sekeliling protein, sedangkan molekul protein sendiri tidak mengalami perubahan kimia, maka perubahan tersebut bersifat reversible. Kelarutan dan fungsi protein pada umumnya akan pulih kembali bila dikembalikan ke keadaan semula. Larutan garam divalent lebih efisien dalam mengendapkan protein, karena di dalam air garam tersebut akan berdisosiasi menjadi 3 ion, yang masing-masing berinteraksi sempurna dengan air. Sebagai contoh, globulin dapat diendapkan oleh (NH4)2SO4 setengah jenuh, sedangkan NaCl baru dapat mengendapkan protein tersebut bila berada dalam larutan jenuh. Albumin, yang baru akan mengendap oleh (NH 4)2SO4 jenuh, tidak dapat diendapkan oleh NaCl jenuh, kecuali dengan penambahan asam mineral dalam jumlah yang sangat kecil. Pada gambar 2.1 diperlihatkan mekanisme terjadinya pengendapan protein oleh garam dalam konsentrasi tinggi.

H H O H N NH3+

O H O H O H N

O H

RC

O + (NH4)2SO4 O

R+ Protein terlarut

NH3+ COOCOONH3+ NH3+ NH3+

COOCOO-

Protein beragregasi / mengendap

Gambar 1.

Pengendapan Protein Dengan Cara Salting Out

Bahan dan Pereaksi :


1. Serum sapi 2. Larutan ammonium sulfat (NH4)2SO4 jenuh dan1/2 jenuh 3. Larutan NaOH 10% 4. Larutan CuSO4 0,1% 5. Kertas saring+ corong

Cara Kerja dan Hasil :


Menyiapkan 3 tabung reaksi yang bersih dan kering. Melakukan prosedur seperti yang tertera dalam tabel 2 : Tabel 2. Percobaan salting out

1 Serum sapi 1 ml Amonium sulfat jenuh : tetes demi tetes 1 ml Endapan : ada / tidak ada Ada endapan Amonium sulfat jenuh: tetes demi tetes* 1ml Endapan: ada / tidak ada Ada endapan Pisahkan endapan dengan menyaring Lakukan uji biuret terhadap: Filtrat Amonium sulfat jenuh Endapan Amonium sulfat jenuh Filtrat Amonium sulfat 1/2 jenuh (tidak berwarna lembayung) + (warna lembayung) + (warna lembayung)

Tabung

+ (warna lembayung) Endapan Amonium sulfat 1/2 jenuh * Amonium sulfat jenuh dibuat dengan cara mengencerkan Amonium sulfat jenuh dan aquades dengan perbandingan 1:1 *Amonium sulfat jenuh warna biru muda

*Amonium sulfat jenuh warna ungu/lembayung

Kesimpulan :
Protein dapat diendapkan dengan menggunakan garam konsentrasi tinggi melalui proses salting out. Dengan penambahan ammonium sulfat yang jenuh akan mengendapkan serum sapi sehingga larutan menjadi bersifat reversibel. Hal ini dikarenakan garam berdivalent tinggi lebih kuat menarik mantel air daripada protein dalam serum. Serum mengandung 2 jenis protein, yaitu globulin dan albumin. Setelah penambahan ammonium sulfat jenuh, ternyata terbentuk endapan. Dan setelah diuji dengan biuret, baik filtrat maupun endapan yang dihasilkan, sama-sama terbentuk warna ungu. Jadi, endapan yang dihasilkan adalah albumin, sedangkan filtrat adalah globulin, karena albumin akan mengendap pada penambahan ammonium sulfat jenuh.

Jawaban Pertanyaan :

1.

Pada penambahana satu volume ammonium sulfat jenuh ke dalam satu volum

serum terjadi pengendapan protein. Apakah nama protein tersebut? = Protein yang mengendap pada penambahan satu volume amonium sulfat jenuh ke dalam satu volume serum adalah protein Albumin.

2.

Apa nama protein serum yang tidak dapat diendapkan pada penambahan

ammonium sulfat jenuh tersebut? = Yang tidak dapat diendapkan pada percobaan tersebut adalah Globulin.

3.

Apa fungsi protein dalam darah dan di mana disintesis? = Fungsi Albumin adalah mengikat Ligand, albumin disintesis di hati. Fungsi

Protein dalam darah = sebagai transport dan storage. Contoh : CO2 dan O2 dalam darah / eritrosit. 4. Pada keadaan apa saja terjadi defisiensi protein tersebut dan apa gejala utamanya? = Alkaptonuria, defisiensi enzim homogentisic acid dioxygenase.Ditandai dengan perubahan warna urine yang menjadi gelap kalau didiamkan.

3. Pemisahan Protein Dengan Etanol Absolut


Tujuan :
Memperlihatkan, bahwa sebagai makromolekul yang larut, protein dapat dipisahkan dengan mengendapkannya dengan penambahan etanol absolut.

Dasar :
Etanol absolut bersifat sangat kuat menarik air (higroskopis). Penambahan etanol absolut pada suatu larutan protein, akan menyebabkan molekul air yang berinteraksi dengan molekul protein melalui ikatan hidrogen ditarik oleh etanol. Akibatnya molekul-molekul protein beragregasi satu sama lain sehingga mengendap. Bila agregat partikel protein tersebut dibiarkan bersentuhan dengan etanol untuk waktu yang lama endapan yang terbentuk tidak dapat dilarutkan lagi sehingga denaturasi yang terjadi irreversibel. Dengan menggunakan etanol berbagai konsentrasi dan suhu yang rendah, Cohn pada tahun empat puluhan telah berhasil memisahkan protein serum dalam 5 fraksi, dan fraksi V yang diperoleh sebagian besar terdiri atas albumin. Protein tidak dapat mengendap disebabkan oleh karena protein tersebut memiliki muatan listrik, gerak Brown, dan mantel air yang mempengaruhi pengendapan protein tersebut dalam larutan tertentu.

Bahan dan Pereaksi :


1) Serum 2) Larutan albumin telur 3) Etanol absolut 4) Larutan NaOH encer 5) Larutan CuSO4 6) Kertas saring dan corong

Cara Kerja dan Hasil :


Menyiapkan 3 tabung reaksi yang bersih dan kering. Lakukan prosedur yang tertera pada tabel 3 : Tabel 3. Percobaan Pengendapan Protein Dengan Etanol Absolut

Tabung 1 Serum 1 ml Larutan albumin telur Etanol absolut 1 ml Endapan: ada/tidak ada Ada endapan Pisahkan endapan dengan menyaring Uji biuret terhadap: Filtrat Endapan +

2 1 ml 1 ml Ada endapan

Kesimpulan :
Protein dapat dipisahkan dengan mengendapkannya dengan penambahan etanol absolut. Kemudian dipisahkan antara endapan dan supernatan, lalu dites biuret tetap memberikan hasil positif. Demikian juga serum dan etanol absolut, ditandai dengan warna ungu.

Jawaban Pertanyaan :
1. Sebutkan secara garis besar protein utama dari fraksi Cohn I sampai V. Fraksi I : Fibrinogen ,, ,- Globulin (Antibodi) Fraksi II :

Fraksi III : Fraksi IV : Fraksi V :

+A, 1, +2- Globulin (Kolesterol, Fosfatida, Karotenoid, VitaminA, Estrogen ), Isoaglutinin 1,2, 1, , , 2, + (Kolesterol, Fosfatida, Fosfatase, Esterase serum, Hipertensinogen ) Albumin

2. Apakah fungsi tiap-tiap protein tersebut? Fraksi I banyak berperan dalam koagulasi darah Fraksi II berperan sebagai Imunitas Fraksi III dan IV berperan sebagai Lipoprotein Fraksi V yaitu Albumin yang merupakan bagian terbesar dari elektroforesis ini berfungsi sebagai zat yang mempertahankan volume plasma(mencegah shock, Hipoproteinemia dan Odem)

4. Pengendapan Protein Secara Denaturasi Ireversibel

Pengendapan logam berat


Tujuan :

protein

dengan

Memperlihatkan, bahwa logam berat mengendapkan protein secara denaturasi ireversibel.

Dasar :
Logam berat akan mendenaturasikan dan mengendapkan protein. Peristiwa itu terjadi, bila berbagai gugus di permukaan molekul protein bermuatan negatif, sehingga membentuk garam dengan kation logam berat. Jumlah protein yang diendapkan sebanding dengan

jumlah logam berat yang ditambahkan. Makin banyak logam berat yang ditambahkan, makin banyak protein yang mengendap, selama dalam larutan masih terdapat protein. Protein tertentu memerlukan penambahan beberapa tetes alkali supaya protein tersebut bermuatan negatif. Selain itu, kelebihan logam berat dapat pula melarutkan kembali kompleks logam berat-protein, walaupun protein tersebut tetap dalam keadaan denaturasi.

Protein bermuatan negatif membentuk garam dengan kation logam berat menjadikan protein terdenaturasi dan mengendap.

Bahan dan Pereaksi :


1. Putih telur( albumin) 2. larutan HgCl2 1% 3. Larutan Pb-asetat 4. Serum sapi

Cara kerja dan Hasil :


Siapkan dua buah tabung reaksi, lakukan prosedur yang tertera dalam tabel 4. Tabel 4.B. Pengendapan Protein Dengan logam Berat

Tabung Putih telur (Albumin) Serum sapi HgCl2 Pb-asetat

1 1 ml Tetes - tetes -

2 1ml Tetes - tetes

3 1ml Tetes - tetes -

4 1ml Tetes - tetes

Endapan ada/tidak ada

Ada

Ada

Ada

Ada

Kesimpulan :
Pada percobaan di atas diketahui bahwa logam berat seperti HgCl2 dan Pb-asetat dapat mengendapkan albumin. Ini berarti protein terdapat pada albumin.

Jawaban Pertanyaan :
1. Apakah tiap kali penambahan logam berat diikuti oleh penambahan endapan protein? Mengapa? Ya, pada tiap kali penambahan logam berat selalu diikuti oleh penambahan endapan protein. Hal ini dikarenakan logam berat mempunyai sifat pendenaturasi protein dan kandungan kation logam berat akan bereaksi dengan molekul yang bermuatan negatif yang dapat memicu pembentukan endapan pada protein. 2. Berapa tetes setiap logam diperlukan untuk mengendapkan protein di kedua bahan tersebut? Masing-masing dibutuhkan 5 tetes untuk proses pengendapan kedua kation.

3. Sebutkan logam-logam berat yang menjadi pencemar utama lingkungan, sumber pencemaran dan jelaskan mengapa logam tersebut berbahaya. Sebutkan nama suatu penyakit berbahaya yang terkenal yang diambil dari suatu nama teluk di Jepang, yang disebabkan oleh keracunan logam berat. Logam berat apakah yang menjadi penyebab dan jelaskan bagaimana logam tersebut meracuni manusia? Logam berat yang menjadi pencemar utama lingkungan adalah Pb dan sumber pencemaran berasal dari asap kendaraan bermotor. Logam berat ini dapat membahayakan sirkulasi pernafasan, sehingga terjadi infeksi saluran pernafasan. Cystinuria. Ekskresi sistin dalam urine meningkat (bisa mencapai 30 x nilai normalnya). Ekskresi Lysine, Arginine dan reabsorpsi asam amino dari Maple Syrup Urine Disease 4. Apakah yang perlu dilakukan ,bila terjadi keracunan logam berat yang akut? Sebutkan pula apakah yang perlu dilakukan bila terjadi pemaparan kronis. Berilah Gangguan

contoh nyata pemaparan kronis. Hal yang dapat dilakukan bila terjadi keracunan logam berat yang akut adalah dengan meminum susu untuk menetralisirnya.

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA IV ISOLASI DAN PEMISAHAN PROTEIN

Disusun Oleh : AYU KARTIKA SARI ANGELA KRISTIANA INTAN (405080161) (405080162)

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS TARUMANAGARA 2008