Anda di halaman 1dari 11

Perbandingan penilaian sitotoksisitas dari enam tetes mata anti-inflamasi dalam empat kultur sel permukaan mata, sebagaimana

ditentukan oleh nilai viabilitas sel


Masahiko Ayaki Atsuo Iwasawa Yoshimi Niwano
1 2 3

Department of Ophthalmology, International University of Health and Welfare, Mita Hospital, Tokyo, 2Department of Bioengineering, Graduate School of Bioscience and Biotechnology, Tokyo Institute of Technology, Yokohama, 3Laboratory for Redox Regulation, Tohoku University Graduate School of Dentistry, Sendai, Japan
1

ABSTRAK
Tujuan: tetes mata anti-inflamasi sering digunakan dalam pengobatan gangguan korneal epitelial. Dalam penelitian ini, kami mengevaluasi toksisitas dari enam tetes mata anti-inflamasi dalam empat kultur sel permukaan mata. Metode: Toksisitas dari enam solusi optalmik anti-inflamasi yang tersedia secara komersial (diclofenac, bromfenac, pranoprofen, betametason dan fluoromethason) telah dilakukan penilaian pada tiga baris sel korneal dan sau baris sel konjungtival. Viabilitas sel ditentukan oleh 3 - (4,5dimetil-2 thiazoyl) -2,5-difenil-2H-tetrazolium bromide dan neutral red assays setelah mengekspos sel untuk 10, 30, dan 60 menit dari satu kali lipat, ganda, dan sepuluh kali lipat pengenceran obat. Sitotoksisitas dibandingkan dengan menggunakan cell viability score (CVS), parameter sitotoksik terpadu yang mengambil berbagai faktor, seperti pengenceran oleh cairan air mata atau konsentrasi dengan penguapan, waktu paparan obat, dan jenis permukaan sel mata. Hasil: Berdasarkan skor CVS, urutan anti-inflamasi tetes mata diuji dari rendah ke tinggi sitotoksik, dengan % bahan aktif CVS50, dan CVS40/80% untuk setiap solusi yang diberikan dalam kurung, adalah sebagai berikut: Rinderon (betametason, 100 %, 100%) >0.02% Flumethoron (fluoromethorone, 68%, 22%) = 0,1% Flumethoron (fluoromethorone, 76%, 22%) > Bronuck (0.1% bromfenac, 53%, -8%) = Diclod (0.1% diklofenak, 44%, -15%) = Niflan (pranoprofen, 50%, -19%). Rinderon memperlihatkan toksisitas paling rendah dari semua tetes mata antiinflamasi yang diuji. Obat tetes mata yang mengandung non-steroid anti-inflammatory memperlihatkan sitotoksisitas yang lebih besar dari pada yang mengandung steroid dengan benzalkonium pada konsentrasi sebanding. Konsentrasi adalah faktor paling signifikan yang mempengaruhi kelangsungan hidup sel. Kesimpulan: Sitotoksisitas tetes mata anti-inflamasi dievaluasi dalam penelitian ini tergantung pada kedua komponen farmasi dan bahan pengawet. CVS adalah indikator singkat dari sitotoksisitas obat.

Kata kunci: benzalkonium klorida, toksisitas, kornea, sel skor viabilitas, obat anti-inflamasi

PENDAHULUAN Tetes mata anti-inflamasi secara rutin digunakan pasca operasi, serta untuk mengobati penyakit peradangan pada mata. Sebuah studi sebelumnya memeriksa sitotoksisitas setelah 48 jam paparan dari jalur sel mata untuk tetes mata anti-inflamasi di hadapan media kultur menunjukkan bahwa obat tetes mata yang mengandung benzalkonium klorida (BAK) menunjukan cukup sitotoksisitas.1 Namun, paparan obat tetes mata periode 48-jam bukanlah refleksi akurat dari situasi aktual di mana obat tetes mata umumnya diterapkan beberapa kali sehari. Selain itu, permukaan sel-sel mata pasien bersentuhan langsung dengan formulasi tetes mata. Dengan demikian, untuk mencerminkan situasi yang sebenarnya, kami telah mencoba untuk meningkatkan tes sitotoksisitas untuk sel-sel mata.2-6 Dalam studi ini, sel-sel permukaan mata mengalami kontak langsung dengan formulasi obat tanpa adanya media kultur. Berdasarkan penelitian kami, kami mengusulkan penggunaan cell viability score(CVS) sebagai parameter sederhana untuk mengekspresikan potensi sitotoksik obat tetes mata. Awalnya, kita mendefinisikan CVS50 sebagai jumlah baris sel dengan viabilitas% 50 di hadapan sepuluh kali lipat pengenceran obat (misalnya, ketika empat baris sel yang digunakan, nilai harus 0, 1, 2, 3, atau 4 ) .1 Namun, dalam studi terbaru kami telah meningkatkan CVS sehingga CVS50 kini didefinisikan sebagai jumlah pengukuran menunjukkan viabilitas sel% 50 dan dinyatakan sebagai persentase atas kisaran 0% 100% .2,3 Menggunakan metode yang ditingkatkan tersebut, jumlah pengukuran adalah 72 (tiga konsentrasi, tiga kali paparan, empat baris sel, dan dua tes) .2,3 Karena obat tetes mata dapat dipengaruhi oleh berbagai faktor, seperti pengenceran oleh cairan lakrimal atau konsentrasi oleh hilangnya kelembaban, dan karena dapat bersentuhan dengan jenis sel yang berbeda (misalnya, sel-sel epitel kornea dan konjungtiva) pada permukaan kornea untuk jumlah dan waktu yang bervariasi, sitotoksisitas obat tetes mata perlu dievaluasi secara komprehensif. Dengan demikian, CVS telah dimodifikasi berdasarkan jumlah pengukuran sitotoksisitas dalam segala situasi, dengan perhitungan konsentrasi, waktu pemaparan, dan jenis sel.
2

Sitotoksisitas tetes mata merupakan isu kontroversial karena sekali tetes mata yang diterapkan pada permukaan mata, konsentrasi dan penetrasi obat dapat berubah sangat cepat. Oleh karena itu, dalam penelitian ini kami mengevaluasi ulang sitotoksisitas tetes mata anti-inflamasi dengan melakukan penyelidikan komprehensif yang mencakup berbagai konsentrasi dan waktu pengobatan berdasarkan sistem CVS yang dimodifikasi. METODE DAN MATERI Enam tetes mata anti-inflamasi tersedia secara komersial yang diuji dalam penelitian ini. Nama dagang, komponen aktif, komponen inaktif (pengawet), dan produsen tercantum dalam Tabel 1. Struktur kimia dari komponen aktif telah diterbitkan di mana pun.4 Metode untuk kultur sel, alat tes sitotoksisitas, dan evaluasi data yang telah dijelaskan secara rinci .2 Singkatnya, digunakan baris sel berikut yang tersedia secara komersial: SIRC (epitel kornea kelinci, ATCC CCL-60, Koleksi Tipe Kultur Amerika [ATCC] , Manassas, VA), BCE C/D-1b (sel epitel kornea bovine, JCRB-9129, Bank Penelitian Ilmu Kesehatan dan Sumber Daya, Osaka, Jepang), RC-1 (epitel kornea kelinci, JCRB-0246, Penelitian Ilmu Kesehatan dan Sumber Daya), dan Chang konjungtiva (sel konjungtiva manusia, ATCC CCL-20.2, ATCC). Setelah sel telah mencapai titik temu, media kultur diganti dengan larutan murni atau dua kali lipat dan sepuluh kali lipat pengenceran larutan uji yang berbeda, dan sel monolayers diinkubasi dengan adanya solusi ini untuk 10, 30 atau 60 menit. Garam fisiologis steril digunakan sebagai pengencer untuk setiap tetes mata, dan itu menegaskan bahwa paparan dari setiap baris sel untuk garam selama 60 menit tidak berpengaruh signifikan terhadap kelangsungan hidup sel dibandingkan dengan kontrol yang sesuai. Setelah 10, 30, atau 60 menit inkubasi, solusi oftalmik diganti dengan medium kultur segar dan sel-sel diinkubasi selama 48 jam lebih. Viabilitas sel diukur dengan menggunakan 3 - (4,5-Dimethylthiazol-2-il) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, Sigma-Aldrich Co, St Louis, MO) dan neutral red assay(NR, Wako Pure Chemical Industries , Osaka, Jepang). Viabilitas sel dalam larutan uji dihitung sebagai persentase viabilitas kontrol sel dalam medium saja. Percobaan diulang delapan kali, dan hasilnya disajikan sebagai mean SD.

Untuk mengevaluasi sitotoksisitas obat tetes mata anti-inflamasi, nilai mean untuk 1/2 konsentrasi dibandingkan dengan yang lain untuk Rinderon (Shionogi dan Co, Ltd, Osaka, Jepang), obat tetes mata yang mengandung betametason, dengan menggunakan uji perbandingan ganda Dunnett, dengan P<0,05 ditetapkan sebagai tingkat signifikansi. Selain itu, efek dari jenis tetes mata, garis sel, waktu pemaparan, konsentrasi, dan metode uji pada viabilitas sel dievaluasi menggunakan analisis varians untuk parameter bivalen, dengan P<0,05 diambil untuk menunjukkan signifikansi statistik. CVS digunakan untuk membandingkan toksisitas larutan uji. CVS50 tersebut dihitung sebagai jumlah pengukuran menunjukkan viabilitas 50% dibandingkan dengan kontrol. CVS40/80 tersebut dihitung sebagai: (jumlah pengukuran menunjukkan viabilitas >80%) - (jumlah pengukuran menunjukkan <40% viabilitas). Jumlah pengukuran adalah 72 (tiga konsentrasi, tiga kali paparan, empat baris sel, dan dua tes). Hasil dinyatakan sebagai persentase dari semua pengukuran (%CVS). HASIL Untuk semua baris sel yang telah diuji, viabilitas sel setelah terpapar Rinderon adalah 80% (Gambar 1-4). Kelangsungan hidup sel setelah paparan dari sel ke tetes mata lain yang telah diuji adalah tergantung konsentrasi. CVS untuk tetes mata anti-inflamasi yang diuji dalam penelitian ini dirangkum dalam Tabel 2. Berdasarkan CVS, urutan tetes mata anti-inflamasi diuji dari sitotoksik rendah ke toksisitas tinggi, dengan bahan aktif, CVS50%, dan CVS40/80% untuk setiap solusi yang diberikan dalam kurung, adalah sebagai berikut: Rinderon (betametason, 100 %,
4

100%) >0.02% Flumethoron (Santen Pharmaceutical Co, Ltd, Osaka, Jepang, fluoromethorone, 68%, 22%) = 0,1% Flumethoron (Santen Pharmaceutical Co, Ltd, fluoromethorone, 76%, 22%) >Bronuck (Senju Pharmaceutical Co Ltd, Osaka, Jepang, 0,1% bromfenac, 53%, -8%) = Diclod (Wakamoto Co, Ltd, Tokyo, Jepang, 0,1% diklofenak, 44%, -15%) = Niflan (Senju Pharmaceutical Co, Ltd, pranoprofen, 50%, 19%). Rinderon menunjukan toksisitas paling dari semua tetes mata anti-inflamasi yang diuji. Secara mikroskopis mengungkapkan bahwa morfologi dari semua baris sel yang diobati Rinderon adalah mirip dengan sel kontrol (data tidak ditampilkan). Secara keseluruhan, obat tetes mata yang mengandung non-steroid anti-inflammatory drugs menunjukan toksisitas yang lebih besar daripada yang mengandung steroid. Gambar 5 menunjukkan viabilitas sel sesuai dengan obat, metode baris sel, waktu pemaparan, konsentrasi obat, dan uji. Semua faktor ini memiliki pengaruh yang signifikan terhadap kelangsungan hidup sel, sebagaimana ditentukan oleh analisis varians untuk parameter bivalen. Konsentrasi obat, diikuti dengan waktu paparan, memiliki efek paling signifikan pada viabilitas sel. Dari baris sel diuji, Chang konjungtiva dan RC-1 sel tampaknya menjadi sedikit lebih sensitif terhadap paparan obat bila dibandingkan dengan dua baris sel lainnya, dengan tes MTT muncul untuk menjadi sedikit lebih sensitif dibandingkan dengan uji NR untuk mengevaluasi viabilitas sel. Jenis obat merupakan faktor penting yang mempengaruhi kelangsungan hidup sel dan, dari solusi oftalmik berbeda yang diuji, Rinderon (yang berisi betametason steroid sintetis sebagai bahan aktif) adalah yang paling randah sitotoksiknya, diikuti oleh Flumethoron 0,02% dan 0,1% Flumethoron , baik yang mengandung steroid fluoromethorone sintetis sebagai bahan aktif.

Viabilitas sel yang terekspos

obat tetes mata lainnya, yang diklasifikasikan

sebagai non-steroid anti-inflammatory drugs, rendah. Observasi ini sesuai dengan temuan% CVS yang dijelaskan di atas.

Karena viabilitas

sel tampaknya menurun dengan waktu paparan meningkat

untuk semua obat tetes mata selain Rinderon , viabilitas sel dalam solusi oftalmik diencerkan dua kali lipat dibandingkan dengan paparan berikut untuk Rinderon menggunakan Dunnetts multiple comparison test, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1-4. DISKUSI Tetes mata anti-inflamasi dianggap sebagai faktor penyebab utama gangguan permukaan mata selama pengobatan radang mata, seperti pasca operasi atau untuk penyakit mata inflamasi. Berdasarkan nilai-nilai CVS yang diperoleh dalam penelitian ini, potensi sitotoksik tetes mata anti-inflamasi yang diuji adalah, Niflan = Diclod = Bronuck > 0,02% Flumethoron = 0,1% Flumethoron > Rinderon . Dalam hal bahan aktif dalam setiap tetes mata, hasil dari penelitian ini mengkonfirmasi temuan sebelumnya, yaitu bahwa steroid kurang sitotoksik dibandingkan, non-steroids.1 4 Karena beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa deksametason, suatu steroid sintetik, adalah sitoprotektif,5-7 betametason mungkin telah diberikan efek sitoprotektif dalam penelitian ini, menjelaskan mengapa Rinderon menunjukan sitotoksisitas terendah dari semua solusi yang diuji. Alasan lain mengapa obat tetes mata yang mengandung nonsteroidal anti-inflammatory drugs menunjukkan sitotoksisitas yang lebih besar mungkin karena penggunaan BAK sebagai pengawet. Studi sebelumnya telah melaporkan hubungan terbalik antara CVS berbagai obat tetes mata dan konsentrasi BAK yang mengandung therein.1,2,8-10 Dalam penelitian kami terbaru di mana sitotoksisitas in vitro BAK-obat tetes mata yang mengandung antiglaucoma dievaluasi, sitotoksisitas yang obat tetes mata diuji adalah tergantung pada konsentrasi BAK.3 Dalam kasus Diclod , yang tidak mengandung BAK, bahan aktif diklofenak telah digunakan untuk kontrol peradangan pasca operasi dan nyeri tetapi menberi efek samping termasuk kerusakan kornea yang parah,11-14 yang menunjukkan sitotoksisitas okular permukaan. Dari bahan-bahan aktif lainnya, polisorbat adalah racun bagi mata,15 dan beberapa peringatan telah direkomendasikan ketika mempertimbangkan suntikan intraokular obat yang mengandung asam borat polysorbate.15 Boric acid, metil paraoxybenzoate, dan chlorobutanol telah dilaporkan menunjukkan toksisitas rendah hanya pada konsenrasi yang dianjurkan atau yg paling umum digunakan.
16-18

Dalam penelitian ini, kami mengevaluasi efek dari berbagai konsentrasi obat dan waktu paparan dalam empat baris sel yang tersedia secara komersial karena, dalam situasi klinis, mata terekspos berbagai perawatan obat. Misalnya, obat mungkin terkonsentrasi pada mata karena penguapan atau drainase menurun, obat dapat teradsorpsi pada mata untuk jangka waktu lama, atau kerentanan terhadap obat tertentu mungkin berbeda antara jenis sel (misalnya, konjungtiva dibandingkan kornea epitel sel). Memang, diagram pencar yang ditampilkan pada Gambar 5 menunjukkan bahwa konsentrasi obat dan waktu paparan secara signifikan mempengaruhi viabilitas sel. Salah satu keterbatasan dari studi ini adalah bahwa kita hanya menggunakan bioassay untuk mengevaluasi sitotoksisitas. Selain sistem kultur sel monolayer konvensional, seperti yang digunakan dalam penelitian ini, mengevaluasi sitotoksisitas menggunakan model okular yang sudah dibuktikan, seperti model tiga-dimensi (3D), akan memberikan informasi yang berguna. Sebagai contoh, penelitian sebelumnya telah menggunakan epitel model 3D yang dibudidayakan dari sel kornea manusia sebagai alternatif tes mata Draize untuk menilai potensi bahan kimia yang menyebabkan irritasi mata.19, 20 Dalam studi lain, respons dose-dependent BAK terungkap , dengan efek toksik yang signifikan dicatat antara konsentrasi rendah 0,005% dalam model epitel kornea 3D.21 Dengan demikian, penelitian masa depan harus menggunakan salah satu dari model-model
9

baru, seperti model epitel kornea 3D, untuk mengkonfirmasi apakah korelasi signifikan yang diperoleh dengan sistem CVS disajikan di sini dapat direplikasi dalam model lainnya. Selain itu, studi masa depan perlu memeriksa korelasi antara sitotoksisitas in vitro dan in vivo. PENYINGKAPAN Para penulis melaporkan tidak ada konflik kepentingan dalam pekerjaan ini.

10

JURNAL PERBANDINGAN PENILAIAN SITOTOKSISITAS DARI ENAM TETES MATA ANTI-INFLAMASI DALAM EMPAT KULTUR SEL PERMUKAAN MATA, SEBAGAIMANA DITENTUKAN OLEH NILAI VIABILITAS SEL

PEMBIMBING:
Dr. HELMI Sp.M

DISUSUN OLEH: Eugenius (030.04.071)

KEPANITERAAN KLINIK ILMU KESEHATAN MATA RSUD CILEGON PERIODE 18 DESEMBER 2012 - 19 JANUARI 2013 FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS TRISAKTI

11