Anda di halaman 1dari 37

LAPORAN RESMI PRAKTIKUM IMUNOLOGI PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK DAUN NANGKA TERHADAP TITER ANTIBODI PADA MENCIT YANG

DIVAKSINASI HEPATITIS B

DI SUSUN OLEH : GOLONGAN IV FBA 05

LABORATORIUM FARMAKOLOGI DAN TOKSIKOLOGI BAGIAN KIMIA FARMASI FAKULTAS FARMASI UGM YOGYAKARTA 2007

PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK DAUN NANGKA TERHADAP TITER ANTIBODI PADA MENCIT YANG DIVAKSINASI HEPATITIS B

4.

TUJUAN 1. Mahasiswa mengetahui pengaruh pemberian ekstrak daun nangka dengan

variasi kadar terhadap respon imun tubuh mencit yang di vaksin dengan virus hepatitis B 2. Mahasiswa memahami preparasi pengambilan serum dari darah hewan uji (mencit) yang telah diberi immunostimulator dan immunisasi 3. Mahasiswa memahami prosedur isolasi makrofag dan isolasi limfosit 4. Mahasiswa memahami prosedur pengukuran titer antibody menggunakan metode ELISA

DASAR TEORI Imunologi merupakan studi mekanisme yang melindungi individu dari injuri. Injuri atau tantangan dapat berasal dari mikroorganisme eksogenus, zat-zat kimiawi eksogenus atau sel-sel eksogenus. Sistem imun menjalankan tiga fungsi, yaitu pertahanan, homeostatis dan pengawasan. Fungsi pertahanan yang dimaksud adalah pertahanan melawan invasi mikroorganisme. Jika elemen pertahanan seluler berhasil menyebar maka hospes akan muncul sebagai pemenang. Tetapi bila elemen-elemen tersebut hiperaktif maka tandatanda tertentu yang tidak diinginkan seperti alergi atau hipersensitivitas timbul. Sebaliknya, jika elemen-elemennya hipoaktif maka kerentanan terhadap infeksi ulang akan bertambah seperti terlihat pada penyakit defisiensi imun. Homeostatis berfungsi untuk memenuhi kebutuhan umum dari organisme multiseluler untuk mempertahankan keseragaman dari jenis sel tertentu. Homeostatis tersebut memperhatikan fungsi degenerasi dan katabolit normal dari isi tubuh dengan 2

pembersihan elemen-elemen yang rusak, seperti eritrosit dan leukosit dalam sirkulasi. Elemen-elemen sel ini mungkin rusak selama perjalanan jika hidup normal atau sebagai akibat yang merugikan. Pengawasan dini berfungsi untuk memonitor pengenalan jenis-jenis sel yang secara tetap selalu timbul dalam tubuh. Sel-sel mutan tersebut dapat terjadi secara spontan atau disebabkan oleh pengeruh virus tertentu. System imun diberi tugas pengenalan atau pembuangan badan-badan baru yang di dapat, sebagian besar tugas ini terjadi di permukaan sel. Imunomodulasi merupakan cara untuk mengembalikan dan memperbaiki sistem imun yang fungsinya terganggu atau untuk menekan yang fungsinya berlebihan. Obat-obatan yang dapat mengembalikan ketidakseimbangan sistem imun disebut imunomodulator. (Barathawidjaja, 2000) Obat-obat golongan imunomodulator bekerja menurut tiga cara, yakni : 1) Imunorestorasi Suatu cara untuk mengembalikan fungsi sistem imun yang terganggu dengan memberikan berbagai komponen sistem imun, seperti immunoglobulin. 2) Imunostimulasi Merupakan cara memperbaiki fungsi sistem imun dengan menggunakan bahan yang merangsang sistem tersebut. Bahan-bahan yang dapat meningkatkan respon imun disebut imunomodulator, misalnya levamisol. (Barathawidjaja, 2000) 3) Imunosupresi Merupakan suatu tindakan untuk menekan respon imun. Kegunaannya di klinik terutama pada transplatasi alat tubuh dalam usaha mencegah reaksi penolakan dan pada penyakit autoimun untuk menghambat pembentukan antibodi. Contohnya steroid. Sedangkan cara untuk memasukkan bahan-bahan imunomodulator tersebut adalah melalui imunisasi atau vaksinasi, yaitu suatu prosedur untuk meningkatkan derajat imunitas seseorang terhadap patogen tertentu atau toksin. Idealnya adalah yang dapat mengaktifkan sistem pengenalan imun dan sistem imun yang diperlukan. Menurut Kato, vaksinasi adalah suatu cara memproduksi imunitas dengan memperkenalkan

antigen tidak toksik atau virus yang dilemahkan dalam wujud suatu vaksin. Sedangkan imunisasi adalah suatu tindakan terhadap tubuh agar tubuh mempunyai imunitas terhadap penyakit tertentu. Definisi imunitas mencakup semua mekanisme fisiologi yang membantu tubuh untuk mengenal pada dirinya, untuk menetralkan, menyisihkan atau memetabolisme benda asing tersebut dengan atau tanpa kerusakan pada jaringannya. Imunisasi sendiri dapat terjadi secara alamiah ataupun buatan, masing-masing dibedakan menjadi imunisasi aktif dan pasif. Respon imun nonspesifik dapat terjadi melalui mekanisme seluler dan humoral. Sedangkan respon imun spesifik diklasifikasikan menjadi respon imun humoral serta respon yang diperantarai sel. Respon imun humoral meliputi produksi antibodi oleh limfosit B dengan atau tanpa bantuan limfosit T dan produk-produknya. Limfosit Limfosit diproduksi di sumsum tulang. Sekitar 20-30% leukosit darah perifer tersusun atas limfosit. Sel ini mempunyai masa hidup lama. Limfosit bisa diklasifikasikan menurut ukurannya, yaitu limfosit kecil (yang dibagi menjadi dua tipe berdasrkan fungsinya yaitu limfosit T dan limfosit B), serta limfosit granula besar (Large Granular Lymphocytes / LGL). Limfosit kecil berdiameter 8-10m, dengan perbandingan antara inti dan sitoplasma besar. Limfosit kecil ini tidak memiliki granula sitoplasmik, sedangkan limfosit LGL mempunyai diameter lebih dari 16m, dengan perbandingan antara inti dan sitoplasma lebih kecil daripada limfosit kecil. Sitoplasma ini bergranula. Limfosit B menyusun kira-kira 5-10% dari limfosit total dan mengekspresikan immunoglobulin permukaan. Immunoglobulin permukaan berfungsi sebagai reseptor untuk antigen spesifik. Sebagian besar immunoglobulin permukaan adalah IgM dan IgD. Beberapa sel B juga mengekspresikan IgA (Fike, 1997). Limfosit B berdiferensiasi di sumsum tulang (Bellanti, 1993). Setelah matang sel B pindah ke organ limfoid, seperti kelenjar getah bening ataupun limpa (Case dkk, 2001). Sel B yang teraktivasi menghasilkan antibodi. Proses pembentukan antibodi dimulai ketika sel B terpapar oleh antigen bebas atau ekstra seluler. Sel B menjadi teraktivasi, 4

membelah dan berdiferensiasi menjadi sebuah klon sel efektor yang disebut sel plasma. Makrofag Sifat dasar fungsi makrofag adalah kemampuan mengingesti dan melenyapkan bahan-bahan asing dan bahan yang mudah rusak. Proses endositik makrofag diduga dimulai dengan interaksi bahan asing dengan membrane sel. Fagositosis dapat dipermudah oleh adanya antigen yang diselimuti antibodi, ialah proses opsonisasi. Antibodi dari bermacam-macam spesifitas dapat dilekatkan pada permukaan makrofag melalui reseptor Fc-nya. Antibodi sitofilik ini memperlengkapi makrofag dengan peningkatan kemampuan untuk mengenal, mengingesti, dan menghancurkan substansi antigenic. Reseptor-reseptor untuk komponen-komponen yang tidak tergantung pada reseptor-reseptor Fc juga membantu makrofag dalam melenyapkan antigen-antigan dari lingkungannya. Adjuvan adalah substansi-substansi yang dapat meningkatkan secara non spesifik efektifitas imunologin pengimunisasi. Perannya yakni menambah area permukaan antigen, memperlama penyimpanan antigen dlam tubuh, memberi kesempatan pada sistem limfoid untuk menuju ke antigen. Pemilihan adjuvan sangat mempengaruhi rute injeksi. Imunogen yang terlarut dapat diberikan dengan cara intra dermal, intra peritoneal, sub cutan, intra muscular, dan intra vena. Sebagai alasan perbedaan ini adalah bagaimana cepatnya imunogen dibersihkan dari tempat injeksi dan kecenderungannya mencapai pusat limfoid yang sangat penting. Nangka Nangka adalah nama sejenis pohon, sekaligus buahnya. Pohon nangka termasuk ke dalam suku Moraceae; nama ilmiahnya adalah Artocarpus heterophyllus. Dalam bahasa Inggris, nangka dikenal sebagai jackfruit. Kerajaan : Plantae Divisio Kelas : Magnoliophyta : Magnoliopsida

Ordo Famili Genus Species Pemerian

: Rosales : Moraceae : Artocarpus : Artocarpus Heterophyllus

Pohon nangka umumnya berukuran sedang, sampai sekitar 20 m tingginya, walaupun ada yang mencapai 30 m. Batang bulat silindris, sampai sekitar 1 m garis tengahnya. Tajuknya padat dan lebat, melebar dan membulat apabila di tempat terbuka. Seluruh bagian tumbuhan mengeluarkan getah putih pekat apabila dilukai. Daun tunggal, tersebar, bertangkai 1-4 cm, helai daun agak tebal seperti kulit, kaku, bertepi rata, bulat telur terbalik sampai jorong (memanjang), 3,5-12 5-25 cm, dengan pangkal menyempit sedikit demi sedikit, dan ujung pendek runcing atau agak runcing. Daun penumpu bulat telur lancip, panjang sampai 8 cm, mudah rontok dan meninggalkan bekas serupa cincin. Tumbuhan nangka berumah satu (monoecious), perbungaan muncul pada ketiak daun pada pucuk yang pendek dan khusus, yang tumbuh pada sisi batang atau cabang tua. Bunga jantan dalam bongkol berbentuk gada atau gelendong, 1-3 3-8 cm, dengan cincin berdaging yang jelas di pangkal bongkol, hijau tua, dengan serbuk sari kekuningan dan berbau harum samar apabila masak. Setelah melewati umur masaknya, babal akan membusuk (ditumbuhi kapang) dan menghitam semasa masih di pohon, sebelum akhirnya terjatuh. Bunga betina dalam bongkol tunggal atau berpasangan, silindris atau lonjong, hijau tua. Buah majemuk (syncarp) berbentuk gelendong memanjang, seringkali tidak merata, panjangnya hingga 100 cm, pada sisi luar membentuk duri pendek lunak. 'Daging buah', yang sesungguhnya adalah perkembangan dari tenda bunga, berwarna kuning keemasan apabila masak, berbau harum-manis yang keras, berdaging, terkadang berisi cairan (nektar) yang manis. Biji berbentuk bulat lonjong sampai jorong agak gepeng, panjang 2-4 cm, berturut-turut tertutup oleh kulit biji yang tipis coklat seperti kulit, endokarp yang liat keras keputihan, dan eksokarp yang lunak. Keping bijinya tidak setangkup.

Ekologi dan Ragam jenis Nangka tumbuh dengan baik di iklim tropis sampai dengan lintang 25 utara maupun selatan, walaupun diketahui pula masih dapat berbuah hingga lintang 30. Tanaman ini menyukai wilayah dengan curah hujan lebih dari 1500 mm pertahun di mana musim keringnya tidak terlalu keras. Nangka kurang toleran terhadap udara dingin, kekeringan dan penggenangan.

Irisan buah nangka Pohon nangka yang berasal dari biji, mulai berbunga pada umur 2-8 tahun. Sedangkan yang berasal dari klon mulai berbunga di umur 2-4 tahun. Di tempat yang cocok, nangka dapat berbuah sepanjang tahun. Akan tetapi di Thailand dan India panen raya terjadi antara Januari Agustus, sementara di Malaysia antara April Agustus atau September Desember. Varian nangka amat banyak jenisnya, baik dengan melihat perawakan pohon dan bagian-bagian tanamannya, rasa dan sifat-sifat buahnya, maupun sifat-sifat yang tak mudah dilihat seperti kemampuan tumbuhnya terhadap variasi-variasi lingkungan. Dari segi sifat-sifat buahnya, umum mengenal dua kelompok besar yakni:

nangka bubur (Indonesia dan Malaysia), yang disebut pula sebagai khanun

lamoud (Thailand), vela (Srilangka) atau koozha chakka (India selatan); dengan daging buah tipis, berserat, lunak dan membubur, rasanya asam manis, dan berbau harum tajam.

nangka salak (Ind.), nangka belulang (Mal.), khanun nang (Thai), varaka

(Srilangka), atau koozha pusham (India selatan); dengan daging buah tebal, keras, mengeripik, rasa manis agak pahit, dan tak begitu harum. Nangka dapat berkawin silang dengan cempedak secara alami. Hasil silangannya dinamai nangka cempedak.

Kandungan kimia Kayu Kulit kayu Getah Daging buah : : morin, sianomaklurin ( zat samak ), flavon, tannin : tanin : asam serotat

Mineral ( kalsium, besi, magnesium, phosphor, potassium, sodium, seng, tembaga mangaan, selenium ), Vitamin (vit. A, B-6, B-12, C, E, thiamin, riboflavin, niacin, folate ) Lemak ( asam lemak jenuh, saturated; asam lemak tak jenuh, monounsaturated; asam lemak tak jenuh, polyunsaturated ) Karbohidrat Albunimoid

Manfaat Nangka terutama dipanen buahnya. "Daging buah" yang matang seringkali dimakan dalam keadaan segar, dicampur dalam es, dihaluskan menjadi minuman (jus), atau diolah menjadi aneka jenis makanan daerah: dodol nangka, kolak nangka, selai nangka, nangka-goreng-tepung, keripik nangka, dan lain-lain. Nangka juga digunakan sebagai pengharum es krim dan minumnan, dijadikan madu-nangka, konsentrat atau tepung. Biji nangka, dikenal sebagai "beton", dapat direbus dan dimakan sebagai sumber karbohidrat tambahan.

Babal alias tongtolang nangka Buah nangka muda sangat digemari sebagai bahan sayuran. Di Sumatra, terutama di Minangkabau, dikenal masakan gulai nangka. Di Jawa Barat buah nangka muda antara lain dimasak sebagai salah satu bahan sayur asam. Di Jawa Tengah dikenal 8

berbagai macam masakan dengan bahan dasar buah nangka muda (disebut gori), seperti sayur lodeh, sayur megana, oseng-oseng gori, dan jangan gori (sayur nangka muda). Di Jogyakarta nangka muda terutama dimasak sebagai gudeg. Sementara di seputaran Jakarta dan Jawa Barat, bongkol bunga jantan (disebut babal atau tongtolang) kerap dijadikan bahan rujak. Daun-daun nangka merupakan pakan ternak yang disukai kambing, domba maupun sapi. Kulit batangnya yang berserat, dapat digunakan sebagai bahan tali dan pada masa lalu juga dijadikan bahan pakaian. Getahnya digunakan dalam campuran untuk memerangkap burung, untuk memakal (menambal) perahu dan lain-lain. Kayunya berwarna kuning di bagian teras, berkualitas baik dan mudah dikerjakan. Kayu ini cukup kuat, awet dan tahan terhadap serangan rayap atau jamur, serta memiliki pola yang menarik, gampang mengkilap apabila diserut halus dan digosok dengan minyak. Karena itu kayu nangka kerap dijadikan perkakas rumah tangga, mebel, konstruksi bangunan, konstruksi kapal sampai ke alat musik. Dari kayunya juga dihasilkan bahan pewarna kuning untuk mewarnai jubah para pendeta Buddha.

Levamisol Levamisol merupakan derivate tertramizol yang sebelumnya digunakan untuk mengeliminasi parasit intestine. Levamisol merupakan imunomodulator yang memperbaiki fungsi system imun yang menurun. Levamisol dapat menstimulasi pembentukan antibody yang bermacam-macam, mempertinggi respon sel T melalui aktivasi dan proliferilasi sel T, fungsi makrofag dan monosit potensial yang meliputi fagositosis, kemotaksis, peningkatan pergerakan dan perlekatan. Levamisol dapat menstimulasi system imun normal dan menurun dan sering diklasifikasikan keduanya dalam imunoregulator dan imunostimulan. Levamisol mempengaruhi imunitas humoral dan imunitas yang ditengahi oleh sel dan telah menunjukkan perbaikan pergerakan netrofil pada pasien yang terinfeksi virus herpes simpleks. Levamisol mempengaruhi sel T pada tingkat yang lebih besar daripada sel B, menimbulkan reaktivitas kutaneus pada hipersensitif tipe diperlambat dan peningkatan fungsi sel T helper, supresor, dan sitotoksik (Anonim, 2003)

Menurut Barathawidjaja (2000), levamisol merupakan obat cacing yang dapat meningkatkan proliferasi dan sitotoksisitas sel T serta mengembalikan energi (tidak adanya daya untuk bereaksi) pada penderita kanker (imunostimulasi nonspesifik). Levamisol juga dapat meningkatkan efek berbagai bahan seperti antigen, mitoxin, dan factor kemotaktik. Untuk merangsang limfosit, granulosit dan makrofag levamisol telah pula digunakan dalam penanggulangn arthritis rheumatoid, penyakit virus dan lupus eritematosus sistemik. Dosis yang diberikan 2,5 mg/kg BB secara oral untuk dua minggu berturut-turut setiap hari dan sesudah itu, kalau masih perlu dapat diberikan beberapa hari dalam seminggu. Efek sampingnya adalah mual, muntah, urtikaria, dan agranulositosis (Barathawidjaja, 2000). Levamisol ini mempunyai nama dagang Askamex (Konimex) tablet 25 mg dan Ascaridil (Johnson and Johnson Indonesia) tablet 25 mg, 50 mg (Anonim, 2002) Prednison

17-hydroxy-17-(2-hydroxyacetyl)-10,13-dimethyl- 7,8,9,10,12,13,14,15,16,17decahydro- 6H-cyclopenta[a]phenanthreen-3,11-dione Prednisone merupakan senyawa sintetik kortikosteroid biasanya diberikan secara per oral atau dapat pula diberikan secara injeksi intramuskuler. Senyawa ini memliki glukokortickoid effect. Prednisone merupakan suatu prodrug yang dalam hati dimetabolisme menjadi prednisolosn, yang merupakan obat yang aktif dan beresifat steroid. Dosis : 20-80mg per hari, 1 mg/kg untuk anak-anak yang beratnya lebih dari 50mg. Efek samping dari obat ini sam denga obat glukokortikoid, yaitu mengakibatkan kadar gula darah yang tinggi, apalagi padsa pasien penderita diabetes melitus. Efek 10

samping yang imsomnia, euphoria, pada pemejanan yang lama dapat mengakibatakan Cushing's syndrome, kegemukan, osteoporosis, glaukoma, DM tipe II, serta depresi.

Hepatitis B Istilah hepatitis dipakai untuk semua jenis peradangan hati (liver). Penyebabnya dapat berbagai macam, mulai dari virus sampai obat-obatan, termasuk obat tradisional. Virus hepatitis ada beberapa jenis, yakni hepatitis A, B, C, D,E, F, dan G. manifestasi penyakit hepatitis akibat virus bisa akut (Hepatitis A) dapat pula hepatitis kronik (hepatitis B,C) dan ada pula yang kemudian menjadi kanker hati (hepatitis B,C) (Anonim, 2003). Enzime Linked Immunosorbent Assay (ELISA ) ELISA merupakan immunoassay heterogen paling popular yang mempunyai label enzim dan menggunakan fase padat dalam teknik pemisahan (Sheehan, 1997). Ciri utama teknik ini adalah dipakai indicator enzim untuk reaksi imunologi (Burgess, 1995). ELISA digunakan untuk menemukan antibodi. Dalam hal ini antigen mula-mula diikat benda padat kemudian ditambah antibodi yang akan dicari. Setelah itu ditambah lagi antibodi yang bertanda enzim, seperti periksodasefosfatase. Akhirnya ditambahkan substrat kromogenik yang bila bereaksi dengan enzim dapat menimbulkan perubahan warna. Perubahan warna yang terjadi sesuai dengan jumlah enzim yang diikat dan sesuai pula dengan kadr antibodi yang dicari (Barathawidjaja, 2000). Menurut Burgess (1995), ELISA dapat dikelompokkan ke dalam lima konfigurasi, yaitu : I. ELISA langsung Merupakan konfigurasi ELISA paling sederhana. Antigen secara langsung diabsorpsikan ke substrat padat permukaan substrat di cuci dan antibodi yang ditempeli enzim digunakan untuk menunjukkan adanya antigen. Hasilnya kan terlihat bila ditambah substrat. Konfigurasi ini memerlukan antiserum spesifik

11

untuk antigen yang dimaksud. Antiserum ini harus dikonjugasikan pada enzim. Keterbatasan konfigurasi ini berkaitan dengan sifat pengikatan substrat padat dan kualitas antibodi indikator. Pembatas utama sistem ini adalah tidak adanya fleksibilitas. Keuntungan utama adalah kesederhanaan sistem. Konfigurasi ini biasanya digunakan dalam assay untuk mengenali antigen. II. ELISA tidak langsung Merupakan konfigurasi paling sederhana yang dapat digunakan untuk mengukur titer antibodi. Antigen terabsorpsi pada substrat padat. Antibodi primer tidak belabel dan dapat diperoleh dari serum atau cairan tubuh lain. Antibodi sekunder terikat pada enzim ayng sesuai. Antibodi ini biasanya disebut dengan konjugat. Hasil akan tampak jika ditambah substrat. Antigen dan antibodi sekunder biasanya dibuat konstan dan yang berubah adalah antibodi primer. Kerapatan optik berhubungan dengan konsentrasi antibodi primer. Kelemahan utama konfigurasi ini terletak pada tidak adanya spesifitas. Sebagai akibat bereaksi dengan antigen yang tidak murni. III. ELISA penangkap antigen atau ELISA sandwich Konfigurasi ini menggunakan antibodi yang terikat pada fase padat untuk menangkap antigen secara spesifik. Jika tingkat antibodi yang terdapat dalam tubuh harus diukur, konfigurasi sisanya serupa dengan ELISA tak langsung. Antibodi penangkap antigen dan sistem indikator dan yang akan berubah adalah titer antibodi primer untuk antigen spesifik. IV. ELISA penangkap antibodi Konfigurasi ini menggunakan antiglobulin yang terikat pada substrat padat. Antibodi sampel yang diuji ditangkap dan sistem indikator menempeli antigen berlabel. V. ELISA kompetitif atau ELISA pemblok

12

Teknik ini dapat digunakan dalam sejumlah konfigurasi dasar. Kompetisi dapat terhadap antigen atau antibodi. Assay kompetitif membutuhkan antigen untuk ditangkap antigen secara langsung maupun lewat antibodi spesifik ke substrat padat. Antibodi yang telah dikenal bersaing dan antibodi yang tidak dikenal akan mendapatkan tempat penempelan pada antigen. Antibodi yang telah diketahui dapat dilabel atau dideteksi menggunakan antibodi anti spesiesnya. Cara ini dapat membedakan respon imun terhadap organisme yang dekat hubungannya. Kelebihan ELISA adalah cukup sensitif, reagen mempunyai self life cukup panjang, dapat menggunakan spektrofotometer biasa dan mudah dilakukan untuk automatisasi dan yang paling penting adalah tidak mengandung bahan radioaktif (Kresno, 1996). Tiap plate dapat mengandung sampai dengan 96 sumuran sehingga sampel yang banyak dapat diukur. Prosedur ini dari observasi mempunyai keuntungan bahwa permukaan plastik dapat mengabsorpsi rendah tapi mampu mendeteksi sejumlah protein (Kenney and Arakawa, 1997). Penerapan klinik metode ELISA bermacam-macam, baik untuk diagnosis serologic infeksi, misalnya penerapan antibody terhadap bakteri, parasit, atau virus maupaun serodiagnosis yang lain, misalnya penetapan petanda ganas, alergi, penyakit autoimun, dan sebagainya. 5. ALAT DAN BAHAN Alat: Pipa kapiler Ependrof Jarum suntik ujung tumpul (per-oral) Jarum suntik (intraperitoneal) Erlenmeyer Gabus Aluminium foil Jarum penthul Mikropipet

13

Alat sentrifuge Sumuran Inkubator ELISA reader Bahan: Mencit jantan dan betina (jenis Swiss) Daun nangka Kloroform CMC Levamisol Prednison Vaksin Hepatitis B OPD (Ortho-phenylendiamine) BSA1% PBS PBST20 RPMI

6.

CARA KERJA Penentuan Perlakuan pada Hewan Uji Mencit (Swiss) dibagi untuk 9 kelompok (@ 6 mencit)

Kontrol CMC

Levami sol

Prednis on

Ekstak polar 50 mg/kg BB

Ekstrak polar 100 mg/kg BB

Ekstrak polar 200 mg/ kg BB

Ekstrak nonpolar 50 mg/kg BB

Ekstrak nonpolar 100 mg/kg BB

Ekstrak nonpolar 200 mg/kg BB

Masing-masing mencit ditimbang

14

Diambil sampel darah dari vena cavila occulair Diberi perlakuan per-oral Imunisasi pada Hewan Uji Vaksin hepatitis B diberikan Secara intraperitoneal Imunisasi pertama dilakukan setelah 7 hari perlakuan Imunisasi kedua dilakukan pada hari ke- 21 Imunisasi ketiga dilakukan pada hari ke-35 Pengumpulan Serum dari Darah Hewan Uji Gunakan pipa kapiler untuk mengalirkan darah dari vena cavila occulair Tampung darah dalam ependrof Diamkan selama 1 jam pada suhu kamar Sentrifugasi Ambil serrumnya Serum diisolasi dan disimpan dengan temperatur 200C Pengukuran titer antibodi dengan metode ELISA Mikropipet dilapisi vaksin Hepatitis B 100 mikroltr dalam PBS 10 ml

15

Masukkan pada tiap sumuran Inkubasi pada suhu 40C Cuci sumuran dengan PBST20 sebanyak 3 kali Pada sumuran ditambahkan BSA 1% dalam PBS 100 mikroliter Inkubasi selama 1 jam pada suhu 370C Cuci sumuran dengan PBST20 sebanyak 3 kali Pada sumuran diberi serum yang telah diencerkan dengan PBS sebanyak 100 mikroliter Inkubasi selama 1 jam pada suhu 370C Cuci sumuran dengan PBST20 sebanyak 3 kali Ditambah konjugat yang telah diencerkan PBS Inkubasi selama 1 jam pada suhu 370C Cuci sumuran dengan PBST20 sebanyak 3 kali Ditambah substrat ODP 100 mikroliter Inkubasi selama 10 menit pada suhu kamar Amati warna yang terbentuk

16

Baca pada Elisa reader Isolasi Limfosit dan Makrofag Mencit dimatikan dengan kloroform Mencit ditelentangkan pada gabus yang telah dilapisi alumunium foil dan dijepit di kedua kaki tangannya Kulit bagian perut dibuka Selubung peritoniumnya disterilisasi dengan alkohol 70% Suntikkan RPMI sebanyak 5-7 ml pada rongga peritonium hingga menggelembung, namun tidak bocor Ditepuk perlahan-lahan Campuran media dan makrofag diaspirasi kembali dari rongga peritoneal Limfosit dilisis dengan Natrium Hiperklorat Sentrtifuge Hitung jumlah limfosit dan makrofag dengan alat hemositimeter di bawah mikroskop 7. DATA DAN PERHITUNGAN
UJI SIGNIFIKANSI ANTARA BASE LINE DENGAN SERUM HARI KE-14 DAN HARI KE-28 DENGAN UJI PAIR SAMPLE T TEST (WILCOXON SIGNED RANKS TEST)

NPar Tests Wilcoxon Signed Ranks Test


17

Ranks N O.D14 - BaseLine Negative Ranks Positive Ranks Ties Total a. O.D14 < BaseLine b. O.D14 > BaseLine c. O.D14 = BaseLine
b Test Statistics

14 a 23 b 0c 37

Mean Rank 17.36 20.00

Sum of Ranks 243.00 460.00

Z Asymp. Sig. (2-tailed)

O.D14 BaseLine -1.637 a .102

a. Based on negative ranks. b. Wilcoxon Signed Ranks Test

Ranks N O.D.28 - Baseline Negative Ranks Positive Ranks Ties Total a. O.D.28 < Baseline b. O.D.28 > Baseline c. O.D.28 = Baseline
b Te st Statistics

12 a 9b 0c 21

Mean Rank 11.29 10.61

Sum of Ranks 135.50 95.50

Z Asymp. Sig. (2-tailed)

O.D.28 Baseline -.695 a .487

a. Based on positive ranks. b. Wilcoxon Signed Ranks Test

Hipotesis Ho: tidak ada perbedaan nilai optical density sebelum dan sesudah diberi vaksin. Ha: ada perbedaan nilai optical density sebelum dan sesudah diberi vaksin. Pengambilan keputusan Jika sig>0.05 maka Ho diterima Jika sig<0.05 maka Ho ditolak

UJI DISTRIBUSI HASIL ELISA DENGAN UJI KOLMOGOROV-SMIRNOV

18

NPar Tests
One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

N Normal Parameters(a,b) Most Extreme Differences Kolmogorov-Smirnov Z Asymp. Sig. (2-tailed) a Test distribution is Normal. b Calculated from data. Mean Std. Deviation Absolute Positive Negative

Base Line 54 .0667 .05657 .190 .190 -.158 1.394 .041

O.D.14 37 .0682 .05626 .201 .201 -.159 1.224 .100

O.D.28 21 .0551 .04520 .227 .227 -.134 1.042 .228

Oneway
Test of Homogeneity of Variances pengambilan1 Levene Statistic 3.584 df1 8 df2 28 Sig. .006

NPar Tests Kruskal-Wallis Test


Ranks O.D14 kelompok 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Total N 4 3 3 6 4 3 4 5 5 37 Mean Rank 24.00 22.33 19.17 11.75 5.13 27.00 14.00 23.80 27.10

19

a,b Te st Statistics

Chi-Square df Asymp. Sig.

O.D14 16.692 8 .033

a. Kruskal Wallis Test b. Grouping Variable: kelompok

Ranks O.D28 kelompok I II IV VI VII VIII IX Total N 3 3 4 2 2 4 3 21 Mean Rank 10.17 8.83 3.88 16.50 15.50 13.88 13.00

a,b Te st Statistics

Chi-Square df Asymp. Sig.

O.D28 9.500 6 .147

a. Kruskal Wallis Test b. Grouping Variable: kelompok

Hipotesis Ho: tidak ada perbedaan nilai optical density antar kelompok pada pengambilan serum. Ha: ada perbedaan nilai optical density antar kelompok pada pengambilan serum. Pengambilan keputusan Jika sig>0.05 maka Ho diterima Jika sig<0.05 maka Ho ditolak

20

Tabel Signifikansi Antar Kelompok Pada Serum Hari Ke-14 (Mann-Whitney) Kelompok (I) 1 Kelompok (J) Signifikansi (I-J) 2 1.000 3 0.857 4 0.038 5 0.029 6 0.857 7 0.200 8 1.000 9 0.556 2 3 1.000 4 0.167 5 0.057 6 0.700 7 0.629 8 1.000 9 0.571 3 4 0.381 5 0.114 6 0.400 7 0.629 8 0.786 9 0.250 4 5 0.171 6 0.048 7 0.762 8 0.052 9 0.082 5 6 0.057 7 0.343 8 0.016 9 0.016 6 7 0.057 8 0.786 9 0.571 7 8 0.413 9 0.111 8 9 0.841 0.056 + 0.052 + 0.050 + 0.054 = 0.053 4
Kelompok I II Perlakuan CMC Levamisol Serum Base line Hari 14 Hari 28 Base line M1 0.039 0.093 0.028 0.095 M2 0.041 0.132 0.115 0.048 M3 0.026 0.043 0.078

ANALISIS PEMBERIAN EKSTRAK NANGKA SEBAGAI IMUNOMODULATOR Data dan Perhitungan ELISA Tabel Optical Density setelah dikurangi blangko Absorbansi blangko ratarata:

M4 0.081 0.053

M5 0.042 0.047 0.031 0.040

M6 0.087 0.071

Rata-rata 0.053 0.079 0.058 0.064

21

III IV V VI VII VIII IX

Prednison Ekstrak Polar 50mg/kgBB Ekstral Polar 100 mg/kgBB Ekstrak Polar 200mg/kgBB Ekstrak Non Polar 50mg/kgBB Ekstrak Non Polar 100mg/kgBB Ekstrak Non Polar 200mg/kgBB

Hari 14 Hari 28 Base line Hari 14 Hari 28 Base line Hari 14 Hari 28 Base line Hari 14 Hari 28 Base line Hari 14 Hari 28 Base line Hari 14 Hari 28 Base line Hari 14 Hari 28 Base line Hari 14 Hari 28

0.103 0.019 0.025 0.055 0.066 0.063 0.082 0.105 0.268 0.271 0.133 0.062 0.027 0.022

0.033 0.015 0.019 0.080 0.088 0.023 0.021 0.044 0.097 0.106 0.051 -

0.061 0.101 0.010 0.018 0.013 0.021 0.024 0.088 0.034 0.035 0.074 0.137 0.152 0.184 0.188

0.046 0.032 0.250 0.025 0.010 0.030 0.017 0.041 0.027 0.056 0.090 0.084 0.277 0.008 0.048 0.047 0.052 0.034 0.062 0.152 -

0.151 0.037 0.056 0.015 0.036 0.005 0.028 0.021 0.060 0.103 0.036 0.043 0.085 0.039 0.032 0.033 0.072 0.106 0.050

0.062 0.053 0.017 0.031 0.033 0.018 0.065 0.072 0.057 0.047 0.037 0.057 0.090 0.086 -

0.077 0.028 0.092 0.060 0.025 0,038 0,017 0,031 0,023 0,063 0,085 0,083 0,104 0,036 0,067 0,097 0,106 0,064 0,082 0,111 0,087

Perbandingan Optical Density antara Ekstrak Nangka dengan Kontrol CMC Ekstrak terenapkan etanol Kadar 50 mg/kg BB
OD14 = OD 28 = 0.038 = 0.481 0.079 0.017 = 0.293 0.058 0.023 = 0.291 0.079

Kadar 100 mg/kg BB


OD14 =

Kadar 200 mg/kg BB


OD14 = OD28 = 0.085 = 1.076 0.079 0.083 = 1.431 0.058

Ekstrak tak terendapkan etanol Kadar 50 mg/kg BB


OD14 = 0.036 = 0.456 0.079

22

OD 28 =

0.067 = 1.155 0.058

Kadar 100 mg/kg BB


OD14 = OD28 = 0.106 = 1.342 0.079 0.064 = 1.103 0.058

Kadar 200 mg/kg BB


OD14 = OD 28 = 0.111 = 1.405 0.079 0.087 = 1.500 0.058

Kontrol positif
OD14 = 0.077 = 0.975 0.079

OD 28 =

0.028 = 0.483 0.058

Kontrol negatif
OD14 = 0.060 = 0.759 0.079

Serum

Hari-14

Optical Density Kontrol CMC 0.079

Perlakuandosis Polar-50 Polar-100 Polar-200 Non polar-50 Non polar 100 Non polar 200 Levamisol Prednison

Optical Density 0.038 0.023 0.085 0.036 0.106 0.111 0.077 0.060

Indeks

Efek imunostimulansia menurut Wagner Imunosupresan Imunosupresan Tidak aktif Imunosupresan Imunostimulan sedang Imunostimulan sedang Imunostimulan ? Imnosupresan

0.481 0.291 1.076 0.456 1.342 1.405 0.975 0.759

23

Hari-28

0.058

Polar-50 Polar-100 Polar-200 Non polar-50 Non polar 100 Non polar 200 Levamisol Prednison

0.017 0.083 0.067 0.064 0.087 0.028 -

0.293 1.431 1.155 1.103 1.500 0.483 -

Imunosupresan Imunostimulan sedang Tidak aktif Tidak aktif Imunostimulan sedang Imunosupresan -

PEMBAHASAN Penentuan Perlakuan pada Hewan Uji Praktikum kali ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak daun nangka dengan variasi kadar terhadap respon imun tubuh mencit yang di vaksin dengan virus hepatitis B. Selain itu, agar mahasiswa mengetahui prosedur isolasi makrofag dan isolasi limfosit serta memahami prosedur pengukuran titer antibody menggunakan metode ELISA. Untuk menjalankan serangkaian praktikum ini, praktikan dibagi menjadi sembilan kelompok. Masing-masing kelompok diberi enam ekor mencit percobaan, dengan pembagian sebagai berikut: Kelompok 1 diberi perlakuan sebagai control CMC, kelompok 2 diberi Levamisol, kelompok 3 diberikan Prednison, kelompok 4 perlakuan ekstrak polar 50 mg/kg BB, kelompok 5 perlakuan ekstrak polar 100 mg/kg BB, kelompok 6 perlakuan ekstrak polar 200 mg/kg BB, kelompok 7 perlakuan ekstrak nonpolar 50 mg/kg BB, kelompok 8 perlakuan ekstrak non-polar 100 mg/kg BB, kelompok 9 perlakuan ekstrak non-polar 200 mg/kg BB. Langkah pertama, masing-masing hewan uji ditimbang, agar volume pemberian larutan perlakuan dapat dihitung. Sebelum diberikan perlakuan, terlebih dahulu sampel darah dari masing-masing mencit diambil melalui vena cavila occulair agar lebih mudah mendapatkannya dan tidak menyakiti hewan uji bila prosedur pengambilan dijalankan dengan cara yang benar. Setelah itu, baru diberikan larutan perlakuan secara per oral. Imunisasi pada Hewan Uji

24

Imunisasi dilakukan setelah 7 hari mencit diberi perlakuan. Tujuan imunisasi adalah untuk mengenalkan antigen yang akan menstimulasi system imun dalam memproduksi antibody. Untuk imunisasi digunakan vaksin hepatitis B yang berisi protein virus hepatitis B yang telah mengalami proses pengurangan virulensi yang dikenal sebagai atenuasi (perlemahan). Pada atenuasi, meskipun organisme itu hidup tetapi tidak dapat menyebabkan penyakit. Imunisasi yang dilakukan adalah imunisasi aktif secara buatan karena yang diberikan adalah vaksin. Vaksin mengandung antigen yang merangsang system imun tubuh untuk membentuk antibody guna melawan antigen yang dianggap sebagai benda asing pada imunisasi aktif. Perlindungan tidak terbentuk segera, tetapi sekali terbentuk akan berlangsung lama. Pemberian imunisasi ulang akan mengakibatkan peningkatan tanggap kebal sekunder. Injeksi dilakukan secara intraperitoneal, karena rongga peritoneal relatif besar sehingga volume antigen yang diinjeksikan dapat lebih banyak. Penyuntikan secara intraperitoneal tidak secara langsung membawa antigen ke dalam sirkulasi sistemik sehingga partikulat antigen dapat menstimulasi respon imun. Pada penelitian yang dilakukan Kahl dkk (1989), menunjukkan bahwa imunisasi secara intraperitoneal pada mencit menghasilkan titer antibody lebih tinggi dibandingkan subkutan. Kemudian, imunisasi kedua dilakukan pada hari ke-21. Injeksi sekunder ini dilakukan pada hari ke-21 agar antibody yang terbentuk dari imunisasi pertama telah mencapai puncak sebelum imunisasi yang kedua. Injeksi sekunder dimaksudkan untuk memberikan antigen pada pemaparan yang kedua sehingga system memori dari system kekebalan tubuh dapat aktif dan menghasilkan antibody lebih cepat dibandingkan pada pemaparan antigen yang pertama. Imunisasi ketiga dilakukan pada hari ke-35, yaitu satu minggu sebelum dilakukan kultur limfosit dan makrofag. Injeksi ini dilakukan untuk menginduksi respon imun yang baik dan kuat. Selain untuk menginduksi respon, injeksi ini bertujuan untuk menghindari shock anafilaksis (hipersensitivitas tipe cepat berupa gangguan pernafasan).

25

Pengumpulan Serum dari Darah Hewan Uji Pengambilan darah dari mencit dilakukan pada hari ke-0, 14, dan 28. Sampel diambil pada waktu tersebut karena diperkirakan jumlah antibody yang terbentuk akibat vaksinasi dengan vaksin hepatitis B telah mencapai kadar puncak sehingga dapat dideteksi dengan metode ELISA. Darah yang telah diambil, didiamkan selama satu jam pada suhu kamar agar terjadi koagulasi sempurna, kemudian disentrifuge sehingga didapatkan serum. Serum diisolasi dan disimpan pada temperatur 200C sampai saat akan digunakan. ELISA Enzyme Ling Immuno Sorbent Assay merupakan metode biokimia yang digunakan dalam immunologi untuk mendeteksi antibody maupun anti gen dalam suatu sampel. Prinsip dasar kerja Elisa adalah bahwa suatu antibody dapat mengenali epitop tertentu secara spesifik. Ikatan kovalen kompleks antigen-antibody tersebut kemudian divisualisasi dengan cara penambahan antibody kedua yang dikonjugasikan dengan suatu enzim atau senyawa fluoresens. Kemudian kompleks tadi dipaparkan pada kompleks tertentu sehingga akan terbentuk warna yang dapat diukur menggunakan metode kolorimetri maupun spektrofotometri. Penetapan kadar immunoglobulin dalam percobaan ini menggunakan metode ELISA tidak langsung dengan sampel serum. Sampel serum dipilih karena di dalam serum tersebut mengandung berbagai bahan larut tanpa sel, jumlah protein yang lebih sedikit daripada plasma karena ribrin dan fibrinogennya telah digunakan untuk pembekuan darah. Prinsip metode elisa tidak langsung adalah mereaksikan antigen dalam hal ini antigen HAV (Havrix) yang sudah dilekatkan pada permukaan sumuran dengan antibody serum, kemudian direaksikan lagi dengan antigen spesifik berlabel enzim (AgE) yaitu antimouse peroksidase sehingga membentuk kompleks Ag-Ab-AgE. Sehingga ketika ditambahkan substrat yang sesuai maka kompleks tersebut akan menghidrolisis substrat. Substrat yang dipilih adalah substrat yang kromogenik sehingga ketika dihidrolisis akan menghasilkan senyawa berwarna yang dapat diukur intensitasnya (optikal density). Dalam praktikum ini digunakan OPD (Ortho-phenylendiamine). Intensitas warna akan sebanding pula dengan banyaknya substrat yang terhidrolisis dan secara otomatis

26

akan sebanding pula dengan banyaknya antibody yang ada dalam serum. Hidrolisis substrat biasanya memerlukan waktu tertentu dan untuk menghentikan reaksinya digunakan asam atau basa kuat. Reaksi ELISA harus dalam keadaan optimal, konsentrasi reaktan, suhu maupun wqaktu inkubasi. Biasanya tiap kit reagen memberikan petunjuk yang berbeda-beda. Pengukuran titer antibodi dengan metode ELISA Titer antibodi diukur dari serum mencit yang diambil setelah vaksinasi. Pengambilan dilakukan sebanyak tiga kali yaitu sebagai base line, hari ke-14, dan hari ke-28 Kemudian dianalisis antibodinya menggunakan ELISA. Metode ELISA yang digunakan adalah ELISA tak langsung karena metode tersebut karena metode merupakan metode yang paling sederhana yang dapat digunakan untuk mengukur titer antibodi dimana antigen antigen teradsorbsi secara pasif pada matriks padat. Matriks yang digunakan adalah mikroplate karena mudah dipakai bila jumlah sampelnya banyak. Mikroplate ini juga dapat digunakan pada percobaan dengan rektan yang sedikit dan hasilnya dapt ditentukan dengan mengukur substrat yang teredegradasi. Titer yang diukur tidak spesifik satu jenis saja, dan merupakan antibodi polimonoklonal. Akan tetapi sebagian besar berupa subkelas IgG karena divaksinasi Havrix secara i.p. untuk IgM dan IgA akan lebih besar keluar jika divaksinasi secara rectal. Langkah pertama yang dilakukan pada percobaan ini adalah mikropipet dilapisi dengan vaksin hepatitis B 100 l dalam coating buffer sebanyak 10 ml. Dalam hal ini coating buffer yang digunakan adalah PBS. Kemudian dimasukkan pada tiap sumuran kemudian diinkubasi 4C agar antigen benar-benar teradsorbsi kuat pada mikroplet. Lama inkubasi harus diperhatikan dan tidak boleh terlalu lama yaitu sekitar 1jam, karena jika terlalu lama akan menimbulkan reaktivitas antigen-antibodi akibat pelapisan yang berlebihan. Peningkatan jumlah antigen maka laju pelepasan antigen akan lebih cepat. Hal tersebut akan menghambat pengikatan antibody terhadap antigen sehingga akan menurunkan sensitivitas. Konsentrasi antigen yang tinggi juga dapat menyebabkan kerapatan pengikatan antigen yang tinggi pada matriks padat sehingga dapat merubah konformasi antigen serta mengurangi tempat pengikatan sterik antibody. Hal tersebut dikarenakan oleh susunannya yang rapat dan berlapis-lapis.

27

Langkah berikutnya yaitu mencuci dengan PBST20 sebanyak tiga kali. Tujuan dari pencucian ini adalah untuk menghilangkan antigen yang terikat pada pada mikroplate untuk mengurangi reaksi pengikatan non-spesifik. Mikropipet kemudian dilakukan pemblokingan menggunakan BSA 1% dalam PBS sebanyak 100l kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37C. dengan pemblokingan ini cairan BSA 1% akan menutupi tempat-tempat yang kosong sehingga reaksi non-spesifik dapat dihambat. Penghambatan ini sangatlah penting karena karena jika tidak dihambat akan mengganggu hasil analisis. Perlakuan inkubasi dimaksudkan agar pemblokingan dapat terjadi secara sempurna. Kemudian dicuci kembali menggunakan PBST20 sebanyak tiga kali, untuk menghilangkan BSA yang tidak terikat. Sumuran kemudian ditambahkan dengan serum yang telah diencerkan dengan PBS, dengan faktor pengenceran 10 kali. Serum yang ditambahkan pada tiap sumuran adalah sebanyak 100l. Setelah penambahan serum maka mikroplate diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37C. Hal ini dimaksudkan agar antibodi yang terkandung dalam serum dapat dapat mengenali dan berikatan dengan antigen yang telah terikat pada mikroplate. Kemudian dilanjutkan dengan pencucian kembali menggunakan PBST20 sebanyak tiga kali, dengan maksud untuk menghilangkan bahan-bahan lain serta antibodi yang tidak terikat pada antigen pada mikropiopet, sehingga gangguan analisis dapat diminimalisir. Kemudian dilakukan penambahan konjugat sebanyak 100l yang telah diencerkan dengan PBS sebanyak 10 kali. Setelah penambahan konjugat maka dilakukan inkubasi selama 1 jam dalam suhu 37 C. Hal ini dimaksudkan agar konjugat dapat terikat sempurna dengan antibodi yang telah berikatan dengan antigen. Konjugat ini merupakan antibodi kedua yang membawa enzim. Konjugat yang digunakan adalah Whole conjugate yang berisi IgA, IgM, IgG, dan enzim pendegradasi substrat. Selanjutnya dilakukan pencucian kembali menggunakan PBST20 untuk menghilangkan konjugat yang tidak terikat dengan antibodi pertama. Kemudian ditambahakan substrat ODP (OPhenilenediamine). Substrat yang dimasukkan dalam tiap sumuran sebanyak 100 l yang kemudian diinkubasi selama 10 menit dalam suhu kamar. Substrat yang digunakan ini bersifat sebagai kromogenik sehingga saat substrat terdegradasi oleh enzim yang terikat pada konjugat maka akan terbentuk warna yang dapat terbaca pada ELISA reader. Perlakuan inkubasi dimaksudkan agar reaksi degradasi substrat oleh dapat dapat berjalan

28

sempurna. Pada akhir perlakuan dilakukan penyetopan menggunakan H2SO4

2.5

sebanyak 10 untuk tiap sumuran. Tujuan pemberian H2SO4 ini dimaksudkan agar menghentikan reaksi degradasi yang terjadi. Tahap akhir yaitu pembacaan absorbansi pada 492 nm denagn ELISA reader dan hasilnya dianalisis secara statistic dengan membandingkan nilai absorbansi yang terbentuk yang dianalogkan dengan jumlah antibody yang terikat pada mikroplate untuk tiap-tiap perlakuan yang diambil serumnya pada hari yang bertahap. Langkah ELISA diawali dengan berikatannya antigen yang dilapisi pada mikroplate dengan antibodi yang berasal dari mencit. Antibodi tersebut merupakan antibodi pertama. Ikatan antigen-antibodi pertama akan kuat adan tidak terlepas saat pencucian jika antigen spesifik terhadap antibodi pertama. Konjugat yang ditanbahkan merupakan antibodi kedua yang mengikat enzim, antibodi kedua ini berikatan secara spesifik dengan antibody pertama. Pada tahap kahir, ditambahkan substrat kromogenik. Substrat secara spesifik akan berikatan dengan dengan enzim yang dibawa oleh antibodi antibodi kedua dan substrat akan terdegradasi oleh enzim kan membentuk warana yang dapat dibaca oleh ELISA. Pada warna yang terbentuk adalah orange. Absorbansi yang terukur menunjukkan keberadaan antibodi yang pada serum mencit karena absorbansi setara dengan jumlah substrat yang terdegradasi oleh enzim. Jumlah substrat sertara dengan enzim, dan jumlah enzim setara dengan jumlah antibodi kedua. Antibodi kedua ini jumlahnya sebandung dengan antibodi pertama. Maka secara tidak langsung absorbansi menggambarkan jumlah antibodi pertama yang terdapat dalam hewan uji. Maka ELISA yang dipakai dalam percobaan in adalah ELISA secara tidak langsung. Hal-hal yang harus diperhatikan dalam ELISA: 1. Pencucian harus mengenai seluruh bagian sumuran dan diulangi sebanyak tiga kali setiap pencucian agar reaktan yang tidak diperlukan tidak ikut dalam reaksireaksi selanjutnya. Pencucian dilakukan untuk menghilangkan semua materi dari luar dan yang ikatannya longgar dari permukaan fase padat. Jika pencucian tidak dilakukan maka akan terbentuk ion berlapis ganda diffuse pada permukaan plastik sumuran yang biasanya bermuatan negative sehingga pada bidang temu lapisannya terganggu. Pencucian dilakukan sebanyak 4 kali:

29

a. Pencucian I : dilakukan setelah penempelan antigen pada substrat padat. Pencucian ini dilakukan untuk menghilangkan antigen yang tidak terikat pada substrat. Karena jika tidak dihilangkan maka antigen ini akan berkompetisi dengan antigen yang terikat pada substrat padat dalam mengikat antibody pada sampel. b. Pencucian II : pencucian kedua dilakukan setelah antibody terikat pada antigen (Ab-Ag). Hal ini bertujuan untuk menghilangkan antibody yang tidak terikat pada antigen, antiboby berafinitas rendah serta senyawa lain dalam serum yang dapat menggangu reaksi selajutnya. Di dalam tubuh terdapat antibody yang berafinitas tinggi dan rendah, semakin tinggi afinitasnya maka semakin kuat pula respon imunnya. c. Pencucian III : pencucian ketiga dilakukan setelah panambahan AgE dan kompleks Ag-Ab-AgE terbentuk. Pencucian ini bertujuan untuk menghilangkan Age yang tidak terikat pada Ag-Ab. d. Pencucian IV : pencucian keempat dilakukan setelah penambahan substrat dan terjadi hidrolisa substrat ortho-phenylendiamine (OPD) oleh kompleks Ag-Ab-AgE menjadi senyawa berwarna. Pencucian ini dilakukan untuk menghilangkan substrat yang tidak terhidrolisis. 2. Sebaiknya dilakukan pengenceran sempel dengan mengunakan PBS yang mengandung Tween 20 untuk menghindari absorbsi non spesifik pada dinding sumuran oleh partikel. Selain itu digunakan control sebagai pembanding. 3. Pengaruh pinggir lempeng mikro, menurut dogma pengaruh pinggir atau terbentuknya warna yang tidak terduga lebih banyak pada pinggir sumuran lempeng mikrotiter adalah karena perbedaan suhu antara bagian dalam dan luar sumuran. Hal demikian benar terjadi apabila regen yang disimpan pada suhu kamar atau suhu yang lebih rendah ditamba kelempeng mikrotiter yang kemudian diinkubasi pada suhu 37 C. Namun ada 2 hipotesis suhu yang perlu dikemukakan: a. Pengaruh pinggir ditemukan meski reagen diseimbangkan pada suhu tertentu dan diinkubasi yang dilakukan pada suhu ini. b. Gradient suhu yang terlihat paling banyak 1-2 c, tidak cukup tinggi untuk menyebabkan serum dengan antigen fase padat.

30

Uji signifikansi antara base line dengan serum hari ke-14 dan hari ke-28 dengan uji Pair Sample T Test ( Wilcoxon Signed rangks Test). Dari hasil uji tersebut taraf signifikansi optikal density hari ke-14 dan hari ke-28 dengan base line adalah sebesar 0,102 dan 0,487. Hasil keduanya menunjukan tidak ada perbedan signifikan antara base line dengan serum hari ke-14 maupun hari ke-28. Tidak adanya perbedaan nilai optikal density sebelum dan sesudah diberi vaksin ditunjukkan dengan nilai signifikansi yang didapat lebih besar dari 0,05. Hal ini menunjukan bahwa ada kemungkinan mencit pernah terpapar antigen sebelum diberi vaksin. Uji Statistic Data Elisa Suatu data dikatakan baik jika data tersebut terdistribusi normal. Oleh karena itu perlu dilakukan uji normalitas untuk mengetahui apakah data tersebut terdistribusi normal atau tidak. Uji ini dilakukan dengan uji normalitas Kolmodorof-Smirnov, uji ini sebaiknya dilakukan sebelum data diolah berdasarkan model-model penelitian. Uji normalitas ini bertujuan untuk mengetahui distribusi data dalam variable yang akan digunakan dalam penelitian. Data yang baik dan layak digunakan dalam penelitian adalah data yang memiliki distribusi normal. Dari uji distribusi hasil ELISA dengan uji Kolmogorof-Smirnov (NPar Tests) menunjukan hasil terdistribusi normal. Untuk meyakinkan bahwa data tersebut terdistribusi normal maka dilakukan uji homogenitas varian (Oneway). Dari hasil uji homogenitas varian di dapat taraf signifikansi sebesar 0,006 yang berarti data tersebut tidak homogen. Taraf signifikansi menunjukkan homogenitas data, sedangkan suatu data dikatakan homogen jika taraf signifikansinya di atas 0,005. Oleh sebab itu, uji Anova tidak dapat dilakukan dan untuk uji stastistiknya dilakukan dengan uji Kruskal-Wallis. Uji Kruskal-Wallis Uji Kruskal-Wallis dilkukan untuk mengetahui ada tidaknya perbedaan nilai optical density antar kelompok pada pengambila serum. Dari table hasil uji KruskalWallis didapat nilai signivikansi antar kelompok pada pengambilan serum hari ke-14 sebesar 0,033 dan nilai signifikansi antar kelompok pada pengambilan serum hari ke 28 sebesar 0.147. hal ini berarti pada pengambilan serum hari ke 14 terdapat perbedaan nilai

31

optical density yang signifikan antar kelompok karena nilai signifikansi dibawah 0,05. Sedangkan pada pengambilan serum hari ke 28, tidak terdapat perbedaan nilai optical density yang signifikan antar kelompok karena nilai signivikansinya di atas 0,05. Uji ini tidak dapat menunjukkan kelompok mana saja yang berbeda signifikan dan kelompok mana yang tidak berbeda signifikan. Oleh karena itu untuk mengetahui kelompok mana saja yang berbeda signifikan dan yang tidak berbeda signifikan, maka dilakukan uji Mann-Whitney. (hasil output SPSS ada di lampiran) Uji Mann-Whitney Uji Mann-Whitney merupakan bagian dari statistic non parametric yang bertujuan untuk membantu para peneliti di dalam membedakan hasil kinerja kelompok yang terdapat dalam sempel kedalam 2 kelompok dengan dua criteria yang berbeda. Uji ini digunakan untuk mengetahui beda dengan menggunakan rata-rata variable dengan jumlah data sample penelitian yang sangat sedikit (kurang dari 30). Uji mann-whitney di gunakan untuk menguji satu variable kategori dengan satu variable ordinat. (Tommi poltak Mario, hal 78). Data dikatakan berbeda secara signifikan apabila memiliki taraf signifikansi < 0.05. Data yang berbeda signifikan adalah data antara kelompok: 1-4, 1-5, 4-6, 5-8, dan 5-9 Analisis pemberian ekstrak nangka sebagai immunomodulator. Dari perbandingan optical density antara ekstrak nangka dengan kontrtol CMC didapat indeks fagositik untuk menentukan kriteria immunostimulansi (menurut Wagner) Indeks immunostimulan menurut wagner yaitu aktif sebagai immunostimulan jika nilai indeks fagositik ( K) berbeda diantara 1-1,5. Jika 1< k 1,5 bersifat immunostimulan sedang. Jika nilai K > 1,5 bersifat immunostimulan kuat. jika nilai K < 1,5 maka bersifat immunosupresan Dari indeks fagositik (K) yang menunjukkan hasil: a. immunosupresi = serum hari ke-14 perlakuan dosis polar 50, serum hari ke-14 perlakuan dosis polar 100, serum hari ke-14 perlakuan dosis non polar 100

32

serum hari ke-28 perlakuan dosis polar 50. b. immunostimulan aktif sedang = serum hari ke-14 perlakuan dosis non polar 100 serum hari ke-14 perlakuan dosis non polar 200, serum hari ke-28 perlakuan dosis polar 200 serum hari ke-28 perlakuan dosis non polar 200 c. immunostimulan tidak aktif = serum hari ke-14 perlakuan dosis polar 200 serum hari ke-28 perlakua dosis non polar 50 serum hari ke-28 perlakuan dosis non polar 100. Isolasi Makrofag dan Limfosit Makrofag merupakan antigen yang membantu proses antigen sedemikian rupa sehingga menimbulkan interaksi dengan sel sistem imun spesifik. Makrofag dapat diisolasi dari rongga peritonial atau perut mencit, mencit yang digunakan adalah mencit jenis swiss. Pertama-tama mencit dikorbankan dengan memasukkannya ke dalam wadah yang telah dijenuhi oleh kloroform, tutup rapat-rapat. Setelah didiamkan, mencit yang mati dibiarkan terlentang pada gabus yang telah diberi aluminium foil dan dijepit di kedua kaki tangannya. Langkah berikutnya adalah, kulit bagian perut dibuka atau dibedah, selubung peritoniumnya dilakukan sterilisasi dengan menggunkan alkohol 70%. Kemudian disuntikkan RPMI sebanyak sekitar 5 ml pada rongga peritonium hingga mengelembung, namun tidak sampai bocor, kemudian ditepuk-tepuk atau ditekan-tekan secara perlahan-lahan agar makrofag yang berada dalam jaringan ikat dapat larut dalam larutan RPMI. Pengambilan ini dipilah dalam rongga peritonium karena secara teoritis, makrofag akan bermigrasi besar-besaran ke tempat terjadinya infeksi. Vaksinasi yang dilakukan adalah secara intraperitonial maka dapat diasumsikan makrofag akan banyak terdapat di rongga peritonial karena di sanalah terjadi infeksi. Setelah campuran media dengan makrofag diaspirasi kembali ke rongga peritonial, maka cairan tadi disenterifuge dan dihitung jumlahnya dengan menggunakan alat hemositimeter di bawah mikroskop. Sebelum disentrifuge, limfosit dilisis dengan bantuan Natrium Hiperklorat. Namun ternyata uji dengan alat hemositometer tidak dilaksanakan karena alat yang tidak ada atau terbatas . Namun secara teoritis memperlihatkan bahwa

33

jumlah makrofag lebih kecil daripada limfosit, kadang hasil ujinya menunjukkan kenaikan seiring dengan kenaikan kadar pemberian ekstrak daun nangka. Hal ini kemungkinan besar karena antigen yang disuntikkan pada mencit adalah antigen spesifik sehingga ketika dipaparkan , antibodi spesifik langsung diproduksi untuk mengikat antigen tersebut. Hal ini menunjukkan adanya sel memori,yang mengenali antigen bersangkutan, yang dihasilkan terhadap antigen karena vaksinasi dilakukan sebanyak tiga kali pemejanan. Sebab, makrofag dikenal sebagai pengaktif limfosit karena salah satu fungsinya adalah sebagai Antigen Presenting Cell(APC). Sebenarnya jumlah limfosit dan makrofag pada manusia adalah sama, namun pada mencit jumlah limfositnya lebih banyak daripada makrofag. Pada praktikum, dilakukan dua kali sentrifugasi yaitu pada suhu kamar dan suhu 40 derajat celcius. Ternyata dihasilkan adanya perbedaan letak endapan. Pada suhu ruang atau kamar, hasil endapannya terletak pada dinding sisi ependorf, sedangkan pada suhu 40 derajat celcius letak endapannya terletak di bawah. Jumlah makrofag mencit yang telah diberi perlakuan ekstrak daun nangka memperlihatkan jumlah yang lebih besar pada kontrol negatif dan pada kadar 10%, jumlahnya tampak lebih besar daripada perlakuan dengan levamisol. Dengan demikian dapat disimpulkam bahwa meningkatnya kadar, maka jumlah makrofagnya dan limfosit semakin meningkat. Kemampuan ekstrak daun nangka relatif lebih besar daripada kekuatan levamisol dalam menginduksi proliferasi makrofag dan limfosit karena jumlah limfosit dan makrofag yang dihasilkan ekstrak daun nangka lebih banyak daripada perlakuan dengan levamisol. Faktor-faktor kesalahan yang terjadi dalam praktikum ini sehingga datanya tidak begitu signifikan, disebabkan oleh.: 1. faktor hewan uji faktor kejiwaan mencit, yaitu mengalami sterss karena perlakuan yang lama, perkelahian denagn sesamamanya di tempat dan pengambilan serum darah dari vena mata yang memungkinkan menimbulkan respon imun yang tidak maksimal. Suhu ruangan yang terlalu panas sehingga metabolisme tubuh dan kekebalan mencit tidak teratur. 2. faktor praktikan pemberian makan yang kurang teratur, atau tidak pasti setiap harinya.

34

Pemberan ekstrak yang dimuntahakan mencit karena ketidakatepatan dalam menyuntikkannya. Penyuntukan vaksin yang tidak tssepat pada rongga peritonial. Pengambilan darah yang tidak tepat karena tekanan oleh tangan praktikan Waktu yang tidak sama saat pendiaman darah saat koagulasi , dikhawatirkan jika terlalu lama terdapat protein pengganggu dan terjadi hemolisis. Kekeliruan saat pelabelan mencit Warna limpa hasil isolasi yang tidak sesuai yang diharapkan, karena sel limfosit yang tidak semuanya bisa dikeluarkan. Kebocoran selaput peritonial saat isolasi makrofag yang kemungkinan makrofag ada yang tercecer. Masih adanya sisa pereaksi pada alatalat ELISA karena pencucian yang tidak sempurna. Pengenceran yang tidak tepat Ketelitian saat penghitungan jumlah limfosit dan makrofag pada hemositimeter

3. faktor alat dan bahan spesifitas dan sensitivitas alat yang kuranag sempurna karena memberikan serapan meskipun dalam keadaan kosong. pereaksi elisa yang sudah tidak murni lagi dan terkontaminasi sehingga ikatan antara antigen antibodinya kurang kuat. enzim yang digunakan sudah berkuarang aktivitasnya sehingga terjadi penurunan kemmpuan mengikat substrat. blanko yang digunakan tidak murni lagi , justru memberikan serapan lebih besar daripada sampel. saat pengambilan serum , mikropipetnya tidak disertai heparin sehingga banyak darah yang tertinggal dalam mikropipet sehingga didapat serum yang kurang mencukupi.

8.

KESIMPULAN

35

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Imunisasi atau vaksinasi adalah suatu prosedur untuk meningkatkan Obat-obat golongan imunomodulator bekerja menurut tiga cara, yakni: Imunisasi sendiri dapat terjadi secara alamiah ataupun buatan, masingPercobaan yang dilakukan kali ini termasuk imunisasi aktif. Karena Levamisol merupakan imunomodulator yang memperbaiki fungsi system Tidak ada perbedaan nilai optikal density sebelum dan sesudah diberi Suatu data dikatakan baik jika data tersebut terdistribusi normal dengan Meningkatnya kadar ditunjukkan dengan jumlah makrofag dan limfosit

derajat imunitas seseorang terhadap patogen tertentu atau toksin. imunorestorasi, imunostimulasi, dan imunosupresan. masing dibedakan menjadi imunisasi aktif dan pasif. hepatitis B mengaktifkan limfosit imun yang menurun. vaksin, ditunjukkan dengan nilai signifikansi yang didapat lebih besar dari 0,05. dilakukan uji normalitas. yang semakin meningkat. 9. Ekstrak daun nangka sebagai imunostimulan pada ekstrak non polar 50 mg/kgBB (hari ke 28), non polar 100 mg/kgBB dan 200 mg/kgBB. 10. Ekstrak daun nangka sebagai imunosupresan terdapat pada ekstrak polar 50 mg/kgBB, polar 100 mg/kgBB dan non polar 50 mg/kgBB. 11. Pengaruh ekstrak nangka sebagai imunomodulator dipengaruhi oleh dosis, rute pemberian dan waktu pemberian, serta kondisi hewan uji. 12. Ekstrak daun nangka memberikan perubahan terhadap titer antibodi pada mencit yang diinduksi oleh vaksin Hepatitis B. 9. DAFTAR PUSTAKA Anonim, Modulasi Respon Imun Spesifik dan Non-spesifik oleh Daun Dewa [Gynura Procumbens (Lour.) Merr, Asteraceae] pada Mencit BALB/c, Departemen Farmasi FMIPA ITB: Bandung Iwo, Maria Immaculata, dkk, 2004. Risalah Ilmiah Nasional Hasil Penelitian Farmasi. Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma: Yogyakarta

36

Mario, Tommi Poltak, dkk, 2006. SPSS untuk Paramedis. Ardana Media: Yogyakarta

Yogyakarta, 14 Mei 2007 Praktikan,

Golongan IV FBA

37