Anda di halaman 1dari 21

L/O/G/O

TEKNIK BIOLOGI MOLEKULER EKSPRESI KLONING DAN ALEL SPESIFIK OLIGONUKLEOTIDA

Oleh : KELOMPOK 5 1. 2. 3. 4. 5. Annisa Fajriani Fitria Febrianti Muti Dianda Sari Rike Tri Kumala Dewi Ruqayyah Jamaludin

Pendahuluan
Biologi Molekuler

Interaksi berbagai sistem dalam sel, termasuk interaksi DNA, RNA, dan sintesis protein

Next
Perkembangan analisis DNA molekuler dan genetik dalam bidang medis

1 2 3 4

Mendiagnosis Penyakit Mendeteksi Patogen Konseling Genetik Terapi Gen

Next
Strategi dan Teknik Analisis Molekuler
Kloning Ekspresi

Hibridisasi Asam Nukleat


Amplifikasi DNA dengan PCR

KLONING EKSPRESI
Mempelajari fungsi protein
1

Isolasi DNA target


2

Penyisipan DNA target ke dalam vektor rekombinan


3
Introduksi vektor rekombinan yang membawa sisipan ke dalam sel inang

Tahap Pengklonan

Contoh Studi Kasus Kloning Ekspresi


Konversi androgen ke esterogen oleh enzim sitokrom P-450 aromatase (P-450arom)
Dalam jurnal

Cloning and Tissue Spesific Expression of Cytochrome P-450 Aromatase CDNA in Japanese Eel (Anguilla japonica)

Metode
Ovary ikan mature & Bagian otak ikan betina immature Dilakukan kloning & subkloning, identifikasi dengan seleksi biru putih Cek ukuran insert klon, sequencing rekombinan yang terbentuk Isolasi fragmen cDNA P-450arom

Ekstraksi, Screening & Purifikasi RNA total

Amplifikasi cDNA dengan PCR 3 primer yang digunakan oligonukleotida :

Analisis sekuen dan RT-PCR

1. 5-GG(A/T)AT(C/T)GG(C/G)AC(A/T)GC(C/G)AGTAA-3 2. 5-CTGTGGATGGGGATCGGC(A/T)-3 3. 5-TCATCATCACCATGGCGATG-3

Next
Hasil penelitian menunjukkan

Eel P-450arom mRNA dominan berada di jaringan otak dan Pituary. Berdasarkan hasil tersebut dapat dikatakan bahwa ekspresi kloning dapat dilakukan untuk mengidentifikasi apakah fragmen cDNA yang ingin diketahui ekspresinya berada pada jaringan yang sedang diidentifikasi atau tidak.

HIBRIDISASI ASAM NUKLEAT


Tahapan dalam analisis DNA rekombian yang memanfaatkan komplementer interaksi asam nukleat yang sedemikian penting untuk sintetis DNA dan Ra

Pemakaian oligonuleotida spesifik alel Menggunakan DNA/ RNA probe radioaktif

Next
Oligonukleotida Spesifik Alel (ASO)

Salah satu variasi dalam teknik hibridisasi asam nukleat


Southern Blotting

Southern Blotting
Edward M. Southern

Proses perpindahan fragmen DNA yang terpisah secara elektroforesis dari gel ke membran.
Prinsip kapilaritas, dimana bufer yang merupakan fase gerak akan membawa fragmen DNA dari gel ke membran. Karena muatan DNA negatif sedangkan muatan membran positif maka fragmen DNA akan menempel (blot) pada membran. Membran yang digunakan membran nitroselulosa.

Contoh Studi Kasus dengan menggunakan Alel Spesifik Oligonukleotida (ASO)


Silsilah disamping merupakan silsilah parental penderita Cystic Fibrosis Allele yang terjadi karena ada delesi pada 3 basa nukleotida (AGA) alel urutan 508.

Next
Sesuai Hukum Mendel ada segregasi diantara gen-gen tersebut sehingga memunculkan sifat yang bervariasi
Genotipe homozigot dominan Genotipe homozigot resesif Genotipe heterozigot

Next
Dalam kasus Cystic Fibrosis tersebut 1. genotipe homozigot dominan memunculkan fenotipe normal, 2. genotipe homozigot resesif memunculkan fenotipe Cystic Fibrosis, 3. genotipe heterozigot memunculkan fenotipe normal namun membawa gen Cystic Fibrosis (carier)

Next
Dalam silsilah tersebut, sepasang parental memiliki tiga keturunan, 2 diantaranya normal dan 1 diantaranya mengalami cystic fibrosis. Untuk mengidentifikasi apakah kedua anak tersebut membawa gen cystric fibrosis (carrier), maka dilakukan analisis menggunakan southern blot dengan ASO sebagai probenya.

1. Genom DNA utuh 2. Digesti DNA dengan enzim retriksi enzim endonuklease 3. Elektroforesis dengan Gel Agarose 4. Transfer dari gel ke membran nitroselulase 5. Hibridisasi dengan probe ASO radioaktif autoradiogram membran

Metode Southern Blot menggunakan Membran Nitroselulosa

Hasil analisis

Ket : = Menderita Cystic Fibrosis

Didapatkan hasil bahwa kedua parental genotipnya heterozigot, dilihat pada kedua kromosom baik yang normal maupun yang delesi berpendar. Satu anak mengalami CF, dilihat pada kromosom yang mengalami delesi berpendar.Satu anak normal homozigot, dilihat pada kromosom normal berpendar sedangkan kromosom delesi tidak berpendar.Satu anak normal heterozigot, dilihat pada kedua kromosom baik normal ataupun yang terdelesi berpendar.

L/O/G/O

Thank You!
www.themegallery.com