Anda di halaman 1dari 10

1

Isolasi, Purifikasi, Kinetika, Dan Karakterisasi Enzim Invertase Saccharomyces cerevisiae


Anggun Widya Ninggar (G84070034)1, Amelinda2, dan Waras Nurcholis3 Mahasiswa Praktikum1, Asisten Praktikum2, dan Dosen Praktikum3 Pengantar Penelitian Biokimia Departemen Biokimia, FMIPA, IPB 2010 ABSTRAK Invertase merupakan katalis pada hidrolisis sukrosa menghasilkan glukosa dan fruktosa (gula invert). Praktikum ini bertujuan mengisolasi dan mempurifikasi enzim invertase dari ragi, menentukan aktivitas dan kuantitas protein enzim invertase menggunakan assay Nelson dan metode Lowry, menentukan nilai Km dan Vmaks dari enzim invretase melalui study kinetika, dan mengkarakterisasi enzim invertase berdasarkan bobot molekul, pengaruh suhu, dan pengaruh pH. Assay Nelson berprinsip pada pengukuran jumlah gula pereduksi. Pada metode ini aktivitas enzim invertase ditunjukkan oleh bertambahnya produk reaksi (glukosa dan fruktosa) atau berkurangnya substrat (fruktosa/ satuan waktu). Metode Lowry didasarkan pada reaksi Biuret dan reduksi reagen arsenomolibdat menghasilkan warna biru. Hasil optimum karakterisasi enzim invertase amobil diperoleh pada kadar Na-alginat 5 gr, konsentrasi substrat (sukrosa) 0,5 M, pH 4,5, dan suhu 30oC. Pengukuran aktifitas enzim invertase dilakukan dengan metode spektrofotometri menggunakan reagen Nelson. Dari hasil pengukuran diperoleh aktifitas enzim invertase terbesar pada fraksi I sebesar 1.2256 unit/menit, kadar protein terbesar pada fraksi II sebesar 0,0255 mg/mL, fold enzim dan yield enzim berturut-turut adalah 931,49% dan 90,14%. Sedangkan Nilai konstanta Michaelis, Vmaks = -1,0940 mol/mL. menit dan Km = -1,8818 mM. PENDAHULUAN Indonesia merupakan negara yang memiliki sumber daya alam yang melimpah, baik hayati atau non-hayati. Tetapi masih banyak sumber daya alam yang belum dimanfaatkan secara maksimal oleh masyarakat, padahal sumber daya alam tersebut sangat berpotensi untuk dimanfaatkan lebih optimal lagi. Mikroorganisme merupakan salah satu sumber daya alam yang bisa dirasakan manfaatnya dalam kehidupan. Beberapa macam mikroorganisme dapat menghasilkan enzim adalah khamir, fungi, dan bakteri. Diantaranya yang paling lazim adalah khamir Saccharomyces cerevisiae yang merupakan mikroorganisme paling komersial saat ini. Penggunaan S. cerevisiae sebagai pabrik etanol telah banyak dikembangkan di beberapa negara, seperti Brasil, Afrika Selatan, dan Amerika Serikat. Khamir lebih banyak digunakan untuk memproduksi alkohol secara komersial dibandingkan dengan bakteri (Narita 2005). Invertase, dikenal sebagai fructofuranoside fructohydrolase (EC 3.2.1.26) merupakan sebuah katalis untuk hidrolisis sukrosa yang menghasilkan fruktosa dan glukosa (gula invert). Sukrosa merupakan produksi akhir asimilasi karbon (C) pada proses fotosintesis yang terjadi di daun (Kim et al. 2000) dan bentuk karbohidrat yang mudah ditransporta-sikan ke jaringan simpan atau sink tissues (Cheng et al. 1996). Selain berfungsi dalam penyediaan energi dan kerangka karbon, sukrosa juga berperan dalam pengaturan ekspresi gen lainnya (Koch, 1996; Ohto et al., 2001), partisi karbon asimilate (Lunn & Hatch 1997; Grof et al. 1998) serta pertumbuhan dan perkembangan tanaman (Fung et al, 2003). Enzim invertase banyak ditemukan pada ragi roti yang mengandung khamir Saccharomyces ceriviseae. Invertase diproduksi oleh bakteri, fungi, tumbuhan tingkat tinggi, dan beberapa sel hewan (Lee Huang et al. 2000). Tetapi banyak penelitian dilakukan pada produksi invertase yang dihasilkan oleh khamir Saccharomyces cereviceae. Khamir ini banyak terkandung pada ragi roti, dan secara komersil banyak dijual dipasaran. Yeast merupakan mikroorganisme uniseluler berbentuk ellips, bulat atau silindris, yang ukurannya 5-10 kali lebih besar dari bakteri. Ragi ini banyak digunakan dalam pembuatan bir dan roti serta dikenal pula sebagai suplemen makanan karena kaya akan vitamin. Enzim invertase banyak digunakan dalam industri fermentasi karena berfungsi sebagai katalis dalam hidrolisis sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa (gula invert/gula pereduksi). Kemampuan enzim dalam mengkatalisis reaksi kimia dipengaruhi oleh kondisi lingkungan yang meliputi pH, suhu, waktu inkubasi, dan konsentrasi substrat. Enzim invertase yang dihasilkan oleh Saccharomycees ceriviceae mempunyai aktivitas paling tinggi pada pH 4,5 dan temperatur 30C (Bergamasco et al. 2000).

Setiap enzim mempunyai nilai tetapan Michaelis-Menten tertentu, dimana nilai Km dapat digunakan untuk memperkirakan jumlah substrat yang diperlukan agar reaksi enzimatis berjalan efisien. Dengan mengetahui nilai Km dan Vm suatu enzim, maka dapat dilakukan optimalisasi penggunaan enzim tersebut sebagai biokatalisator reaksi pemecahan substrat menjadi produk. Laju reaksi meningkat saat suhu mencapai nilai optimum dan berkurang saat suhunya maksimum. Sedangkan aktivitas enzim akan meningkat dengan meningkatnya kadar substrat (Lehinger 1982). Pemanfaatan enzim secara komersial terus dipelajari dan diterapkan yaitu pemanfaatan enzim untuk proses enzimatik pada industri makanan, minuman, farmasi, dan biokimia. Salah satu contoh pemanfaatan tersebut adalah pematangan buah-buahan hijau yang dipanen, pelayuan daging, pengawetan keju, pencegahan kekeruhan bir, dan pembentukan tekstur gula. Sedangkan pemanfaatan enzim invertase banyak dilakukan dalam industri makanan dan minuman khususnya pada pengolahan selai, permen, produk gula-gula, dan produksi asam laktat dari fermentasi sirup tebu (Acosta et al. 2000). Invertase juga digunakan untuk memproduksi etanol dari sukrosa sebagai sumber karbon (Lee Huang 2000). Adanya isu sosial dan fakta akan terbatasnya sumber bahan bakar fosil telah menstimulasi upaya penggunaan dan pengembangan bahan bakar alternatif yang renewable dan ramah lingkungan. Produksi etanol melalui fermentasi mikroba dianggap sebagai metode alternatif sumber energi bahan bakar fosil dikarenakan keunggulannya, yaitu rendahnya biaya produksi, persentase rendemen yang tinggi, prosesnya relatif lebih cepat, penanganannya sederhana, dan produk samping yang relatif lebih sedikit serta aman bagi lingkungan (Narita 2005). Secara umum enzim larut dalam air, sehingga banyak enzim tidak ekonomis untuk digunakan pada pengoperasian tipe batch dalam skala besar di industri, karena hanya dapat digunakan satu kali proses dengan biaya yang cukup mahal. Tetapi dalam tahun-tahun belakangan ini berbagai teknik telah ditemukan untuk memperbaiki kerja enzim, yaitu dengan cara mengikatkan enzim pada bahan-bahan yang tidak larut dalam air, dimana bahanbahan tersebut dapat dipisahkan dari produk dengan mudah. Hal itu memungkinkan penggunaan kembali bahan-bahan tak larut yang mengandung enzim tersebut. Teknik ini disebut dengan amobilisasi enzim. Teknik amobilisasi pada enzim merupakan suatu teknik yang dapat meningkatkan kemampuan hidup enzim sehingga dapat digunakan kembali. Teknik tersebut merupakan metode terbaik untuk mengurangi pengeluaran biaya dalam proses enzimatik secara kontinu khususnya dalam industri makanan dan minuman (Bucke 1987).

METODE PERCOBAAN Waktu dan Tempat Praktikum dilakukan selama 6 minggu yaitu 2 Maret - 27 April 2010. Tempat pelaksanaannya di Laboratorium Pendidikan Departemen Biokimia, FMIPA IPB. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini antara lain mortar, sentrifus, refrigerator Sorvall, rotor SS-34, pipet pasteur, bulb, tabung sentrifus 50 mL, inkubator, gelas ukur, gelas piala 100 dan 600 mL magnetic stirer, tabung reaksi bertutup, waterbath, vortex, spektrofotometer UV/VIS, stopwatch, dan mikropipet, pipet kaca, pipet stirer, magnetic stirer, seperangkat peralatan SDS-PAGE. Bahan-bahan yang digunakan yaitu ragi (Saccharomyces cerevisiae), pasir/ glassbead, toluen, akuades, asam asetat1N, parafilm, amonium sulfat, 4mM glukosa, 4 mM fruktosa, Reagen arsenomolibdat, bufer asetat 0.2 M pH 4.5, bufer tris-HCl 0.05 M pH 7.3, reagen A (2% Na2CO3 dalam NaOH 0.1 N), reagen B (2.7% sodium potasium tartrat), reagen C (1% CuSO4 dalam H2O), reagen D (reagen folin Cioucalteou yang telah diencerkan dengan air sampai 1 N dalam asam, harus dibuat fres), fraksi enzim invertase I, II, III, sukrosa 0.5M, H2O, reagen Folin Wu, larutan monomer, 4x running gel bufer (1.5 M Tris-Cl pH 8.8), 4x stacking gel bufer (0.5 M Tris-Cl pH 6.8), 10% SDS, 10% amonium persulfat, 2x treatment bufer (0.125M Tris-Cl, 4% SDS, 20% v/v gliserol, 0.2 M DDT, 0.02% bromfenol blue, pH 6.8), tank bufer (0.025M Tris, 0.192M glisin, 0.1% SDS, pH 8.3), water saturated n-butanol, TEMED, standar BM protein campuran (marker), larutan fikasasi (25% isopropanol, 10% asam asetat) dan larutan pewarna commassie blue (0.06 commassie blue G-250, 10% asam asetat). Prosedur Percobaan Isolasi Invertase Ragi Ekstraksi invertase ragi. Ragi ditimbang 10 gram dan sejumlah glass bead (2-3 gram) dimasukkan ke dalam mortar. Setelah itu ditambahkan 10 mL toluen ke dalam mortar tersebut, gerus sedikit demi sedikit hingga membentuk pasta yang halus, lalu ditambahkan 20 mL akuadessecara bertahap selama 30 menit, dilanjutkan dengan penggerusan setiap penambahan. Seluruh isi mortar dipindahkan ke dalam tabung sentrifus 50 mL laulu sentrifugasi selama 15 menit, 12000 rpm. Setelah itu, lapisan air dipindahkan dan ekstrak protein dikumpulakan, dicatat volumenya. Fraksi satu didapat dari aliquot sebagai sampel dari ekstrak kasar, lalu diukur aktivitas dan kadar proteinnya.

Pemanasan ekstrak invertase ragi. Ekstrak diinkubasi pada suhu 50oC selama 30 menit lalu ekstrak didinginkan, disentrifugasi 15 menit, 15000rpm. Volume supernatan diukur, lalu diambil 2 mL aliquot untuk uji aktivitas dan kadar protein ekstrak kasar pemanasan. Fraksinasi ekstrak invertase ragi. Fraksinasi pengendapan dibuat dengan amonium sulfat 20, 40, 60, dan 80% dengan menambahkan garam amonium sulfat selama satu jam. Lalu disentrifugasi selama 30 menit, 30000 rpm. Supernatan yang didapat ditambahakan amonium sulfat lagi untuk fraksi pengendapan berikutnya. Hasilnya disimpan dalam suhu -20oC. Setelah itu, endapan dilarutkan dengan buffer tris-HCl dengan pH 7.3 lalu diukur volume total masing-masing fraksi, diambil 1-2 mL untuk uji kadar aktivitas. Uji Aktivitas Invertase Ragi dengan Assay Nelsons Pembutan kurva standar. Sepuluh tabung disiapkan lalu diisi dengan komposisi glukosa 4 mM pada tabung dua sampai delapan berturut-turut adalah 0.02, 0.05, 0.1, 0.15, 0.20, 0.25, 0.3 mL; fruktosa 4 mM hanya pada tabung sembilan yaitu 0.2 mL; sukrosa 4 mM pada tabung sepuluh yaitu 0.2 mL; dan H2O pada tabung satu sampai sepuluh berturut-turut adalah 1, 0.98, 0.95, 0.90, 0.85, 0.80, 0.75, 0.70, 0.80, 0.80 mL. Setelah itu, masingmasing tabung ditambahkan 1 mL reagen Nelsons, ditutup dengan alumunium foil lalu didihkan selama 20 menit. Setelah 20 menit, tabung didinginkan dan ditambahkan 1 mL reagen arsenomolibdat, dikocok dengan vorteks, dibiarkan 5 menit, lalu ditambahkan 7 mL H2O, dikocok lagi dengan vorteks. Terakhir, baca serapannya pada panjang gelombang 510 nm dan dibuat kurva standard. Uji aktivitas enzim invertase. Sembilan tabung disiapkan lalu diisi dengan komposisi buffer asetat 0.2 M pH 4.5 pada tabung 1 sampai 7 adalah 0.2 mL; H2O dari tabung 1 sampai 9 berturut-turut adalah 0.6, 0.55, 0.10, 0.55, 0.10, 0.55, 0.10, 1.0, 0.8 mL; Fraksi 1 pada tabung 2 dan 3 adalah 0.05 dan 0.50 mL; fraksi 2 pada tabung 4 dan 5 adalah 0.05 dan 0.50 mL; fraksi 3 pada tabung 6 dan 7 adalah 0.05 dan 0.50 m; glukosa 4 mM pada tabung 9 adalah 0.20 mL; sukrosa 0.5 M pada tabung 1 sampai 7 adalah 0.2 mL. Setelah itu, semua tabung diinkubasi 10 menit pada suhu ruang, ditambahkan 1 mL reagen Folin Wu, tabung ditutup, dan dididihkan selama 20 menit. Setelah 20 menit, tabung didinginkan, ditambahkan reagen arsenomolibdat 1 mL, dikocok dengan vorteks, lalu biarkan selama 5 menit. Setelah 5 menit, tambahkan semua tabung dengan H2O 7 mL, dikocok lagi dengan vorteks, dan dibaca serapannya pada panjang gelombang 510 nm. Setelah itu, ditentukan aktivitas spesifiknya.

Penentuan Kadar Protein dengan Metode Lowry Pembuatan kurva standard. Sepuluh tabung disiapkan lalu diisi dengan komposisi standard BSA pada tabung 2 sampai 10 berturutturut adalah 0.05, 0.1, 0.15, 0.20, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, dan 0.45 mL; H2O dari tabung 1 sampai 10 berturut-turut adalah 0.50, 0.45, 0.40, 0.35, 0.30, 0.25, 0.20, 0.15, 0.10, 0.05 mL; reagen ABC pada semua tabung sebanyak 5 mL. Setelah itu, semua tabung dikocok dengan vorteks, diinkubasi 10 menit pada suhu ruang. Penambahan reagen harus diatur dengan baik. Pada saat sepuluh menit terakhir ditambahkan 0.5 mL reagen D ke tabung pertama dan seterusnya. Kemudian dicampur dengan vorteks, diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang lalu dibaca serapannya pada panjang gelombang 700 nm. Pengukuran kadar protein enzim invertase. Sampel fraksi 1 dan 2 diencerkan dengan air dalam perbandingan 1:4 dengan komposisi assay tabung 1 sebagai blanko berisi 0.5 mL H2O; Tabung 2, 3, dan 4 berisi fraksi 1 dengan jumlah 0.05, 0.20, 0.5 mL dan H2O 0.45, 0.3, 0 mL; tabung 5, 6, dan 7 berisi fraksi 2 dengan jumlah 0.05, 0.20, 0.5 mL dan H2O 0.45, 0.3, 0 mL. Selanjutnya prosedur mengikuti metode Lowry seperti pembuatan kurva standard protein. Perlakuan untuk fraksi 3 adalah fraksi 3 disuspensikan pada buffer tris. Preparasi Buffer tris dan Fraksi 3 adalah dengan pengenceran air 1:1. Enam buah tabung disiapkan, tabung 1, 2, dan 3 sebagai blanko berisi buffer tris 0.05 M berturutturut adalah 0.05, 0.2, 0,5 mL dan H2O 0.45, 0.3, 0 mL, sedangkan tabung 4, 5, dan 6 adalah sampel yang berisi fraksi 3 berturut-turut adalah 0.05, 0.2, 0,5 mL dan H2O 0.45, 0.3, 0 mL. Selanjutnya prosedur mengikuti metode Lowry seperti pembuatan kurva standard protein. Study Kinetika Enzim Invertase. Pengaruh konsentrasi substrat pada aktivitas invertase. Kurva Michaelis-Menten dapat diperoleh dari data dengan proses eksperimen yaitu penyiapan duabelas tabung reaksi yang kemudian diisi dengan komposisi buffer asetat 0.2 M pH 4.5 pada tabung 1 sampai 10 sebanyak 0.20 mL; sukrosa 0.5 mM pada tabung dua sampai sepuluh berturut-turut sebanyak 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.10, 0.20, 0.40, 0.20, 0.40 mL, kemudian ditambahkan H2O sampai volumenya 0.9 mL kecuali tabung 11 dan 12 sebanyak 1.0 mL dan 0.8 mL; ditambahkan reagen Nelsons pada tabung 9 dan 10 sebanyak 1.0 mL; enzim fraksi 3 sebanyak 0.1 mL pada tabung satu sampai sepuluh dan glukosa 4 mL sebanyak 0.2 mL pada tabung 12. Assay dimulai dengan penambahan enzim lalu diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Reaksi dihentikan dengan penambahan reagen folin Wu sebanyak 1.0 mL,

tutup dengan alumunium foil dan dididihkan selama 20 menit. Setelah itu, baca serapannya pada panjang gelombang 510 nm. Prediksi Bobot Molekul Enzim Invertase Pembuatan gel. Semua komponen untuk running gel dicampur kecuali ammonium persulfat dan TEMED yaitu jenis larutan 10%, 14 mL akrilamid+6 mL air, 5 mL tris HCl 3 M pH 8.9, 0.4 mL 10% SDS, 14.4 mL air akuades kemudian diaduk dengan magnetik stirer, aerasi dengan vakum. Setelah itu, ditambahkan 0.4 mL amonium persulfat, dan 0.02 mL TEMED campur dan tuang dalam plat kaca kurang lebih 4 cm. N-butanol dimasukkan. Setelah gel membeku selama 1-2 jam, n-butanol dibuang dan dicuci dengan running gel overlay. Kemudian ditambahkan 1 mL running gel overlay dan dibiarkan hingga stacking gel siap. Setelah siap, dua sumur diset dalam gel, masingmasing dengan standard BM protein campuran dan yang kedua dengan invertase fraksi 3. Prosedur elektroforesis SDS-page. Sampel protein dididihkan selama 90 detik, kemudian sampel disimpan pada 0oC hingga siap digunakan. Sampel protein dan standar diambil sekitar 5L dan diletakkan ke dalam sumur gel. Setelah itu, sistem elektroforesis dirakit dan dihubungkan ke dengan power supply (50-100 volt). Prosedur pewarnaan standar. Gel disimpan dalam larutan fiksasi pewarnaan cepat, lalu digoyang perlahan-lahan. Larutan fiksasi diganti dengan larutan pewarnaan coomasive blue kemudian digoyang selama 2-24 jam hingga protein terlihat. Setelah itu larutan pewarnaan diganti dengan larutan destaining II hingga baground gell jernih kemudian disimpan dalam asam asetat 7% atau ddH2O. HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi Ekstrak Kasar Enzim Invertase Ragi roti digunakan sebagai sumber enzim invertase pada isolasi ekstrak kasar enzim invertase karena ragi banyak mengandung khamir Saccharomyces cereviseae. Isolasi diawali dengan mencampurkan ragi roti sebanyak 10 gram dan pelarut toluen sebanyak 10 mL lalu diaduk. Selanjutnya, campuran tersebut dihomogenasikan dengan menggunakan homogenizer supaya lebih merata. Pemecahan sel dilakukan setelah proses inkubasi. Hal ini dikarenakan enzim invertase termasuk enzim yang berada di dalam sel (intraseluler), maka perlu dilakukan proses pemecahan dinding sel untuk mengeluarkan enzim di dalam sel supaya dihasilkan enzim yang lebih banyak. Proses pemecahan sel ini dilakukan dengan cara keras, yaitu dengan glassbed dan digerus selama 30 menit. Inkubasi ragi dilakukan selama 30 menit dengan suhu inkubasi sebesar 50oC. Suhu diatur sebesar 50oC karena jika suhu

terlalu panas maka mikroorganisme penghasil enzim invertase akan mati, sehingga enzim tidak akan diperoleh. Selanjutnya, pemisahan enzim dilakukan dengan cara disentrifuge dengan kecepatan 12000 rpm selama 15 menit. Hal ini berguna untuk memisahankan pecahan dinding dinding sel dari supernatannya. Prinsip dari metode sentrifuge ini, yaitu proses pemisahan ekstrak enzim yang didasarkan pada berat molekul dengan menggunakan gaya sentrifugal. Sehingga nantinya berat molekul yang ringan akan berada diatas dan yang berat berada dibawah (Koolman, 2000). Setelah disentrifuge, supernatan didekantasi dari residu/pecahan dinding-dinding sel, maka hasil yang diperoleh berupa ektrak kasar enzim invertase yang berwarna cokelat. Berdasarkan komposisi tersebut maka jumlah ekstrak kasar enzim invertase yang diperoleh sebanyak 18.02 gram. Ekstrak kasar enzim invertase hasil optimasi ditentukan aktivitasnya dengan menggunakan assay Nelsons dan kandungan proteinnya menggunakan metode Lowry, diukur aktifitas secara spektroskopi. Assay Nelson berprinsip pada pengukuran jumlah gula pereduksi. Pada metode ini aktivitas enzim invertase ditunjukkan oleh bertambahnya produk reaksi (glukosa dan fruktosa) atau berkurangnya substrat (fruktosa/ satuan waktu). Metode Lowry didasarkan pada reaksi Biuret dan reduksi reagen arsenomolibdat menghasilkan warna biru (Hasanah Putra 2010). Uji Aktivitas Invertase Ragi dengan Assay Nelsons Pembuatan Kurva Standar Gula Invert. Sepuluh tabung disiapkan lalu diisi dengan komposisi glukosa 4 mM pada tabung dua sampai delapan berturut-turut; fruktosa 4 mM hanya pada tabung sembilan; sukrosa 4 mM pada tabung sepuluh; dan H2O pada tabung satu sampai sepuluh. Setelah itu, masing-masing tabung ditambahkan 1 mL reagen Nelsons, ditutup dengan alumunium foil lalu didihkan selama 20 menit untuk memperjelas warna yang terjadi. Setelah 20 menit, tabung didinginkan dengan hasil diperoleh berupa padatan berwarana biru sampai biru kehijauan. Semakin tinggi konsentrasi gula invert, maka warna hijau semakin dominan. Untuk melarutkan padatan tersebut maka reagen arsenomolibdat ditambahkan sebanyak 1 mL, dikocok dengan vorteks, dibiarkan 5 menit. Warna larutan yang diperoleh, yaitu semakin tinggi konsentrasi gula invert maka warna larutan semakin biru pekat. Supaya campuran lebih encer dan bisa diukur absorbansinya,lalu ditambahkan 7 mL H2O, dikocok lagi dengan vorteks. Pengukuran absorbansi dilakukan secara spektroskopi pada panjang gelombang () sebesar 540 nm.

Kurva standar gula invert seperti pada gambar 1 dibuat dengan mengalurkan absorbansi (A) terhadap konsentrasi larutan gula invert (M). Nilai absorbansi mengalami kenaikan dengan semakin besarnya konsentrasi larutan gula invert sehingga diperoleh persamaan garis antara konsentrasi dan absorbansi yaitu y = 0,515x+ 0,00372 dengan r2 = 0,985. Persamaan tersebut akan digunakan untuk menghitung konsentrasi gula invert yang terbentuk. Gambar 1. Kurva standar aktivitas invertase ragi dengan assay Nelsons Nilai R2 dari kurva diatas adalah 0.985, hal ini menunjukkan bahwa kelinearan kurva standar baik karena hampir mendekati +1, yang mana titiktitik pada kurva standar melewati garis lerengnya. Perbedaan pH berpengaruh terhadap 2 jenis, yaitu struktur enzim dan gugus fungsional enzim. Suatu enzim dapat menghasilkan produk yang maksimal pada pH optimumnya. Aktivitas maksimum invertase yaitu pada pH 4,5 dengan aktivitas sebesar 1.2256 unit pada fraksi 1, 0.9568 unit pada fraksi 2, dan 1.1232 unit pada fraksi 3. Unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah yang menyebabkan pembentukan 2 mol gula pereduksi per menitnya. Hasil pH optimum ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Bergamasco et al. (2003), yang melaporkan bahwa

aktifitas enzim terjadi pada range pH 3,0 - 5,0 dengan aktivitas maksimum terjadi disekitar pH 4,5. Diatas skala tersebut aktivitas enzim mengalami penurunan. Semakin basa kondisi hidrolisis menyebabkan semakin rendahnya harga aktivitas enzim invertase. Perubahan pH dapat menyebabkan turunnya aktivitas enzim akibat perubahan ionisasi gugus-gugus fungsionilnya karena gugus ionik berperan penting dalam menjaga konformasi sisi aktif enzim untuk mengikat dan mengubah substrat menjadi produk. Perubahan pH juga dapat menyebabkan enzim terdenaturasi sehingga menyebabkan penurunan katalitik enzim. Denaturasi enzim dakibatkan karena terjadinya pemutusan ikatan penstabil struktur (seperti ikatan ionik, hidrogen, hidrofobik) yang menghubungkan antar polimer protein. Pemutusan tersebut dapat terjadi pada protein kwartener, tersier ataupun sekunder. Pada protein kwartener terjadi pemutusan ikatan penstabil struktur karena bentuknya yang merupakan gabungan antara globular satu dengan globular lainyya sehingga dapat terjadi pemutus an ikatan tersebut pada protein tersier satu dengan protein tersier lainnya dan terjadi seterusnya, pada protein tersier membentuk protein sekunder (Awwalurrizki &Putra 2009).

Tabel 1 Data unit enzim invertase dan unit aktivitas dalam fraksi (Total unit). [glukosa] unit enzim Tabun RataLarutan A FP g invertase rata mol B lanko Fraksi 1 1 2 3 4 5 6 Fraksi 3 7 8 9 0 0,114 1,523 0,851 1,387 1,013 1,484 -0,063 0,268 2,1567 2,95 1,645 2,686 1,959 2,874 -0,129 0,513 2,1561 0,295 1,645 0,2686 1,959 0,2874 1,1232 0,9568 1,2256 12 1,2 24 2,4 24 2,4 -

Total unit 67,284 6,7284 103,334 4 10,3334 60,6528 6,0653 -

rata-rata 37,006

Fraksi 2

56,834

33,359

Standar glukosa

Pada percobaan ini menunjukkan bahwa unit aktivitas tertinggi ada pada fraksi dua sebesar

56.824, sedangkan unit enzim invertase tertinggi adalah pada fraksi 1 dimana fraksi satu merupakan ekstrak kasar enzim invertase dan fraksi 3 merupakan fraksi yang dimurnikan pada enzin invertase. Penentuan Kadar Protein dengan Metode Lowry Pembuatan kurva standard. Sepuluh tabung disiapkan lalu diisi dengan komposisi standard BSA pada tabung 2 sampai 10; H2O dari tabung 1 sampai 10; reagen C (campuran dari reagen A dan B) pada semua tabung. Fungsi dari reagen ini adalah unuk membentuk kompleks Biuret. Setelah itu, semua tabung dikocok dengan vorteks, diinkubasi 10 menit pada suhu ruang. Penambahan reagen harus diatur dengan baik. Pada saat sepuluh menit terakhir ditambahkan 0.5 mL reagen D ke tabung pertama dan seterusnya. Kemudian dicampur dengan vorteks, diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang lalu dibaca serapannya pada panjang gelombang 700 nm. Kurva standar pada gambar 2 dibuat dengan mengalurkan absorbansi sebagai ordinat (sumbuY) dan konsentrasi larutan BSA sebagai absis (sumbu-X). Nilai absorbansi mengalami kenaikan dengan semakin bertambahnya konsentrasi larutan BSA sehingga diperoleh persamaan garis, yaitu y=0,0323x + 2,2497x10-3 dan faktor korelasi sebesar 0,9416. Persamaan yang diperoleh digunakan untuk menentukan kandungan protein. Kandungan protein yang diukur dalam penelitian ini adalah protein terlarut dan protein total. Protein terlarut merupakan oligopeptida dan mudah diserap oleh sistem pencernaan. Protein

total merupakan pengukuran kandungan nitrogen (N) dalam sampel. Oleh karena itu, terdapat senyawa non-protein yang ikut terdeteksi dan terkalkulasi. Namun, interferensi ini relatif kecil dan dapat diabaikan. Gambar 2 Kurva standar BSA. Metode Lowry-Folin hanya dapat mengukur molekul peptida pendek dan tidak dapat mengukur molekul peptida panjang (Alexander & Griffiths 1992). Prinsip kerja metode Lowry adalah reduksi Cu2+ (reagen Lowry B) menjadi Cu+ oleh tirosin, triptofan, dan sistein yang terdapat dalam protein. Ion Cu+ bersama dengan fosfotungstat dan fosfomolibdat (reagen Lowry E) membentuk warna biru, sehingga dapat menyerap cahaya. Protein merupakan polimer heterogen molekul-molekul asam amino. Protein yang terkandung dalam kedelai merupakan protein globuler. Dalam protein globuler, rantairantai samping hidrofil dan polar berada di bagian luar dan rantai samping hidrofob dan nonpolar berada di bagian dalam. Pada percobaan ini didapat kadar protein paling tinggi adalah pada fraksi II yaitu sebesar 0,0225 mg/mL sedangkan paling kecil adalah pada fraksi III sebesar 0,0015 mg/mL. Hal ini dikarenakan pada fraksi III sudah dilakukan perlakuan terus-menerus atau paling banyak sehingga kadar proteinnya paling kecil. Sementara itu kandungan protein Total pada fraksi II juga tertinggi (1,0328) dan fraksi III paling rendah (0,0608).

Tabel 2 Data jumlah protein, total protein, dan aktivitas spesifik enzim invertase. Laruta protein [protein] RataTotal Tabung A n (g) (mg/mL) rata protein Blanko 1 2 Fraksi 1 3 4 5 Fraksi 2 6 7 Fraksi 3 8 9 0 -0,007 0,12 0,208 0,037 0,048 0,775 -0,011 -0,004 -0,286 3,646 6,369 1,076 1,416 23,924 -0,41 -0,1935 -0,0057 0,0182 0,0127 0,0215 0,0071 0,0478 -0,0082 -0,00096 0,001 5 0,025 5 0,015 5 0,6975 0,1744 0,0698 2,295 0,574 0,2295 0,135 0,0338

Ratarata

Aktivitas Spesifik

0,3139

80,387

1,0328

37,522

0,0608

748,8

10

0,027

0,766

0,0015

0,0135

Dari hasil keseluruhan aktivitas spesifik fraksi III paling besar (748,8) dibandingkan fraksi yang lain. Dari konsentrasi tersebut didapat yield enzim sebesar 90,14%, sedangkan fold enzimnya sebesar 931,49%. Yield enzim merupakan perbandingan antara total unit dalam fraksi yang dimurnikan dengan total unit dalam ekstrak kasar, sedangkan fold enzim merupakan perbandingan antara aktivitas spesifik dari fraksi yang dimurnikan dengan aktivitas spesifik ekstrak kasar. Penentuan kinetika enzim Penentuan kinetika enzim invertase (Vmaks dan Km) didasarkan atas plot grafik hubungan antara konsentrasi substrat [S] dan aktivitas enzim (V) (Fayyaz et al. 1995; Dinu 2001). Larutan substrat sukrosa dibuat dengan konsentrasi antara 0.02-0.4 dengan interval 0.02 dan 0.1 dalam larutan buffer asetat 0,2 M pH 4.5 lalu dilakukan pengujian aktivitas enzim sesuai prosedurnya. Setelah itu ditentukan aktivitas enzim (mol gula pereduksi/ menit) pada masing-masing konsentrasi substrat. Selanjutnya dibuat tabel V dan [S] dan dikonversi menjadi 1/V dan 1/[S] serta dibuat plot grafik hubungan antara 1/V dan 1/[S]. Lalu ditentukan nilai Vmaks dan Km yang didasarkan atas persamaan kurva Lineweaver-Burk (Whitaker, 1996), dengan cara: - Bahwa dari persamaan: 1/V = 1/Vmaks + Km/ Vmaks.(1/[S]) - Bila 1/V = Y dan 1/[S] = X, maka rumusnya dapat ditulis menjadi: Y = a + bX, sehingga: a = 1/Vmaks dan b = Km/Vmaks - Dengan demikian, bila harga 1/Vmaks diketahui maka nilai Vmaks didapat, begitu pula nilai Km akan juga didapat dari persamaan b = Km/Vmaks. Aktivitas enzim invertase pada beberapa konsentrasi substrat (Tabel 3) menunjukkan bahwa konsentrasinya mula-mula meningkat secara signifikan sejalan dengan meningkatnya konsentrasi substrat. Penentuan Vmaks dan Km didasarkan atas persamaan garis regresi grafik hubungan antara 1/[S] dan 1/V (Tabel 3),

dari persamaan regresi y=1,720x 0,914, maka diperoleh Vmaks = -1,0940 gram/ menit dan
Km = -1,8818 mM Aktivitas enzim invertase yang mula-mula meningkat secara signifikan sejalan dengan meningkatnya konsentrasi substrat, tetapi tidak signifikan setelah konsentrasi substrat ditingkatkan lagi. Hal ini terjadi karena suatu reaksi enzimatis akan meningkat dengan bertambahnya konsentrasi substrat [S], akan tetapi setelah [S] meningkat lebih lanjut akan sampai pada kecepatan yang tetap. Pada kondisi dimana kecepatan reaksi enzimatis tidak dapat bertambah lagi dengan bertambahnya [S] disebut kecepatan maksimum (Vmaks) (Wiesman, 1989). Gambar 3 Kurva hubungan antara kecepatan dan konsentrasi substrat (Michaelis Menten) Gambar 4 Kurva hubungan antara 1/V dan 1/S (Lineweaver burk) Penentuan Vmaks akan menghasilkan gambaran tentang sifat-sifat kinetika enzim lain, Vmaks, yaitu suatu konsentrasi substrat yang separuh lokasi aktifnya telah terisi atau bila kecepatan reaksi enzimatis telah mencapai setengah dari kecepatan maksimum, yang dikenal dengan Km (tetapan Michaelis-Menten). Nilai Km digunakan selain sebagai ukuran afinitas E-S juga berhubungan dengan tetapan keseimbangan disosiasi kompleks E-S menjasi E dan S. Fayyaz (1995) menambahkan bila nilai Km kecil berarti kompleks E-S mantap dan afinitas enzim terhadap substrat tinggi, sedangkan bila nilai Km besa afinitasnya menjadi rendah. Harga Km enzim sangat bervariasi tergantung dari jenis substrat, keadaan lingkungan dan kekuatan ion. Pada percobaan kali ini didapat Vm negatif artinya reaksi berjalan sangat lamabat atau mungkin tidak berjalan sama sekali. Hal ini karena kurva yang dihasilkan tidak hiperbolik yang disebabkan saat penambahan enzim ke tabung kurang tepat dengan interval waktunya.

seperti disajikan pada Gambar 4. Selanjutnya


Tabel 3 Data kecepatan da konsentrasi substrat sukrosa Tabun g 1 2 A 0 0,046 [sukrosa] mol 0 0,082 V 0 0,0082 1/V 0 121,95 [S] 0 0,0143 1/[S] 0 69,93

3 4 5 6 7 8

0,107 0,111 0,191 0,241 0,501 0,826

0,201 0,208 0,364 0,461 0,996 1,596

0,0201 0,0208 0,0364 0,0461 0,0996 0,1596

49,75 48,08 27,47 21,69 10,35 6,27

0,0386 0,0429 0,0571 0,0714 0,1429 0,2857

34,97 23,31 17,51 14,01 6,99 3,50

Prediksi bobot molekul enzim invertase Prinsip dasar SDS-PAGE adalah makromolekul bermuatan akan bermigrasi dalam medan listrik dengan laju yang ditentukan oleh ukuran dan muatannya. Sebelum protein dijalankan dalam medan listrik, protein terlebih dahulu akan didenaturasi dengan perubahan kondisi yang tajam misalnya panas, adanya agen pereduksi, penambahan deterjen dan lain-lain, kemudian akan dibungkus dengan deterjen anionik yaitu SDS. Muatan asli molekul protein akan ditimpa oleh molekul SDS yang bermuatan negatif. Adanya 2-merkaptoetanol dapat membantu denaturasi protein dengan cara mereduksi semua ikatan disulfide. SDS dilakukukan pada pH netral. Pada metode ini digunakan SDS dan -merkaptoetanol. SDS bersama -merkaptoetanol dan pemanasan menyebabkan rusaknya struktur tiga dimensi protein menjadi konfigurasi random coil. Hal ini disebabkan oleh pecahnya ikatan disulfida yang selanjutnya tereduksi menjadi gugus-gugus sulfhidril. Denaturasi protein adalah suatu keadaan dimana terjadi perubahan konformsi protein. Perubahan ini meliputi proses destruksi ikatan pada struktur sekunder sehingga konformasi protein asli berubah tetapi ikatan kovalen pada polipeptida tidak mengalami kerusakan. SDS merupakan deterjen anionik, memiliki gugus ion sulfat dan rantai alkil lipfoilik yang menyebabkan peptida dan protein tidak saling berikatan yang dinamakan denaturasi. SDS mengelilingi peptida atau protein sehingga bermuatan negatif, kemudain semua peptida dan protein dalam campuran akan bermigrasi menuju anoda yang pergerakannya tidak dipengaruhi oleh bentuk. Hal ini disebabkan karena adanya denaturasi yang mengakibatkan bentuk molekul seragam yaitu berbentuk rantai lurus yang kemudian diselimuti oleh SDS sehingga bermuatan negatif. Pergerakan protein merupakan fungsi dari berat molekulnya, dimana kompleks SDS-protein yang lebih besar mempunyai mobilitas yang lebih kecil dibandingkan dengan kompleks yang lebih kecil.

Stacking gel mempunyai fungsi untuk mengumpulkan sampel yang akan dipisahkan sehingga memungkinkan cuplikan untuk bergerak bersama-sama dan membentuk suatu pita cuplikan yang pekat. Resolving gel mempunyai fungsi untuk terjadinya pemisahan yang lebih baik sehingga memungkinkan terjadi perbedaan gerak yang jelas terlihat antara spesies dengan molekul besar dan spesies dengan molekul yang lebih kecil. Fungsi buffer elektroforesis untuk mempertahankan pH di dalam reservoir dan gel serta sebagai elektrolit pembawa aliran listrik. Oleh karena itu pemilihan buffer harus memenuhi kriteria antara lain: pemilihan buffer didasarkan pada tidak adanya interkasi yang terjadi antara buffer dengan makromolekul yang dipisahkan, pH yang digunakan tidak mengakibatkan denaturasi protein (kisaran yang digunakan untuk protein biasanya 4.5-9.0, kekuatan ionik dan konsentrasi buffer harus diperhitungkan dengan tepat (kekuatan ionik biasanya berkisar 0.05-0.15). Sistem buffer kontinyu adalah gel yang digunakan dalam satu slab terdiri dari dua gel yaitu stacking gel dan separating gel. Buffer dan konsentrasi akrilamid yang digunakan pada kedua gel tersebut berbeda. Pada stacking gel digunakan buffer dengan pH 6.8 dan konsentrasi akrilamid rendah. Sedangkan pada separating gel digunakan buffer dengan pH 8.8 dan konsentrasi akrilamid tinggi. Sehingga protein akan terkonsentrasi pada stacking gel dan akan mengalami resolusi yang tinggi pada separating gel. Hal ini menghasilkan pemisahan yang baik dan pita tajam. Pewarnaan berfungsi untuk memperjelas pita protein hasil pemisahan dengan elektroforesis. Pewarna yang digunakan harus dapat bereaksi dengan molekul sampel yang dipisahkan, tetapi tidak bereaksi dengan gel elektroforesis. Ikatan antara pewarna dan gel bukan ikatan kovalen sehingga mudah dilepaskan oleh pencucian yang intensif dan penyinaran.

Gambar 5 Hasil elektroforesis SDS PAGE Adapun pengamatan yang sudah diujikan, tampak jelas terlihat laju migrasi dan berbedaan gerak yang jelas terlihat antara spesies dengan molekul besar dan spesies dengan molekul yang lebih kecil, dan dengan menggunakan pewarnaan tampak terlihat jelas proses pemisahan pita protein hasil elektroforesis. Sampel yang dimasukan ke dalam sumur pada stacking gel akan terkonsentrasi atau tertumpuk dan tidak mengalami pemisahan meskipun dibawah pengaruh medan listrik, hal ini disebabkan karena pori gel berukuran besar (4% akrilamid). Mobilitas ion pada stacikng gel secara berurutan adalah ion klorida, protein kemudian ion glisin. Ketika pergerakan mencapai separating gel, konsentrasi glisin meningkat akibat peningkatan pH sehingga mobilitasnya menurun akibat adanya ukuran pori yang semakin kecil. Dengan demikian pergerakan ion pada separating gel secara berurutan adalah ion klorida, ion glisin, dan protein. Hasil running dari masing-masing sampelnya diekstrak dari sel-sel mikroorganisme. Dua macam konsentrasi ini dipilih untuk membedakan antara populasi mikroorganisme yang resisten dengan yang tidak resisten. Pola Pita protein hasil running dengan menggunakan gel polyakrilamid seperti terlihat pada Gambar 2. Protein marker digunakan untuk mengidentifikasi berat molekul dari campuran polypeptida (Hames & Rickwood 1990). Marker protein yang digunakan memiliki rentang berat molekul 212 kDa- 11,3 kDa. Dari hasil elektroforesis terdapat sejumlah pita protein yang memiliki ketebalan berbeda-beda. Protein yang memiliki ketebalan dan intensitas warna yang lebih besar dibandingkan protein lain dan selalu ada di setiap variaetas disebut protein mayor. Pada hasil elektroforesis di atas terdapat beberapa buah protein mayor pada. Berat molekul dari protein mayor ini berkisar 148,7 kDa, 121,6 kDa, dan 105 kDa. Alasan elektroforesis digunakan dalam penelitian ini karena memiliki peran sangat penting dalam proses pemisahan molekul-molekul biologi, khususnya protein. Karena disamping metode

tersebut tidak mempengaruhi struktur biopolimer, tetapi juga sangat sensitif terhadap perbedaan muatan dan berat molekul yang cukup kecil (Bachrudin, 1999). Protein yang dialirkan dalam medium yang menagndung medan listrik maka senyawa-senyawa yang bermuatan akan bergerak dalam larutan sebagai akibat dari sifat polaritas yang berlawanan, maka mobilitas suatu molekul meupakan fungsi dari bentuk, ukuran molekul, dan besar tipe muatan. Penggunaan SDS dan merkaptoetanol disertai dengan pemanasan akan memecah struktur tiga dimensi dari protein, terutama ikatan disulfida menjadi subunit-subunit polipeptida secara individual. SDS juga membungkus rantai protein yang tidak terikat dengan muatan negatif yang sama membentuk kompleks SDS-protein. Kompleks SDS protein mempunyai densitas muatan yang identik dan bergerak pada gel hanya berdasarkan ukuran protein. Jadi kompleks SDSprotein yang lebih besar mempunyai mobilitas yang lebih rendah dibandingkan dengan kompleks SDS-protein yang lebih kecil. SIMPULAN Berdasarkan hasil percobaan diperoleh kesimpulan bahwa aktivitas optimum invertase dalam mendegradasi sukrosa menjadi gula invert adalah pada kondisi pH 4,5. Berbagai pengujian seperti aktivitas, kadar, kinetika dan bobot molekulnya, dari aktivitasnya ternyata fraksi I memiliki konsentrasi dan aktivitasnya lebih besar dari yang lain (1.2256 unit/menit), hal ini disebabkan pada fraksi I masih fresh. Sedangkan pengamatan kadar protein memiliki konsentrasi larutan sampel yang dihitung dengan bantuan kurva standar yang tertinggi ialah dari fraksi II sebesar 0,0255 mg/mL. Dengan data mengenai aktvitas dan kadar pada fraksi II memperkuat literatur yang menyatakan bahwa konsentrasi enzim dapat mempengaruhi aktivitas enzim, ditandai dengan semakin banyaknya substrat yang berubah menjadi produk melalui proses enzimatis. Besarnya fold enzim dan yield enzim berturut-turut adalah 931,49% dan 90,14%, sedangkan Vmaks = -1,0940 mol/mL.menit dan Km = -1,8818 mM. Dan untuk mengetahui bobot molekulnya menggunakan elektroforesis dengan metode SDSPAGE dimana protein akan bermigrasi dengan dialiri arus listrik, dan yang memiliki molekul besar akan tetap diam. DAFTAR PUSTAKA Acosta N, Beldarrain A, Alonso Y. 2000. Characterization of recombinant invertase expressed in methylotropic yeasts Biotechnology and Applied Biochemistry 32: 179-187

10

Alexander RR, Griffiths JM. 1992. Basic Biochemical Methods. New York: WileyLiss. Awwalurrizki N, Putra SR. 2009. Hidrolisis Sukrosa dengan enzim invertase untuk produksi etanol menggunakan Zymomonas mobilis [skripsi]. Surabaya: Fakultas matematika dan Ilmu pengetahuan Alam, Institut Teknologi Sepuluh Nopember Bachrudin. Z. 1999. Petunjuk Laboratorium: Isolasi, Identifikasi, dan Pewarnaan Protein. PAU Bioteknologi: UGM Yogyakarta Bergamasco R., Bassetti FJ, Moraes FF, Zanin GM. 2000. Characterization of free and immobilized invertase regarding activity and energy of activation. Brazilian Journal of Chemical Engineering 17: 873-880 Bergamasco R, Akgol S, Bulut A, Denizli A, Yakub A.M. 2003. Covalent immobilization of inverase onto a reactive film composed of 2- hydroxyethyl methacrylate and glycidyl methacrylate. Biochemical Engineering Journal 14:117- 126 Bucke C. 1987. Cell immobilization in calcium Alginate. Methods in Enzymology 135: 175189 Cheng, WH, Im KH, Chourey PS. 1996. Sucrose phosphate synthase expression at the cell and tissue leve1 is coordinated with sucrose sinktosource transitions in maize leaf. Plant Physiol 111 : 1021-1029. Dinu D. 2001. Enzymatic hydrolysis of pectic acid and pectins by polygalacturonase from Aspergillus niger. Roum Biotechnol 6 (5) : 397-402. Fayyaz A, Asbi BA, Ghazali HM, Che-Man YB, Jinap S. 1995. Kinetics of papaya pectinesterase. Jurnal of Food Chemistry 53 : 129-135. Fung RW, Kamper GL, Gardner RC, MacRae E. 2003. Differential expression within an SPS gene family. Plant Sci 164:450-470 Grof CP, Huber JL, McNeil SD, Lunn LE, Campbell JA. 1998. A modified assay method show leaf sucrose phosphate synthase activity is correlated with leaf sucrose

content across a range of sugarcane varieties. Aust. J. PlantPhysiol 25 : 499-502. Hames, B.D & Rickwood.1990. A Practical Approach: Gel elektrophoresis protein. Huntington: Robert E Krieger Publishing Company Hasanah EN, Putra SR. 2009. Karakterisasi ekdtrak kasar enzim invertase yang dimobilisasi dengan Na-Alginat [skripsi]. Surabaya: Fakultas matematika dan Ilmu pengetahuan Alam, Institut Teknologi Sepuluh Nopember. Kim J.Y., Mahe A, Brangeon J, Prioul JL. 2000. Amaize vacuolar invertase , IVR2, is induced by water stress. Organ/tissue specificity and diurnal modulation of expression. Plant Physiol 124:71-84. Koch, K. E. (1996) Carbohydrate modulated gene expression in plants. Annu. Rev. Plant Physiol.Plant Mol. Bio. 47:509-540. Koolman J, Rohm KH. 1994. Atlas Berwarna Dan Teks Biokimia. Wanandi SI; penerjemah. Terjemahan dari: Color Atlas Of Biochemistry. Jakarta: Hipokrates. Lee WC, Huang CT. 2000. Modelling of mobilis ATTC 10988 grown on the media containing glucose and fructose. Biochemical Engineering Journal 4: 217-227 Lehninger AL. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jilid ke-1. Maggy Thenawidjaja; penerjemah. Terjemahan dari: Principles Of Biochemistry. Erlangga: Jakarta Lunn JE, Hatch MD. 1997. The role of sucrose phosphate synthase in the control photosynthate partitioning in Zea mays leaves. Aust. J. Plant Physiol 24 : 1-8. Narita V. 2005. Saccharomyces cerevisiae Superjamur yang Memiliki Sejarah Luar Biasa. Jakarta: Pustaka Utama. Ohto M, Onai K, Furkawa Y, Aoki E, Araki T, Nakamura A. 2001. Effect of sugar on vegetative development and floral transition in Arabidopsis Plant Physiol. 127 : 252-261. Wiseman A. 1989. Handbook of Enzyme Biotechnology. 2nd. Edition. New York: Ellis Howard.