LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN ISOLASI DNA

Nama NIM Kelompok Asisten

Disusun Oleh: : Aminatus Sholikah : 115040213111035 : kamis, 06.00-07.30 : Putu Shantiawan Prayoga

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN MALANG 2012

I.

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan komponenkomponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan pasangan basa. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap dari materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih, karena memiliki nukleus dimana terdapat DNA didalamnya. DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontamoinasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tannin, pigmen, alkaloid, dan flavonoid. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat, dan pada beberapa tanaman kontaminasi sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Kehadiran kontaminasi diatas dapat menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA tidak sensitive oleh enzim retriksi dsan mengganggu proses amplifikasi DNA dengan PCR. Elektroforesis dengan Agarose merupakan metode standar untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari molekul DNA/RNA. Cara pemisahan dengan elektroforesisi ini merupakan alat pendukung yang sangat pokok dalam teknologi DNA rekombinan, dengan aplikasi yang begitu luas baik untuk pemisahan untai tunggal atau untai ganda molekul DNA.

1.2 Tujuan Memahami mengenai pengertian isolasi DNA dan PCR Memahami mengenai uji kualitas DNA Memahami mengenai komponen dan tahapan PCR Memahami mengenai manfaat PCR

II.

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian Isolasi DNA dan PCR Isolasi DNA merupakan suatu proses untuk mendapatkan DNA murni yang dapat digunakan untuk keperluan pemeriksaan atau diagnosa. DNA dapat di isolasi dari berbagai sel yang memiliki inti sel, karena DNA terletak di dalam inti sel (Aditya, 2010). Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell dkk. 2002: 115). Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran (Alberts dkk. 1994: 254). Polymerase Chain Reacton (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro. Teknik ini pertama kali dikembangkan oleh Karry Mullis pada tahun 1985. Teknik PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan kali hanya dalam beberapa jam (Handayono dan Rudiretna, 2000). 2.2 Uji Kualitas DNA Pengukuran secara kualitas, dilakukan pengecekan hasil isolasi DNA pada gel agarose, horizontal elektroforesis. Sebanvak 4 ml DNA sampel dan 1 ml loading dye di-running dalam tangki elektroforesis agarose 1% pada 100 volt selama 30 menit. Gel hasil elektroforesis kemudian direndam dalam larutan ethidium bromide selama 10 menit. Kemudian pola pita yang dihasilkan dilihat di bawah UV transilluminator dan difoto

dengan kamera Polaroid MP4. Jika muncul pita berarti DNA hasil isolasi siap untuk digunakan sebagai template untuk PCR (Saili, 2012). 2.3 Komponen dan Tahapan PCR Komponen PCR Komponen- komponen yang diperlukan pada proses PCR adalah templat DNA; sepasang primer, yaitu suatu oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat; dNTPs (Deoxynucleotide triphosphates); buffer PCR; magnesium klorida (MgCl2) dan enzim polimerase DNA. 1) Templat DNA Fungsi DNA templat di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama. Templat DNA ini dapat berupa DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA apapun asal di dalam DNA templat tersebut mengandung fragmen DNA target yang dituju. Penyiapan DNA templat untuk proses PCR dapat dilakukan dengan menggunakan metode lisis sel ataupun dengan cara melakukan isolasi DNA kromosom atau DNA plasmid dengan menggunakan metode standar yang ada. Pemilihan metode yang digunakan di dalam penyiapan DNA templat tergantung dari tujuan eksperimen. 2) Primer Keberhasilan suatu proses PCR sangat tergantung dari primer yangdigunakan. Di dalam proses PCR, primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (OH) pada ujung 3 yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA.

Perancangan primer dapat dilakukan berdasarkan urutan DNA yang telah diketahui ataupun dari urutan protein yang dituju. Data urutan DNA atau protein bisa didapatkan dari database GenBank. Apabila urutan DNA maupun urutan protein yang dituju belum diketahui maka perancangan primer dapat didasarkan pada hasil analisis homologi dari urutan DNA atau protein yang telah diketahui mempunyai hubungan kekerabatan yang terdekat. 3) dNTPs (deoxynucleotide triphosphates) dNTPs merupakan suatu campuran yang terdiri atas dATP (deoksiadenosin trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat) , dCTP (deoksisitidin trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat). Dalam proses PCR dNTPs bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA. dNTP akan menempel pada gugus OH pada ujung 3 dari primer membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA templat. Konsentrasi optimal dNTPs untuk proses PCR harus ditentukan. 4) Buffer PCR dan MgCl2 Reaksi PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu. Oleh karena itu untuk melakukan proses PCR diperlukan buffer PCR. Fungsi buffer di sini adalah untuk menjamin pH medium. Selain buffer PCR diperlukan juga adanya ion Mg2+, ion tersebut berasal dari berasal MgCl2. MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polimerase. Dengan adanya MgCl2 ini akan meningkatkan interaksi primer dengan templat yang membentuk komplek larut dengan dNTP (senyawa antara). Dalam proses PCR konsentrasi MgCl2 berpengaruh pada spesifisitas dan perolehan proses. Umumnya buffer PCR sudah mengandung senyawa MgCl2 yang diperlukan. Tetapi disarankan sebaiknya antara MgCl2 dan buffer PCR dipisahkan supaya dapat dengan mudah dilakukan variasi konsentrasi MgCl2 sesuai yang diperlukan.

5) Enzim Polimerase DNA Enzim polimerase DNA berfungsi sebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi DNA. Pada proses PCR enzim ini diperlukan untuk tahap ekstensi DNA. Enzim polimerase DNA yang digunakan untuk proses PCR diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik oleh karena itu enzim ini bersifat termostabil sampai temperatur 95 C. Aktivitas polimerase DNA bergantung dari jenisnya dan dari mana bakteri tersebut diisolasi . Sebagai contoh adalah enzim Pfu polimerase (diisolasi dari bakteri Pyrococcus furiosus) mempunyai aktivitas spesifik 10x lebih kuat dibandingkan aktivitas spesifik enzim Taq polymerase (diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus). Penggunaan jenis polimerase DNA berkaitan erat dengan buffer PCR yang dipakai. Dengan menggunakan teknik PCR, panjang fragmen DNA yang dapat diamplifikasi mencapai 35 kilo basa. Amplifikasi fragmen DNA pendek (kurang dari tiga kilo basa) relatif lebih mudah dilakukan. Untuk mengamplifikasi fragmen DNA panjang (lebih besar dari tiga kilo basa) memerlukan beberapa kondisi khusus, di antaranya adalah diperlukan polimerase DNA dengan aktivitas yang kuat dan juga buffer PCR dengan pH dan kapasitas tinggi (High-salt buffer). (Handayono dan Rudiretna, 2000). Tahapan pada proses PCR Proses PCR melibatkan beberapa tahap yaitu: (1) pradenaturasi DNA templat; (2) denaturasi DNA templat; (3) penempelan primer pada templat (annealing); (4) pemanjangan primer (extension) dan (5) pemantapan (postextension). Tahap (2) sampai dengan (4) merupakan tahapan berulang (siklus), di mana pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah DNA. (Handayono dan Rudiretna, 2000). Penjelasan tentang tahapan PCR adalah sebagai berikut: a. Denaturasi

Denaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 96oC selama 30-60 detik. Pada suhu ini DNA utas ganda akan memisah menjadi utas tunggal. b. Annealing Setelah DNA menjadi utas tunggal, suhu diturukan ke kisaran 40-60oC selama 20-40 detik untuk memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA template di tempat yang komplemen dengan sekuen primer. c. Ekstensi/elongasi Dilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA polymerase, biasanya 70-72oC. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai pada pasangannya, jika basa pada template adalah A, maka akan dipasang dNTP, begitu seterusnya (ingat pasangan A adalah T, dan C dengan G, begitu pula sebaliknya). Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga ke ujung. Lamanya waktu ekstensi bergantung pada panjang daerah yang akan diamplifikasi, secara kasarnya adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp (Science, 2009). 2.4 Manfaat PCR Polymerase Chain Reaction (PCR) dapat digunakan untuk: a. Amplifikasi urutan nukleotida. b. Menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami mutasi. c. Bidang kedokteran forensik. d. Melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan finger print (Mahmuddin, 2010).

III.

METODOLOGI

3.1 Alat dan Bahan (Beserta Fungsinya) 3.1.1 Alat 1. Pipet Mikro 2. Cawan Petri 3. Mortar 4. Fortex 5. Sentrifuse 6. Freezer 7. Elektroforesis 3.1.2 Bahan 1. Daun Jeruk : Sebagai spesimen isolasi DNA 2. PVC : Penyerap fenol 3. CTAB : Untuk melisis membrane 4. Chisam : Mendegradasi protein 5.DNApallet :Hasil presipitasi DNA yang menggumpal 6. Isopropanol dingin : Menggumpalkan DNA 7. TE (Tris EDTA) : Untuk meresuspensi 8. Nitrogen cair :Mempermudah proses penumbukan menjadi bubuk 9. Buffer pencuci : sebagai larutan penyangga 3.2 Langkah Kerja (Diagram alir + dokumentasi langkah kerja) Buffer ekstraksi CTAB (1 ml) + mercaptoetamol +inkubasi 30 (650C) Timbang sample 0,1 gr +PVP 1 % N2 cair (-1960C) : memindahkan cairan yg bervolume cukup kecil, biasanya kurang dari 1000 l. : Tempat specimen. : Menumbuk Spesimen. : Alat untuk menghomogenkan larutan. : Alat untuk memisahkan larutan. : Untuk inkubasi. : Menguji kuantitas DNA.

Chisam 30 l Sentrifuse 6000 Rpm 10

Ambil Supernatan

Chisam 1x volume supernatant (1:1) Sentrifuse 6000 rpm 10

Isopropanol 0,45 x volume supernatant Inkubasi freezer 30

DNA pellet + Buffer Pencuci 200l +RNAse 1l (350C) +Resuspensi dengan elution buffer 20-50l

Simpan untuk elektroforesis Elektroforesis Siapkan Gel Agarose 0,32 gr/40 ml Siapkan DNA + loading dye Siapkan elektroforesis tank dengan larutan TBE Ready

3.3 Analisa Perlakuan Pada praktikum isolasi DNA ini bahan yang digunakan adalah daun jeruk. Langkah pertama yang dilakukan adalah mengisi tabung eppendorf maks dengan 1,5 ml buffer ekstraksi CTAB (CTAB 3%, NaCl 1,4 M, EDTA 0,002M dan Tris -HCl 0,1M) dan 5 l mercaptoethanol. Daun jeruk ditimbang 0,1 gram dan digerus dalam mortar dengan bantuan nitrogen cair dan ditambah PVP 1%, kemudian dimasukkan kedalam tabung eppendorf yang sudah berisi 1 ml buffer ekstraksi CTAB dan 5 l mercaptoethanol. Setelah itu ekstrak daun divortex hingga homogen. Voretx ini digunakan untuk menghomogenkan larutan. Ekstrak daun diinkubasi dalam suhu 65 oC selama 30 menit sambil dibolak-balik tiap 10 menit. Kemudian ditambahkan 30 l chisam (Chloroform : Isoamylalcohol (24:1)). CISAM digunakan untuk menghilangkan kontaminan protein. Setelah itu ekstrak daun divortex hingga homogen. Ekstrak daun kemudian disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 6000 rpm. Dan diambil supernatannya. Supernatan dimasukkan pada mikrovivet baru dan ditambahkan chisam 1 x volume supernatan. Larutan supernatan dan chisam disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 6000 rpm. Sentrifuse untuk memisahkan berdasarkan berat jenis dengan menggunakan kecepatan 6000rpm. Fase atas dimasukkan tabung baru ditambah isopropanol 0,45 x volume supernatan. Larutan tersebut dibolak-balik perlahan hingga tampak benang-benang putih dalam larutan. Larutan diinkubasi dalam freezer selama 30 menit. Setelah diinkubasi, larutan disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 6000 rpm setelah itu supernatan dibuang dengan hati-hati agar endapan DNA pellet tidak ikut terbuang. Endapan DNA pellet dicuci dengan buffer pencuci dengan cara menambahkan 200 l buffer pencuci ke dalam tube, kemudian cairan di buang. Pencucian ini dilakukan 2 kali. Setelah itu endapan DNA pellet dikering anginkan. Endapan DNA kemudian diresuspensi dengan 20-50 l buffer TE lalu ditambah 1 l RNAse dan disimpan dalam lemari es untuk elektroforesis.

IV.

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Gambar Hasil Dokumentasi

Keterangan gambar hasil elektroforesis dna total : sample 1 sample 2 sample 3 sample 4 sample 5 sample 6 sample 7 sample 8 sample 9 sample 10 sample 11 sample 12 sample 13 = kubis = kubis (ada) = kubis (ada) = tomat = tomat = bayam = bayam (ada) = bayam = ubi jalar = ubi jalar = ubi jalar = jeruk (ada) = jeruk (ada)

4.2 Analisa Gambar Hasil Elektroforesis Dilihat dari gambar diatas kita dapat mengetahui bahwa penyinaran dibawah lampu UV dapat memperlihatkan potongan pita-pita DNA yang mempunyai fragmen-fragmen. Sample yang dapat menunjukkan adanya fragmen DNA adalah 2 sample kubis, 1 sample bayam, dan 2 sample jeruk. Sedangkan pada sample-sample lain tidak ditunjukkan adanya fragmen DNA. Tidak adanya fragmen DNA disebabkan oleh beberapa faktor diantara lain kegagalan dalam proses atau tahapan isolasi DNA, konsentrasi atau jumlah DNA tidak memadai untuk dimuat dalam gel. Pada daun ubi jalar dapat diketahui bahwa salah satunya potongan fragmen pita DNA yang banyak terurai dan kurang sempurna karena pengaruh konsentrasi agarose yang menyebabkan DNA bermigrasi, sehingga fragmen-fragmennya lebih besar. Dari setiap bahan yang dilakukan untuk praktikum ini tidak semua akan muncul pita DNA saat dielektroforesis. Hal ini dikarenakan kurang efektifnya perlakuan saat praktikum dan kesterilan alat dan bahan praktikum. Hal ini menyebabkan tidak munculnya pita DNA saat dielektroforesis dibawah lampu UV.

Pada elektroforesis tersebut terdapat bermacammacam kontaminasi, diantaranya smear (semburan) yang diakibatkan karena adanya kontaminasi protein dan DNA terdegradasi, berapi-api yang disebabkan karena adanya kontaminasi polisakarida, dan pita tebal dibawah bagian bawah gel agarose yang disebabkan karena adanya kontaminasi RNA. (Asris, 2010) Dari gambar hasil elektroforesis ini dapat diketahui bahwa adanya kontaminasi polisakarida dengan ditunjukkan adanya gambar berapi-api diatas pita DNA yang sangat tebal. Selain itu, dari hasil diatas dapat diketahui bahwa molekul DNA memiliki jarak tertentu yang berbeda-beda. Panjang DNA dinyatakan dalam base pair (bp), namun pada hasil tidak menunjukkan panjang molekul DNA tersebut.

V.

PENUTUP

5.1 Kesimpulan Dari praktikum kali ini dapat disimpulkan bahwa beberapa isolasi DNA telah berhasil dilakukan. DNA dapat dilihat pada sampel daun kubis, bayam, dan jeruk, sedangkan yang lainnya tidak ada. Kegagalan pada beberapa sampel daun ini untuk memperlihatkan DNAnya dapat disebabkan oleh kurang efektifnya perlakuan saat praktikum dan kesterilan alat dan bahan praktikum. 5.2 Saran Praktikum kali ini hanya mendapat contoh dari pihak yang sudah ahli, semoga lain kali praktikan diberi kesempatan mencobanya sendiri.

DAFTAR PUSTAKA

Aditya. 2010. Retrieved 10 2012, from http://sharkestaditya.blogspot.com/2010/03/isolasi-DNA.html. Diakses tanggal 3 Desember 2012. Asris. 2010. Isolasi DNA. HYPERLINK "http://asris07.student.ipb.ac.id/%202010/06/19/isolasi-dna/" http://asris07.student.ipb.ac.id/ 2010/06/19/isolasi-dna/ . Diakses tanggal 3 Desember 2012 Handayono dan Rudiretna. 2000. Jurnal : Prinsip Umum Melaksanakan Polymerase Chain Reaction PCR. Surabaya : Pusat Studi Bioteknologi, Universitas Surabaya. Mahmuddin. (2010, 08 31). Retrieved 10 2012, from http://mahmuddin.wordpress.com/2010/08/31/polymerase-chainreaction-pcr/#more-292. Saili. (2012, 02 03). Retrieved 20 2012, from http://takdirsaili.wordpress.com/2010/02/03/analisis-molekulertingkat-kekerabatan/. Science. (2009, 05 07). Retrieved 10 2012, from http://sciencebiotech.net/mengenal-pcr-polymerase-chainreaction/.