BAHAN DAN METODE

Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di rumah kaca University Farm IPB di Cikabayan dan Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan dari bulan Maret sampai Juli 2011.

Metode Penelitian Persiapan Tanaman Inang Sumber Inokulum Tanaman untuk perbanyakan virus yang digunakan adalah bibit tanaman kacang panjang varietas Parade. Benih kacang panjang ditanam dalam polybag dengan menggunakan media tanam berupa campuran tanah dan pupuk kandang (1:1) dan ditempatkan di rumah kaca atau pada ruang kedap serangga untuk menghindari serangan hama terutama serangga vektor. Tanaman kacang panjang tersebut akan diinokulasi dengan BCMV secara mekanis.

Inokulasi Virus secara Mekanis Inokulasi dilakukan secara mekanis menggunakan cairan perasan tanaman (sap) sakit. Sap dibuat dari daun tanaman yang terinfeksi BCMV. Isolat BCMV yang digunakan adalah BCMV isolat Cirebon yang berasal dari Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Daun terinfeksi digerus sampai halus didalam mortar setelah sebelumnya ditambahkan bufer fosfat (0.01M; pH 7.0) dengan perbandingan 1:10 (b:v). Daun tanaman kacang panjang yang akan diinokulasi sebelumnya ditaburi dengan carborundum (600 mesh). Sap dioleskan pada permukaan daun dengan menggunakan kapas steril dimulai dari bagian pangkal daun ke ujung secara searah dengan tidak mengulangi pada daerah yang sama. Setelah pengolesan sap selesai, daun tanaman disiram dengan air mengalir untuk membersihkan sisa-sisa sap yang masih melekat. Tanaman yang sudah diinokulasi dipelihara dan dirawat di rumah kaca sampai muncul gejala.

12

Metode Indirect Enzyme -Linked Immunosorbent Assay (I-ELISA) Metode I-ELISA dilakukan dengan menggunakan tanaman yang terinfeksi BCMV. Sampel tanaman terinfeksi BCMV digerus dalam buffer coating dengan perbandingan 1:100 (b:v). Sampel tersebut kemudian dimasukkan ke dalam

masing-masing sumuran pada plat mikrotiter ELISA sebanyak 100 l dan diinkubasi pada suhu 4oC selama semalam. Masing-masing sumuran selanjutnya dicuci sebanyak 5-7 kali dengan phosphate buffer saline tween-20 (PBST) dan kemudian diisi dengan 100 l antiserum BCMV yang telah dilarutkan dalam bufer ECL (bovine serum albumin 2 g, PVP 20 g, NaN3 0.2 g) (1:200). Plat ELISA tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selam 2 jam. Masing-masing sumuran selanjutnya dicuci kembali dan kemudian diisi dengan 100 l konjugat yang dilarutkan dalam bufer ECL dengan perbandingan 1:1000. Larutan konjugat terebut kemudian diinkubasi pada suhu ruang selam 2 jam. Setelah 2 jam plat dicuci 2-7 kali dengan PBST. Sumuran selanjutnya diisi dengan 100 l PNP yang dilarutkan dalam bufer PNP. Setelah diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit dilakukan pengamatan secara kuantitatif dengan menggunakan ELISA reader (Bio-RAD 550) pada panjang gelombang 405 nm. Reaksi dihentikan dengan cara menambahkan larutan NaOH 3 M sebanyak 50 l kedalam masing-masing sumuran. Pada setiap pengujian disertakan kontrol negatif yaitu tanaman sehat dan bufer. Evaluasi metode I ELISA dilakukan untuk menentukan batas sensitifitas, yaitu dengan melakukan pengenceran pada sap tanaman dan antiserum. pengenceran 105. Sap tanaman diencerkan secara berseri sampai 106 dan antiserum diencerkan hingga

Metode Dot Immunobinding Assay (DIBA) Metode DIBA dilakukan berdasarkan metode Mahmood et al. (1997). Sebelum digunakan membran nitroselulosa direndam dalam metanol 100% selama 10 detik dan dikering anginkan. Jaringan daun tanaman terinfeksi BCMV digerus dalam tris buffer saline (TBS dengan perbandingan 1:10 (b/v) (TBS: TrisHCl 0.02 M dan NaCl 0.15 M, pH 7,5). Cairan perasan tanaman tersebut

13

selanjutnya diteteskan ke atas membran nitroselulosa sebanyak 10 l. Setelah tetesan sampel kering, membran direndam di dalam 10 ml larutan blocking non fat milk 2% dalam TBS yang mengandung Triton X-100 dengan konsentrasi akhir 2%. Membran kemudian diinkubasi pada suhu ruang sambil digoyang dengan kecepatan 50 rpm selama 2 jam dengan menggunakan EYELA multi shaker MMS. Membran kemudian dicuci 5 kali dengan dH2O, tiap pencucian berlangsung 5 menit sambil digoyang dengan kecepatan 100 rpm. Membran selanjutnya direndam dalam 5 ml TBS yang mengandung antibodi 5 l ditambah non fat milk dengan konsentrasi akhir 2% dan kemudian membran diinkubasi semalam pada suhu kamar sambil digoyang dengan kecepatan 50 rpm. Membran kemudian dicuci sebanyak 5 kali dengan Tween 0.05% dalam TBS (TBST). Membran selanjutnya direndam dalam 5 ml TBS yang mengandung konjugat 5 l (goat anti rabbit-IgG, Sigma, USA) ditambah non fat milk dengan konsentrasi akhir 2% dan kemudian membran diinkubasi selama 60 menit sambil digoyang dengan kecepatan 50 rpm. Membran selanjutnya dicuci kembali dengan TBST dan direndam selama 5 menit dalam 10 ml bufer substrat (Tris-HCl 0.1 M, NaCl 0.1 M dan MgCl2 5 mM) yang mengandung nitro blue tetrazolium (NBT) 66 l dan bromo chloro indolil phosphate (BCIP) 30 l. Bila reaksi positif akan terjadi perubahan warna putih menjadi ungu pada membran nitroselulosa yang telah ditetesi cairan perasan tanaman dan reaksi dapat dihentikan dengan merendam membran dalam dH2O. Evalusi metode DIBA dilakukan dengan perlakuan pengenceran sap tanaman hingga 106 dan penggunaan dua membran yang berbeda yaitu Amersham HybondTM-P dan Nitropure GE untuk menentukan sensitifitas metode deteksi.

Metode Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) Tahapan metode deteksi BCMV menggunakan metode RT-PCR terdiri atas tahapan ekstraksi RNA total, transkripsi balik, dan amplifikasi cDNA. Ekstraksi RNA Total. Metode ekstraksi RNA dilakukan dengan menggunakan NucleoSpin RNA Plant mini kit mengikuti metode Macherey-Nagel (2010). Daun tanaman kacang panjang yang sakit (0,1 g) digerus menggunakan pistil dan mortar steril yang didalamnya telah diisi dengan nitrogen cair hingga menjadi bubuk.

14

Sebanyak 350 l bufer RA1 yang telah ditambahkan 1% merkaptoetanol (3.5 l) dimasukkan ke dalam hasil gerusan yang telah menjadi bubuk. Sap yang dihasilkan dimasukkan ke dalam tabung mikro1.5 ml kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 11 000 rpm selama 1 menit. Sap tanaman dipindahkan dalam tabung mikro yang baru tanpa endapannya dan ditambahkan 350 l etanol 70%. Sap dipindahkan ke dalam kolom ungu dan disentrifugasi dengan kecepatan 11 000 rpm selama 1 menit. Supernatan yang terbentuk ditambahkan 350 l MBD (Membrane Desalting Buffer) dan kemudian dipindahkan dalam kolom biru. Hal ini dilakukan dengan tanpa menyentuh pelet di dasar tabung. Sebanyak 95 l DNase ditambahkan dalam kolom biru dan diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Proses selanjutnya adalah pencucian dan pengeringan membran silika. Proses pencucian dilakukan sebanyak tiga kali dengan bufer pencucian yang berbeda. Sebanyak 200 l RA2 ditambahkan pada kolom biru kemudian

disentrifugasi dengan kecepatan 11 000 rpm selama 30 detik. Pencucian kedua dilakukan dengan menambahkan RA3 sebanyak 600 l pada kolom biru lalu disentrifugasi dengan kecepatan 11 000 rpm selama 30 detik. Pencucian ketiga dilakukan dengan menambahkan bufer yang sama pada pencucian kedua, tapi hanya sebanyak 250 l dan disentrifugasi dengan kecepatan 11 000 rpm selam 2 menit. Setiap proses pencucian kolom biru sebelumnya dipindahkan ke collection tube baru lalu ditambahkan bufer-bufer pencucian. Untuk memastikan bahwa kolom biru benar-benar kering, selanjutnya kolom dipindahkan lagi ke collection tube baru dan disentrifugasi lagi 11 000 rpm selama 1 menit. Kolom dipindahkan ke tabung mikro 1.5 ml baru dan ditambahkan 60 l RNase- free water ke permukaan saringan dalam kolom sehingga pelet tergenang, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 11 000 rpm selama 1 menit. Hasil ekstraksi disimpan pada suhu -80oC sampai akan digunakan. Transkripsi Balik (Reverse Transcription). Reaksi transkripsi balik (10 l) terdiri atas 2.2 l water free nuclease, 2 l bufer RT 10x, 0.35 l dNTP 10 mM, 0.75 l oligo d(T) 10 M, 0.35 l RNAse Inhibitor, 0.35 l MmULV RT, dan 2 l RNA sampel ditambahkan kedalam tabung mikro. Tabung mikro tersebut dimasukkan ke dalam thermal cycler (Gene Amp PCR System 9700) dengan

15

kondisi RT; 25oC selama 5 menit, 37oC selama 90 menit dan 70oC selama 15 menit. Hasil akhir dari RT adalah produk cDNA yang akan digunakan pada reaksi selanjutnya yaitu PCR. Amplifikasi cDNA. Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan pasangan

primer yaitu BIC-cpF (5-TCA GGA ACT GGG CAG CCG CAA C-3) dan BICcpR (5-CTG CGG GGA ACC CAT GCC AAG-3). Reaksi amplifikasi (25 l) terdiri atas 16.3 l water free nuclease, 2.5 l PCR buffer, 0.2 l dNTP, 2.5 l sucrose creasol, 1l primer BIC-F, 1 l primer BIC-R, 1 l taq polymerase, 1 l cDNA hasil RT. Semua bahan tersebut diisi ke dalam tabung mikro, selanjutnya tabung mikro tersebut dimasukkan ke dalam thermal cycler (Gene Amp PCR System 9700). Amplifikasi BCMV dilakukan sebanyak 35 siklus mengikuti metode Udayashankar et al. (1995) melalui beberapa tahapan yaitu pemisahan utas DNA pada suhu 94 oC selama 2 menit, penempelan primer pada DNA 68 oC selama 1 menit dan sintesis DNA pada suhu 72 oC selama 1 menit. Khusus untuk siklus terakhir ditambah tahapan sintesis selama 10 menit, kemudian siklus berakhir dengan suhu 4 oC. Evaluasi metode RT-PCR dilakukan dengan perlakuan pengenceran cDNA hingga 105 untuk menentukan batas cDNA yang dapat digunakan untuk deteksi BCMV.

Metode Polymerase Chain Reaction (PCR) Metode PCR dilakukan melalui tahapan ekstrasi DNA, amplifikasi DNA, dan visualisasi hasil PCR dengan gel agarosa. Ekstrasi DNA Total Tanaman. Ekstrasi DNA total dilakukan menggunakan metode CTAB (Doyle & Doyle, 1990) dengan beberapa modifikasi. Bufer

ekstraksi (2% CTAB, 100 mM Tris pH 8, 10 mM EDTA, 5 M NaCl, 1% 2-makaptoetanol) dipanaskan sebanyak 10 ml dalam penangas air 65oC. Sampel daun sebanyak 0.1 g digerus dalam 500 l bufer, setelah itu dimasukkan dalam tabung mikro berukuran 2 ml. Hasil campuran selanjutnya diinkubasi dalam penangas air pada suhu 65oC selama 60 menit. Setiap 10 menit tabung dibolakbalik untuk membantu proses lisis. Setelah 60 menit tabung yang berisi campuran tersebut diambil dari penangas dan didiamkan sebentar (2 menit) pada suhu ruang,

16

kemudian ditambahkan 1 ml campuran Kloroform:Isoamilalkhohol (CI) dengan perbandingan 24:1 (v : v). Agar tercampur dengan baik tabung divorteks selama 5 menit, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 15 menit dan diambil supernatannya. Supernatan yang diperoleh diambil secara hati-hati dan dipindahkan pada tabung baru dan ditambahkan 0.1 volume sodium asetat (CH3COOH 3M pH 5.2) dicampur dengan rata dan ditambahkan 2.5 volume etanol absolut dan diinkubasi pada suhu -20oC selama satu malam. setelah itu disentrifugasi dengan kecepatan 12 000 rpm selama 15 menit. Pelet hasil

sentrifugasi dicuci dengan menambahkan etanol 70%, kemudian disentrifugasi kembali selama 10 menit dan dibuang supernatannya, selanjutnya pelet dikeringkan. Setelah kering, pelet yang diperoleh dilarutkan dengan 60 l bufer TE 1x (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA). Amplifikasi DNA. Metode amplifikasi dilakukan mengikuti metode yang dilakukan oleh Rojas et al. (1993). Reaksi PCR (volume total 25 l) dilakukan dengan mencampurkan water free nuclease, 16.3 l bufer PCR, 2.5 l sucrose cresol, 0.5 l dNTP, 1 l masing-masing primer pAL1v 1978 (5GCA TCT GCA GGC CCA CAT YGT CTT YCC NGT 3) pAR1c 715 (5 GAT TTC TGC AGT TDA TRT TYT CRT CCA TCC A 3) (Rojas et al. 1993), 0.2 l unit Taq DNA polimerase, dan 1 l DNA template. PCR dilakukan pada reaksi sebagai berikut: satu siklus optimasi pada suhu 94oC selama 1 menit, 30 siklus yang terdiri dari tahap denaturasi DNA pada suhu 94oC selama 1 menit, tahap penempelan primer ke DNA target pada suhu 55oC selama 2 menit, dan tahap pemanjangan DNA pada suhu 72oC selama 10 menit yang diakhiri pada suhu 4oC untuk penyimpanan. Visualisasi Hasil PCR. Hasil PCR divisualisasi pada 1% gel agarosa dalam 0.5x bufer TBE (Tris-borate EDTA) dengan tegangan 100 volt selama 25 menit. Gel diamati dengan UV transilluminator setelah diwarnai dengan etidium bromida.

Deteksi Virus dari Sampel Kacang Panjang Bergejala Sampel daun kacang panjang yang menunjukkan gejala mosaik diperoleh dari beberapa pertanaman kacang panjang. Pengambilan sampel dilakukan di Bogor (Balebak, Situ Gede, Bubulak, Cibereum, Cikabayan) dan Brebes.

17

Pengambilan sampel di lapangan dilakukan dengan mengumpulkan daun dari tanaman yang menunjukkan gejala. Gejala pada tanaman diamati dan dicatat. Sampel tanaman tersebut kemudian digunakan untuk diagnosis BCMV menggunakan metode serologi (DIBA) dan molekuler (PCR dan RT-PCR).