Anda di halaman 1dari 19

Laporan Praktikum Fisiologi Molekuler

Tanggal : 17 September 5 November 2012 Waktu : 11.00 wib s.d selesai PJP : Dr. Anja Meryandini Asisten : Bu Dewi

ISOLASI BAKTERI PENGHASIL ENZIM SELULASE

MUTI DIANDA SARI P051114021

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012

METODOLOGI

Waktu dan Tempat Praktikum ini telah dilaksanakan pada tanggal 17 September s/d 5 November 2012 di Laboratorium Bioteknologi Hewan jurusan Bioteknologi PAU Institut Pertanian Bogor. Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam praktikum ini antara lain tabung reaksi, ose, pembakar Bunsen, rak tabung reaksi, cawan petri, tisu, mikropipet, pipet tip, botol kaca, Erlenmeyer, oven, incubator, shaker water bath, sentrifuse, vortex mixer, laminar air flow, spektofotometer, kelereng, seal dan autoklaf. Sedangkan bahan yang digunakan dalam praktikum ini antara lain sampel tanah kering yang didapat dari depan perpustakaan IPB, aquades, CMC (Carboxymethyl Cellulose), media agar CMC, pereaksi Bradford, garam fisiologis 0,85%, pereaksi DNC (3,5-dinitrosalicilat acid), buffer fosfat pH 7, D-glukosa, congo red indicator 0,1%, NaCl 0,2%, alcohol 70%, dan spiritus. Langkah Kerja 1. Isolasi Bakteri dari Tanah Tanah ditimbang sebanyak 1 gram kemudian dihaluskan dengan mortar dan disuspensikan dengan larutan NaCl 10 ml 0,85%. Kemudian dilakukan pengenceran dengan larutan garam fisiologis hingga 10-7.

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 Pada pengenceran 10-4 10-5 10-6 10-7 masing-masing diambil sebanyak 1 ml dan disebar kedalam petri yang berisi media CMC (Carboxymethyl Cellulose) padat dengan batang penyebar/ose. Petri tersebut kemudian di seal dan di inkubasi pada suhu ruang selama 48 jam. Setelah 48 jam bakteri yang tumbuh pada media tersebut diidentifikasi dan diberi kode sesuai masing-masing kelompok. 2. Pembuatan Koloni Tunggal Bakteri yang tumbuh dibuat koloni tunggal dengan cara membuat kuadran dan diamati setelah 48 jam kemudian. Tahap yang dilakukan adalah dengan mengambil satu ose koloni bakteri dan digoreskan berurutan berdasarkan nomor yang telah ditentukan dari kuadran 1 hingga kuadran 4.

1 4 3 2

3. Pemurnian dan Peremajaan Hasil dari kuadran berupa bakteri tunggal yang tumbuh diseleksi kemudian ditanam kedalam tabung yang berisi media CMC agar miring dan diinkubasi selama 48 jam. Peremajaan perlu dilakukan untuk membuat stok bakteri dan agar bakteri dalam kondisi optimal ketika akan diproduksi enzim ekstra kasar. Peremajaan bakteri dilakukan sebelum enzim ekstrak kasar akan diproduksi.

4. Uji Selulolitik Masing-masing dari isolat bakteri diinokulasikan pada media CMC agar miring. Masing-masing bakteri dititikkan pada permukaan media, kemudian diinkubasi selama 72 jam. Koloni yang telah tumbuh kemudian diukur ukuran koloni

bakterinya lalu ditetesi indikator congo red 0.1 % dan didiamkan selama 15 menit, kemudian dibilas menggunakan NaCl 0,2 % sebanyak tiga kali. Zona bening yang terbentuk di sekitar koloni bakteri mengindikasikan adanya aktivitas enzim selulase. Kemudian indeks selulolitiknya diukur dengan cara

membandingkan antara diameter koloni dan diameter zona bening yang terbentuk. Kemudian dipilih 7 bakteri dengan nilai index potensial tertinggi, 7 bakteri selulolitik ini selanjutnya yang akan digunakan untuk produksi enzim selulase.

Indeks selulolitik = diameter zona bening diameter koloni

5. Pembuatan Kurva Standar Glukosa Larutan gula standart yang digunakan adalah deret glukosa dengan konsentrasi 0 mg/mL, 0,05 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,15 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,25 mg/mL, dan 0,3 mg/mL. Untuk membuat deret glukosa maka dibuat terlebih dahulu stok glukosa sebesar 1 mg dalam aquades 1 mL dengan konsentrasi 1 mg/mL. Stok gukosa diambil 0 mL (0 mg/mL), 0,1 mL (0,05 mg/mL), 0,2 mL (0,1 mg/mL), 0,3 mL (0,15 mg/mL), 0,4 mL (0,2 mg/mL), 0,5 mL (0,25 mg/mL ) dan 0,6 mL (0,3 mg/mL) dan masing-masing larutan ditambahkan aquades hingga 2 ml. Setelah deret glukosa

tersebut jadi, langkah berikutnya ditambahkan 2 mL pereaksi DNS dan divortex hingga homogen, kemudian dipanaskan pada suhu 100oC selama 15 menit. Selanjutnya didinginkan dengan merendamnya kedalam air dingin. Pengukuran absorbansi dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm.

6. Peremajaan Isolat Terseleksi Isolat bakteri terpilih yang memiliki indeks potensial selulose tertinggi yang telah diremajakan sebelumnya di pindahkan ke media padat CMC yang digoreskan secara penuh ke cawan petri kecil di dalam laminar. Inkubasi 24 jam. Setelah itu di pindahkan ke media CMC cair 20 ml dengan mengambil 3-6 cock borer dari media padat CMC yang telah tumbuh.

7. Produksi Enzim Selulase Isolat yang telah ditanam ke media cair CMC 20 ml di inokulasikan ke media cair CMC 100 ml dan kemudian di uji aktivitasnya setiap hari selama 8 hari. Isolat bakteri dimasukkan ke dalam 100 ml media cair CMC dan diinkubasi pada water bath shaker selama 8x24 jam pada suhu 25oC . Setiap hari, media inokulum diambil dan disentrifuge selama 20 menit dengan kecepatan 280 rpm untuk memisahkan sel dengan ekstrak kasar enzim. 1 ml Ekstrak kasar enzim dimasukan kedalam ependrof untuk ukur kadar protein pada hari ke 8, dan sisa supernatant dimasukan kedalan tabung reaksi siap diukur aktivitas enzim selulase untuk setiap harinya 8 tabung reaksi.

8. Penentuan Aktivitas Enzim Selulase Substrat 1% CMC dimasukkan ke dalam 9 tabung reaksi masing-masing sebanyak 0,5 mL. Ekstrak kasar enzim dimasukkan ke dalam 3 tabung reaksi yang berisi 1% CMC dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37oC. Setelah diinkubasi, sampel, kontrol dan blanko didinginkan ke dalam air dingin selanjutnya diukur

absorbansinya

dengan

menggunakan

spektrofotometer

pada

panjang

gelombang 540 nm. Absorbansi yang diperoleh digunakan untuk menentukan kadar glukosa dengan rumus persamaan regresi linear yang diperoleh dari kurva standar glukosa. Satu unit dari aktivitas selulase didefinisikan sebagai jumlah dari enzim yang melepaskan satu mol glukosa dalam satu menit pada kondisi pengujian. Aktivitas selulase (mol/ menit) = kadar glukosa x Fp x 1000 BM Glukosa x t Keterangan : Fp = Faktor Pengenceran

BM (Berat Molekul) Glukosa = 180 T = Lamanya waktu inkubasi (60 menit)

9. Pengukuran Kadar Protein Enzim Pengukuran kadar protein enzim dilakukan untuk mengetahui aktivitas spesifik enzim selulase. Analisis protein enzim dilakukan dengan metode Bradford (1976) dengan menggunakan standar Bovine Serum Albumine (BSA). Untuk pengukuran sampel, enzim ekstrak kasar dimasukkan ke dalam tabung sebanyak 0,2 ml dan pereaksi Bradford sebanyak 2 ml kemudian di vortex dan diinkubasi selama 5 menit pada suhu 25oC. Selanjutnya diukur absorbansi dengan menggunakan spektofotometer pada panjang gelombang 595 nm. Sedangkan untuk blanko 0,2 ml H2O steril ditambah dengan 2 ml Bradford kemudian divortex, diinkubasi selama 5 menit pada suhu 25oC dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 595 nm.

10. Pembuatan Kurva Standar Protein Pembuatan kurva standar protein menggunakan metode Bradford (1976). Digunakan konsentrasi 0 mg/mL, 0,02 mg/mL, 0,04 mg/mL, 0,06 mg/mL, 0,08

mg/mL, dan 0,1 mg/ml. Masing-masing larutan diambil sebanyak 5 ml dan ditambahkan 0,01 gr pereaksi Bradford Divortex hingga homogen, kemudian diinkubasi pada suhu 25oC selama 15 menit. Selanjutnya dilakukan pengukuran absorbansi dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm.

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

Selulolitik merupakan aktivitas bakteri dalam perombakan selulosa dengan bantuan enzim selulase. Enzim selulolitik dibentuk oleh sebagian besar mikroorganisme. Selulosa merupakan senyawa paling melimpah di dunia dan merupakan sumber daya alam terbarukan sehingga menjadikannya sebagai bahan mentah potensial sebagai makanan, bahan bakar, dan senyawa kimia. Beragam bakteri, actinomycetes dan fungi filamentous dapat memproduksi selulase ekstraselular ketika ditumbuhkan pada substrat mengandung selulosa. Komponen dari sistem selulase pertama diklasifikasikan berdasarkan pada model aksi katalitiknya dan saat sekarang diklasifikasikan berdasarkan sifat strukturalnya. Tiga tipe utama dari aktivitas enzimatik yang ditemukan; (1) Endoglucanase atau 1,4-B-D-glucanase, termasuk 1,4-B-D-glucan-4-glucano-hydrolase (EC 3.2.1.4), (2) exoglucanase, termasuk 1,4-B-D-glucan glucanohydrolase (juga dikenal sebagai cellodextrinase) (EC 3.2.1.74) dan 1,4-B-D-glucan cellobiohydrolase)

(cellobiohydrolase) (EC 3.2.1.91), dan (3) B-glucosidase atau B-glucosida glucohydrolase (EC. 3.2.1.21) (Saadah, 2010). Enzim selulase yang dihasilkan pada praktikum ini diisolasi dari bakteri tanah. Tanah yang digunakan berasal dari tanah yang diambil dari daerah depan perpustakaan IPB. Tanah tersebut ditimbang sebanyak 1 gram dimasukkan ke dalam larutan fisiologis 0,85% (NaCl), dihomogenkan kemudian dilakukan pengenceran hingga 10-7. Fungsi garam fisiologis disini adalah untuk menjaga tonisitas sel dan juga berfungsi sebagai pemurnian yang artinya hanya mikroorganisme yang mampu hidup pada konsentrasi garam sebesar 0,85%. Tujuan pengenceran hingga 10-7 yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Pada tahap isolasi digunakan CMC sebagai media seleksi pertumbuhan mikroorganisme yang mempunyai kemampuan selulolitik. CMC merupakan eter polimer selulosa linear dan berupa senyawa anion yang memiliki sifat higrokopis dan biodegradable, mudah larut dalam air

dan membentuk larutan koloid. Dalam praktikum ini, semua isolat ditumbuhkan pada media CMC padat yang mengandung CMC 1% (b/v) yang berfungsi sebagai komponen induser enzim selulase serta glukosa 0,1% (b/v) dan yeast ekstrak 0,2% (b/v) sebagai komponen pemacu tumbuh sel di fase awal. Setelah glukosa pada medium tumbuhnya habis maka bakteri akan mensintesis enzim selulase. memanfaatkan sumber karbon dari selulosa dengan

Tabel 1. Indeks Selulolitik


Kelompok 1 2 4 6t 6y Bakteri (x) 0,95 0,65 0,95 0,4 Bakteri + Zona Bening (y) 1,4 0,45 NIP = 0,47 0,13

Pengujian kualitatif berdasarkan zona bening berfungsi untuk mendeteksi bisa atau tidaknya bakteri yang diisolasi menghasilkan enzim selulase. Indikasinya adalah jika pada koloni bakteri terbentuk zona bening artinya bakteari tersebut mampu menguraikan selulosa menjadi glukosa dengan bantuan enzim selulase. Pada tabel diatas hanya pada nomor 2 dan 6y yang memiliki nilai indeks potensial selulolitik yaitu 0,47 dan 0,13. Tetapi karena pada kelompok 1 bakteri yang dihasilkan masih dianggap kurang potensial maka kelompok ini menggunakan bakteri dari kelompok 2 dengan kode 2.3. Nilai indeks potensial bakteri diperoleh dari nisbah antara diameter zona jernih dengan diameter koloni. Congo red yang digunakan pada uji selulolitik akan mengikat pada ikatan 1,4- glikosida di dalam selulosa sehingga menimbulkan warna merah, sedangkan warna bening yang timbul disekitar koloni bakteri mengindikasikan bahwa selulosa sudah terurai menjadi monosakaridanya. Karena ikatan 1,4- glikosidanya sudah dilepaskan oleh enzim selulase yang dihasilkan bekteri tersebut maka congo red tidak dapat mengikat glukosa, darisinilah terbentuk zona bening.

Berdasarkan nilai indeks potensial yang tertinggi maka bakteri tersebut digunakan untuk melakukan uji aktivitas enzim selulase selanjutnya. Pengukuran aktivitas enzim dilakukan dengan assay enzim selulase setiap hari selama 8 hari untuk mengetahui aktivitas optimum dan waktu terbaik dalam produksi enzim selulasenya. Uji aktivitas enzim selulase dilakukan berdasarkan kadar glukosa. Kadar glukosa diukur dengan menggunakan metode DNS. Fungsi pemberian DNS yaitu sebagai pewarnaan untuk menentukan panjang gelombang serta untuk mengoksidasi glukosa yang terbentuk. Pada penentuan kadar glukosa juga digunakan blanko, larutan blanko ini digunakan sebagai kalibrasi sebagai larutan pembanding dalam analisis fotometri. Menurut Lesmana (2011), larutan blanko dibagi menjadi 3 jenis yaitu Kalibrasi blanko dimana larutan yang digunakan untuk membuat titik nol konsentrasi dari grafik kalibrasi, larutan ini hanya berisi pengencer yang digunakan untuk membuat larutan sendiri; kemudian, reagen blanko yaitu larutan yang berisi reagen yang digunakan untuk melarutkan sampel, pembacaan absorbansi untuk larutan ini biasanya dikurangi dari pembacaan sampel; Metode blanko yaitu larutan yang diperlakukan sama dengan sample ditambah dengan reagen yang sama, mengalami kontak dengan alat yang sama dan diperlakukan dengn prosedur yang sama.

Tabel 2. Aktivitas Harian Selulase, Kadar protein dan Aktivitas Spesifik Isolat Bakteri Selulolitik K1 Kode Isolat K1 Waktu Produksi (24 jam) 1 2 3 4 5 6 Aktivitas Selulase (nkat)
-0.0042853 0.01485581 -0.0117132 0.00342826 -0.0108562 0.00599946

Protein (mg/mL) 0.253 0.267 0.274 0.236 0.244 0.240

Aktivitas Spesifik (nkat/mg)


-0.01694 0.05564 -0.04275 0.014527 -0.04449 0.024998

7 8

-0.0017141 0.00228551

0.251 0.251

-0.00683 0.009106

Berdasarkan dari tabel diatas menunjukkan bahwa aktivitas enzim selulosa yang dimiliki isolat bakteri seluloloitik K1 berbeda-beda setiap waktu inkubasi selama 8 hari. Untuk lebih jelasnya aktivitas selulase harian dapat dilihat pada grafik dibawah ini :

Grafik Aktivitas Selulase Harian


0.001 0.0008 Aktivitas Selulase (nkat) 0.0006 0.0004 0.0002 0 -0.0002 0 -0.0004 -0.0006 -0.0008 3, -0,01171320 Hari Ke2 1, -0,00428530 4 6 6, 0,00599946 4, 0,00342826 8, 0,0228551 7, -0,00171410 10 8
y = 2E-06x - 2E-05 R = 9E-05

2, 0,01485581

5, -0.01085620

Grafik Aktivitas Enzim Selulase Isolat Bakteri Selulolitik K1 yang Diuji pada Substrat CMC Suhu 25oC, pH 7.

Berdasarkan grafik aktivitas selulase harian diatas puncak aktivitas dan waktu yang optimum untuk produksi enzim selulase isolate K1 adalah pada hari ke-2 dengan aktivitas 0,01485581 nkat. Pada hari ke-3, aktivitas selulase menurun hingga -0,0 1171320 nkat dan kemudian meningkat lagi pada hari ke-4 0,00342826 nkat. Namun setelah hari ke-5 aktivitas selulase mengalami penurunan menjadi -0,01085620 nkat, tetapi aktivitas selulase tersebut naik pada hari ke-6 0,00599946 nkat, mengalami penurunan kembali pada hari ke-7 menjadi -0,00171410 nkat dan naik pada hari ke-8 menjadi 0,0228551 nkat. Nilai aktivitas enzim berkaitan dengan proses pendegradasian

substrat sebagai nutrisi bagi mikrofungi. Setiap mikrofungi memiliki kemampuan yang berbeda dalam mendekomposisi substrat. Jika mikrofungi menempel pada substrat, maka mikrofungi tersebut akan mengeluarkan enzim spesifik (Moore-landecker, 1996). Nilai yang negative mengindikasikan bahwa tidak adanya aktivitas enzim tersebut. Hal tersebut juga dapat disebabkan oleh faktor-faktor seperti aktivitasnya terlalu kecil dan sensitivitas alat kurang tinggi sehingga aktivitasnya tidak terbaca. Aktivitas enzim selulase yang meningkat berkaitan dengan fase pertumbuhan sebelumnya. Bakteri tersebut mengalami fase pertumbuhan dimana bakteri tersebut memanfaatkan substrat yang tersedia sebagai media pertumbuhannya. Substrat yang digunakan sebagai media pertumbuhan bakteri adalah CMC (Carboximethyl Cellulose). Bakteri tersebut dapat memecah selulosa menjadi glukosa didalam substrat dengan bantuan enzim selulase. Pada fase logaritmik terjadi aktivitas enzim optimum dimana bakteri dapat membelah dengan cepat dan konstan. Hal ini juga dipengaruhi pH, suhu, kelembaban udara, kandungan nutrient dan juga kondisi lingkungannya. Pembelahan tersebut dapat berlangsung terus hingga hasil metabolisme menghasilkan racun dan menyebabkan pertumbuhannya melambat, kemudian masuk ke fase statis. Fase statis adalah jumlah sel yang tumbuh sama dengan jumlah sel yang mati. Setelah fase statis maka akan masuk ke fase eksponensial yaitu fase kematian.

Selain menentukan aktivitas enzim selulase, kadar protein yang terkandung dalam isolate juga perlu untuk diukur dan diketahui karena enzim merupakan protein yang perlu diketahui berapa besar protein terlarutnya. Pengukuran kadar protein menggunakan metode Bradford dimana didasarkan pada pengikatan secara langsung zat warna Coomassine Brilliant Blue G250 (CBBG) oleh protein yang memiliki residu asam amino dengan rantai samping aromatik (Tyrosine, Tryptophan dan Phenylalanine) atau yang bersifat basa (Arginine, Histidine dan Leucine). Reagen CBBG bebas berwarna merah kecoklatan dengan panjang gelombang maksimal 465 nm. Suasana asam reagen CBBG berada dalam bentuk anion yang mengikat protein yang membentuk warna biru dengan panjang gelombang maksimal 595 nm. Jumlah CBBG yang terikat pada protein

proposional dengan muatan positif yang ditemukan pada protein (Azhari dkk, 2010). Protein yang terlarut dalam media produksi perlu diukur untuk mengetahui jumlah protein enzim yang disintesis oleh mikroba dan untuk menghitung aktivitas spesifik enzim. Namun protein terlarut yang terukur tidak mutlak mencerminkan bahwa yang terukur semuanya enzim yang disintesis oleh mikroorganisme, karena di dalam media juga mengandung protein terlarut berupa sisa media (yeast ekstrak) atau hasil metabolisme protein mikroorganisme yang disekresikan. Selain itu tidak semua protein enzim adalah kelompok dari selulase. Untuk lebih jelasnya kadar protein yang terkandung dalam isolate tersebut dapat dilihat pada grafik dibawah ini :

Grafik Kadar Protein


0.28 0.275 0.27 0.265 0.26 0.255 0.25 0.245 0.24 0.235 0.23 0 3, 0.274 2, 0.267 7, 0.251 5, 0.244 4, 0.236 2 4 Hari Ke6 6, 0.24 8 10 8, 0.251 Kadar Protein (mg/ml)
y = -0.002x + 0.262 R = 0.178

1, 0.253

Grafik Protein Terlarut dalam Enzim Ekstrak Kasar Isolat Bakteri Selulolitik K1

Beradasarkan grafik diatas yang menunjukan hasil analisis protein terlarut diperoleh bahwa mulai dari produksi enzim ekstrak kasar isolate bakteri selulolitik terjadi peningkatan dan penurunan dari hari pertama hingga hari ke delapan. Aktivitas optimum kadar protein yang dihasilkan terjadi pada hari ketiga dengan jumlah hingga 0,274 mg/ml. Tetapi, pada hari keempat terjadi penurunan menjadi 0,236 mg/ml yang juga merupakan produksi protein terlarut yang terendah pada aktivitas kadar protein

ini, dan terjadi peningkatan dan penurunan hingga hari ketujuh dan stagnan hingga hari kedelapan. Analisis kadar protein ini dilakukan untuk mengetahui konsentrasi protein terlarut pada enzim ekstrak kasar sehingga aktivitas enzim spesifik dari enzim selulosa terhadap kadar protein terlarut dapat diketahui, sehingga besarnya aktivitas enzim dalam protein pun dapat diketahui. Protein merupakan zat makanan yang sangat penting bagi tubuh karena zat ini selain berfungsi sebagai bahan bakar dalam tubuh juga berfungsi sebagai zat pembangun dan pengatur. Fungsi utama protein bagi tubuh ialah untuk membentuk jaringan baru dan mempertahankan jaringan yang telah ada (Winarno, 1997). Analisis kadar protein pada praktikum ini menggunakan metode Bradford yang menggunakan standard Bovine Serum Albumine (BSA). Albumin sendiri merupakan salah satu jenis protein globuler yang larut dalam air dan terkogulasi oleh panas (Winarno, 1989). Fungsi dari larutan BSA sendiri adalah untuk mengetahui kadar protein. Larutan blanko yang dibuat berfungsi sebagai kalibrasi angka dari hasil pengukuran oleh spektofotometer dengan panjang gelombang tertentu (OD terpilih). Untuk memperjelas dan mengetahui hubungan antara konsentrasi BSA dan absorbannya maka dibuatlah kurva standard (Sudarmadji, 1996).

Kurva Standar BSA


0.3 0.25 Absorbansi 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 Konsentrasi (mg/ml) y = 2.4021x + 0.0246 R = 0.9554

Grafik Kurva Standar hubungan antara Konsentrasi BSA dan absorbannya.

Gambar dibawah ini menunjukkan aktivitas enzim selulase dari isolate bakteri selulolitik terhadap waktu produksi yang menunjukkan pola kuadratik dengan persamaan y = 2E-0,5x-0,000 dengan R2 = 4E-0,5.

Aktivitas Spesisik Enzim


0.08 0.06 Aktivitas Spesifik (nkat/mg) 0.04 0.02 0 0 -0.02 -0.04 -0.06 Hari Ke1 2 1, -0.01694 3 4 5 6 6, 0.024998 4, 0.014527 8, 0.009106 7 7, -0.00683 8 9 2, 0.05564

y = 0.000x - 0.001 R = 0.000

3, -0.04275

5, -0.04449

Grafik Aktivitas Enzim Spesifik Selulase Isolat Bakteri Selulolitik

Berdasarkan grafik diatas puncak aktivitas spesifik terjadi pada hari kedua dengan jumlah 0,05564 nkat/mg dan aktivitas terendah terjadi pada hari ketiga sebesar -0,04275 nkat/mg. Pada grafik tersebut dapat dilihat bahwa lamanya waktu fermentasi dapat mempengaruhi aktivitas enzim spesifik yaitu memiliki kecendrungan meningkat dan menurun pada hari-hari tertentu. Menurut Hans (2011), aktivitas spesifik memberikan pengukuran aktivitas enzim yang merupakan jumlah waktu tertentu dalam kondisi tertentu per milligram total protein. Aktivitas tertentu adalah sama dengan laju reaksi dikalikan dengan volume reaksi dibagi dengan massa total protein.

DAFTAR PUSTAKA Azhari, A. Mentaya, I. dan Gayang, F. 2010. Penentuan Kadar Protein dengan Metode Bradford. Laporan praktikum. IPB. Bogor.

Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of icrogram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254. Hans, Otto. 2011. Assays Enzim. http://hansottopratamayohan.blogspot.com/2011/08/asayz-enzim.html?m=1 Lesmana, Indra. 2011. FUNGSI LARUTAN BLANKO. http://indralesman.blogspot.com/2011/03/fungsi-larutan-blanko.html?m=1 Moore-Landecker, E. 1996. Fundamentals of the Fungi. Prentice Hall. Upper Saddle River. New Jersey. 574 pp. Saadah, Z. Ika,N. dan Abdullah. 2010. Produksi Enzim Selulase oleh Aspergillus niger Menggunakan Substrat Jerami dengan Sistem Fermentasi Padat. http://eprints.undip.ac.id/13064/1/BAB_I_-_V.pdf Sudarmadji, S., Bambang Haryono dan Suhadi. 1996. Analisa Bahan Makan dan Pertanian. Liberty. Yogyakarta. Winarno. 1989. Kimia Pangan dan Gizi. Cetakan keempat. PT. Gramedia. Jakarta Winarno. 1997. Kimia Pangan dan Gizi. Cetakan kedelapan. PT. Gramdia. Jakarta

LAMPIRAN Pembuatan larutan yang digunakan : 1. Larutan pereaksi DNS Pembuatan larutan pereaksi DNS dilakukan dengan cara melarutkan 10 gr NaOH, 182 gr KNa-Tartat, 10 gr DNS, dan 10 gr Na2SO3 kedalam 1000 mL aquades. Simpan dalam botol yang berwarna gelap (Miller, 1959).

2. Larutan pereaksi Bradford Pembuatan larutan pereaksi bradford dilakukan dengan cara melarutkan 0,05 g Commassie Briant Blue G-250, 25 mL Etanol 95% (v/v), 50 mL Asam Phospor 85% (v/v) ke dalam 500 mL aquades. Campuran dihomogenkan lalu disaring dengan kertas saring dan disimpan dalam botol yang berwarna gelap dengan suhu 4oC (Miller, 1959).

3. Substrat 1 %CMC Pembuatan substrat dilakukan dengan cara 1 gram CMC dilarutkan kedalam 100 mL buffer phospat pH 7. Kemudian diaduk dan dipanaskan dengan menggunakan magnetic stirrer hingga homogen. 4. Garam fisiologis Garam fisiologis dibuat dengan cara melarutkan 0,85 gram NaCl ke dalam 100 mL aquades. 5. 0,1 % Congo red Pembuatan congo red dilakukan dengan cara 0,1 gram congo red dilarutkan ke dalam 100 mL etanol 96%.

6. 2% NaCl Garam fisiologis dibuat dengan cara melarutkan 2 gram NaCl ke dalam 100 mL aquades.

7. Kurva Standar Glukosa Pengukuran kadar glukosa dalam berbagai konsentrasi

Konsentrasi (mg/ml) 0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300

OD 1 0.116 0.163 0.293 0.437 0.578 0.746 0.895

OD 2 0.117 0.161 0.295 0.439 0.578 0.745 0.892

Rata2 0.117 0.162 0.294 0.438 0.578 0.746 0.894

OD Terkoreksi 0.000 0.046 0.178 0.322 0.462 0.629 0.777

Grafik Standar Glukosa


0.900 0.800 0.700 0.600 0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 0.000 -0.100 -0.200

Absorbansi

y = 2.7014x - 0.0606 R = 0.9858

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

0.300

0.350

Konsentrasi (mg/ml)

Grafik Standar Glukosa

8. Kurva Standar BSA Absorbansi Protein Pada Berbagai Konsentrasi

Konsentrasi (mg/ml) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 OD 1 0.311 0.394 0.491 0.496 0.483 0.52 OD 2 0.306 0.398 0.479 0.513 0.475 0.541 Rata-rata 0.3085 0.396 0.485 0.5045 0.479 0.5305

OD Terkoreksi 0 0.0875 0.1765 0.196 0.1705 0.222

Grafik Standar BSA


0.3 0.25 Absorbansi 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 0.02 0.04 0.06 Konsentrasi (mg/ml) 0.08 0.1 0.12 y = 2.4021x + 0.0246 R = 0.9554

Grafik Standar BSA