Luciana Silva Ribeiro, 2011.

PREPARO DE MEIOS E REAGENTES

GAR BAIRD PARKER (BP) Aplicao: Meio seletivo/diferencial para isolamento e contagem de S. aureus. Composio da base Triptona (peptona de casena e digesto pancretica) Extrato de carne Extrato de levedura Piruvato de sdio Glicina Cloreto de ltio gar gua destilada pH 7,0+-0,2 - 121C/15min Suplementos Soluo aquosa de telurito de potssio 1% Emulso gema de ovo:salina (1:1 p/p) 10ml/940ml base 50ml/940ml base

10g 5g 1g 10g 12g 5g 20g 940ml

Preparao Preparar a base, esterilizar, resfriar a 45-50C, adicionar assepticamente os suplementos estreis previamente preparados. Plaquear imediatamente, o meio complemento no pode reaquecido. Estocar a placas sob refrigerao por no mais de 48h. Soluo aquosa de telurito de potssio 1%: dissolver 1g de telurito de potssio em 100ml de gua destilada, esterilizar por filtrao e estocar em frasco escuro, sob refrigerao. Emulso de gema de ovo: mergulhar os ovos em etanol 70% por 10 min, flambar, abrir assepticamente e transferir as gemas para um frasco estril tarado. Adicionar s gemas uma quantidade de soluo salina 0,85% estril, suficiente para diluio 1:1 (peso/peso). Misturar o contedo por agitao ou com auxlio de baguetas estrieis, at obter uma suspenso homognea. O meio adicionado de gema de ovo (evidenciar a produo de lecitinase), telurito de potssio e cloreto de ltio (inibir a flora acompanhante). Piruvato de sdio e a glicina atuam favorecendo seletivamente o crescimento da flora acompanhante. Colnias tpicas: so negras (devido a reduo do telurito de potssio a telureto), circulares, pequenas, lisas, convexas, com bordas perfeitas, rodeadas por uma zona opaca e/ou um halo transparente (ao da lecitinase).

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

Fig 01. Colnias tpicas de S. aureus

Colnias atpicas: caractersticas de outros microrganismos so negras, lustruosas, de forma irregular sem halo opaco ou transparente. (podem ser colnias de S. epidermidis). Colnias pequenas, negras e sem halo de clarificao so caractersticas de Micrococos. Leveduras e Bacillus, eventualmente podem crescer neste meio, porm as colnias so pardo-escuras e brancas, respectivamente.

Fig 02. Colnias atpicas de S. aureus

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

GAR BATATA DEXTROSE ACIDIFICADO (PDA ACIDIFICADO) Aplicao: Meio seletivo para isolamento de bolores e leveduras. Composio Amido de batata ou infuso de 200g de batatas Dextrose gar gua destilada 121C/15min

4g 20g 15g 1L

Preparao Preparar o meio e esterilizar a 121C/ 15min. No momento do uso, fundir o Agar, resfriar a 45-50C e adicionar uma quantidade suficiente de soluo aquosa de cido tartrico 10% estril, para obter pH final de 3,5. Geralmente, a adio de 1ml de soluo de cido tartrico para cada 100ml de meio suficiente para obter o pH requerido. O meio acidificado deve ser utilizado imediatamente, no podendo ser reaquecido. Soluo de cido tartrico 10%: dissolver 10g de cido em gua destilada e completar o volume para 100ml. Esterilizar por filtrao. O crescimento de bolores possui aspecto cotonoso em funo da presena do agrupamento de hifas que forma um miclio. Podem apresentar colnias com diversas coloraes.

Fig 03. Crescimento de bolores

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

As leveduras apresentam colnias mucides, de coloraes diferentes.

Fig 04. Colnias de Leveduras

Na contagem de bolores e leveduras em alimentos, o resultado deve ser expresso em unidades formadoras de colnias (UFC) por grama ou mililitro de amostra de bolores e leveduras, e no, contando separadamente os bolores e as leveduras, pois, sua confirmao s possvel, quando se procede a microscopia. As placas devem ser incubadas a 25C por 3 a 5 dias.

GAR BISMUTO SULFITO (BS) Aplicao: Meio seletivo diferencial para deteco presuntiva de Salmonella. Composio Peptona Extrato de carne Dextrose Fosfato dissdico (NaHPO4) Sulfito de Bismuto Sulfato ferroso Verde Brilhante (2,5ml da soluo aquosa 1%) gar gua destilada pH 7,7+-0,2

10g 5g 5g 4g 8g 0,3g 0,025g 20g 1L

Preparao Dissolver os ingredientes e aquecer em banho-maria apenas o tempo necessrio para a completa fuso do gar. No autoclavar. Distribuir em placas imediatamente, agitando continuamente para suspender o precipitado que normalmente permanece aps o aquecimento.

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

Obs.: os fabricantes recomendam que as placas de BS sejam preparadas no dia de uso, porm, diversos estudos tm demonstrado que o meio recm preparado txico para vrias cepas de Salmonella.

Fig 05. Agar Bismuto Sulfito Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Sistema inibidor: ao combinada do precipitado de bismuto-sulfito com soluo de sulfito de sdio e o verde brilhante. Sistema indicador: fosfato cido dissdico e sulfato ferroso.

Fig 06. gar BS crescimento de Salmonella Fonte: Hajdenwurcel (2004)

A Salmonella reduz o sulfito a sulfeto na presena de glicose produzindo sulfeto de hidrognio, graas presena de ferro e fosfato, tornando as colnias negras. Em volta da colnia aparece um brilho metlico devido reduo dos ons bismuto a bismuto metlico.

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

Fig 07. gar BS crescimento de E. coli Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Fig 08. gar BS crescimento de Proteus Fonte: Hajdenwurcel (2004)

E. coli apresenta colnias pequenas, de colorao variando de marrom a verde sem brilho metlico. Proteus apresenta colnias pequenas e verdes, sem brilho metlico.

GAR CITRATO DE SIMMONS Aplicao: Meio para prova bioqumica, teste do citrato. Composio Sulfato de magnsio Fosfato de amnia (NH4H2PO4) Fosfato dipotssico (K2HPO4) Citrato de sdio Cloreto de sdio gar Azul de bromotimol (40ml as soluo 0,2%) gua destilada pH 6,6+-0,2 121C/ 15 min

0,2g 1g 1g 2g 5g 15g 0,08g 1L

Preparao Dissolver os ingrediente, fundir o Agar, distribuir em tubos de 10x110mm (4-5ml/tubo), esterilizar a 121C/15min e inclinar. Soluo de 0,2% de azul de bromotimol: dissolver 0,1g em 2,5ml de NaOH 0,1N e completar o volume para 50ml com gua destilada. Esta prova fundamenta-se em determinar a capacidade dos microrganismos utilizarem o citrato de sdio como nica fonte de carbono para seu metabolismo, resultando em alcalinidade do meio. O gar Citrato de Simmons contm sais inorgnicos de amnia que sero utilizados pelo microrganismo, resultando na produo de amnia. A utilizao de cidos orgnicos e seus sais como fonte de carbono, tambm, promovem a produo de carbonatos e bicarbonatos. A produo desses
7

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

compostos provoca um aumento do pH do meio de cultura, que tem em sua composio o indicador de pH azul de bromotimol.

Fig 09. Prova do citrato positivo Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Fig 10. Prova do citrato negativo Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Resultado positivo: Alcalinizao do meio e viragem do indicador de pH (azul de bromotimol) para azul. Ex.: E. aerogenes.

Os microrganismos que no conseguem utilizar o citrato de sdio como nica fonte de carbono, no crescem no meio de cultura e o mesmo permanece com sua cor inicial (verde). Ex.: E. coli.

GAR (CALDO) INFUSO CREBRO CORAO (BHI) Aplicao: Meio de enriquecimento e manuteno para uso geral. Composio do caldo Infuso de 200g de crebro de bezerro (slidos) Infuso de 250g de corao de boi (slidos) Proteose peptona Dextrose Cloreto de sdio Fosfato dissdico (Na2HPO4) gua destilada pH 7,4+-0,2 121C/ 15 min

7,7g 9,8g 10g 2g 5g 2,5g 1L

Preparao Dissolver os ingredientes, ajustar o pH e esterilizar a 121C/15min. Para a preparao do gar, adicionar 15g de gar para cada litro de caldo.

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

GAR LEVINE EOSINA AZUL DE METILENO (L-EMB) Aplicao: Meio seletivo/diferencial para deteco presuntiva de E. coli. Composio Peptona Lactose Fosfato dipotssico (K2HPO4) Eosina amarela Azul de metileno gar gua destilada pH 7,1+-0,2 121C/ 15 min

10g 10g 2g 0,4g 0,065g 15g 1L

Preparao Dissolver os ingredientes, ajustar o pH e esterilizar a 121C/15min. Distribuir em placas imediatamente, pois no pode ser reaquecido.

Fig 12. gar EMB Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Os corantes eosina e azul de metileno inibem o crescimento de bactrias Gram positivas permitindo diferenciao entre microrganismos fermentadores e no fermentadores de lactose com aparecimento do brilho metlico so caractersticas utilizadas para diferenciao de E. coli das outras enterobactrias.

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

Fig 13. gar EMB Crescimento de E. coli Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Fig 14. gar EMB Crescimento de Enterobacter aerogenes Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Colnias tpicas de E. coli neste meio de cultura so nucleadas com centro preto e brilho verde metlico (reao da eosina em pH baixo, devido a produo de cido pela fermentao da lactose).

As colnias de Enterobacter so mucides, rosas, acinzentadas, sem brilho verde metlico. A produo de colnias mucides deve-se a presena de cpsula (material polissacardico produzido pelo microrganismo).

GAR LISINA FERRO (LIA) Aplicao: Meio para provas bioqumicas, teste de descarboxilao da lisina e teste de produo de H2S. Composio Peptona Extrato de levedura Dextrose Cloridrato de L-Lisina Citrato frrico amoniacal Tiossulfato de sdio Prpura de bromocresol (2ml de soluo 1%) gar gua destilada pH 6,7+-0,2 121C/ 15 min

5g 3g 1g 10g 0,5g 0,04g 0,02g 15g 1L

Preparao Dissolver os ingrediente, fundir o gar, distribuir em tubos de 10x110mm (4-5ml/tubo), esterilizar a 121C/15min e inclinar, mantendo fundo de 2,5cm, no mnimo, porque a reao de descarboxilao da lisina mais eficiente em condies anaerbias. Soluo de 1% de prpura de bromocresol: dissolver 1g em 1,9ml de NaOH 0,1N e completar o volume para 10ml com gua destilada.
10

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

Fig 15. gar LIA Fonte: Hajdenwurcel (2004)

O meio de cultura deve ser inoculado com a colnia suspeita, atravs de picada com agulha e platina e estrias na rampa. Carboidrato: glicose. Indicador de H2S: tiossulfato de sdio e Citrato frrico amoniacal. Indicador de pH: Prpura de bromocresol Lisina: aminocido que ser ou no descarboxilado.
Fig 16. gar LIA Crescimento de Salmonella Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Fundo e rampa alcalinos (prpura) com produo de H2S (escurecimento do meio). Pode tambm ocorrer ausncia de produo de H2S. O meio fica alcalino, porque mesmo ocorrendo a fermentao da glicose com produo de cido, a lisina descarboxilada, produzindo um composto alcalino (cadaverina) que neutraliza o cido formado.

Fig 17. gar LIA Crescimento de Proteus Fonte: Hajdenwurcel (2004)

O meio adquire uma colorao castanha em funo da reao de desaminao da lisina a cido -cetocarbnico. Este composto reagindo com os sais de ferro provoca o aparecimento da cor castanha. O fundo fica amarelo em funo da fermentao da glicose.

11

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

GAR MANITOL GEMA DE OVO POLIMIXINA (MYP) Aplicao: Meio seletivo/ diferencial para isolamento presuntivo de Bacillus cereus. Composio da base Extrato de carne Peptona D-Manitol Cloreto de sdio Vermelho de fenol (12,5ml da soluo 0,2%) gar gua destilada pH 7,1+-0,2 121C/ 15 min Suplemento Soluo de sulfato de polimixina B 10.000IU/ml Emulso gema de ovo:salina (1:1)

5g 3g 1g 10g 0,5g 15g 1L

10ml/900ml base 100ml/900ml base

Preparao Esterilizar a base a 121C/20min, resfriar a 45-50C, adicionar assepticamente os suplementos previamente preparados e plaquear imediatamente, pois o meio completo no pode ser reaquecido. Soluo 0,2% de vermelho de fenol: dissolver 0,1g em 4ml de NaOH 0,1N e completar o volume para 50ml com gua destilada. Soluo de sulfato de polimixina B 10.000IU/ml: dissolver 500.000 unidades de sulfato de polimixina em 50ml de gua destilada, esterilizar por filtrao e estocar sob refrigerao. Para determinar o peso da polimixina necessrio para 500.000 unidades, verificar no frasco a potncia da polimixina adquirida. Por exemplo, se a o potncia for 7.900 U/mg, significa que cada miligrama tem 7.900 unidade e que so necessrias 63,29mg para 500.000 unidades. Emulso gema de ovo: VIDE gar Baird Parker.
Fig 18. gar MYP (Mossel) Fonte: Hajdenwurcel (2004)

O meio de cultura adicionado de gema de ovo (evidenciar a produo de lecitinase) e polimixina (inibir a flora acompanhante). O indicador de pH o vermelho de fenol. Apresenta o manitol que pode ou no ser fermentado.

12

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

Fig 18. gar MYP (Mossel) - Crescimento de B. cereus Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Bacillus cereus no fermenta o manitol, utilizando as peptonas e alcalinizando o meio que muda para colorao vermelha mais escura (esta colorao torna-se um rseo leitoso, quando misturada com a precipitao da gema de ovo). A presena de lecitinase evidenciada pelo halo opaco ao redor das colnias.

Fig 19. gar MYP (OXOID) Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Fig 20. gar MYP (OXOID) - Crescimento de B. cereus Fonte: Hajdenwurcel (2004)

O meio de cultura tambm adicionado de gema de ovo e polimixina, porm o indicador de pH o azul de bromotimol. Apresenta do piruvato de sdio na composio, possibilita uma melhor reao de hidrlise da lecitina da gema de ovo, facilitando a formao de esporos e reduz o crescimento invasivo de algumas colnias de B. cereus.

Bacillus cereus no fermenta o manitol, utilizando as peptonas e alcalinizando o meio e mudando-o de colorao amarela-esverdeada para azul em funo do indicador de pH. A presena de lecitinase evidenciada pelo halo opaco ao redor das colnias.

13

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

GAR (CALDO) DE MAN ROGOSA & SHARP (MRS) Aplicao: Meio para cultivo de bactrias lticas. Composio do caldo Peptona Extrato de carne Extrato de levedura Glicose Sorbitano monooleato Fosfato dipotssico (K2HPO4) Acetato de sdio.3H2O Citrato de amnia Sulfato de magnsio.7 H2O Sulfato de mangans.4 H2O gua destilada pH 6,2+-0,2 121C/ 15 min

10g 8g 4g 20g 1g 2g 5g 2g 0,2g 0,05g 1L

Preparao Dissolver os ingredientes, ajustar o pH e esterilizar a 121C/15min. Para a preparao do gar, adicionar 15g de gar para cada litro de caldo.

Fig 21. gar MRS glicose acidificado Crescimento de Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus Fonte: Silva (2007)

Fig 22. gar MRS com adio de soluo de maltose - Crescimento de Lactobacillus acidophilus Fonte: Silva (2007)

14

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

GAR PADRO PARA CONTAGEM (PCA) Aplicao: Meio de enriquecimento para contagem total de microrganismos em placas, ou para manuteno da cultura de bactrias. Composio Triptona Extrato de levedura Dextrose gar gua destilada pH 7,0+-0,2 121C/ 15 min

5g 2,5g 1g 15g 1L

Fig 23. gar PCA Fonte: Hajdenwurcel (2004)

O mtodo de contagem de microrganismos em placas pode ser utilizado para contagem de grupos microbianos como aerbios mesfilos, psicrotrficos, termfilos, variando apenas a temperatura de incubao.

15

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

GAR TRPLICE ACAR FERRO (TSI) Aplicao: Meio para prova bioqumica, testes de fermentao da glicose, lactose e sacarose, teste de produo de H2S. Composio Extrato de carne Extrato de levedura Peptona Proteose peptona Glicose Lactose Sacarose Sulfato ferroso (FeSO4) Cloreto de Sdio Tiossulfato de sdio (Na2S2O3) Vermelho de fenol (12ml da soluo 0,2%) gar gua destilada pH 7,4+-0,2 121C/ 15 min Preparao Dissolver os ingredientes, fundir o gar, distribui em tubos de 10x100mm (4-5 ml/tubo), esterilizar a 121C/15min e inclinar, mantendo fundo de no mnimo 2,5cm. Soluo 0,2% de vermelho de fenol: Dissolver 0,1g em 4 ml de NaOH 0,1N e completar o volume para 50ml com gua destilada.

3g 3g 15g 5g 1g 10g 10g 0,2g 5g 0,3g 0,024g 12g 1L

Fig 24. gar TSI Fonte: Hajdenwurcel (2004)

O meio de cultura deve ser inoculado com a colnia suspeita, atravs de picada com agulha de platina (crescimento em anaerobiose) e estrias na rampa (aerobiose). Carboidratos: Glicose, lactose, sacarose. Indicador de H2S: Tiossulfato de sdio e Sulfato ferroso. Indicador de pH: Vermelho de fenol.

16

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

Fig 25. gar TSI crescimento de Samonella Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Fermentao da glicose em aerobiose com produo de CO 2, H2O e energia e fermentao da glicose em anaerobiose com produo de cidos orgnicos, aldedos, alcois, CO2, H20 e energia. A glicose est em concentrao dez vezes menor que os outros carboidratos, e quando acaba o microrganismo comea a utilizar as peptonas e produzir compostos alcalinos. Como na superfcie (aerobiose) no h produo de cido, o meio fica alcalino (viragem do indicador vermelho de fenol para amarelo). Neste tubo pode ser visualizada a produo de gs.

Fig 26. gar TSI crescimento de Samonella Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Reao igual a anterior, s que a cepa foi produtora de H2S (precipitado preto), e o H2S produzido mascarou a parte amarela do tubo.

Fig 27. gar TSI crescimento de Samonella Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Fig 28. gar TSI crescimento de Coliforme Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Perfil tpico da Salmonella onde ocorreu fermentao da glicose em anaerobiose, produo de H2S e produo de alcalinidade na superfcie do meio (aerobiose).

O coliforme fermenta a lactose e a glicose. Portanto, as condies cidas aps 18-24h ainda existem. O meio fica amarelo no fundo e na superfcie, ocorrendo produo de gs.

17

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

GAR VERDE BRILHANTE SULFA (BGS) Aplicao: Meio seletivo diferencial para isolamento de Samonella. Composio Extrato de levedura Polipeptona Cloreto de Sdio Lactose Sacarose Vermelho de fenol Verde brilhante Sulfapiridina gar gua destilada pH 6,9+-0,2 121C/15min Preparao Suspender os ingredientes na gua destilada, ajustar o Ph, aquecer at a completa fuso do gar e esterilizar a 121C/15min. Plaquear imediatamente, o meio no pode ser reaquecido.

3g 10g 5g 10g 10g 0,08g 0,0125g 1g 20g 1L

Fig 29. gar Verde Brilhante Crescimento de Salmonella Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Fig 30. gar Verde Brilhante Crescimento de E.coli Fonte: Hajdenwurcel (2004)

A Salmonella apresenta colnias de cor vermelha, pois no fermenta a lactose. Ela utiliza as peptonas como fonte de energia produzindo substncias alcalinas que elevam o Ph do meio, modificando para uma colorao vermelha mais intensa.

E. coli apresenta colnias de cor amarela, pois fermenta a lactose.

18

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

GAR (CALDO) VERMELHO DE FENOL - CARBOIDRATOS Aplicao: Meio para prova bioqumica, teste de fermentao de carboidratos Composio do caldo base Proteose peptona Extrato de carne (opcional) NaCl Vermelho de fenol (9ml da soluo 0,2%) gua destilada pH 7,4+-0,2 - 121C/15min

10g 1g 5g 0,018g 1L

Preparao do caldo: Dissolver os ingredientes da base, acertar o pH, distribuir em tubos 10x100mm (4ml/tubo) com tubinhos de Durhan e esterilizar a 121C/15min. Preparar e esterilizar por filtrao uma soluo aquosa a 10% do carboidrato a ser testado e adicionar assepticamente aos tubos de meio base, na quantidade necessria para atingir a concentrao final de 0,5 ou 1% no meio completo (0,4ml ou 0,2ml de soluo de carboidrato/4ml de base) Preparao do gar: Preparar o caldo base suplementado com 15g/L de gar e esterilizar em pores de 100ml. Resfriar a 50-55C e adicionar assepticamente, a cada 100ml de base, 10ml da soluo de ccarboidrato, para concentrao final 1%. Plaquear imediatamente ou distribuir em tubos de 10x100mm estreis (5ml/tubo). Soluo de Vermelho de fenol 0,2%: dissolver 0,1g em 4ml de NaOH 0,1N e completar o volume para 50ml com gua destilada.
Fig 31. Caldo vermelho de fenol Teste positivo Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Prova bioqumica da fermentao da glicose em anaerobiose: esta prova recomendada para confirmao de colnias suspeitas de B.cereus. Caldo vermelho de fenol 1% glucose. Deve ser desaerado (fervura por 15min, seguido de imediato resfriamento). Aps a inoculao da colnia suspeita, adicionar leo mineral estril. O resultado positivo se d quando ocorre viragem do indicador, alterando a cor do meio de vermelho para amarelo. Ex.: Bacillus cereus.

Fig 32. Caldo vermelho de fenol Teste negativo Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Quando o meio permanece com a cor inalterada significa teste negativo de utilizao da glicose em anaerobiose.

19

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

GAR XILOSE LISINA DESOXICOLATO (XLD) Aplicao: Meio seletivo diferencial para isolamento presuntivo de Samonella. Composio Extrato de levedura L-Lisina Xilose Lactose Sacarose Desoxicolato se sdio Citrato frrico amoniacal Tiossulfato de sdio (Na2S2O3) Cloreto de Sdio Vermelho de fenol (40ml da soluo 0,2%) gar gua destilada pH 7,4+-0,2 fervura Preparao Dissolver os ingredientes, ajustar o pH e ferver em banho-maria, sob constante agitao, at completa fuso do gar. No autoclavar. Plaquear imediatamente, no pode ser reaquecido. Soluo 0,2% de vermelho de fenol: Dissolver 0,1g em 4 ml de NaOH 0,1N e completar o volume para 50ml com gua destilada.

3g 5g 3,75g 7,5g 7,5g 2,5g 0,8g 6,8g 5g 0,08g 15g 1L

Fig 33. gar XLD Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Sistema inibidor: Desoxicolato de sdio. Indicador de pH: Vermelho de fenol. Indicadores de produo de H2S: Tiossulfato de sdio e Citrato frrico amoniacal. Lisina: aminocido que poder ser descarboxilado, levando a formao de uma diamina (composto bsico) chamada cadaverina e CO 2, resultando em alcalinidade do meio.
20

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

Fig 34. gar XLD Crescimento de E.coli Fonte: MicrobLog: Microbiology Training (2011)

A Salmonella no fermenta a lactose nem a sacarose, mas fermenta a xilose, levando a viragem do indicador vermelho de fenol para amarelo, devido produo de cido. Aps, haver um aumento de pH devido a descarboxilao da lisina, tornando o vermelho de fenol novamente vermelho, inclusiva mais intenso que a cor original do meio. A produo de H 2S varia de acordo com a espcie, produzindo ou no, colnia com centro negro.

Fig 35. gar XLD Cresimento de Salmonella Fonte: http://www.jlindquist.net/generalmicro/dfentericplate.html

E.coli produz colnias amarelas em funo da fermentao da lactose. Lactose e sacarose esto em excesso para que os coliformes lisina positivo no alcalinizem o meio.

21

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

GUA PEPTONADA 0,1% (H2Op) Aplicao: Diluente para homogeneizao e diluio de amostras para anlise. Composio Peptona gua destilada pH 7,0+-0,2 - 121C/15min Preparao Dissolver a peptona na gua destilada e distribuir em tubos ou frascos, na quantidade requerida. Esterilizar a 121C/15min.

1g 1L

GUA PEPTONADA TAMPONADA (BPW)

Aplicao: Diluente e meio de pr-enriquecimento para deteco de Salmonella. Composio Peptona NaCl Fosfato dissdico (Na2HPO4) Fosfato monopotssico (KH2PO4) gua destilada pH 7,2+-0,2 - 121C/15min

10g 5g 3,5g 1,5g 1L

Preparao Dissolver os ingredientes na gua destilada, ajustar o pH e distribuir em tubos ou frascos, na quantidade requerida. Esterilizar a 121C/15min.

22

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

CALDO E. COLI (EC) Aplicao: Meio para contagem de coliformes fecais, confirmao de resultado presuntivo pelo mtodo NMP. Composio Triptose Lactose Sais biliares N3 Fosfato dipotsssico (K2HPO4) Fosfato monopotssico (KH2PO4) Cloreto de Sdio gua destilada pH 6,9+-0,2 121C/15min Preparao Dissolver os ingredientes, ajustar o pH distribuir em tubos de 16x150mm com tubo de Durhan (aproximadamente 6ml/tubo) esterilizar a 121C/15min.

20g 5g 1,5g 4g 1,5g 5g 1L

Fig 36. Caldo EC Crescimento de coliformes fecais Fonte: Hajdenwurcel (2004)

O caldo EC seletivo para microrganismos Gram negativos em funo da presena de sais biliares. A incubao a temperatura de 45,5C em banhomaria por 24 horas permite evidenciar a presena de coliformes fecais, pois eles apresentam a capacidade de fermentao da lactose com produo de gs temperaturas mais elevadas.

23

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

CALDO LACTOSADO (CL) Aplicao: Meio de pr-enriquecimento para deteco de Salmonella. Composio Extrato de carne Peptona Lactose gua destilada pH 6,9+-0,2 121C/15min Preparao Dissolver os ingredientes, ajustar o pH e esterilizar a 121C/15min.

3g 5g 5g 1L

Fig 37. Caldo Lactosado Fonte: Hajdenwurcel (2004)

O pr-enriquecimento tem a finalidade de promover o crescimento de clulas injuriadas que foram submetidas ao do calor, alta presso, mudana de pH, ao de inibidores. Tambm permite uma diluio na gua de substncias inibidoras solveis existentes nas amostras de alimentos.

24

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

CALDO LAURIL SULFATO TRIPTOSE (LST) Aplicao: Meio seletivo para deteco presuntiva de coliformes totais, fecais e E. coli pelo mtodo NMP. Composio Triptose Lactose Fosfato dipotsssico (K2HPO4) Fosfato monopotssico (KH2PO4) NaCl Lauril Sulfato de sdio gua destilada pH 6,8+-0,2 121C/15min Preparao Dissolver os ingredientes, ajustar o pH, distribuir em tubos de 16x150mm com tubo de Durhan (10ml/tubo) e esterilizar a 121C/15min.

20g 5g 2,75g 2,75g 5g 0,1g 1L

Fig 38. Caldo LST Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Crescimento com produo de gs evidencia o teste positivo. Este meio de cultura permite um enriquecimento seletivo de coliformes, recuperando as clulas injuriadas.

25

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

CALDO RAPPAPORT-VASSILIADIS MODIFICADO (RV R10) Aplicao: Meio seletivo para enriquecimento de Salmonella em alimentos. Composio Soluo A Triptona NaCl Fosfato monopotssico (KH2PO4) gua destilada

5g 8g 1,6g 1L

Preparao Dissolver os ingredientes, aquecendo se necessrio. Essa soluo deve ser preparada no dia em que for preparado o meio completo. Soluo B MgCl2.6H2O gua destilada

400g 1L

Preparao Mantendo a proporo, dissolver todo o contedo de um novo frasco de cloreto de magnsio na gua, porque o sal muito higroscpico. Acondicionar em frasco mbar, com tampa bem apertada. Soluo C Verde de malaquita oxalato gua destilada 0,4g 100ml

Preparao Dissolver o corante na gua e estocar em frasco escuro. Meio completo Soluo A Soluo B Soluo C pH 5,2+- 0,2 - 115C/15min Preparao do meio completo Juntas as quantidades de soluo A, B e C, ajustando o pH. Distribuir em tubos de 16x150mm (10ml/tubo). Esterilizar a 115C/15min. 1000ml 100ml 10ml

26

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

Fig 39. Caldo Rappaport-Vassiliadis Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Os seguintes fatores tornam esse meio de cultura excelente para o enriquecimento seletivo de Salmonella: alta presso osmtica (cloreto de magnsio), pH baixo (5,2). Presena de ver de malaquita. A Salmonella cresce muito bem nessas condies, sendo a flora acompanhante inibida.

27

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

CALDO SELENITO CISTINA (SC) Aplicao: Caldo para enriquecimento seletivo de Salmonella em alimentos. Composio Triptona Lactose Fosfato dissdico (Na2HPO4) Selenito cido de sdio L-Cistina gua destilada pH 7,0+-0,2 fervura/ 10 min Preparao Dissolver os ingredientes na gua destilada, ajustar o pH, distribuir em tubos de 16x150mm (10ml/tubo) e submeter a fervura por 10 min. No autoclavar. A altura do meio no tubo no deve ser inferior a 5 cm, porque o meio mais eficiente quando apresenta potencial de xido-reduo reduzido. Cuidado: os sais de selenito so txicos quando inalados ou ingeridos.

5g 4g 10g 4g 0,01g 1L

Fig 40. Caldo Selenito Cistina Fonte: Hajdenwurcel (2004)

28

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

CALDO TETRATIONATO (TT) Aplicao: Meio de enriquecimento seletivo para anlise de Salmonella. Composio da base Proteose peptona Peptona de casena digesto pancretica Oxgall Tiossulfato de sdio Carbonato de clcio gua destilada pH 8,4+-0,2 aquecer at a fervura Suplemento Soluo de iodo Soluo 0,1% de verde brilhante (opcional) Preparao Suspender os ingredientes da base e aquecer at a fervura. No autoclavar. O precipitado no vai dissolver completamente. No momento do uso adicionar, a cada litro de base, 20ml de soluo de iodo e 10ml de soluo 0,1% de verde brilhante. Ajustar o pH e distribuir em tubos. Utilizar imediatamente, o meio completo no deve ser estocado. Soluo de iodo Iodo Iodeto de potssio gua destilada

2,5g 2,5g 11g 30g 10g 1L

0,2ml/10ml base 0,1ml/10ml base

6g 5g 20ml

Colocar o iodo e o iodeto de potssio num almofariz e homogeneizar com o pistilo. Adicionar consecutivamente, pores de 1ml, 5ml e 10ml de gua destilada, homogeneizando a soluo aps cada diluio. Em seguida, transferir a soluo para um frasco mbar, lavando o almofariz e o pistilo com o restante da gua destilada.
Fig 41. Caldo Tetrationato Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Permite o crescimento de Salmonella e previne o crescimento de parte da flora acompanhante. Com a adio de iodo ao caldo, haver oxidao do tiossulfato de sdio com formao de tetrationato. A toxicidade desse meio est relacionada com a presena desses dois compostos (tetrationato e tiosulfato). O meio tamponado com carbonato de clcio que ir neutralizar os cidos que podem ser produzidos pela decomposio do tetrationato por algumas enzimas.

29

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

CALDO TRIPTONA 1% Aplicao: Meio para prova bioqumica, teste do indol. Composio Triptona NaCl gua destilada pH 7,3+-0,2 121C/15min Preparao Dissolver os ingredientes na gua destilada, distribui em tubos de 10x100mm (4-5ml/tubo) e esterilizar a 121C/15min. O princpio desta prova consiste em detectar a habilidade do microrganismo produzir indol a partir do aminocido triptofano, atravs da enzima triptofanase. O principal intermedirio da degradao do triptofano o cido indolpirvico que pode forma indol por desaminao e escatol por descarboxilao do cido indolactico. O triptofano fornecido no meio de cultura atravs da adio de peptonas. A presena do indol detectada pelo teste colorimtrico, pela adio do reagente de Kovacs, que apresneta em sua composio (p-dimetilaminobezaldedo, lcool amlico e cido clordrico).

10g 5g 1L

Fig 42. Prova do indol teste positivo Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Fig 43. Prova do indol teste negativo Fonte: Hajdenwurcel (2004)

A prova positiva caracterizada pela presena de um anel vermelho na camada alcolica. Ex.: E. coli.

A prova negativa caracterizada pela presena de um anel amarelo na camada alcolica. Reao varivel pode ocorrer com aparecimento de colorao alaranjada na camada alcolica, devido produo de escatol, produto precursor da formao de indol. Ex.: E. aerogenes.

30

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

CALDO VERDE BRILHANTE BILE 2% (VB) Aplicao: Meio seletivo para contagem de coliformes totais. Composio Bile de boi (oxgall) Peptona Lactose Verde Brilhante (13,3ml de soluo aquosa 0,1%) gua destilada pH 7,2+-0,2 121C/15min

20g 10g 10g 0,0133g 1L

Preparao Dissolver os ingredientes, acertar o pH, distribuir em tubos de 16x150mm com tubo de Durhan (aproximadamente 6ml/tubo) e esterilizar a 121C/15min.

Fig 43. Caldo Verde Brilhante Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Crescimento com produo de gs evidencia um teste positivo. O meio de cultura apresenta sais biliares que inibem o crescimento de microrganismos Gram positivos e a lactose utilizada como substrato para produo de gs.

31

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

CALDO VM-VP Aplicao: Meio para prova bioqumica, testes de Vermelho de Metila e VogesProskauer. Composio Peptona Glicose Fosfato dipotsssico (K2HPO4) gua destilada pH 6,9+-0,2 121C/15min

20g 10g 10g 1L

Preparao Dissolver os ingredientes na gua destilada, acertar o pH e distribuir em tubos de 10x100mm (5ml/tubo) e esterilizar a 121C/15min. Prova vermelho de metila O principio da prova consiste em detectar a capcidade do microrganismo converter a glicose em cido em vez de acetilmetilcarbinol. Esta prova baseiase no emprego de um indicador de pH, o vermelho de metila, para determinar a produo de cido proveniente da fermentao da glicose. Aps a incubao adiciona-se o indicador vermelho de metila que muda para colorao vermelha quando o pH atinge 4,2 ou menos.

Fig 44. Caldo VM-VP Teste VM POSITIVO Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Fig 45. Caldo VM-VP Teste VM NEGATIVO Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Resultado positivo: o cultivo suficientemente cido para permitir que o vermelho de metila mantenha uma colorao vermelha definida. E. coli e outros microrganismos VM positivos produzem grande quantidade de cidos: ltico, succnico, actico e frmico.

Resultado negativo: colorao amrela (pH superior a 6,0) ocorrendo colorao alaranjada, deve-se continuar a incubao at 4 dias e repetir a prova. Os microrganismos VM negativos tambm produzem cidos, porm numa menor concentrao, devido neutralizao e formao de outros compostos. O cido actico convertido em acetona e 2,3butilenoglicol (produtos neutros). Enterobacter aerogenes VM negativo.
32

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

Prova de Voges-Proskauer Esta prova baseia-se em determinar a capacidade dos microrganismos produzirem um composto neutro, o acetilmetilcarbinol (acetona) a partir da fermentao da glicose. Na presena de oxignio atmosfrico e em meio alcalino (KOH 40% ou NaOH 40%) a acetona e 2,3 butilenoglicol so oxidados para diacetil que combina com um grupamento guandico da arginina (presente na peptona) produzindo uma colorao vermelha. O alfa-naftol e a creatina so adicionados para catalisarem a reao. Esta reao lenta. Inicialmente forma-se um anel vermelho na superfcie do meio de cultura que vai intensificando com o tempo. A intensidade da colorao vermelha proporcional a quantidade de diacetil no meio de cultura. E. aerogenes VP positivo. E. coli VP negativo.

Fig 46. Caldo VM-VP Teste Voges Proskauer Fonte: Hajdenwurcel (2004)

33

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

PERXIDO DE HIDROGNIO 3% Aplicao: reagente para prova bioqumica do teste de catalase. Composio Perxido de Hidrognio 30% gua destilada

10ml 90 ml

Preparao Dissolver 10ml de gua oxigenada 30% em 90ml de gua destilada. Cuidado. O perxido de hidrognio a 30% pode provocar queimaduras dolorosas, devendo ser manuseado com luvas e culos protetores. Em caso de respingos, lavar com etanol 70% em abundncia. No lavar com gua.

REAGENTES DE BARRIT PARA TESTE DE VP Aplicao: reagentes para prova bioqumica, teste de Voges-Proskauer. Soluo 5% de alfa-naftol Alfa-naftol Etanol absoluto

5g 100ml

Estocar em geladeira. CUIDADO. O reagente no deve ser pipetado com a boca. Soluo 40% de KOH ou NaOH KOH ou NaOH gua destilada

40g 100ml

Preparar o KOH rapidamente ( altamente higroscpico) Estocar sob refrigerao, em frasco de polietileno ou em frasco de vidro com a boca e a tampa parafinadas. CUIDADO. A soluo extremante custica, podendo causar queimaduras dolorosas a pele. Em caso de acidente, lavar com gua em abundncia.

SOLUES DE CIDO CLORDRICO HCl 1N: Dissolver 86ml de cido clordrico concentrado em menos de um litro de gua destilada e completar o volume para um litro. HCl 0,1N: Dissolver 8,6ml de cido clordrico concentrado em menos de um litro de gua destilada e completar o volume para um litro. HCl 0,02N: Dissolver 20ml de HCl 1N em menos de um litro de gua destilada e completar o volume para um litro.

34

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

SOLUO DE LCOOL IODADO Aplicao: Desinfetante Composio Iodo Iodeto de potssio Etanol 70%

10g 10g 500ml

Preparao Colocar o iodo e o iodeto de potssio em um almofariz e homogeneizar com o pistilo. Adicionar lcool em pequenas pores e continuar homogeneizando aps cada adio. Em seguida, transferir para um frasco e lavar o almofariz e o pistilo com o restante do lcool. SOLUO DE HIDRXIDO DE SDIO NaOH 1N: Dissolver 40g de NaOH em menos de um litro de gua destilada e completar o volume para um litro. NaOH 0,1N: Dissolver 4g de NaOH em menos de um litro de gua destilada e completar o volume para um litro. NaOH 0,02N: Dissolver 0,8g de NaOH em menos de um litro de gua destilada e completar o volume para um litro.

35

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS SILVA, N.; JUNQUEIRA, V.C.A.; SILVEIRA,N.F.A.; TANIWAKI, M.H.; SANTOS, R.F.S.; GOMES, R.A.R. Manual de mtodos de Anlise Microbiolgica de Alimentos. 3ed. So Paulo. 2007. HAJDENWURCEL, J.R. Atlas de microbiologia de alimentos. Vol1. So Paulo. 2004. SILVA, S.V. Desenvolvimento de iogurte probitico (Dissertao) Universidade Federal de Santa Maria. 2007 MicrobLog: Microbiology Training Disponvel: http://microblog.me.uk/286 Acesso em: 21 de maio de 2011. Differential Media: Overview of Some Common Enteric Plating Media Disponvel: http://www.jlindquist.net/generalmicro/dfentericplate.html Acesso em: 21 de maio de 2011. com prebitico.

36