1 DINAMIKA EKSPRESI GEN MATRIX METALLOPROTEINASE-8 DAN TISSUE INHIBITOR METALLOPROTEINASE-1 PADA PEMAKAI PIRANTI ORTODONTIK LEPASAN Susilowati*,

Imam Mudjari** *Department of Orthodontics, Faculty of Dentistry, Hasanuddin University **Department of Dental Public Health, Faculty of Dentistry,Hasanuddin University Kompleks Dosen Unhas, Jl. Sunu CX-6 Makassar 90213, Sulawesi Selatan Email: susmudjari@yahoo.co.id Abstract The teeth will move if subjected into pressure from orthodontic appliances which causes a remodeling of periodontal ligament and alveolar bone. MMP-8 plays an important role in the remodeling process during orthodontic movement. The expression of MMP-8 gene is regulated by a natural inhibitor namely TIMP-1. The purpose of this study was to observe the MMP-8 and TIMP-1gene expressions in the gingival crevicular fluid (GCF) of patients with removable orthodontic appliance. A sample of 8 patients wearing removable orthodontic appliances was obtained. The finger springs were activated with 75 grams of force to produce canine distalization. GCF samples were collected from the distal side of upper canines before force application, 1-, 2-, 3-, and 4 weeks after application consecutively. The samples were analyzed by using RT-PCR. Statistical univariate analysis was used to show the distribution and percentages of the gene expressions. The gene expression of MMP-8 at t0 was 28.1% but the force application elevated its expression to 62.5 % at t 1, and then decreased continously at t2 (37.5%), t3 (34.4%), and t4 (31,3%). The gene expression of TIMP-1 at t0 was 40,6% but the force application elevated its expression to 59,4% at t1, and then decreased continously at t2 (43,8%), t3 (40,6%), and t4 (37,5%). In conclusion, there was a dynamic gene expressions of MMP-8 and TIMP-1 before and after force application and the pattern was similar, i.e. the highest level was happened on the first week, but it declined continously in the following weeks. Key words: matrix metalloproteinase-8, tissue inhibitor metalloproteinase-1, gene expression, removable orthodontic appliance

PENDAHULUAN Tuntutan dan kebutuhan akan perawatan ortodontik pada masa kini semakin meningkat, baik di Indonesia maupun negara-negara lain di dunia. Pemakaian piranti ortodontik cekat semakin diminati walaupun piranti ortodontik lepasan juga masih banyak dipakai, terutama di negara-negara yang sedang berkembang. Penelitian tentang pergerakan gigi dimulai kurang lebih 100 tahun yang lalu, dilihat dari aspek-aspek seluler, histologis, radiologis, dan yang terbaru adalah biologi molekuler dan genetika. Profil dari bermacam-macam sitokin, faktor pertumbuhan, gen, dan enzim-enzim yang dihubungkan dengan pergerakan gigi ortodontik telah banyak diteliti, dan biasanya pengambilan sampelnya dari cairan krevikuler gingiva yang berada di sulkus gingiva.. Gigi geligi akan bergerak jika dikenai tekanan. Piranti-piranti ortodontik aktif, dapat memberikan tekanan ke arah yang dikehendaki operator dengan tujuan untuk memperbaiki maloklusi. Tekanan pada gigi akan menimbulkan perubahan-perubahan pada jaringan periodontal dan tulang alveoler. Pada sisi regangan / tarikan akan terjadi aposisi sedangkan pada sisi tekanan, akan terjadi resorpsi tulang alveoler yang memerlukan keaktivan sel-sel osteoblas dan osteoklas yang berada di dalam matriks ekstraseluler. Untuk memudahkan mobilitas sel-sel tersebut, diperlukan suatu enzim yang dapat memecah kolagen yang merupakan komponen terbesar dari matriks

3 ekstraseluler yaitu kolagenase (matriks metaloproteinase/ MMP), misalnya MMP-1, -8, dan -131. Aksi dari MMP diatur oleh inhibitor spesifik yaitu Tissue Inhibitor

Metalloproteinase (TIMP). Dikenal ada 4 TIMP, yaitu: TIMP-1, -2,-3, dan - 4 . Yang paling banyak diteliti adalah TIMP-1, suatu glikoprotein yang disintesis oleh dengan cara

kebanyakan sel jaringan ikat. TIMP menghambat aksi dari MMP mengikat sisi aktifnya2.

Perubahan-perubahan morfologis dan histokimiawi dari sel-sel ligamentum periodontal telah banyak diteliti , tetapi masih sedikit penelitian tentang ekspresi gen MMP-8 dan TIMP-1 secara in vivo dan in vitro pada cairan krevikuler gingiva (GCF) akibat dari tekanan mekanis yang berasal dari piranti ortodontik. Penelitian-penelitian yang dilakukan di negara-negara barat hampir selalu menggunakan piranti ortodontik cekat, belum ada yang menggunakan piranti lepasan dalam hubungannya dengan ekspresi gen. Data yang didapatkan juga kebanyakan meneliti kadarnya, bukan ekspresi gennya. Oleh karena itu perlu diteliti bagaimana dinamika ekspresi gen MMP-8 dan TIMP-1 di dalam GCF selama pergerakan gigi pada pemakai piranti ortodontik lepasan. Hasil dari penelitian ini diharapkan bisa menambah pengertian tentang respons jaringan paradental terhadap tekanan ortodontik pada umumnya serta peran MMP-8 dan TIMP-1 dalam proses biomekanik pergerakan gigi akibat tekanan dari piranti lepasan pada khususnya

4 BAHAN DAN CARA Jenis penelitian ini adalah uji coba klinik (clinical trial) dengan rancangan time series.Pemasangan piranti ortodontik dilakukan di RSGMP FKG Unhas,

sedangkan pemeriksaan ekspresi gen (TIMP-1 dan MMP-8) menggunakan uji RTPCR dilakukan di Laboratorium Biologi Molekular dan Imunologi, Fakultas Kedokteran Unhas. Subjek penelitian adalah mahasiwa FKG dan pasien yang memakai piranti ortodontik lepasan, sebanyak 8 orang (6 perempuan dan 2 laki-laki, berusia 19-25 tahun), yang memenuhi kriteria inklusi sebagai berikut: gigi lengkap dari molar pertama atas kiri sampai dengan molar pertama atas kanan, pasien menderita crowded gigi anterior atau protrusi, berdasarkan analisis ruang (metode Kesling) diperlukan pencabutan gigi atas, oral hygiene baik, tidak ada kelainan periapikal / periodontal, akar gigi tidak mengalami kelainan ekstrim dalam hal bentuk dan ukuran (panjang), belum pernah atau tidak sedang menjalani perawatan ortodontik, dan mau berpartisipasi dalam proses penelitian sampai selesai. Sebagai kriteria eksklusi adalah sebagai berikut: menderita penyakit sistemik (DM), posisi gigi kaninus atas mesioversi atau distoversi ekstrem, posisi gigi kaninus atas ektopik/ di luar lengkung, gigi kaninus dan molar pertama atas goyang, dan cairan krevikuler gingiva tercampur darah. Pada pasien dilakukan pemasangan piranti ortodontik dilakukan pencabutan seminggu setelah

gigi premolar pertama atasnya. Besar gaya awal (aktivasi

finger spring) yang diberikan adalah 75 gram. Setelah itu dilakukan pengumpulan

5 GCF pada sisi distal dari gigi kaninus atas pada waktu sebagai berikut: sebelum dilakukan aktivasi finger spring (to), seminggu setelah aktivasi (t1), dua minggu setelah aktivasi (t2), tiga minggu setelah aktivasi (t3), dan empat minggu setelah aktivasi (t4). Pengumpulan GCF dilakukan sebagai berikut: pasien diminta untuk kumurkumur kemudian permukaan gigi yang akan diambil cairannya dibersihkan dari plak lalu dikeringkan dengan udara dan dijaga tetap kering dengan pemasangan cotton roll3. Dua buah paper point dimasukkan ke dalam sulkus, ditunggu 1 menit lalu dibuang. Diulang lagi aktivitas yang sama, setelah paper point berada di sulkus 1 menit, paper point dimasukkan ke dalam tabung L6 (transport buffer). Sampel

disimpan di lemari pendingin pada suhu -20o untuk menunggu dianalisis. Sampel GCF diekstraksi untuk mendapatkan RNA total. Analisis RT-PCR (Reverse Trancriptase- Polymerase Chain Reaction) dilakukan dengan memasukkan reagensia berikut ke dalam sebuah tabung mikro: 6 l Reverse Transcription buffer (Primecript, Takara, Japan), 1.5 l primer spesifik untuk MMP-8 yaitu sense primer: TGGACCCAATGGAATCCTTGC ATAGCCACTCAGAGCCCAGTA dan antisense primer:

yang menghasilkan fragmen 544 bp, 1,5 l

enzyme mixt, 19.5 l H2O and 1.5 l sampel mRNA. Kemudian tabung diinkubasi pada temperatur 37 C selama 15 menit, yang memungkinkan transkripsi terbalik bekerja. Temperatur dinaikkan menjadi 94o C selama 2 menit, 60o C selama 2 menit, dan 72o C selama 3 menit. Pita (band) DNA terlihat setelah 37 siklus PCR. GAPDH (Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase) ditambahkan pada masing-masing 5

6 sampel yang berfungsi sebagai kontrol internal. Produk PCR dilewatkan melalui 2% gel agarose untuk elektroforesis dan dilihat di bawah sinar UV. Semua prosedur di atas juga diulang untuk TIMP-1 dengan menggunakan :sense primer 5-GGGGACACCAGAAGTCAACCAGA-3, antisense primer 5-

CTTTTCAGAGCCTTGGAGGAGCT-34. Pengambilan foto DNA dalam gel agarosa dilakukan dengan kamera digital. Hasil uji laboratorium dengan RT-PCR dinyatakan dalam skor semi-kuantitatif 14 sebagai berikut: skor 1 jika cahaya dari band kurang terang dibanding kontrol, skor 2 jika cahaya dari band adalah sama dengan kontrol, skor 3 jika cahaya dari band sedikit lebih terang dibanding kontrol, dan skor 4 jika cahaya dari band jauh lebih terang dibanding kontrol. Data yang diperoleh dari penelitian diproses secara elektronik dengan menggunakan program SPSS versi 15.0, kemudian dianalisis secara statistik dengan analisis univariat.Penyajian datanya dilakukan dalam bentuk grafik persentase yang diharapkan memberikan gambaran distribusi ekspresi gen MMP-8 dan TIMP-1 menurut lamanya waktu pemberian tekanan. HASIL PENELITIAN Penelitian ini dilakukan terhadap 8 pasien yang memakai piranti ortodontik lepasan, dilakukan aktivasi pada finger spring dengan gaya awal sebesar 75 gram. Selanjutnya dilakukan observasi secara bertahap selama 4 minggu mengenai ekspresi gen MMP-8 dan TIMP-1 melalui GCF.

Grafik 1: sebaran ekspresi gen MMP-8 untuk piranti ortodontik lepasan Grafik 1 memperlihatkan bahwa ekspresi gen MMP-8 sebelum diberi tekanan sebesar 28,1%. Pemberian tekanan pada minggu pertama memberikan kenaikan sebesar 62,5%. Selanjutnya mengalami penurunan pada minggu kedua sebesar 37,5%. Pada minggu ketiga, mengalami penurunan menjadi 34,4% , kemudian semakin menurun pada minggu keempat menjadi 31,3 %.

Grafik 2: sebaran ekspresi gen TIMP-1 untuk piranti ortodontik lepasan Grafik 2 memberikan informasi bahwa sebelum diberi tekanan, persentase TIMP-1 sebesar 40,6%. Dengan pemberian tekanan selama minggu pertama menaikkan nilai TIMP-1 menjadi 59,4%. Pada minggu kedua, turun menjadi 43,8 %. Pada minggu ketiga, mengalami penurunan lagi menjadi 40,6%. Selanjutnya turun lagi menjadi 37,5% pada minggu keempat. PEMBAHASAN Pada penelitian ini, semua pasien mempunyai kebersihan mulut yang baik dan tidak menderita gingivitis maupun periodontitis. Alasannya adalah bahwa adanya sisasisa makanan pada permukaan gigi bisa memicu terjadinya gingivitis dan periodontitis. Periodontitis adalah penyakit inflamasi yang menyerang jaringan pendukung gigi, menyebabkan kerusakan progresif dari perlekatan jaringan pendukung dan tulang alveolar. Salah satu penyebabnya adalah adanya infeksi bakteri. Bakteri yang ada di dalam plak, termasuk lipopolisakarida (LPS) dan asam

9 lipoteichoic, berinteraksi dengan toll-like receptor pada sel epitel, leukosit dan fibroblas, merangsang produksi sitokin seperti IL-1 beta, TNF-alfa, IL-6, IL-8, prostaglandin E2 (PGE2)5. Untuk memudahkan infiltrasi leukosit, fibroblas yang distimulasi oleh IL-1 beta dan TNF-alfa mensekresi MMP yang mendegradasi molekul-molekul ECM termasuk kolagen6,7. Telah diteliti bahwa pada penderita periodontitis, terjadi peningkatan MMP-8 pada GCF8. Pergerakan gigi yang disebabkan oleh gaya ortodontik ditandai oleh perubahan remodeling pada jaringan gigi dan paradental, termasuk pulpa, ligamentum periodontal (PDL), tulang alveolar, dan gingiva. Jaringan-jaringan tersebut bila dikenai tekanan dengan besaran, frekuensi, dan durasi tertentu, menunjukkan perubahan-perubahan makroskopis dan mikroskopis. Gaya ortodontik merubah vaskularisasi PDL, menghasilkan sintesis lokal dari molekul-molekul penting seperti neurotransmitter, sitokin, faktor pertumbuhan, colony stimulating factor, dan metabolit asam arakhidonat. Molekul-molekul ini dapat memicu respons seluler oleh berbagai tipe sel di dalam dan sekitar gigi, menciptakan kondisi mikro yang cocok untuk resorpsi dan deposisi jaringan9,10 Pemberian tekanan pada gigi akibat piranti ortodontik mengakibatkan kenaikan kadar MMP-8 pada GCF. Pada penelitian pada GCF dari pemakai piranti ortodontik yang dianalisis dengan teknik IFMA (Immunofluorometric Assay) terbukti bahwa konsentrasi MMP-8 pada GCF meningkat 2-5 kali dibanding baseline setelah 4 jam dan meningkat 3-5 kali setelah 6 jam11.

10 Ingman dkk.1 meneliti kadar dan aktivitas MMP-1 dan -8 pada GCF dari 5 pemakai piranti ortodontik cekat yang diobservasi setiap hari selama satu bulan juga membuktikan adanya peningkatan rerata kadar MMP-8 sebesar 12 kali dibandingkan dengan kontrol. Teknik yang dipakai adalah IFMA dan Western Blot. Walaupun rerata kadar MMP-8 selama satu bulan mengalami peningkatan, tetapi konsentrasi tertinggi justru pada akhir minggu keempat. Mantyla dkk.12 dalam penelitiannya membuktikan bahwa adanya kenaikan kadar MMP-8 yang berasal dari PMN dan fibroblas pada pergerakan gigi secara translasi menunjukkan adanya proses remodeling periodontal. Pada penelitian kami, yang diteliti bukan kadarnya MMP-8 tetapi ekspresi gennya. Secara teoritis, peningkatan ekspresi gen akan meningkatkan kadar enzim yang disandi, begitu pula sebaliknya. Kenaikan ekspresi gen MMP-8 yang tajam pada minggu 1 (Grafik 1) kemungkinan karena finger spring baru diaktivasi. Sedangkan penurunan ekspresinyai kemungkinan disebabkan karena gaya dari finger spring yang untuk menggerakkan gigi kaninus ke distal berasal dari coil sebagai timbunan energi yang disalurkan melalui lengan klamer yang mana setelah diaktifkan, lama kelamaan akan kembali ke posisi semula. TIMP-1 merupakan protein yang dikode oleh familia gen TIMP yang menjadi inhibitor alami untuk matriks metaloproteinase (MMP), menginduksi proliferasi berbagai macam sel, dan mempunyai sifat anti-apoptosis. Transkripsi gen TIMP-1 sangat dipengaruhi oleh berbagai sitokin dan hormon.

10

11 Aktivitas dari MMP dikontrol oleh TIMP, memainkan peran yang sangat penting dalam remodeling fisiologis dari periodontium maupun dalam merespons terhadap gaya mekanik selama perawatan ortodontik13,14. Penghambatan dari MMP sintetik telah terbukti mengurangi pergerakan gigi ortodontik15,16 Uji coba pergerakan gigi ortodontik pada binatang (biasanya tikus), menunjukkan adanya peningkatan ekspresi MMP-1, -2, -8, -9, dan -13 dan TIMP-1 dan -3 pada PDL dan tulang alveolar17. Adanya kenaikan MMP dan TIMP menurut Bildt dkk.16 terjadi pada sisi resorpsi dan aposisi, tetapi menurut Garlet dkk.18, kenaikan TIMP-1 hanya terjadi pada sisi aposisi saja. Pada pemakai piranti lepasan, ekskpresi gen TIMP-1 sebelum diberi tekanan (baseline) sebesar 40,6% (Grafik 2). Dengan pemberian tekanan selama seminggu pertama menaikkan nilai TIMP-1 menjadi 59,4%. Kemudian menurun pada minggu ke 2, 3, dan 4. Hal ini sejalan dengan ekspresi MMP-8 yang juga mengalami kenaikan yang hampir sama. Kenaikan ekspresi gen TIMP-1 ini bisa jadi merupakan kompensasi untuk menekan kenaikan ekspresi gen MMP-8 yang juga naik. Keseimbangan yang tepat antara aktivitas TIMP dan MMP penting untuk integritas komponen ECM antara lain kolagen, vibronektin, laminin, elastin, dan proteoglikan
17

. TIMP-1 menghambat semua jenis MMP kecuali MMP-14. Telah

diyakini oleh beberapa peneliti bahwa TIMP berguna untuk membatasi resorpsi tulang / proses remodeling sehingga bisa membatasi translasi gigi secara ortodontik. Apabila kadar TIMP-1 di daerah resorpsi menurun, resorpsi tulang akan meningkat, Pada sisi aposisi, kadar TIMP-1 meningkat sehingga resorpsi akan menurun 16.

11

12 Pada jaringan periodontal yang sehat, kadar TIMP biasanya lebih tinggi dibanding jaringan periodontal yang mengalami inflamasi, yang mana kadar MMP melebihi kadar TIMP. Tetapi pada umumnya kadar MMP dan TIMP pada daerah aposisi dan resorpsi lebih tinggi dibanding dengan kontrol

KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian ini, dapat ditarik kesimpulan bahwa dinamika ekspresi gen MMP-8 dan TIMP-1 pada GCF pasien yang memakai piranti ortodontik lepasan mempunyai pola yang sama yaitu: sebelum piranti diaktivasi ekspresinya rendah, sesudah piranti diaktivasii mengalami kenaikan dimana puncak ekspresi tertinggi adalah pada akhir minggu pertama, kemudian menurun secara berturut-turut pada minggu 2, 3, dan 4. Tingkat ekspresi gen mulai kembali normal pada minggu kedua. Disarankan untuk penelitian lebih lanjut sebaiknya di dalam menganalisis ekspresi gen MMP-8 dan TIMP-1 dugunakan metode kuantitatif murni seperti Real Time PCR.

Daftar Pustaka 1. Ingman T, Apajalahti S, Mantyla P, Sorsa T. Matrix metalloproteinase-1 and -8 in gingival crevicular fluid during orthodontic tooth movement: a pilot study during 1 month of follow-up after fixed appliance activation. European J of Orthod 2005; 27: 202-7.

12

13 2. Nagase H, Visse R, Murphy G. Structure and function of matrix metalloproteinase and TIMP. Cardiovascular Research 2006; 69(3):562-7. 3. Isik F, Sayinsu K, Arun T, Unlucerci Y. Bone marker level in gingival crevicular fluid during orthodontic intrusive tooth movement: a preliminary study. J of Contemp Dent Pract 2005; 6 (2): 7-35. 4. De Quan Li, Tie Yan Shang, Hyun-Seung Kim, Solomon A, Stephen C. Regulated Expression of Collagenases MMP-1, -8, and-13 aStromelysins MMP-3, 10, and -11 by Human Corneal Epithelial Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci; 44: 292836. 5. Madianos PN, Bobetsis YA, Kinane DF. Generation of inflammatory stimuli: how bacteria set-up inflammatory responses in gingival. J Clin Periodontal 2005; 32:57-71. 6. Nedbal W, Tomakidi P, Lehmann MJ. Antisense mediated inhibition of ICAM-1 expression: a therapeutic strategy against inflammation of human periodontal tissue. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 2002; 12:71-8. 7. Rai B, Kharb S, Jain R, Anand SC. Biomarkers of periodontitis in oral health. J of Oral Sci 2008; 50(1): 53-6. 8. Pozo P, Melej C, Javier P, Martinez B. Longitudinal analysis of metalloproteinases, tissue inhibitors of metalloproteinases and clinical parameters in gingival crevicular fluid from periodontitis-affects patients. J of Period Res 2008; <http://hdl.handle.net/2250/2434> ( January 2009). 9. Bass NM. Measurement of the profile angle and the aesthetic analysis of the facial profile. J Orthod 2002; 70(30):546-50. 10. Domeij H. Expresiion and regulation 0f MMP-1 and MMP-3 in human gingival fibroblast. Thesis. Kongl Caroliska Medico Chirurgiska Institutet. 2005; 1-55. 11. Apajalahti, S, Sorsa T, Railavo S, Ingman T. The in vivo levels of matrix metalloproteinase-1 and -8 in gingival crevicular fluid during initial orthodontic tooth movement. J.Dent.Res 2003; 82:1018-22. 12. Mantyla P, Stenman M, Kinane DF, Tikanoja S. Sorsa T. Gingival crevicular fluid collagenase-2 (MMP-8) test stick for chair-side monitoring of periodontitis. J Periodontal Res 2003; 38(4):436-39.

13

14 13. Verstappen J, Von den Hoff JW. Tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMPs): their biological functions and involvement in oral disease. J of Dent Res 2006; 85:1074-84. 14. Ejeil A, Igondjo TS. Expression of MMPs and TIMPs in healthy and diseased human gingival. J of Periodontol. 2006. 74:188-95. 15. Holliday LS, Vakani A, Archer L. Effects of matrix metalloproteinase inhibitors on bone resorption and orthodontic tooth movement. J Dent Res 2003; 82:68791 16. Bildt MM, Bloemen M, Kuijpers-Jagtman AM. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitor of metalloproteinases in gingival crevicular fluid during orthodontic tooth movement. European J of Orthod 2009; 31:529-35. 17. Leonardi R, Talic NF, Loreto C. MMP-13 (collagenase 3) immunolocalisation during orthodontic tooth movement in rats. ActaHistochemica. 2007; 109:21520. 18. Garlet TP, Coelho U, Silva JS. Cytokine expresiion pattern in compression and tension sides of periodontal ligament during orthodontic tooth movement in humans. European J.of Oral Sci 2007; 115:355-62.

14