Ce fascicule est organis de faon illustrer les diffrents thmes abords en cours magistral et en travaux pratiques. La prparation personnelle des exercices qui ncessite une matrise pralable du cours est vivement recommande afin de tirer le meilleur profit des sances de travaux dirigs.
La plupart des thmes sont prcds de quelques rappels thoriques des notions abordes en cours et qui vous seront utiles pour rsoudre les exercices. En aucun cas, ces rappels thoriques trs succincts ne remplacent le cours.
Les thmes 1 et 2 sont des rvisions des notions que vous devez avoir acquises en Licence 1 re anne dans le module BIO 121. Les thmes suivants illustrent directement le programme abord en Licence 2 me anne dans le cadre de ce module BIO 241.
CONTROLE DES CONNAISSANCES
Dans le cadre du module BIO 241, deux notes de contrle continu et une note dpreuve terminale nous permettront dvaluer vos connaissances. La premire note de contrle continu (CC1) sera une note de travaux pratiques. Le deuxime contrle continu (CC2) sera ralis sous forme dun examen crit (1h), au cours du semestre, et portera sur des notions abordes en cours magistral et travaux dirigs. Enfin, une preuve terminale crite (2h) se droulera la fin du module et portera sur lensemble des connaissances devant tre acquises dans ce module. La note finale de lUE = CC1(25%) + CC2(25%) + ET (50%)
TD BIO 241 2012-2013 AVANT-PROPOS 2 EQUATIONS UTILES
Equation de Henderson-Hasselbalch pH = pK a + log ([A - ] / [AH])
Variation dnergie libre dans les conditions non standard AG = AG o + RT ln ) [B] [A] [D] [C] (
Variation dnergie libre et potentiel redox AG o = - n F AE 0
Potentiel redox dans une raction doxydo-rduction AE 0 = E 0 (accepteur) E 0 (donneur)
Equation de Michaelis-Menten
KM [S] [S] V V max 0 + =
QUELQUES UNITES
Masse molaire, poids molculaire, dalton
- Masse molaire : masse dune mole de molcules de la substance, cest--dire la masse de 6,022.10 23 molcules. Elle sexprime en g.mol -1 .
- Poids molculaire : correspond au rapport entre la masse dune molcule de la substance et le douzime de la masse dun atome de carbone 12. Cest un nombre sans dimension.
- Dalton : unit introduite pour dfinir la masse de certaines particules biologiques pour lesquelles le terme de poids molculaire est impropre. Le dalton est le douzime de la masse dun atome de carbone 12, soit 1/6,022.10 23 grammes.
Les 3 modes dexpression font apparatre la mme valeur numrique pour un compos donn. Exemple pour lhmoglobine : on dira que cette protine a un poids molculaire de 64 000, ou une masse molaire de 64 000 g.mol -1 , ou encore quune molcule de cette protine possde une masse de 64 000 Da ou 64 kDa.
- Concentration massique. - Concentration molaire. - Concentration en % (p/v) ou en % (v/v). - Normalit. - Prparation dune solution de concentration exacte partir dune substance solide (solut). - Produit anhydre, produit hydrat. - Puret en %. - Dilutions en cascade.
Exercice n1 :
Vous voulez raliser un dosage des protines suivant un protocole appel mthode de Lowry. Pour cela, vous devez prparer diffrentes solutions : A- Solution de NaOH 0,1 M dans leau distille. B- Solution de CuSO 4 , 5H 2 O 1% (p/v) dans leau distille. C- Solution de tartrate double de K et Na (C 4 H 4 KNaO 6 ) 2% (p/v) dans leau distille. D- Solution de Na 2 CO 3 2% (p/v) dans NaOH 0,1 M.
1- Calculer les quantits de produits peser pour prparer 100 mL de chaque solution, sachant que vous disposez des poudres suivantes : - NaOH M = 40 g.mol -1 Puret = 97%. - CuSO 4 , 5H 2 O M = 249,68 g.mol -1 Puret = 98%. - C 4 H 4 KNaO 6 , 4H 2 O M = 282,22 g.mol -1 Puret = 98%. - Na 2 CO 3 , 10H 2 O M = 286,14 g.mol -1 Puret = 99%.
2- En pratique, comment procdez-vous ? Quel type de verrerie devez-vous utiliser ?
3- A laide de ces diffrentes solutions, vous devez ensuite prparer le ractif cuproalcalin selon le protocole suivant : - 1 mL de solution de sulfate de cuivre (B) - 1 mL de tartrate double de K et Na (C) - Complter 100 mL avec la solution de carbonate de sodium 2% (p/v) dans la soude 0,1 M. Calculer la concentration finale en sulfate de cuivre et en tartrate double de K et Na.
4- Comme vous navez aucune ide de lordre de grandeur de la concentration en protines de lextrait biologique dont vous souhaitez doser les protines, vous devez au pralable effectuer une gamme de dilutions en cascades de cet extrait : 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32. Comment ralisez-vous ces dilutions en cascades, sachant que vous devez raliser le dosage de chaque dilution en triplicata pour tester la reproductibilit de votre manipulation ? (voir le protocole exact du dosage ci-dessous). TD BIO 241 2012-2013 RAPPELS 6 Protocole du dosage des protines par la mthode de Lowry : - A 200 L dchantillon protique, ajouter 1 mL de ractif cuproalcalin et agiter. - Laisser reposer 15 min. - Ajouter rapidement 100 L de ractif de Folin-Ciocalteu et homogniser. - Laisser reposer 30 min. et lire labsorbance 750 nm contre un tmoin sans protines.
Exercice n2 :
A partir des donnes ci-dessous, calculer la molarit et la normalit des deux solutions. Indiquer comment prparer 1 litre de solution 1 N. 1- Acide actique (CH 3 CO 2 H) M = 60,05 g.mol -1 d = 1,05 Puret = 99,7%. 2- Acide sulfurique (H 2 SO 4 ) M = 98,08 g.mol -1 d = 1,83 Puret = 95%.
SPECTROPHOTOMETRIE
Notions dj acquises, revoir :
- Absorbance dune substance colore (spectre dans le visible) ou incolore (spectre dans lUV). - Loi de Beer-Lambert et ses limites. - Loi dadditivit. - Gamme talon.
Exercice n1 :
Le tryptophane prsente une bande dabsorption avec un maximum la longueur donde de 280 nm. Dans une cuve de trajet optique 1 cm, une solution de tryptophane 200 M a une absorbance 280 nm de 1,2.
1- Calculer le coefficient dextinction molaire du tryptophane.
Une solution de la protine X, la concentration de 25 M, prsente une absorbance 280 nm de 0,6. La protine X ne contient aucun rsidu tyrosine et phnylalanine.
2- Dterminer le nombre de rsidus tryptophane que contient cette protine X.
Exercice n2 :
Luracile et ladnine sont deux bases azotes qui prsentent un maximum dabsorption 260 nm. Une solution duracile 20 mol.L -1 prsente une absorbance 260 nm gale 0,24 dans une cuve de trajet optique 1 cm.
1- Calculer le coefficient dextinction molaire de luracile.
TD BIO 241 2012-2013 RAPPELS 7 Une solution contenant un mlange duracile et dadnine prsente une absorbance 260 nm gale 0,4 (cuve de 1 cm). Sachant que la concentration molaire en uracile est le double de celle de ladnine et que le coefficient dextinction molaire de ladnine 260 nm est de 16000 mol -1 .L.cm -1 :
2- Calculer les concentrations molaires en adnine et en uracile dans le mlange.
CONCEPT ACIDES / BASES FAIBLES
Notions dj acquises, revoir :
- Equation de Henderson-Hasselbalch. - Titration d'un acide faible par une base forte ; courbe de titration. - Solutions tampon.
Exercice n1 :
Calculer le pH des solutions tampon suivantes : 1- Acide actique (1 M) + actate de sodium (0,5 M). 2- Acide phosphorique (0,3 M) + KH 2 PO 4 (0,8 M).
Donnes : pKa de lacide actique = 4,76 ; pKa de lacide phosphorique = 2,14.
Exercice n2 :
Lacide phosphorique est un triacide. Il se trouve trs souvent associ diverses molcules biologiques (protines, lipides) sous forme de groupement phosphate. Son tat dionisation dpend du pH de la solution et des valeurs de ses pKa.
1- Quelles sont les formes prsentes pH physiologique (7,4) ? 2- Sous quelle forme va-t-on lcrire prfrentiellement ?
TD BIO 241 2012-2013 RAPPELS SUR LES PROTEINES 9 PROPRIETES DES ACIDES AMINES ET PEPTIDES
Notions dj acquises, revoir :
- Molcules caractre hydrophobe, polaire, apolaire. - Formule semi-dveloppe des 20 acides amins standard. - Attribuer chaque fonction ionisable la valeur de pKa correspondant. - Ecrire les quilibres de dissociation des acides amins et peptides. - Calcul du pHi dun acide amin et dun peptide. - Courbe de titration des acides amins et peptides.
Proprits des 20 acides amins rencontrs dans les protines :
Nom Abrviation pKa o-COOH pKa o-NH 3 +
pKa Chane latrale Masse molaire (g.mol -1 ) Alanine Ala, A 2,3 9,7 89 Arginine Arg, R 2,2 9,0 12,5 174 Asparagine Asn, N 2,0 8,8 132 Aspartate Asp, D 2,1 9,8 3,9 133 Cystine Cys, C 1,7 10,8 8,3 121 Glutamate Glu, E 2,2 9,7 4,3 147 Glutamine Gln, Q 2,2 9,1 146 Glycine Gly, G 2,4 9,6 75 Histidine His, H 1,8 9,2 6,0 155 Isoleucine Ile, I 2,4 9,7 131 Leucine Leu, L 2,4 9,6 131 Lysine Lys, K 2,2 9,0 10,5 146 Methionine Met, M 2,3 9,2 149 Phnylalanine Phe, F 1,8 9,1 165 Proline Pro, P 2,0 10,6 115 Srine Ser, S 2,2 9,2 105 Thronine Thr, T 2,6 10,4 119 Tryptophane Trp, W 2,4 9,4 204 Tyrosine Tyr, Y 2,2 9,1 10,1 181 Valine Val, V 2,4 9,6 117
Les diffrentes classes dacides amins :
En biochimie, la classification gnralement utilise traduit la capacit de lacide amin interagir avec son environnement (ex : capacit former des liaisons lectrostatiques, Hydrogne, ou de van der Waals).
1- Acides amins relativement apolaires hydrophobes - : (Gly), Ala, Pro, (Met), Val, (Tyr), Leu, Ile, Trp, Phe.
Ecrire les quilibres de dissociation et calculer le pHi des acides amins suivants : Leucine, Cystine, Histidine.
Exercice n3 :
On tudie le peptide tyrosyl-alanyl-glutaminyl-aspartyl-lysine.
1- Ecrire la formule semi-dveloppe du peptide pH = 1. Indiquer les extrmits N- terminale et C-terminale. Indiquez les carbones o. 2- Ce peptide comporte 5 fonctions ionisables dont les pKa sont respectivement : 2,2 ; 3,9 ; 9,1 ; 10,1 ; 10,5. Attribuer chaque valeur de pKa chaque fonction ionisable en justifiant votre rponse (daprs le tableau). 3- Ecrire les quilibres de dissociation et calculer le pHi du peptide. 4- Tracer la courbe de titration de 1 mole du peptide par la soude.
STRUCTURE ET METHODES DETUDE DES PROTEINES
Notions dj acquises, revoir :
- Structure primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire. - Interactions non covalentes (liaison hydrogne, liaison ionique, liaison de van der Waals, interaction hydrophobe) - Rle des agents dnaturants et des agents rducteurs sur la conformation des protines. - Prcipitation des protines par les sels ou les solvants organiques. - Mthodes chromatographiques. - Electrophorse sur gel de polyacrylamide en conditions natives ou dnaturantes.
TD BIO 241 2012-2013 RAPPELS SUR LES PROTEINES 12 Exercice n1 :
Dans des conditions de pH proches des conditions physiologiques, la masse molaire dune protine P a t dtermine par filtration sur gel. M = 140 000 g.mol -1 .
1- Rappeler le principe de la chromatographie par filtration sur gel.
Lorsque cette mme protine est tudie par lectrophorse sur gel de polyacrylamide en prsence de SDS avec ou sans 2-mercaptothanol, les profils lectrophortiques obtenus sont reprsents sur les pistes A et B de la figure suivante. La piste C contient les marqueurs de masse molculaire.
A : en absence de 2-mercaptothanol ; B : en prsence de 2-mercaptothanol ; C : marqueur de masse molculaire.
2- Quest-ce que le SDS et quel est son rle dans cette lectrophorse ? 3- Quel est le rle du 2-mercaptothanol ? 4- Sur quel (s) critre (s) sont spares les protines lors de cette lectrophorse ? 5- A partir de ces donnes, dcrire la protine P native en termes de masse molaire des sous-units prsentes, de stchiomtrie entre les sous-units et du type de liaisons (covalentes ou non) existant entre les sous-units.
Exercice n2 :
Dans une protine, identifier quels sont les groupes pouvant former des liaisons hydrogne ou lectrostatiques avec la chane latrale de larginine pH 7.
A B C Albumine srique : 67 000 Da Ovalbumine : 43 000 Da Anhydrase carbonique : 30 000 Da Inhibiteur de trypsine : 20 000 Da Dpts TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE 13
THEME N3 : ENZYMOLOGIE
ENERGIE DACTIVATION
CINETIQUE ENZYMATIQUE
INHIBITION
ACTIVITE ENZYMATIQUE
NOTION DE SITE ACTIF
TD BIO 2
Quelqu
Un cata ce fait, ractio droula
La loi e et la co
Avec : - - - -
Exercic
La rac suivant
241 2012-201 ues rappe LES E alyseur ag , il ne mo n. Les enz ant dans la empirique onstante de - k = const - T = temp - R = cons - Ea = ne - A = const ce : ction de d te : 2 H 2 3 ls thoriq ENZYMES git en abais odifie pas zymes aug a cellule, et e dArrhen e vitesse d tante de vi rature ab tante des g ergie dactiv tante. compositi 2 O 2
E ENERG ues : SONT DE ssant lne lquilibre mentent do t se retrouv nius perme de la ractio k tesse de la bsolue en k gaz parfait vation (J. m ion de lea 2 H 2 ENZYMOLOG 14 IE DACTI ES CATAL ergie dac e, mais au onc les vit vent intact et de relier on : k = Ae - Ea / a raction. kelvins. ts = 8,315 mol -1 ). au oxygn 2 O + O 2
GIE IVATION LYSEURS ctivation d ugmente s esses des es la fin r lnergie RT
J. mol -1 . K e (H 2 O 2 ) s BIOLOGIQ dune ract seulement processus de la ract
dactivatio K -1 . se droule QUES. tion chimiq la vitesse s biochimiq tion. on, la temp e selon la r que. De e de la ques se prature raction TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE 15 Cette raction peut avoir lieu sans catalyseur, en prsence dun catalyseur chimique (le platine collodal), ou en prsence dun catalyseur enzymatique (la catalase). 1- Daprs les donnes du tableau suivant, dterminer le facteur par lequel la vitesse de la raction est augmente en prsence de chacun des catalyseurs. 2- Quel est le catalyseur le plus efficace ?
Conditions de raction Ea (kJ.mol -1 ) 20C Aucun catalyseur En prsence de platine collodal En prsence de catalase 75 49 8
CINETIQUE ENZYMATIQUE
Quelques rappels thoriques :
1- Relation de Michaelis-Menten :
Le modle de Michaelis-Menten permet de dcrire le comportement dun grand nombre denzymes. Dans ce modle, une enzyme (E) fixe un substrat (S) pour former un complexe enzyme-substrat (ES) qui peut se dissocier en E et S ou conduire la formation du produit de raction (P). La vitesse de la raction enzymatique est dfinie par : V = dt [P] d dt [S] d = .
V = dt [P] d est, pour chaque temps t, la pente de la tangente la courbe [P] = f(t).
Si lon se place en condition de vitesse initiale (V 0 ), cest--dire dans des temps de raction trs courts, nous pouvons supposer que le produit nest pas converti de nouveau en substrat par la raction inverse.
Nous voulons tablir une expression qui relie la vitesse de catalyse avec les concentrations en substrat et enzyme. Notre point de dpart est : V 0
E + S ES E + P k 1 k -1 k 2 [P] Temps V = cte = V 0
V = cte = 0 TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE 16 [ES] k V 2 0 = (1)
Nous avons maintenant besoin dexprimer [ES] en termes de concentrations connues. Les vitesses de formation et de disparition de ES sont donnes par :
Vitesse de formation de ES : k 1 [E] [S] (2) Vitesses de disparition de ES : k -1 [ES] + k 2 [ES] Ou (k -1 + k 2 ) [ES] (3)
Pour simplifier, nous allons nous placer dans lhypothse de ltat stationnaire, cest--dire un tat dans lequel la concentration en ES reste constante. Cet tat stablit dans les tous premiers temps de la raction. La vitesse de formation de ES est donc gale sa vitesse de disparition :
k 1 [E] [S] = (k -1 + k 2 ) [ES] (4)
En rarrangeant lquation (4), on obtient :
1 2 1 k k k [ES] [S] [E] + =
(5)
Lquation (5) se simplifie en dfinissant une nouvelle constante, K M , appele la constante de Michaelis :
1 2 1 M k k k K + =
(6)
Lquation (5) devient alors :
M K [ES] [S] [E] = ou M K [S] [E] [ES] = (7)
Il faut maintenant exprimer [E] en termes de concentrations connues.
Examinons alors la loi de conservation de lenzyme :
[E] T = [E] + [ES] (8)
Ou encore : [E] = [E] T [ES] (9)
Lquation (7) devient alors :
M T K [S] [ES]) ([E] [ES]
= (10)
Do lon tire : M T K [S] [S] [E] [ES] + = (11) TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE 17 En revenant lquation (1) V 0 = k 2 [ES] et en substituant [ES] par son expression dans lquation (11), on obtient :
KM [S] [S] [E] k V T 2 0 + = (12)
La vitesse maximale tant atteinte lorsque toute lenzyme est sature en substrat et donc quand [E] T = [ES], on obtient :
V max = k 2 [E] T (13)
Lquation (12) devient ainsi la relation de Michaelis-Menten:
KM [S] [S] V V max 0 + = (14)
2- Reprsentations graphiques :
2.1- Reprsentation de Michaelis-Menten :
En fixant [E] et en faisant crotre [S], on constate que la vitesse crot et tend vers une limite V max quand toute lenzyme est sature de substrat, cest--dire quand toute lenzyme est sous forme de complexe ES. Ainsi, si [S] devient trs grande, K M << [S] et V 0 = V max .
2.2- Reprsentation de Lineweaver et Burk :
La reprsentation graphique de Michaelis-Menten ntant pas suffisamment prcise pour dterminer K M et V max , cest le plus souvent la reprsentation en double inverse 1/V 0 = f(1/[S] 0 ) qui est utilise. La reprsentation graphique de Michaelis-Menten ntant pas suffisamment prcise pour dterminer K M et V max , cest le plus souvent la reprsentation en double inverse 1/V 0 = f(1/[S] 0 ) qui est utilise. V max / 2 V max
[S] 0
V 0
S = K M
TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE 18
3- Signification de K M , k cat et k cat /K M :
- La reprsentation de Michaelis-menten montre que K M est gal la concentration en substrat avec laquelle la raction atteint la moiti de sa vitesse maximale. La constante de Michaelis K M est souvent associe laffinit de lenzyme pour son substrat. Cependant, cette relation nest valable que pour les ractions dans lesquelles k 2 est trs petit devant k -1 , ce qui conduit :
K M = 1 1 k k = Ks = constante de dissociation du complexe ES
- La constante catalytique k cat est gale k 2 . Elle reprsente le nombre de molcules de substrat transformes par une molcule denzyme en une seconde. Lunit de k cat est donc s -1 . Elle traduit lefficacit cintique de lenzyme.
- Cest en fait le rapport de ces 2 valeurs (k cat / K M ) qui traduit le mieux lefficacit catalytique dune enzyme.
4- Les effecteurs de lactivit enzymatique :
Les effecteurs sont des substances chimiques qui modifient l'activit des enzymes. On distingue : - les activateurs qui augmentent l'activit catalytique. Ex : certains cations augmentent l'activit des enzymes (Mg 2+ pour les kinases, Zn 2+ pour les phosphatases alcalines). - les inhibiteurs qui diminuent l'activit catalytique.
Nous ne dtaillerons ici que les inhibiteurs. Nous nous intresserons 2 types dinhibitions rversibles, cest--dire caractrises par une dissociation rapide du complexe enzyme-inhibiteur EI. Dune faon gnrale, un inhibiteur est li lenzyme mais nest pas transform par elle.
1 / V 0
1 / [S] 0
1 / V max
- 1 / K M
TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE 19 4.1- Inhibition comptitive :
Lorsque linhibiteur possde une structure voisine de celle du substrat (on parle alors danalogue de substrat), il peut se fixer lenzyme sur le mme site que le substrat. Inhibiteur et substrat ne peuvent donc pas se trouver ensemble dans le site actif de lenzyme : il sagit dune inhibition comptitive. Un inhibiteur diminue la vitesse de catalyse en rduisant la proportion de molcules denzyme lies au substrat. Une inhibition comptitive peut tre leve par un excs de substrat. La constante dinhibition K i est galement la constante de dissociation du complexe EI : K i = [EI] [I] [E]
La reprsentation de Lineweaver et Burk suivante montre quun inhibiteur comptitif ninduit pas de variation de la V max , mais augmente la valeur du K M . Le K M apparent devient alors : K M app. = K M (1 + i K [I] )
4.2- Inhibition non comptitive :
Dans une inhibition non comptitive, le substrat et linhibiteur peuvent se lier simultanment lenzyme sur des sites distincts. Un inhibiteur non comptitif agit en diminuant la constante catalytique plutt que la proportion de molcules de substrat lies lenzyme. Contrairement linhibition comptitive, une inhibition non comptitive ne peut pas tre leve par un excs de substrat.
E + S + I ES E + P EI K i
x + Inhibiteur - Inhibiteur 1 / [S] 0 1 / V 0
1 / V max
- 1 / K M - 1 / K M app. TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE 20 La reprsentation de Lineweaver et Burk suivante montre quun inhibiteur non comptitif ninduit pas de variation du K M , mais diminue la valeur de V max . La V max
apparente devient : V max app. = ) K / [I] ( 1 V i max + (dans le cas simple ou K i = K i )
Exercice n1 :
Les affirmations suivantes sont-elles vraies ?
1- V 0 et V max sont des vitesses initiales. 2- On peut calculer V max et K M partir des cintiques d'apparition du produit en fonction du temps obtenues partir de plusieurs concentrations en substrat. 3- Si l'on exprime V 0 en fonction de [S] 0 , on obtient une parabole. 4- Il est possible de dterminer V max et K M en reprsentant 1/V 0 en fonction de 1/[S] 0 . 5- K M est la concentration en enzyme qui donne la moiti de V max . 6- Pour une enzyme et un substrat donns, les valeurs de K M et V max sont invariables. 7- La vitesse initiale d'une raction enzymatique : - Prsente une relation linaire en fonction de quantits croissantes d'enzyme. - Prsente une relation hyperbolique en fonction de quantits croissantes d'enzyme. - Peut tre sensible aux variations de temprature. - Est maximale pH 7. - Est sensible la prsence d'autres ligands que le substrat.
1 / V max app. E + S + I ES + I E + P EI + S EI x K i K i
1 / V max
1 / V 0
+ Inhibiteur - Inhibiteur - 1 / K M
1 / [S] 0
TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE 21 Exercice n2 :
Les mesures des constantes de vitesse dune raction enzymatique simple, avec une enzyme E obissant la cintique de Michaelis-Menten, donnent les valeurs suivantes :
k 1 = 2 x 10 8 M -1 sec -1
k -1 = 1 x 10 3 sec -1
k 2 = 5 x 10 3 sec -1
1- Calculer la constante de Michaelis K M de lenzyme. 2- Quelle est la valeur de la constante catalytique (k cat ) de lenzyme ? 3- Dterminer lefficacit catalytique de lenzyme. 4- Indiquer si cette enzyme est proche de la perfection cintique.
Exercice n3 : 1/Vo [So] 1 / [So] [ P ] t e mp s Vo 1 2 3 Les figures suivantes reprsentent : courbe 1 [P] = f ( t ) courbe 2 Vo = f ( [ So ] ) courbe 3 1/Vo = f ( 1/[So] )
1- Que peut-on dterminer partir de chacune des courbes ci-dessus ? Complter les graphiques (flches). 2- A partir de la courbe 2, donner l'expression de la vitesse de la raction pour les concentrations en substrat : - Infrieures K M / 10. - Comprises entre K M / 10 et 10 K M . - Suprieures 10 K M . 3- A quelle partie de la courbe correspond : - Une raction d'ordre 1. - Une raction d'ordre 0. - Une raction dordre intermdiaire. E + S ES E + P k 1 k -1 k 2 TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE 22 4- Une enzyme E qui obit une cintique michaelienne a un K M = 1 M vis--vis de son substrat S. Pour une concentration de [S] = 100 M, la vitesse initiale V 0
mesure est de 0,1 M.min -1 . Quelle sera la valeur de V 0 dans les conditions suivantes : a- [S] = 1 mM b- [S] = 1 M c- [S] = 2 M 5- Les figures 4 et 5 reprsentent : ) [S] 1 ( f V 1 0 = en prsence d'un inhibiteur comptitif (IC) et non comptitif (INC).
a- Indiquer sur les graphiques lequel reprsente linhibition comptitive et lequel reprsente linhibition non comptitive. Justifier. b- Complter les graphiques en prcisant ce que chaque flche indique.
Exercice n4 :
Les vitesses initiales d'une raction enzymatique sont donnes pour cinq concentrations en substrat (Tableau ci-dessous). 1- Dterminer K M graphiquement. 2- Calculer la concentration d'un inhibiteur comptitif, ayant une constante de dissociation K i = 2,4.10 -4 M, qui aurait pour effet de doubler la valeur du K M .
[S] (mol.L -1 ) V 0 (mol.L -1 min -1 ) 1,0 x 10 -4
1,5 x 10 -4
2,0 x 10 -4
5,0 x 10 -4
7,5 x 10 -4
28 35 42 63 75
[ I ] [ I ] = 0 1/Vo 1/ [S] [ I ] [ I ] = 0 1/Vo 1/ [S] 4 5 TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE 23 Exercice n5 :
Le tableau ci-dessous traduit la cintique de la transformation d'un substrat S par une dcarboxylase en prsence et en l'absence d'une substance F.
1- Sans construire la courbe, dterminer la vitesse maximale et la constante de Michaelis en l'absence et en prsence de F ; en dduire le rle prcis de F.
On mesure la vitesse de transformation du substrat S en prsence de 3 substances M, N et P. On obtient les courbes 1, 2 et 3 ci-aprs.
2- Dduire de ces courbes si M, N et P sont des activateurs ou des inhibiteurs. Justifier. 3- Dans le cas d'un inhibiteur, prciser le type d'inhibition. Justifier les rponses.
Pour caractriser une enzyme nouvellement purifie, un biochimiste a mesur les vitesses de raction en prsence de concentrations croissantes de substrat et cela dans trois conditions : a) En prsence de l'enzyme seule. b) En prsence de l'enzyme et d'un analogue non mtabolisable du substrat (compos A) une concentration de 150 M. c) En prsence de l'enzyme et d'un compos qui inhibe l'enzyme en se liant hors du site actif de l'enzyme (compos B), une concentration de 60 M.
A partir des rsultats exprimentaux, il a trac les diagrammes de Lineweaver et Burk reprsents dans la figure ci-dessous.
1- Indiquer la correspondance entre les expriences a, b, c et les symboles employs (losanges, cercles, triangles). Justifier la rponse. 2- Dterminer graphiquement K M , K M app., V max et V max app. 3- Calculer les constantes d'inhibition pour les composs A et B (cest--dire les constantes de dissociation des complexes EI).
ACTIVITE ENZYMATIQUE
Quelques rappels thoriques :
1- Lactivit enzymatique : elle sexprime en nanokatals.
Un nanokatal mesure lactivit dune solution enzymatique qui catalyse la transformation dune nanomole (10 -9 mole) de substrat en une seconde dans les conditions optimales de la raction (pH, temprature, concentration saturante en substrat) dans un volume ractionnel donn.
0 1 2 -5,00E+03 0,00E+00 5,00E+03 1,00E+04 1 / [S] 0 (M -1 ) 1 / V 0 (min.M -1 ) TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE 25 AE (nkat) = (s) raction de temps es transform substrat de nanomoles de nombre
Lactivit enzymatique se rapporte toujours un volume de solution enzymatique donne. Par convention, on ramne souvent le rsultat 1 mL de solution enzymatique non dilue.
2- Lactivit spcifique :
Elle correspond lactivit enzymatique ramene 1 mg de toutes les protines prsentes dans lchantillon (et non pas lenzyme seule). AS (nkat.mg -1 ) = (mg) protines de masse e enzymatiqu activit
3- Evaluation dune purification enzymatique :
Un extrait enzymatique brut est constitu de la protine laquelle on sintresse mais aussi dun grand nombre de protines indsirables dites contaminantes.
Une purification russie implique : a- De rcuprer le maximum dactivit enzymatique par rapport ce que contenait lextrait brut initial ; ceci est traduit par la valeur du rendement de purification. b- Dliminer le maximum de protines contaminantes prsentes dans lextrait brut initial ; ceci est traduit par la valeur du facteur de purification.
Aprs chaque tape de purification, plusieurs paramtres doivent ainsi tre mesurs : a- La masse totale de protines (mg) : elle est obtenue en dterminant la concentration (en mg.mL -1 ) dune partie de lchantillon et en multipliant par le volume total de la fraction. b- Lactivit enzymatique totale (nkat) : elle est obtenue en mesurant lactivit enzymatique (en nkat.mL -1 dextrait enzymatique) dun volume dchantillon et en multipliant par le volume total de lchantillon. c- Lactivit spcifique (nkat.mg -1 ) : ce paramtre est obtenu en divisant lactivit enzymatique totale par la masse totale de protine. Elle est gnralement exprime en nkatals.mg -1 de protines.
Ces trois paramtres permettent ensuite de calculer : a- Le rendement de la purification = 100 x brut extrait l' de totale AE purifi extrait l' de totale AE (%) b- Le facteur de purification = initial brut extrait l' de AS purifi extrait l' de AS
4- Notion de vitesse et dactivit Units :
- Une vitesse de raction en phase liquide est conventionnellement exprime en variation de la concentration de produit (ou substrat) en fonction du temps car ce sont les concentrations qui dterminent les quilibres ractionnels. La vitesse caractrise donc laspect cintique de la raction enzymatique. TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE 26
- Lactivit enzymatique est exprime en variation du nombre de moles de produit (ou substrat) en fonction du temps. Le volume denzyme utilis pour raliser le test enzymatique doit alors tre obligatoirement prcis. Lactivit enzymatique caractrise ainsi le pouvoir catalytique de lchantillon enzymatique.
Exercice n1 :
La glucose-6-phosphate-dshydrognase (G-6-P-D) catalyse la raction :
D-glucose-6-phosphate + NADP +
6-phosphoglucono-o-lactone + NADPH + H +
Le coefficient d'extinction molaire du NADPH 340 nm est 6220 M -1 .cm -1 . Les autres composs n'absorbent pas 340 nm. On se propose de purifier la G-6 P-D de Bacillus subtilis. Pour tester le degr de puret de la prparation, aprs chaque tape de purification, on ajoute une partie de la prparation enzymatique une solution de D-glucose-6-P et de NADP + qui restent en excs pendant tout le temps de la mesure dans la cuve de spectrophotomtre. La longueur du trajet optique est 1cm. Le volume total final est 1mL.
1- Aprs une tape de purification, on ajoute au mlange ractionnel une partie de prparation enzymatique contenant 100 g de protines (doses par la mthode de Lowry). Aprs 5 min., la variation d'absorbance 340 nm est de 0,3. Calculer l'activit spcifique (AS) de la prparation de G-6-P-D ce stade de purification. 2- Aprs de nouvelles oprations de purification, une partie de la prparation enzymatique contenant 1 g de protines entrane aprs 1 min. un accroissement de l'absorbance de 0,36. 2.1- Calculer l'AS de la prparation de G-6-P-D ce stade de purification. 2.2- Par rapport au stade prcdent, combien de fois lenzyme a telle tait purifie ? 3- Aprs de nouvelles tapes de purification, on ne parvient pas obtenir une activit spcifique plus leve. Qu'en dduire ?
Exercice n2 :
Plusieurs tapes de purification sont utilises pour obtenir une enzyme : - tape 1 : prcipitation par le sulfate d'ammonium - tape 2 : chromatographie par change d'ions - tape 3 : chromatographie par filtration sur gel
1- Rappeler le principe des diffrentes techniques utilises pour purifier lenzyme.
2- Les mesures effectues au cours de cette purification sont donnes dans le tableau suivant. Calculer pour chaque tape l'activit enzymatique totale (AT), l'activit spcifique (AS), le rendement (Rdt) et le facteur de purification (Fp ).
TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE 27 Fraction Volume de solution (mL)
Masse de protines (mg)
Activit enzymatique mesure sur 0,1 mL de solution protique (nmol.sec -1 )
Les 2 principales enzymes de transamination prsentes dans le srum sont : - La glutamate oxaloactate transaminase (GOT). - La glutamate pyruvate transaminase (GPT).
1- Ecrire la raction catalyse par ces 2 enzymes. Donnes : l'o-ctoglutarate est l'o-ctoacide dicarboxylique driv de Glu et l'acide oxaloactique est l'o-ctoacide dicarboxylique driv de Asp.
On dispose des ractifs suivants : - ractif 1 : alanine 0,08 M, lactate dshydrognase 10 mg.L -1 et NADH 2.10 -4 M dans le tampon phosphate 0,1 M pH 7,4. - ractif 2 : solution 0,1 M d'acide o-ctoglutarique.
On met incuber 2,2 mL de ractif (1) avec 0,5 mL de srum pendant 5 min. 25C. On ajoute alors 0,3 mL de ractif (2) et, trs rapidement, le mlange est transvas dans la cuve d'un spectrophotomtre rgl 340 nm. L'paisseur de la cuve est de 1 cm. On relve l'absorbance toutes les minutes pendant 5 minutes, ce qui donne les rsultats suivants :
temps (min.) 0 1 2 3 4 5 A 340 0,558 0,452 0,348 0,245 0,142 0,070
2- Quelle est la transaminase dose ? 3- Calculer l'activit transaminasique en nkat par mL de srum. Donne : c NADH 340 nm = 6220 M -1 .cm -1 . 4- Les valeurs physiologiques sont comprises entre 5 et 15 mU.mL -1 de srum (milliunits internationales). Commenter la valeur trouve dans l'exprience propose. Donne : Une unit internationale est l'activit enzymatique qui transforme 1 mole de substrat par minute dans les conditions optimales de pH, de force ionique et de concentration en substrat.
Exercice n4 :
La glutamate dshydrognase (GDH) catalyse la raction suivante :
TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE 28
Cette enzyme permet la dsamination de l'acide glutamique en prsence de NAD + .
On mesure l'activit de la GDH dans le sens de formation de l'acide glutamique dans les conditions suivantes : - 0,2 mL de sulfate d'ammonium 5 M - 2,4 mL d'une solution tampon pH 8 - 0,1 mL d'une solution de NADH 6,5 mg.mL -1 (M = 709 g.mol -1 ) - 0,2 mL d'une solution 1 M d'acide o-ctoglutarique - Pr-incubation 5 min. 25C - Addition de 0,1 mL de solution de GDH contenant 1,6 mg.mL -1 de protines (doses par la mthode de Lowry) pour dmarrer la raction.
On mesure l'absorbance du milieu ractionnel (maintenu 25C) 340 nm en fonction du temps dans une cuve de trajet optique de 1 cm. On obtient les rsultats suivants :
1- Expliquer le rle des diffrents constituants du milieu ractionnel. 2- Tracer la courbe A = f(t). Commenter l'allure de cette courbe, en expliquant notamment lapparition dun dbut de plateau. 3- Donner la vitesse initiale V 0 de la raction en M.min -1 . 4- Calculer l'activit enzymatique de 1mL de solution de GDH dans les conditions du test. 5- Calculer l'activit spcifique de la solution de GDH.
Donne : c NADH 340 nm = 6220 M -1 .cm -1 .
Exercice n5 :
On souhaite tudier une nouvelle protase P isole du tube digestif d'un insecte amazonien. Cette protase existe sous deux formes P i et P a ayant des squences en TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE 29 acides amins identiques. Seule la forme P a possde une activit protasique. Pour lucider le mode d'activation de la protine P i (forme inactive) en protine P a (forme active), une exprience l'aide de DIFP a t ralise.
La dcouverte de la neurotoxicit du DIPF (diisopropylphosphofluoridate) a conduit utiliser ce ractif comme agent inactivateur d'enzyme. Le DIPF ragit avec une srine du site actif de lenzyme, selon la raction suivante :
1. Les deux protases P a et P i sont incubes sparment en prsence de 32 P-DIPF pendant 30 minutes 37C, puis dialyses pour liminer l'excs de ractif radiomarqu. Les deux protases sont alors analyses par lectrophorse sur gel de polyacrylamide, en prsence de SDS (sodium dodecyl sulfate) avec ou sans 2- mercaptothanol.
Aprs coloration au bleu de Coomassie, la photographie du gel obtenu donne le rsultat suivant :
Les marqueurs de masse molaire dposs dans la piste 1, sont les suivants : - galactosidase 120 000 g.mol -1 ; albumine du srum de buf 70 000 g.mol -1 ; ovalbumine 42 000 g.mol -1 ; trypsine 25 000 g.mol -1 ; myoglobine 16 000 g.mol -1 ; Enzyme Enzyme Piste 1 Piste 2 Piste 3 Piste 4 Piste 5 TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE 30 peptone 9 000 g.mol -1 . La protine P i est dpose sur les pistes 2 et 3, respectivement en absence et en prsence de 2-mercaptothanol. De mme, la protine P a est dpose sur les pistes 4 et 5, respectivement en absence et en prsence de 2-mercaptothanol.
1- Que pouvez-vous tirer de l'analyse de cette lectrophorse sur le mode d'activation de la protine P ?
Aprs autoradiographie du gel, les bandes radioactives sont rvles sur un film photosensible par une coloration noire. Le rsultat est le suivant :
2- Complter votre analyse prcdente (question 1) de l'lectrophorse, par l'tude des rsultats obtenus par autoradiographie pour affiner vos conclusions sur le mode d'activation de la protine P.
2. L'tude enzymatique de la protine P s'effectue sur un substrat artificiel, le para- nitrophnylactate (pNPA) dont le produit d'hydrolyse absorbe 410 nm avec un coefficient d'extinction molaire 410 nm de 4 000 M -1 .cm -1 .
1- Ecrire la raction catalyse par la protine P sur le substrat artificiel.
2- Lextrait enzymatique est trop concentr en activit pour tre utilis en ltat. Une dilution au 1/300 est ncessaire. Quels sont les volumes respectifs en solution tampon et en extrait enzymatique que vous devez prendre pour effectuer cette dilution sachant qu'un volume minimum de 600 L d'extrait dilu est ncessaire pour la suite de vos manipulations ?
Le protocole exprimental pour mesurer l'activit enzymatique de l'enzyme P est le suivant. Le spectrophotomtre est programm pour faire une cintique pendant 3 minutes 410 nm. Le zro dabsorbance est fait 410 nm laide d1 mL de tampon phosphate de sodium 0,1 M pH 7. Dans une cuve de 1 mL, 450 L de tampon phosphate 0,1 M, pH 7, et 500 L de pNPA 1 mM sont mis en prsence de 50 L dextrait enzymatique dilu et homogniss rapidement avant de dmarrer la cintique. Piste 1 Piste 2 Piste 3 Piste 4 Piste 5 TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE 31
3- Quelle critique apportez-vous au choix du contenu de la cuve utilis pour faire le zro d'absorbance ?
Le rsultat exprimental obtenu est le suivant :
4- Calculer l'activit enzymatique de 1mL de l'extrait enzymatique de dpart dans les conditions exprimentales proposes. Dtailler vos calculs.
Le dosage selon la mthode de Bradford des protines prsentes dans l'extrait enzymatique est effectu selon le protocole suivant : A 100 L dchantillon protique dilu, ajouter 1 mL de ractif de Bradford. Laisser 20 min. temprature ambiante. Lire labsorbance 595 nm contre un tmoin ne contenant pas de protines.
5- Donner le contenu du tube tmoin.
L'extrait enzymatique est pralablement dilu au 1/10me. Les rsultats exprimentaux obtenus sont les suivants :
6- Quel est l'intrt de faire plusieurs mesures ? TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE 32 7- Calculer la concentration en protines de l'extrait enzymatique laide de la courbe dtalonnage suivante, effectue avec de la srum albumine bovine.
8- Calculer l'activit spcifique de l'extrait enzymatique.
NOTION DE SITE ACTIF
Quelques rappels thoriques :
Le site actif est une zone de l'enzyme o se fixe le substrat et o intervient l'effet catalytique. Les acides amins prsents dans cette zone, ainsi que les molcules non protiques (dites cofacteurs) qui y sont galement localises, participent directement l'action catalytique.
On distingue les acides amins qui participent la fixation du substrat par lintermdiaire de liaisons non covalentes (essentiellement ioniques, hydrophobes et hydrogne) et les acides amins catalytiques participant la transformation du substrat en produit.
NB : Les protines sont des molcules dformables ; il en rsulte que les ligands qui se fixent en un autre point de l'enzyme que le site actif, et souvent fort loin, peuvent modifier la conformation du site actif et ainsi changer les valeurs des constantes cintiques de l'enzyme.
Principe de l'tude exprimentale d'un site actif :
Toutes les mthodes physicochimiques d'tude des protines sont utilises pour dterminer le mcanisme d'action d'une enzyme. Nanmoins, de nombreuses mthodes sont bases sur le principe suivant : modification lgre soit de la structure d'un ligand soit de celle de l'enzyme et mesure des variations d'activit et d'affinit correspondantes. Si les constantes caractristiques K M ou k cat sont nettement modifies, on en dduit que la zone concerne du ligand ou de l'enzyme participe la fixation du substrat ou sa transformation. 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Absorbance 595 nm Masse de SAB (en g / tube) TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE 33 Exercice n1 :
La carboxypeptidase est une mtalloenzyme qui assure l'hydrolyse de la liaison peptidique liant le dernier acide amin du ct COOH terminal au reste des peptides et des protines substrats. La fixation du peptide L-alanyl-L-tyrosine sur le site actif de cette enzyme, est donne dans le schma ci-dessous :
OH C H 2 H C C O - O NH C O C H N H H O H + N C NH 2 N H COO - Zn ++ Tyr 248 H H Arg 145 Glu Poche apolaire
NB : Cette reprsentation donne une image plane de la structure spatiale du site actif : deux groupes positionns au voisinage l'un de l'autre sur ce schma, sont supposs l'tre dans la structure relle, tridimensionnelle de l'enzyme. Les traits hachurs reprsentent les liaisons enzyme-substrat.
1- Quels types d'interactions interviennent dans la fixation du substrat ? 2- Prciser priori si le K M est modifi si on remplace le L-alanyl-L-tyrosine par les substrats suivants : L-alanyl-L-phnylalanine ; L-alanyl-L-aspartate ; L-aspartyl-L-tyrosine.
Exercice n2 :
La glycraldehyde-3-phosphate-deshydrognase catalyse l'oxydation du glycraldehyde-3-phosphate en 1,3-bisphosphoglycrate :
Si on fait ragir de l'iodoactate sur cette enzyme, on constate que le glycraldehyde-3-phosphate continue se fixer sur l'enzyme modifie mais ne s'oxyde plus. Que peut-on conclure ?
TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE 34 Donne : l'iodoactate ICH 2 COO - est un agent alkylant qui ragit avec les thiols (- SH) pour former de faon irrversible des groupements -S-CH 2 COO - .
Exercice n3 :
Les paramtres V max et K M d'une raction enzymatique sont tudis en fonction du pH et donnent les rsultats suivants :
1- Que reprsentent les paramtres V max et K M pour une enzyme michaelienne ? Que permettent-ils dtudier chez cette enzyme ? 2- Quel est le type d'acides amins qui apparat comme essentiel pour le fonctionnement du site catalytique, et quel est l'tat de protonation de ce (ou ces) acide(s) amin(s) dans l'enzyme active ? 3- Mme question en ce qui concerne le site de fixation du substrat sur l'enzyme.
pH V max (units arbitraires) 4 8 6 10 0 10 20 pH K M (mM) 4 8 6 10 0 40 80 K M = 1mM TD BIO 241 2012-2013 BIOENERGETIQUE 35
THEME N4 : BIOENERGETIQUE
ENERGIE LIBRE SENS DES REACTIONS EQUILIBRE
POTENTIELS REDOX FORMULE DE NERNST
TD BIO 241 2012-2013 BIOENERGETIQUE 36 ENERGIE LIBRE SENS DES REACTIONS - EQUILIBRE
Quelques rappels thoriques : Variation dnergie libre et constante dquilibre
Considrons la raction chimique suivante, se droulant au sein d'un systme pH = 7 ( ce pH, les grandeurs thermodynamiques classiques sont affectes du signe "prime"). o A + | B C + o D
Bien que la raction puisse voluer dans les 2 sens, nous avons crit C et D droite ; nous les appellerons donc produits . A et B sont alors appels substrats .
Nous voulons calculer la variation dnergie libre lorsque o moles de A et | moles de B sont converties en moles de C et o moles de D, chacun une concentration donne. Pour la raction inverse, nous avons seulement besoin de changer le signe de lnergie libre que nous aurons calcule.
Dans une raction chimique, la variation dnergie libre (AG), exprime en kJ.mol -1 , dpend de la variation dnergie libre dans les conditions standard (AG o ) et de la concentration des substrats et produits. AG = AG o + RT ln ) [B] [A] [D] [C] (
(1)
Avec : - Conditions standard : Concentrations molaires des ractants autres que H + , 298K, pH = 7. - R = constante des gaz parfaits = 8,315 J. mol -1 . K -1 . - T = temprature absolue en kelvins (K). - [A], [B], [C], [D] : concentrations dans les conditions initiales.
Signification de AG :
- Si AG > 0 : la transformation nest pas spontane, et il faut lui fournir de lnergie pour quelle se fasse (cest la raction inverse qui est alors spontane) : elle est dite endergonique. - Si AG < 0 : la transformation est spontane et elle est susceptible de fournir de lnergie : elle est dite exergonique. - Si AG = 0 : la transformation na tendance se faire ni dans un sens ni dans lautre : elle est lquilibre.
Lorsque le systme est lquilibre, les concentration dans le facteur entre parenthses de lquation (1) ne sont plus les concentrations initiales mais les concentrations lquilibre. De ce fait, ce facteur entre parenthses est appel la constante dquilibre K de la raction : K = eq ) [B] [A] [D] [C] ( | o o (2)
TD BIO 241 2012-2013 BIOENERGETIQUE 37 Lquation (1) devient donc : 0 = AG o + RT ln eq ) [B] [A] [D] [C] ( | o o (3) ou : AG o = - RT ln K (4)
Exercice n1 :
La variation d'nergie libre standard de la raction :
D-glucose-1-phosphate D-glucose-6-phosphate
considre de gauche droite, est de : - 7270 J.mol -1 ( 25C et pH = 7). Dans quel sens la raction tend-elle se faire spontanment dans les 3 cas suivants :
La variation d'nergie libre standard de la raction :
pyruvate + aspartate oxaloactate + L-alanine
considre de gauche droite, est nulle 25C, pH = 7. On incube du pyruvate, de l'aspartate et de la L-alanine dont les concentrations initiales sont 1 x 10 -3 M, l'oxaloactate tant initialement absent.
Calculer la molarit des diffrents composs l'quilibre.
Exercice n3 :
Le tableau suivant donne les variations dnergie libre standard d'hydrolyse de quelques composs phosphoryls.
Composs AG o (kJ.mol -1 ) Phosphonolpyruvate Carbamyl-phosphate Actyl-phosphate Cratine-phosphate Pyrophosphate ATP Glucose-1-phosphate Glucose-6-phosphate Glycrol-3-phosphate - 61,7 - 51,4 -43,0 - 43,0 - 33,4 - 30,4 - 20,8 - 13,8 - 9,1 TD BIO 241 2012-2013 BIOENERGETIQUE 38 1- Quest-ce que le potentiel de transfert de groupement phosphate ? 2- Quel est le compos qui a le potentiel de transfert le plus lev ? 3- Quel est le sens de chacune des ractions suivantes lorsque les ractifs sont initialement prsents en quantits quimolaires (1M) ?
ATP + cratine cratine-phosphate + ADP
ATP + pyruvate phosphonolpyruvate + ADP
4- Quel est llment de couplage absolument indispensable ?
Exercice n4 :
La raction de biosynthse de la L-glutamine chez l'homme est catalyse par la L- glutamine synthtase. On peut la rsumer de la manire suivante :
AG o de cette raction est de -16,3 kJ.mol -1 (de gauche droite).
1- Prciser la signification de cette dernire donne. 2- Cette raction peut tre considre comme la somme de deux ractions composantes, l'une exergonique, l'autre endergonique. Ecrire ces deux ractions composantes et valuer AG o de la raction endergonique. 3- Plus gnralement, quelles sont les conditions thermodynamiques ncessaires pour qu'une raction endergonique puisse se produire ?
Donne : AG o de lhydrolyse de lATP = - 30,4 kJ.mol -1 .
POTENTIELS REDOX FORMULE DE NERNST
Quelques rappels thoriques :
Le transport des lectrons dans les systmes biologiques consiste en une srie de ractions doxydation et rduction couples entre elles (encore appeles ractions redox). Une oxydation = perte dlectrons ; une rduction = gain dlectrons.
Un rducteur est un compos ayant tendance fournir un (ou des) lectron(s). Un oxydant est un compos ayant tendance capter un (ou des) lectron(s).
Oxydant + n e - Rducteur
Les formes rduite et oxyde dun mme compos constituent un couple redox.
Le pouvoir rducteur dun couple redox est dfini par le potenteil redox (E). Plus ce potentiel redox est ngatif, plus le couple a un pouvoir rducteur. TD BIO 241 2012-2013 BIOENERGETIQUE 39
Il est possible de calculer les potentiels redox grce la relation de Nernst :
E = E 0 + [red] [ox] ln F n T R
Avec : - E = potentiel redox en volts pH 7. - E 0 = potentiel standard redox pH 7, 298K, [ox] = [red] = 1 mol.L -1 . - R = constante des gaz parfaits = 8,315 J. mol -1 . K -1 . - T = temprature absolue en kelvins. - n = nombre dlectrons impliqus. - F = faraday = 96 500 J.V -1 .mol -1 = 96 500 C. (Coulombs). - [ox] et [red] = concentrations des formes oxyde et rduite.
Une raction doxydo-rduction fait intervenir 2 couples redox : la forme rduite dun premier couple transfre ses lectrons la forme oxyde du second couple. On obtient alors la forme oxyde du premier couple et la forme rduite du second couple. Ox 1 + n e - Red 1 E 0 (1)
Red 2 Ox 2 + n e - E 0 (2)
Si E 0 (2) < E 0 (1), le couple 2 est le plus rducteur. Spontanment, les lectrons sont transfrs de la forme rduite du couple 2 la forme oxyde du couple 1 et donc le systme 2 rduit le systme 1 :
Red 2 + Ox 1 Ox 2 + Red 1
Il est possible de calculer la variation dnergie libre des ractions redox dans les conditions standard grce la relation suivante :
AG o = - n F [ E 0 (1) E 0 (2) ] = - n F AE 0
Quelques potentiels redox standard E 0 utiles en biochimie :
E 0 (Volt) O 2 + 2 H + + 2 e -
NO 3 - + 2 H + + 2 e -
2 cyt c (ox) + 2 e -
2 cyt b (ox) + 2 e -
Pyruvate + 2 H + + 2 e -
NAD + + 2 H + + 2 e -
Actoactate + 2 H + + 2 e -
H 2 O
NO 2 - + H 2 O
2 cyt c (red)
2 cyt b (red)
Lactate
NADH + H +
|-hydroxybutyrate
+ 0,81
+ 0,42
+ 0,25
+ 0,08
- 0,19
-0,32
- 0,35
TD BIO 241 2012-2013 BIOENERGETIQUE 40 Exercice n1 :
En vous aidant du tableau prcdent, dterminer le sens de chacune des ractions suivantes. Justifier les rponses (on suppose que les conditions sont les conditions standard et que le milieu contient l'enzyme catalysant la raction considre).
2 cyt c (ox) + 2 cyt b (red) 2 cyt c (red) + 2 cyt b (ox) (3)
Exercice n2 :
Une bactrie dnitrifiante A est anarobie stricte. Elle possde nanmoins une chane transporteuse d'lectrons lui permettant de respirer . L'accepteur final d'lectrons, au lieu d'tre l'oxygne molculaire comme dans l'arobiose est le nitrate (NO 3 - ) rduit en nitrite (NO 2 - ). Les lectrons sont introduits dans la chane des transporteurs d'lectrons par le nicotinamide adnine dinuclotide rduit (NADH + H + ).
1- Ecrire le bilan global des ractions ralises par cette bactrie. 2- Calculer la variation d'nergie libre standard correspondante. 3- La respiration nitrate est-elle thoriquement plus ou moins exergonique que la respiration arobie ? Justifier par le calcul.
TD BIO241 2012-2013 METABOLISME GENERAL 41
THEME N5 : METABOLISME GENERAL
GLYCOLYSE
CYCLE DE KREBS
PHOSPHORYLATION OXYDATIVE
|-OXYDATION DES ACIDES GRAS
TD BIO241 2012-2013 METABOLISME GENERAL 42 Exercice n1 : Fermentation des bactries lactiques.
La plupart des bactries lactiques sont dpourvues de cytochromes. Elles peuvent dgrader le glucose par 2 voies : - La voie de la glycolyse - La voie htro-fermentaire.
Le bilan de la voie de la glycolyse en conditions anarobie peut s'crire :
1 glucose
2 acides lactiques
1- On laisse se dvelopper la souche bactrienne sur un milieu contenant du glucose dont le C1 est radioactif ( 14 C). Sur quel atome de carbone de quel produit retrouvera-t-on la radioactivit au terme de la glycolyse ? 2- Quel est le gain net en moles d'ATP par mole de glucose consomm ? On prcisera quelles sont les tapes au cours desquelles il y a consommation ou production d'ATP. 3- La transformation de glucose en acide lactique s'accompagne-t-elle globalement d'une rduction de nicotinamide-adnine-dinuclotide ? Expliquer votre rponse. 4- Quel serait le bilan en ATP et en NADH de la dgradation dune mole de saccharose par la voie de la glycolyse ? 5- La voie de la glycolyse comprend plusieurs ractions couples. Dcrire celles qui correspondent des ractions de phosphorylation lie au substrat.
La voie htro-fermentaire d'une bactrie lactique comporte la squence de ractions donne dans la figure 1. Le 3-phosphoglycraldhyde form est transform en lactate par une squence de ractions commune avec celle de la voie de la glycolyse.
6- Quel est le gain net en moles d'ATP par mole de glucose consomm par la voie htro-fermentaire, lorsque cette voie donne les produits de fermentation figurant dans le bilan suivant :
1 glucose 1 CO 2 + 1 acide lactique + 1 thanol
7- Etablir le bilan de NADH + H + participant aux ractions de cette voie.
Une tude prcise des produits forms donne les rsultats regroups dans le tableau ci-dessous. Toutes les valeurs sont exprimes en mmol. de produits forms partir de 10 mmol. de glucose ferment.
8- Etablir la balance carbone de cette fermentation (rapport exprim en pourcentage entre le nombre de moles d'atomes de carbone rcupres en TD BIO2
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241 2012-2013 duits et le mmenter la 1 : Schm ce n2 : C emire ta de une vari ire cette r ire les for worth. suppose ditions de [glu [AD er que dans 3 nombre d a valeur ret ma de la v Changemen ape de la iation dne action. N rmules du que les concentra cose] = 10 P] = 10 -4 M s ces cond METAB e moles d trouve. oie htro nt de sens dgradati ergie libre ommer l'e D-glucose conditions tions suiva 0 -5 M M ditions, X se BOLISME GE 43 d'atomes d ofermenta d'une rac on du D-g standard enzyme im e et du p s initiales antes : [A [X e transform ENERAL e carbone aire d'une ction bioch glucose pa gale - 1 plique. N produit X de la r ATP] = 10 - X] = 10 -1 M me en gluc e de glucos bactrie la imique ar la voie 3,4 kJ.mol Nommer le selon la r action co -3 M M cose. se consom actique e de la gl l -1 25C. e produit X reprsenta orresponde mmes).
ycolyse X form. ation de ent aux TD BIO241 2012-2013 METABOLISME GENERAL 44 Exercice n3 :
Lenzyme aldolase catalyse la raction suivante dans la voie de la glycolyse :
Le AG o ' de la raction est + 5,7 kcal.mol -1 (T = 25C), alors que le AG dans la cellule est 0,3 kcal.mol -1 . Calculer le rapport entre produits et substrat lquilibre et dans les conditions intracellulaires. A laide de vos rsultats, expliquer comment la raction peut tre endergonique dans les conditions standard et exergonique dans les conditions intracellulaires.
Rappel : 1 cal = 4,18 J.
Exercice n4 :
Un tre humain consomme environ 2800 kcal par jours en s'alimentant. Si on considre que les voies mtaboliques qui conduisent la production d'ATP oprent avec une efficacit thermodynamique de 50%. Calculer le poids d'ATP qui est produit par le corps humain en une journe sachant que l'nergie libre produite par l'hydrolyse d'une mole d'ATP = 50 kJ et masse molaire de l'ATP = 551 g/mol.
Exercice n5 :
Quelle quantit dATP, exprime en moles, une cellule musculaire peut-elle produire :
1.1- en condition arobie partir : a- dune mole de glucose b- dune mole dacide gras palmitique (C 16 ) (donner seulement lordre de grandeur) 1.2- en condition anarobie prolonge partir : a- dune mole de glucose b- dune mole dacide gras palmitique (C 16 )
Donnes : Utilisez pour le calcul les valeurs P/O suivantes : 2 moles ATP formes par mole de FADH 2 re-oxyd et 3 moles ATP formes par mole de NADH,H + re- oxyd (quelle que soit son origine cytosolique ou mitochondriale)
Exercice n6 :
Un fragment de muscle squelettique humain dans lequel une lectrode a t implante est plong dans une solution physiologique contenant du glucose. Lorsquil est stimul par un courant lectrique, le fragment de muscle consomme 76 moles dATP par minute. La concentration initiale en glucose de la solution physiologique est de 3,6 g/L. Le volume total est de 10 ml. Dans ces conditions exprimentales, tout lATP consomm par le fragment de muscle provient TD BIO241 2012-2013 METABOLISME GENERAL 45 uniquement de loxydation du glucose prsent dans la solution physiologique, en condition arobie. En vous aidant des rsultats de la question prcdente, dterminer le temps ncessaire pour que la quantit de glucose prsente dans la solution initialement soit totalement puise. Dtailler votre raisonnement et vos calculs.
Donne : la masse molaire du glucose est de 180 g/mol
TD BIO241 2012-2013 METABOLISME GENERAL 46
THEME N6 : METABOLISME GENERAL
SPECIFICITES MICROBIENNES
TD BIO241 2012-2013 METABOLISME GENERAL 47 Remarque prliminaire : Tous les exercices qui suivent impliquent le calcul de temps de gnration (Tg) et de taux de croissance (v). Il sagit de notions que vous avez abordes au cours de lUE BIO231, et il vous suffira donc de vous reporter au polycopi de TD de cette UE pour vous remmorer leur mode de calcul. v = Tg 1 (v est exprim en divisions.min -1 ou divisions.h -1 , et Tg en min ou h) log N = ( Tg log2 x At ) + log N 0 avec N = population un temps t N 0 = population initiale At = t t 0 Exercice n1 : Dans le cadre d'un travail sur le catabolisme des sucres chez Escherichia coli, vous avez voulu tudier l'influence de la nature des sources de carbone sur la croissance. Vous avez effectu trois cultures parallles, inocules avec la mme pr-culture une DO 600 initiale gale 0,7, en variant la composition du milieu comme suit : A, milieu minimum + glucose 0,25% + lactose 0,1% ; B, milieu minimum + glucose 0,15% + lactose 0,2% ; C, milieu minimum + glucose 0,07% + lactose 0,28%. Les rsultats sont prsents dans la figure ci-dessous.
1- Dcrivez lallure gnrale de la courbe (A, B ou C). 2- Calculez (aussi prcisment que possible) les diffrents temps de gnration et taux de croissance horaires. 3- Interprtez les diffrences observes entre les 3 courbes, en faisant rfrence vos connaissances thoriques sur le sujet. 4- Comment pourriez-vous faire pour tester votre interprtation du phnomne mis en vidence ? 5- Si vous aviez remplac le glucose par du maltose, qu'auriez-vous vu ?
5 4 3 2 1 0 5 4 3 2 1 0 5 4 3 2 1 0 t (h) DO 600
A B C 0,1 TD BIO241 2012-2013 METABOLISME GENERAL 48 Exercice n2 :
Vous tudiez le catabolisme du glycrol chez une bactrie. Vous avez ralis diffrentes cultures en milieu minimum en variant uniquement la concentration en glycrol, sachant quil sagit l de la seule source de carbone disponible. A : [glycrol] = 400 mg.L -1 , B : [glycrol] = 100 mg.L -1 , C : [glycrol] = 40 mg.L -1 , D : [glycrol] = 10 mg.L -1 . Le milieu de culture ne contient que des nutriments, le glycrol rentre dans la cellule par diffusion facilite. 1- Calculez les temps de gnration des diffrentes courbes. 2- Comment interprtez-vous le fait que les courbes de croissances A et B soient identiques ? Quelle exprience complmentaire vous permettrait de tester votre hypothse quant la culture A (proposez un protocole succinct, et analysez les probables rsultats exprimentaux) ? 3- Pourquoi la culture C entre-t-elle en phase stationnaire avant les cultures A et B, et une DO plus faible ? Quelle exprience complmentaire vous permettrait de tester votre hypothse (proposez un protocole succinct, et analysez les probables rsultats exprimentaux) ? 4- Comment expliquez-vous les diffrences entre les courbes C et D ?
Exercice n3 :
On tudie la croissance d'une bactrie dans un milieu dfini, contenant un tampon de rgulation du pH (Na 2 HPO 4 : 3,8 g.L -1 , KH 2 PO 4 : 1,5 g.L -1 ), des sels minraux (MgSO 4 : 200 mg.L -1 ; CaCl 2 : 20 mg.L -1 ). Le glucose (2 g.L -1 ) est la seule source de carbone et dnergie ; la source dazote est soit du nitrate de potassium (KNO 3 ) (culture A), soit du chlorure dammonium (NH 4 Cl) (culture B). Aprs 3 h de culture, on fait buller de lazote (N 2 ) dans le milieu de culture dans le seul but de chasser rapidement loxygne dissous. Toutes les 30 minutes, une aliquote de la culture est prleve, sur laquelle on effectue une mesure de DO 600 (le 0 est rgl avec le milieu de culture non inocul). 5 4 3 2 1 0 t (h) DO 600
A B 9 8 7 6 13 12 11 10 17 16 15 14 19 18 C D x 0,1 TD BIO241 2012-2013 METABOLISME GENERAL 49 1- Calculez temps de gnration et taux de croissance (expliquez brivement vos calculs). 2- Commentez l'aspect des deux courbes. A quel(s) phnomne(s) biologique(s) peut- on imputer lorigine des diffrences observes : avant et aprs le bullage ; entre les cultures A et B (justifiez vos rponses). 3- On sintresse deux mutants (M1, M2) drivs de la bactrie tudie. Daprs les courbes de croissance obtenues, quelle(s) hypothse(s) pourriez-vous mettre qui puisse expliquer, pour chaque mutant, la diffrence de comportement : par rapport la souche sauvage ? entre les deux cultures A et B ? 4- Pour chacune des trois souches tudies, que se passerait-il si, aprs avoir lanc une culture dans le milieu A en absence doxygne, on injectait de loxygne dans la culture t = 3 h (esquissez la courbe de croissance) ?
A 4,5 4 3,5 3 6,5 6 5,5 5 8,5 8 7,5 7 9,5 9 B bullage dazote 0,1 TD BIO241 2012-2013 METABOLISME GENERAL 50 Exercice n4 :
Des chercheurs sintressent au comportement de bactries du genre Shewanella quand on ajoute dans leur milieu de culture de lADN. Ils ont ralis diffrentes cultures dont les rsultats sont prsents dans les deux figures ci-dessous.
Figure 1 : Cultures en arobie des bactries Shewanella oneidensis MR-1 (A), Shewanella putrefaciens CN32 (B) et Shewanella sp. souche W3-18-1 (C) dans un milieu de culture contenant : du PIPES (solution tampon) ; de lacide lactique ; NH 4 Cl, NaCl, MgCl 2 , KCl, CaCl 2 et Na 2 SeO 4 ; des traces de vitamines et de minraux ; et NaH 2 PO 4 (carrs noirs) ou ADN de sperme de hareng (carrs blancs). Les donnes prsentes correspondent la densit optique, c.a.d. la biomasse totale.
Figure 2 : Cultures en anarobie de Shewanella oneidensis MR-1 dans un milieu contenant : du PIPES (solution tampon) ; de lacide lactique ; NH 4 Cl, NaCl, MgCl 2 , KCl, CaCl 2 et Na 2 SeO 4 ; Fe(III)-NTA (= Fe 3+ complex de lacide nitriloactique) ; des traces de vitamines et de minraux. Dans la figure 2A, les chercheurs ont ajout au milieu de culture du NaH 2 PO 4 ; dans la figure 2B, du NaH 2 PO 4 et de lADN de sperme de hareng. Les carrs noirs reprsentent la quantit de cellules en suspension ; les ronds blancs reprsentent la concentration en Fe 2+ . 1- Au vu des rsultats prsents dans la Figure 1, que pouvez-vous dire du rle jou par lADN (justifiez votre rponse) ? 2- Quels autres rles pourrait-il jouer (et quelles incidences pourrait-on en tirer quant la composition des milieux de culture) ? TD BIO 241 2012-2013 METABOLISME GENERAL 51 3- Quel rle le Fe(III)-NTA joue-t-il dans les cultures de la Figure 2, et quelles conclusions pouvez-vous en tirer quant aux capacits mtaboliques des bactries du genre Shewanella ? 4- Pouvez-vous expliquer labsence de croissance bactrienne dans la Figure 2C ?
TD BIO 241 2012-2013 METABOLISME GENERAL 52 CORRIGES valeurs numriques
Thme n1 : Rappels
Concentrations Ex 1 1: 0,41 g NaOH - 1,02 g CuSO 4 , 5H 2 O - 2,73 g tartrate de K et Na, 4H 2 O - 5,44 g Na 2 CO 3 , 10 H 2 O
3: Sulfate de cuivre :0,01 % - Tartrate de K et Na 0,02%
Ex 2 1: 17,4 M - 17,4 N - 57 mL acide actique concentr + H 2 O qsp 1L 2: 17,7 M - 35,4 N - 28 mL acide concentr + H 2 O qsp 1L