Anda di halaman 1dari 30

BAB I PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang Kloning merupakan teknik terobosan baru untuk mendapatkan sebuah gen yang sangat dibutuhkan keberadannya bagi kehidupan manusia. Dalam beberapa kasus penyakit yang menimpa manusia, hewan, dan tumbuhan, pengobatan biasa tidak dapat memberikan hasil kesembuhan yang maksimal. Setelah dikenalnya teknik kloning, pintu pengobatan penyakit pada mahluk hidup mulai lebih terbuka. Sekarang ini, teknik kloning sudah dipakai untuk membuat vaksin dan hormon. Kita sudah bisa, dengan menggabungkan dua jenis sel (seperti sel tikus dan sel kanker manusia) untuk menghasilkan sejumlah besar antibodi tertentu, lewat sistem kekebalan, untuk memerangi penyakit. Saat disuntikkan kedalam aliran darah, antibodi klon ini mencari dan menyerang sel penyebab penyakit dimanapun ditubuh kita. Dengan menempelkan antibodi klon pada unsur pelacak, para ilmuan dapat menemukan kanker tersembunyi, dan dengan menempelkan obat penghancur kanker, dosis perawatan dapat dikirim langsung ke sel kanker. Sumber DNA penyembuh tadi bisa darimana saja, salah satu contohnya adalah dari DNA Chicken Anemia Virus (CAV) yang memiliki jenis protein VP3 yang disebut dengan Apoptin. Apoptin adalah protein yang mampu menginduksi kematian sel spesifik pada sel tumor secara terprogram. Apoptin mengakibatkan terjadinya apoptosis pada sel tumor. Apoptosis adalah mekanisme biologi yang merupakan salah satu jenis kematian sel yang terprogram. Apoptosis pada umumnya berlangsung seumur hidup dan bersifat menguntungkan bagi tubuh. Karena kelebihan yang dimiliki oleh Apoptin dan peluangnya yang besar untuk menghilangkan sel tumor secara permanen, para peneliti memiliki gagasan untuk

mengembangbiakkan Apoptin ini untuk diproduksi lebih banyak lagi. Dengan menggunakan teknologi kloning, hal ini sangat mudah dilakukan. Organisme yang dipilih untuk menjadi sel inang atau host adalah E. Coli. Dalam makalah ini, akan dijelaskan lebih lanjut mengenai strategi strategi yang akan dipakai dalam mengkloning apoptin pada E. coli, dimulai dari tahap pengisolasian apoptin hingga replikasinya, serta kelebihan dan kekurangannya.

1.2. Tujuan Tujuan dari penelitian ini ialah untuk meng-kloning gen apoptin dengan menambahkan 10 histidin pada N-Terminal dan 8 Arginin pada C-Terminal, menggunakan plasmid pUC19 pada E.coli BL21(DE3).

1.3. Strategi Kloning Gen Apoptin


E.coliJM109 (Sumber gen apoptin)

CAV

isolasi DNA genomik ekstrak DNA genomik gen yang akan diklon (gen apoptin)

isolasi plasmid pUC19

p emo to n g a n men g g u n a k a n en z im r es kt ri ks i fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran fragmen yang membawa gen apoptin ligasi fragmen-fragmen DNA genomik dengan DNA plasmid plasmid terpotong

plasmid sendiri (religasi)

DNA rekombinan tanpa gen apoptin

DNA rekombinan yang membawa gen apoptin

chemnical transformation (Heat shock)

transformasi sel inang (E.coli BL21(DE3)

sel inang utuh (non transforman)

sel inang dengan plasmid religasi

sel inang dengan DNA rekoombinan tanpa gen apoptin

sel inang dengan DNA rekoombinan tanpa & dengan gen apoptin

seleksi untuk memilih sel inang dengan DNA rekombinan yang membawa gen apoptin

reisolasi DNA rekombinan

harvesting dan pemurnian Bagan 1. Skema Kloning Gen Apoptin

BAB II STRATEGI KLONING GEN APOPTIN MENGGUNAKAN PLASMID PUC19 DAN SEL INANG E.COLI BL21(DE3)

2.1. Strategi Isolasi Gen Apoptin

Chicken Anemia Virus (CAV) Apoptin adalah protein yang mampu menginduksi kematian sel spesifik pada sel tumor. Karena itu banyak usaha untuk mengkulturkan apoptin agar mampu menjadi alternatif untuk obat sel tumor. Salah satu metode untuk mengkultur protein apoptin adalah dengan kultur sel yang sudah di transformasi. Untuk melakukan transformasi sel yang akan di kultur perlu dilakukan isolasi dari gen yang mengkodekan apoptin untuk disisipkan di sel. Gen apoptin dikodekan oleh Chicken Anemia Virus (CAV) yang termasuk Famili Gyrovirus. CAV adalah virus DNA yang menyebabkan anemia dan atropi organ pada ayam. CAV mampu mengkodekan 3 macam protein virus yaitu : VP1, VP2, dan VP3. Protein VP1 berperan dalam menyusun kapsid (Lampiran 1). Protein VP1 memiliki massa 51 Kda. Protein VP2 adalah protein yang memiliki spesifitas terhadap fosfatase dan memiliki masa 30 Kda. Sementara protein VP3 adalah protein apoptin, yang mampu menginduksis apoptosis pada sel limosit pada ayam dan beberapa jalur sel pada sel tumor. Tetapi tidak menginduksi lisis pada sel normal. Protein apoptin memiliki massa 13 KDa. Mekanisme spesifitas dari apoptin hingga saat ini belum diketahui. Untuk mendapatkan gen apoptin bisa didapatkan dari isolasi dari virus CAV yang menginfeksi ayam atau embrio atau sel yang dikulturkan.

VP3 (Apoptin) VP3 atau selanjutnya akan disebut dengan nama apoptin adalah protein yang terdiri dari 121 asam amino terdiri terutama dari prolin, serin, threonin dan asam amino dasar lainnya. Apoptin menganding sinyal Bipartite-type nuclear (atau NLS1 dan NLS2) pada posisi 82-88 dan 111-121 atau pada ujung c-terminalnya. Dan nuclear export signal (NES) yang menunjukkan adanya potensi perpindahan dari nukleus ke sitoplasma dan sebaliknya. Apoptin memiliki kemampuan untuk menginduksi terjadinya apoptosis pada sel kanker manusia namun tidak pada sel normal. Sel memicu apoptosis dengan cara intrinsik mitokondrial yang memerlukan caspase-3 dan caspase-9. Belum ada mekanisme yang jelas mengapa apoptin dapat spesifik membunuh lini sel dari sel kanker. Tetapi salah satu sebabnya adalah karena pada sel

kanker apoptin berlokalisasi di nukleus sementara pada sel normal umumnya diekspresikan di sitoplasma. Bentuk apoptin sangat stabil, multimerik aktif biologis terdiri dari 30-40 monomer dan nukleoprotein kompleks tingkat tinggi.

Gambar 1. Struktur sekuens asam amino dari apoptin (Sumber. Los M, S , Paniraghi 2009)

Tahapan purifikasi DNA Chicken anemia virus dari kultur DNA CAV memiliki ukuran sekitar 2,3 kb. Untuk mendapatkan DNA CAV dan memisahkannya dari komponen virus yang lain. Yang pertama harus dilakukan adalah mengambil virus CAV yang ingin di kultur. Virus CAV dapat ditemukan pada hati ayam broiler yang terinfeksi virus. Sampel dari jaringan hati kemudian dipanaskan pada suhu 650C selama 20 menit untuk mengurai jaringan-jaringan yang kompeks. Kemudian menggunakan buffer phenol jenuh dengan volume yang sama seperti sampel untuk ditambahkan pada sampel dan mengocok sampel selama 3 menit kemudian melakukan sentrifugasi pada 14000 RPM selama 5 menit. Fenol akan berada dibagian bawah tabung. Kemudian lapisan atas dari lisat dipisahkan dan dicampurkan dengan kloroform pada volume yang sama dengan sampel. Dan disentrifugasi pada 14000 RPM selama 5 menit. Bagian atas dari hasil sentrifugat dipisahkan. Metode tersebut dikenal dengan ekstraksi fenol-kloroform. Penambahan fenol berfungsi untuk memisahkan fasa-fasa pada virus. Fasa organik akan terikat pada fenol dan kloroform. Fasa organik akan lebih berat dan mengikat protein-protein berat seperti kapsid yang menyusun virus. Kemudian komponen DNA akan terikat pada fasa cair yang lebih ringan. Fenol dipilih karena memiliki kelarutan yang buruk sehingga protein yang larut dalam fenol akan terpisah dari cairan. Metode pemisahan ini lebih baik dibandingkan metode pemisahan dengan kolom adsorpsi karena meskipun memakan waktu lebih lama, dapat mendapatkan DNA yang lebih murni. Hal ini
4

dikarenakan kemampuan fenol untuk memisahkan fasa lebih baik dibandingkan pengikatan kovalen pada proses adsorpsi. Kemudian menambahkan NaAc 3M pada sampel sebanyak 1/10 dari volume sampel. Dan kemudian menambahkan juga 100% EtOH sebanyak 2 kali volum sampel. Setelah mengocok sampel selama beberapa detik, sampel didinginkan pada suhu -200C selama 30 menit. Setelah waktu pendinginan selesai, melakukan sentrifugasi lagi pada 14000 RPM selama 5 menit. Setelah 5 menit jika tidak terbentuk pelet pada sampel lakukan ulang sentrifugasi selama 5 menit. Kemudian memisahkan pelet dari supernatan dengan pipet secara perlahan-lahan. Penambahan etanol ditujukan untuk mengendapkan DNA. Karena DNA memiliki sifat yang sangat polar akibat muatan yang dimiliki struktur fosfatnya. Untuk itu, etanol yang memiliki sifat tidak polar dapat menyebabkan adanya atraksi elektrik antara gugus fosfat dan ion positif yang ada dalam larutan sampel sehingga membentuk ikatan ion dan mengendapkan DNA. Ion yang nantinya berikatan dengan DNA untuk diendapkan adalah ion natrium yang berasal dari Natrium asetat. Setelah itu pelet dibiarkan kering sehingga tidak ada cairan lagi didalam sampel. Pelet kemudian disuspensikan didalam air. Sampel tersebut seharusnya mengandung DNA virus CAV yang murni untuk kemudian dilakukan tahapan berikutnya.

Menentukan posisi gen apoptin Setelah mendapatkan DNA dari CAV, langkah selanjutnya adalah mencari gen yang mengkodekan apoptin. Seperti telah dibahas pada bagian sebelumnya, apoptin atau VP3 adalah protein yang dikodekan oleh 121 basa nitrogen. Sementara pada CAV terdapat 3 macam protein yang dapat dikodekan dengan DNA CAV memiliki panjang 2,1 KB. Untuk menggandakan gen apoptin kita akan menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction). Metode PCR dapat mengamplifikasi atau menggandakan bagian tertentu dari suatu DNA. Agar dapat mengamplifikasi sampel, PCR menggunakan sebuah oligonukleotida yang dinamakan primer. Primer adalah rantai DNA yang bersifat komplementer dengan fragmen yang ingin digandakan. Sehingga untuk dapat mengamplifikasi rantai DNA di CAV yang mengkodekan VP3 perlu diketahui sekuens DNA. Mengetahui sekuens DNA dilakukan dengan metode sanger atau sekuensing dengan dideoksi. Metode sanger dipilih dibanding metode lainnya karena metode sanger mudah dilakukan dan tidak menggunakan bahan yang merusak sampel seperti metode maxam-gilbert (Lampiran 2). Kemudian setelah dipetakan sekuens dari DNA CAV, kita dapat membuat primer yang sesuai dengan kode gen yang mengkodekan VP3.

Modifikasi gen apoptin dengan penambahan histidin pada ujung N-terminal Penambahan histidin pada DNA rekombinan umum dilakukan. Hal tersebut bertujuan memudahkan pada saat panen protein. Hal tersebut karena histidin cenderung bersifat lengket. Metode ini atau dinamakan Histidine tagging. Memanfaatkan afinitas histidin terhadap beberapa media yang mengandung logam bermuatan seperti kobalt atau nikel. Protein rekombinan yang mengandung histidin akan cenderung berinteraksi ionik dengan logam-logam tadi. Sementara protein yang lain tidak mempunyai afinitas yang sama. Kemudian didalam media tersebut, dibilas dengan buffer. Misalnya buffer fosfat sehingga protein lain akan terbilas sementara protein rekombinan yang mengandung histidin akan tetap menempel pada media. Metode ini biasanya menggunakan minimal 5 buah rantai histidin. Untuk menambahkan histidin pada DNA rekombinan umumnya dilakukan pada saat mengamplifikasi DNA yang akan menjadi insert. Hal ini disebabkan cara penambahan yang mudah dilakukan. Karena hal yang perlu dilakukan adalah melakukan modifikasi pada pemesanan primer DNA yang akan digunakan untuk PCR. Histidin akan ditempelkan pada ujung N-Terminal dari apoptin. DNA ditranslasikan dari ujun 5 ke ujung 3. Dimana ujung 5 berarti mengkodekan ujung N-Terminal dan ujung 3 tempat dimana berada C-Terminal.
Tabel 1. Kode Asam Amino

Sumber. Nakamoto, T. 2009

Untuk itu jika ingin menambahkan histidin pada N-Terminal maka penambahan histidin dilakukan pada ujung 5 primer. Penambahan histidin dilakukan dengan menambahkan basa nitrogen yang mengkodekan histidin setelah kodon start pada primer.

Berdasarkan tabel diatas, berarti dibutuhkan penambahan 10 kodon CAT atau CAC setelah kodon AUG sebagai kodon start untuk menambahkan 10 rantai histidin pada N-Terminal apoptin. Baru kemudian primer yang komplementer dengan gen VP3 yang diketahui melalui sekuensing.

Gambar 2. Desain primer yang telah ditambahkan Histidin

Sehingga hasil DNA yang didapatkan sebagai hasil PCR adalah rantai DNA yang mengkodekan apoptin beserta 10 rantai histidin pada N-Terminalnya

Modifikasi gen apoptin dengan penambahan arginin pada uajung C-terminal Menambahkan arginin pada C-Terminal tidak sesederhana seperti menambahkan histidin. Pada penambahan di N-Terminal, pemanjangan DNA oleh DNA polimerase akan dilakukan dari arah 5 ke ujung 3 dan urutan basa nitrogen di ujung 5 tidak akan terpengaruh. Sementara pada modifikasi di ujung 3 jika dilakukan sebelum terjadi pemanjangan DNA maka ketika pemanjangan terjadi, basa nitrogen yang tadinya terletak paling ujung tidak akan terletak di ujung 3 lagi melainkan ditengah-tengah rantai yang baru mengalami pemanjangan. Untuk mengatasi hal berikut metode lain selain modifikasi primer perlu dilakukan. Ada 2 pilihan cara untuk menambahkan arginin pada ujung C-terminal. Cara pertama adalah dengan meligasikan gen yang mengkodekan arginin pada plasmid yang disiapkan sebagai vektor. Sementara cara kedua adalah melakukan ligasi pada insert hasil PCR yang akan disisipkan. Cara yang dilakukan adalah cara yang kedua karena gen hasil PCR ada dalam jumlah banyak dan dapat digandakan dengan mudah. Selain itu panjang dari gen tidak terlalu besar sehingga lebih mudah dilakukan modifikasi. Untuk menempelkan dengan cara yang kedua yang perlu disiapkan adalah gen hasil PCR, enzim ligase, ATP dan kodon yang mengkodekan arginin (AGG atau AGA). Kodon yang mengkodekan arginin akan menempel pada C-terminal dibandingkan pada N-Terminal karena gugus OH lebih mudah diserang oleh fosfat yang dibawa oleh ATP. Setelah proses tersebut selesai akan didapatkan banyak DNA yang mengkodekan apoptin yang memiliki histidin di ujung N-terminal dan arginin di ujung C-Terminal. Kemudian gen tersebut siap untuk dimasukkan kedalam vektor untuk proses transformasi.

2.2. Strategi Isolasi Plasmid pUC19

Konsep dasar vektor dalam teknik kloning Seperti yang telah kita ketahui bahwa transformasi sel inang dilakukan menggunakan perantara vector. Jadi, vektor adalah molekul DNA yang berfungsi sebagai wahana atau kendaraan yang akan membawa suatu fragmen DNA masuk ke dalam sel inang dan memungkinkan terjadinya replikasi dan ekspresi fragmen DNA asing tersebut. Vektor yang dapat digunakan pada sel inang prokariot, khususnya E. coli, adalah plasmid, bakteriofag, kosmid, dan fasmid. Untuk dapat dikatakan vector yang tergolong baik, maka harus memenuhi beberapa syarat penting sebagai berikut : (1) Mempunyai ukuran relative kecil dibandingkan dengan pori dinding sel inang sehingga dapat dengan mudah melintasinya, (2) Mempunyai sekurang kurangnya dua gen marker yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid ke dalam sel inang, (3) Mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang kurangnya didalam salah satu marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA, dan (4) Memiliki titik awal replikasi (ori) sehingga dapat melakukan replikasi didalam sel inangnya. Selain itu terdapat syarat tambahan yang dapat digunakan untuk memperhitungkan vector mana yang dianggap baik, walaupun syarat ini tidak terlalu penting : (a) Memiliki ukuran yang cocok. Faktor ini berpengaruh pada aktivitas pemotongan dan penyambungan. Tempat pemotongan enzim restriksi yang meliputi 6 nukleotida akan terjadi pada sekali pada setiap 46 bp. Oleh karena itu, vector yang memiliki ukurang lebih dari 4 kbp mungkin akan memiliki beberapa lokasi untuk enzim yang diberikan dan pemotongan vector akan menguranginya menjadi beberapa pieces yang akan memberikan hasil yang tepat pada proses ligasinya. Selain itu, apabila ukuran terlalu besar maka akan sulit menghandlenya,. (b) Memiliki penanda untuk insersi DNA Misalkan, insersi DNA kedalam vector dapat dideteksi dengan inaktivasi gene lacZ. (c) Memiliki kemampuan tinggi untuk mengcopy Untuk memaksimalkan hasil plasmid dari transformasi sel, jumlah copy di setiap selnya sebaiknya setinggi mungkin. Bagian bagian penting didalam vector beserta fungsi dari bagian tersebut adalah sebagai berikut : Origin of replication : merupakan sekuen DNA yang mana replikasi dapat diinsiasi. Untuk DNAs kecil termasuk plasmid bakteri cukup memiliki satu single origin saja. Tapi lebih
8

besar DNAs memiliki lebih banyak origins dan replikasi DNA diinsiasi pada setiap daerah tersebut. Promoter : untuk mengontrol ekspresi gen. Ekspresi vektor memiliki tujuan untuk mengendalikan ekspresi gen tertentu didalam organsime inang (misalkan E.coli). kontrol tersebut dapat menjadi sangat penting. Hal ini biasanya dengan memasukkan DNA target kedalam sebuah tempat dibawah kontrol promoter tertentu. Yang biasa digunakan ialah promoter T7,dan Iac. Adaptor : molekul tambahan yang dapat digunakan untuk menyambungkan ujung tumpul fragment DNA hasil pemotongan enzim restriksi. Multiple clone site : disebut juga dengan polylinker, merupakan segment pendek dari DNA yang terdapat beberapa restriction site sampai lebih dari 20 tempat. MCS mengizinkan untuk insersi DNA kedalam vector yang ditargetkan dan memungkinkan mengarahkan dalam orientasi yang dipilih.

Pemilihan plasmid pUC19 sebagai vektor dalam teknik kloning gen apoptin Pada kasus kali ini dipilih vector yang akan digunakan ialah pUC19 (Gambar 3) yang diambil dari bakteri E.Coli. Pemilihan vektor yang digunakan didasarkan pada pertimbangan panjang gen yang akan diligasi serta host yang akan digunakan. Dari beberapa laporan penelitian vektor plasmid puC19 memberikan hasil yang memuaskan pada pembuatan pustaka DNA dengan panjang gen < 2000bps serta menggunakan host E coli (Hanahan, 1983; Yanisch-Perron et al.,1985; Liu dan Niu, 2008). Plasmid ini sangat mudah ditransfeksikan kedalam E coli dengan metode yang sederhana dan relatif murah seperti heat shock serta dapat dengan cepat bereplikasi dan amat mudah diseleksi dengan metode white/ blue color selection (Yanisch-Perron, 1985; Chung, et al., 1989).

Gambar 3. Vektor pUC 19 (Sumber. http://www.fermentas.com/en/products/all/molecular-cloning/vectors-phage/sd005-puc18-puc19-dna)

pUC19 merupakan vektor yang memiki circular double stranded DNA dan mempunyai 2686 pasang basa. puC19 adalah salah satu molekul vektor yang paling banyak digunakan sebagai rekombinan atau pengenalan DNA asing, dapat dengan mudah dibedakan dari non rekombinannya berdasarkan perbedaan warna koloni pada media pertumbuhan. pUC18 hampir mirip dengan pUC19 namun wilayah MCS nya dibalik (Lampiran 3). Mirip dengan plasmid plasmid yang lain, puC 19 memiliki oriV, gen bla yang terdapat ampicilin resistance dan memiliki fragmen DNA special dengan beberapa perbedaan recognition sites untuk restriksi endonuklease. Sekuen Multiple cloning site berada pada bagian 5 dari lacZ gene yang mengkodekan untuk amino, bagian N terminal dari beta-galactosidase (LacZ) dari E.coli. Daerah MCS berada dalam lacZ gene (kodon 6 7 lac Z digantikan oleh MCS), dimana bermacam jenis sisi restriksi untuk beberapa restriksi endonuklease itu ada. Strain bakteri yang cocok untuk sistem seleksi ini seharusnya memiliki bagian 3 dari gen lacZ yang menyandikan bagian terminal carboksi utuh.

Isolasi plasmid pCU19 dari bakteri E.coli JM109 Secara umum, isolasi DNA plasmid menghasilkan DNA plasmid yang diinginkan. Isolasi DNA plasmid dilakukan dengan cara isolasi DNA plasmid pUC19 yang terdapat dalam E.coli JM 109. Bakteri inang pembawa pUC 19 ini ditumbuhkan dalam kompleks : Luria Bertani sebagai sumber DNA. Dalam medium LB pada suhu 37oC dengan pengocokan pada kecepatan 150 250 r/menit, sel E.coli akan membelah sekali setiap 20 menit sampai kultur mencapai densitas maksimum kira kira 2 0 3 x 109 sel/ml. E. coli JM109 dipanen, diambil 3 ml dan disentrifugasi pada
kecepatan 5700 x g selama 5 menit. Tujuan dari sentrifugasi ini adalah untuk mengendapkan bakteri pada dasar tabung karena untuk penyiapan ekstrak sel bakteri harus diperoleh dalam volume yang sekecil mungkin.

Untuk isolasi dan purifikasi plasmid terdapat 2 metode yang terkenal yaitu denaturasi dengan alkali atau metode sentrifuge isopiknat. Namun dalam pembahasan kali ini akan digunakan metoda denaturasi dengan alkali karena metode ini merupakan metode yang popular saat ini. Untuk isolasi dan purifikasi DNA memiliki 4 bagian penting yang meliputi (1) Pemecahan sel, (2) Penghilangan protein dan kromosom DNA, (3) Pengambilan plasmid dan (4) Pemurnian lebih lanjut apabila dibutuhkan Pada langkah awal isolasi DNA yaitu lisis sel, dimana dapat digunakan buffer P1 dan P2. Dimana buffer P1 telah ditambah dengan enzim RNAse A dan deterjen Sodium Dodesil Sulfat (SDS) dan indicator LyseBlue. Kombinasi RNAse dan SDS inilah yang dapat merusak dinding dan lisis sel. Menurut Birnboim dan Doly (1979) dengan hasil pengamatan terdapat rentang pH 12 -12,5 ikatan hydrogen dari DNA kromosom non supercoiled akan terdenaturasi, heliks ganda terurai dan
10

kedua rantai polipeptida memisah. Pendenaturasian ini perlu dicek apakah telah berhasil atau belum yaitu dengan penambahan buffer P2 yang dapat memperjelas proses ini. Jika denaturasi telah terjadi, maka suspense pelet sel akan berwarna biru karena adanya reaksi dengan indicator Lyse Blue. Proses renaturasi selanjutnya dilakukan dengan cara mengembalikan DNA pada kondisi asam dengan penambahan buffer N3 yang mengandung asam asetat. Pemberian asam akan menyebabkan DNA bakteri yang sebelumnya terdenaturasi mengelompok dalam massa DNA linier yang kusut. Sentrifugasi selanjutnya pada kecepatan 13000 selama 10 menit akan mengendapkan massa DNA ini didasar tabung sentrifugasi dan meninggalkan plasmid murni dalam supernatant. Penambahan RNAse A (ribonuklease) dan SDS di buffer pertama (P1) menyebabkan sebagian besar protein dan RNA menjadi tidak larut dan dapat dihilangkan pada tahap sentrifugasi (ikut mengendap bersama massa DNA, dinding serta debris sel lainnya). Karena metode ini menggunakan metode denaturasi alkali maka keuntungannya ialah tidak diperlukan presipitasi menggunakan fenol atau pelarut organic seperti kloroform untuk menghilangkan sisa protein. Supernatan yang berisi plasmid murni kemudian dicuci dua kali menggunakan buffer PB yang isinya mengandung isopropanol dan buffer PE yang mengandung 96 100% ethanol. Kemudian supernatant plasmid kemudian dipindahkan ke tabung mikrosentrifuge baru dan dielusi sebanyak 2 kali dengan buffer EB (Elution Buffer) dimana masing masing melewati sentrifugasi pada 13000 rpm selama satu menit. Hasil elusi inilah DNA plasmid pUC19 yang telah berhasil diisolasikan dari E.coli JM109

2.3. Startegi Penyisipan Insert Gen Apoptin ke dalam Vektor Plamid pUC19 Penambahan alkalin fosfatase pada larutan vektor penambahan insert penambahan buffer penambahan air (pelarut) penambahan DNA ligase inkubasi campuran larutan

Penambahan alkaline phosphatase ke dalam larutan vektor Penambahan alkalin fosfatase pada larutan vektor (sebelum dicampur dengan insert) untuk menghilangkan gugus P pada 5P sehingga menjadi 5OH (defosforilasi) sehingga dapat meminimalisasi terjadinya kemungkinan vektor menyambung pada vektor itu sendiri atau vektor menyambung dengan vektor lain (terjadi ligasi antar vektor) (Lampiran 4). Dengan berubahnya 5P menjadi 5OH maka yang diharapkan terjadi yaitu vektor hanya berikatan dengan insert, 3OH pada vektor akan menyambung pada 5P insert, akan tetapi 3OH insert tidak dapat menyambung ke vektor karena 5P vektor telah berubah menjadi 5OH sehingga terjadi nick atau celah. Meskipun

11

terjadi celah, insert dan vektor tetap berikatan dan dapat ditransformasikan dimana celah ini nanti akan diperbaiki di dalam sel apabila berhasil ditransformasikan (Gambar 4).

Gambar 4. Mekanisme Efisiensi Ligasi (Sumber. Anam, Khairul. 2009. Laporan Praktikum Genetika Molekular: DNA Rekombinasi. Sekolah Pascasarjana Bioteknologi, Institut Pertanian Bogor)

Penambahan buffer Fungsi buffer adalah untuk mempertahankan pH pada nilai tertentu agar DNA tidak terdegradasi dengan penambahan bahan lainnya. Umumnya digunakan buffer yang mengandung ATP karena sebagian besar enzim restriksi buffer akan bekerja jika dilengkapi dengan ATP. Buffer biasanya diberikan atau disiapkan sebagai konsentrat 10X yang, setelah pengenceran, konsentrasi ATP menghasilkan sekitar 0,25-1 mM. Hal ini juga disesuaikan dengan penggunaan pelarut dan enzim yang akan ditambahkan pada langkah selanjutnya sehingga tercipta kondisi yang sesuai untuk proses ligasi fragmen DNA (insert) dengan vektor.

Penambahan air (pelarut) Umumnya pelarut yang digunakan adalah ddH2O (double-distilled water) karena dapat melarutkan DNA atau RNA dengan baik. ddH2O atau disebut juga aqua bidestillata atau ultrapure water, adalah air yang sangat murni, lebih murni dari aquadest atau pun air reverse osmosis karena telah melalui berbagai macam cara pemurnian. Secara umum ddH2O dibuat dengan melewatkan aquadest ke dalam suatu cartridge berisi resin-resin filter dan deionisasi untuk menghilangkan ionion dari air, hingga diperoleh nilai hantaran listrik yang sangat kecil (sekitar 5.5 106 Sm1 atau 18 M cm), terakhir air tersebut dilewatkan melalui filter membran dengan pori-pori 0.22 l. Biasanya ddH2O tidak perlu disterilkan lagi menggunakan autoclave. Penambahan ddH2O adalah untuk pemurnian dan proses vakum. Selain itu penambahan ddH2O juga memiliki efek positif, yaitu tidak mengandung EDTA seperti pelarut TE Buffer (campuran antara larutan Tris-HCl dengan EDTA). EDTA merupakan chelating agent yang dapat
12

membentuk senyawaan kompleks dengan ion logam seperti Mg2+ dan menghambat aplikasi enzimatis. Namun penambahan ddH2O memiliki efek negatif yakni timbul peluang untuk berubahnya pH. Ini dapat terjadi karena DNA dan RNA memiliki sifat asam lemah. yang dalam waktu lama dapat menyebabkan degradasi DNA/RNA, apalagi DNase juga bekerja pada pH yang sedikit asam. Oleh karena itu dilakukan penambahan buffer di awal.

Penambahan DNA Ligase DNA ligase ditambahkan paling akhir karena kondisi larutan telah disesuaikan terlebih dahulu agar ligasi dapat berjalan efektif. DNA ligase merupakan enzim yang mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara ujung 5-fosfat dan 3-hidroksil pada DNA yang mengalami nick. Nick pada DNA dapat terjadi pada saat replikasi DNA, rekombinasi dan kerusakan. Jenis DNA ligase yang digunakan pada kloning umumnya adalah T4 DNA Ligase yaitu enzim ligase yang dihasilkan oleh bakteri E. coli yang telah terinfeksi virus T4. Enzim ini akan meligasi fragmen DNA yang menggantung, memiliki ujung kohesif (lengket) maupun ujung tumpul. Untuk meligasi fragmen DNA yang memiliki ujung tumpul, diperlukan konsentrasi enzim yang lebih besar. Kofaktor T4 DNA Ligase adalah ATP sehingga proses ligasi DNA T4 memerlukan larutan penyangga (buffer) yang mengandung ATP dengan konsentrasi 0.25-1 mM seperti yang telah ditambahkan sebelumnya. Mekanisme DNA ligase dimulai dari hidrolisis kofaktor, yaitu ATP. Peristiwa ini menghasilkan kompleks enzim-adenylate AMP yang berikatan kovalen dengan grup -amino residu lysin pada sisi aktif dengan melepaskan pyrofosfat inorganik (PPi). Kemudian sebagian AMP akan berpindah dari sisi aktif lysin ke ujung bebas 5-fosfat yang berada pada nick utas DNA. Pada akhirnya, ikatan fosfodiester akan terbentuk antara ujung 3-OH yang berada di ujung nick
Gambar 5. Mekanisme DNA Ligase (Sumber. http://id.wikipedia.org/wiki/DNA_ligase)

dengan 5-fosfat dan melepaskan AMP dan enzim adenylate.

Inkubasi campuran larutan Suhu optimum aktivitas DNA ligase adalah pada suhu 37C, tetapi pada suhu tersebut ikatan hidrogen yang terbentuk di antara ujung lancip (lengket) menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan tersebut dan mengakibatkan denaturasi. Maka, alternatif yang
13

baik dilakukan dalam proses ini adalah inkubasi pada suhu yang diturunkan dengan waktu inkubasi yang diperpanjang. Suhu inkubasi optimal untuk T4 DNA ligase 160C. Namun hal ini biasanya dilakukan jika diinginginkan efisiensi yang tinggi dalam ligasi (contohnya dalam membuat pustaka genom), tetapi jika ligasi bertujuan untuk kloning umumnya ligasi dilakukan pada suhu 4 C semalaman, atau pada suhu ruang selama 30 menit hingga beberapa jam. Pada akhirnya terjadi transformasi dan fragmen DNA yang diinginkan (insert) dapat disisipkan ke dalam molekul DNA (vektor).

2.4. Strategi Pemasukan Gen Apoptin Rekombinan ke dalam E.coli BL12(DE3)

Pemilihan bakteri Escherichia Coli sebagai sel inang dalam proses kloning gen apoptin Escherichia coli merupakan bakteri berbentuk batang dengan panjang sekitar 2 micrometer dan diameter 0.5 micrometer. Bakteri ini umumnya hidup pada rentang 20- 400C, optimum pada 370. E. coli ditemukan pertama kali oleh Theodore Eschetrch pada tahun 1885, dan hingga kini bakteri ini menjadi salah satu tulang punggung dunia bioteknologi. Hapir semua rekayasa genetika di dunia bioteknologi selalu melibatkan E.coli, termasuk dalam proses kloning.

Escherichia coli Kingdom : Bacteria Phylum Class Order Family


Gambar 6. Koloni E.coli (Sumber. http://en.wikipedia.org/e-coli, diakses pada 20 September 2012, pukul 22.08)

: Proteobacteria : Gamma proteobacteria : Enterobacteriales : Enterobactericeae : Escherichia coli : Escherichia coli

Genus Species

Pemilihan E.coli sebagai host cell adalah karena bakteri ini memiliki laju pertumbuhan yang cenderung lebih cepat, dapat dikultivasi pada medium kultur biasa, berbagai gen asing yang mengkode protein target dapat diterima dan diekspresikan dengan baik oleh E.coli. Namun penggunaan E.coli sebagai host cell juga memiliki kelemahan, salah satunya adalah sinyal transkripsi dan translasi spesies lain tidak dikenali dengan baik oleh inang E.coli, sehingga ekspresi gen-gen heterolog di E.coli lemah. Selain itu, masalah serius pada ekspresi protein rekombinan pada E.coli, yaitu degradasi protein produk secara cepat dan seringkali protein rekombinan justru terakumulasi dan membentuk agregat kompak, yang bersifat inaktif tidak larut (sehingga menghambat proses purifikasi), yang disebut dengan badan inklusi (inclusion bodies). Efek lebih
14

buruk dari fenomena ini adalah protein dapat menjadi tidak aktif. Hal ini terjadi karena keterbatasan E.coli dalam membentuk struktur tiga dimensi protein secara benar dalam proses pelipatan pasca translasi. Bakteri Escherichia coli merupakan bakteri gram negatif yang tahan hidup dalam media yang kekurangan zat gizi. Namun susunan dinding sel bakteri gram negatif lebih kompleks daripada sel bakteri gram positif. Bakteri gram negatif mengandung sejumlah besar lapisan lipoprotein, lipopolisakarida, dam lemak (Yalun, 2008) (Lampiran 5). Adanya lapisan-lapisan tersebut mempengaruhi aktivitas kerja DNA rekombinan saat memasuki sel inangnya, dan memperlambat waktu proses kloning, serta potensi untuk terjadinya kegagalan proses transformasi lebih besar jika dibandingkan dengan bakteri gram positif, seperti Bacillus subtillis. E.coli memiliki banyak strain yang dapat digunakan dalam tahapan rekayasa genetika. Setiap strain memiliki tingkat efisiensi transformasi yang berbeda-beda dan kemampuan untuk mengekspresikan gen pengkode yang terdapat pada pUC19.
Tabel 2. Protein Expression Strain Properties

(Sumber. Anonim. 2000. Competent Cell Clining and Protein Expression. New England Biolabs Inc. http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/pdf/brochures/CompetentCell.pdf/. Diakses pada 28 September 2012, pukul 23.12)

Pada proses kloning gen apoptin ini, hots cell yang digunakan adalah E.coli BL21(DE3). Selain memiliki tingkat efisiensi transformasi yang cenderung lebih tinggi, Strain BL21(DE3) memiliki gen DE3 pengkode T7 RNA polimerase yang dapat mengekspresikan gen target pada vektor ekspresi dengan induksi IPTG (Isopropil thiogalaktosida). Induksi dari T7 RNA polimerase pada E.coli BL21 (DE3) akan mensintesis mRNA dalam jumlah yang tinggi. Dan pada sebagian besar penelitian, akumulasi protein heterologus dalam jumlah tinggi juga dapat diperoleh. Strain

15

tersebut juga memiliki mutasi Ion dan OmpT protease sehingga dapat meminimalisir degradasi protein rekombinan yang terekspresi. Selain itu, sel inang yang digunakan dalam hal ini E.coli BL21(DE3), adalah bakteri yang diperoleh pada tahap logaritmik (log phase) karena pada tahap ini masih ada kesempatan bagi sel inang untuk membelah dan memperbanyak diri sehingga ada peluang bagi plasmid yang diperoleh menjadi lebih banyak sebelum disebar pada media (Lampiran 6).

Pembuatan bakteri kompeten Sebelum dilakukan proses transformasi, terlebih dahulu E.coli BL21(DE3) harus dibuat kompeten. Keadaan kompeten adalah keadaan dimana bakteri (host cell) siap untuk dimasukin oleh materi genetik asing. Pembuatan bakteri kompeten dilakukan dengan penambahan larutan CaCl 2, sehingga mengingkatkan kemapuannya untuk mengambil DNA. Larutan CaCl2 dalam keadaan dingin efektif untuk memperlemah dindig sel dan meningkatkan permeabilitasnya sehingga mudah mengikat DNA. Dinding sel yang dilindungi oleh lipoprotein dengan plasmid yang sama-sama bermuatan negatif akan sulit untuk menempel. Penambahan larutan CaCl2 membantu mengubah sifat permeabilitas sel. Bakteri yang tadinya terdapat pada bagian pelet kemudian diresuspensi kembali dengan larutan MgCl2. Mg2+ dapat menurunkan kerapatan membran. Hal ini dikarenakan adanya interaksi antara mineral tersebut dengan bagian hidrofilik membran. Melalui hasil ini dapat diketahui bahwa penamabahan MgCl2 berperan dalam mengganggu kestabilan membran sel E.coli BL21(DE3).

Transformasi gen apoptin rekombinan ke dalam E.coli BL21(DE3) Tahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke dalam sel inang ini dinamakan transformasi, karena sel inang diharapkan akan mengalami perubahan sifat tertentu setelah dimasuki molekul DNA rekombinan. Teknik transformasi pertama kali dikembangkan pada tahun 1970 oleh M. Mandel dan A. Higa, yang melakukan transformasi bakteri E.coli. Hal terpenting yang ditemukan oleh Mandel dan Higa adalah perlakuan kalsium klorid (CaCl2) yang memungkinkan sel-sel mengambil DNA dari bakteriofag E. coli untuk

. Pada tahun 1972 S.N. Cohen dan kawan-kawannya

menemukan bahwa sel-sel yang diperlakukan dengan CaCl2 dapat juga mengambil DNA plasmid. Frekuensi transformasi tertinggi akan diperoleh jika sel bakteri dan DNA dicampur di dalam larutan CaCl2 pada suhu 0 hingga 5C. Perlakuan kejut panas antara 37 dan 45C selama lebih kurang satu menit yang diberikan setelah pencampuran DNA dengan larutan CaCl2 tersebut dapat meningkatkan frekuensi transformasi tetapi tidak terlalu esensial. Molekul DNA berukuran besar lebih rendah efisiensi transformasinya daripada molekul DNA kecil.
16

Mekanisme transformasi belum sepenuhnya dapat dijelaskan. Namun, setidaktidaknya transformasi melibatkan tahap-tahap berikut ini. Molekul CaCl2 akan menyebabkan sel-sel bakteri membengkak dan membentuk sferoplas yang kehilangan protein periplasmiknya sehingga dinding sel menjadi bocor. DNA yang ditambahkan ke dalam campuran ini akan membentuk kompleks resisten DNase dengan ion-ion Ca2+ yang terikat pada permukaan sel. Kompleks ini kemudian diambil oleh sel selama perlakuan kejut panas diberikan. Pemberian kerjutan panas (heat shock) yang diikuti pendinginan akan menjadikan dinding sel kembali seperti semula. Secara garis besar, sebenarnya ada dua teknik yang dapat digunakan untuk memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel inangnya, yakni chemical transformation, menggunakan metode heat shock (seperti yang telah dijelaskan sebelumnya) atau electroporation, menggunakan kejutan listrik. Dalam teknik kloning gen apoptin menggunakan vektor plamid dan E.coli BL21(DE3) sebagai host cell, teknik transformasi yang digunakan adalah chemical tranformation. Berikut adalah protokol yang dilakukan dalam tahapan transformasi gen apoptin rekombinan.

Gambar 7. Skema tahapan transformasi (Sumber. Anonim. 2010. Transformasi, Ekspresi Gen Asing dalam Sel Bakteri. http://sciencebio- tech.net/transformasiekspresi-gen-asing-dalam-sel-bakteri/ diakses pada 28 September 2012, pukul 23.44)

Sebagai perbandingan, selain teknik heat-shock, sejak tahun 1980 telah digunakan teknik elektroforasi yaitu dengan mengejutkan sel bakteri dengan medan listrik berkekuatan tinggi (1020 kV/cm). Saking terkejutnya, akan terbentuk lubang-lubang pada dinding sel yang bisa diterobos DNA pUC19 berukuran besar dan kemudian lubang tersebut akan tertutup dengan sendirinya (Lampiran 7).

Mengidentifikasi klon yang diinginkan


17

Pada saat proses transformasi, DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya DNA rekombinan, maka dari itu harus dilakukan seleksi untuk memilih sel inang transforman yang membawa DNA rekombinan. Selanjutnya, diantara sel-sel transforman yang membawa DNA rekombinan, kita juga harus melakukan seleksi untuk mendapatkan sel DNA rekombinannya membawa fragmen sisipan atau gen yang dinginkan, dalam hal ini gen apoptin. Menurut Muladno (2002) dalam proses transformasi ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah tahapan transformasi dilakukan, antara lain : a) sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti transformasi yang dilakukan gagal b) sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal c) sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan atau tanpa fragmen sisipan atau gen apoptin yang diinginkan. Untuk membedakan antara kemungkinan pertama dan kedua dilihat perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang memperlihatkan dua sifat marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan kedualah yang terjadi. Selanjutnya, untuk membedakan antara kemungkinan kedua dan ketiga dilihat pula perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang hanya memperlihatkan salah satu sifat di antara kedua marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan ketigalah yang terjadi. Menemukan sel yang mengandung hasil insersi yang diinginkan diantara semua sel perpustakaan genomik merupakan kerja yang sulit. Proses tersebut melibatkan penelusuran semua sel rekombinan atau fag yang diperoleh dari transformasi atau transduksi untuk menemukan klon yang diinginkan. Proses ini dinamakan dengan proses screening. Kemungkinan menemukan fragmen gen yang diinginkan dalam sebuh perpustakaan gen tertentu bisa diestimasi melalui rumus berikut ini. ( )

dimana N adalah jumlah rekombinan yang perlu discreening, n adalah rasio ukuran genom organisme relatif terhadap ukuran fragmen rata-rata dalam perpustakaan gen, P sama dengan probabilitas (apabila p = 0.95 berarti ada 95% kemungkinan untuk menemukan klon tersebut).

Contoh. Kelompok kami melakukan proses kloning gen apoptin yang diisolasi dari chicken anemia virus, menggunakan plasmid sebagai vektornya. Ukuran genom apoptin hasil transformasi adalah 1,4 x 103 kb dan ukuran rata-rata fragmen perpustkaan adalah 2,32 kb. Perpustakaan genomik dibuat dalam vektor-vektor yang ditransformasi ke dalam sel-sel bakteri E. coli BL21(DE3).

18

Dengan propabilitas 95%, berapa banyak koloni bakteri rekombinan yang harus discreening untuk menemukan fragmen gen apoptin tersebut? Langkah1 : mencari nilai n (rasio ukuran genom organisme relatif terhadap ukuran fragmen rata-rata dalam perpustakaan gen)

Kemudian, N (jumlah sel rekombinan yang perlu discreening guna menemukan setidaknya satu sel yang mengandung gen apoptin) bisa dihitung. Langkah 2 : ( )

Jadi, sekitar 1800 koloni bakteri yang diperoleh dari transformasi yang harus discreening guna menemukan fragmen gen apoptin dengan tingkat propabilitas yang diharapkan sekitar 95%. Jika ukuran rata-rata insersi perpustakaan gen lebih besar, maka jumlah yang harus di-screening akan menurun. Sebaliknya, jika ukuran genom lebih besar, maka semakin banyk koloni yang harus di-screening guna menperoleh keberhasilan. Rumus ini bisa bekerja sebagai panduan untuk mebuat estimasi jumlah klon yang harus di-screening. Metode screening ynag digunakan pada teknik kloning apoptin ini adalah dengan blue-white screening. Alasan penggunaan metode ini adalah karena vektor yang digunakan adalah plasmid pUC19 yang memiliki semua elemen terkait metode ini. Pada awalnya, yang harus dilakukan adalah memastikan apakah di dalam E.coli BL211(DE3) hasil transformasi benar-benar memiliki hasil rekombinan dari proses transformasi. Seperti yang kita ketahui, bahwa pada umumnya, bakteri tidak dapat hidup pada media yang mengandung antibiotik. Untuk itu pada DNA plasmid pUC19 yang ditranformasikan terdapat gen panyandi antibiotik resisten, yakni gen ampicilin resisten (ampR) agar bakteri host [E.coli BL21(DE3)] menjadi tahan hidup di media yang mengandung antibiotik. Jadi bakteri yang tidak disisipi plasmid akan mati dengan sendirinya. Permasalahan berikutnya adalah bagaimana menentukan host cell yang plasmidnya memiliki gen apoptin atau tidak? Harus selalu diingat bahwa

19

tahapan ligasi tidak 100% berhasil menyambungkan vektor dan insertnya. Bisa saja vektor tersebut berligasi sendiri (vector self-ligation), atau justru insert yang berligasi sendiri (insert self-ligation). Pada kasus ini, gen apoptin (insert) disisipkan di pertengahan gen lacZ yang merupakan penyandi lacZ- subunit dari enzim -galaktosidase. Enzim ini dapat memecah substrat seperti Xgal (suatu galaktosa yang dimodifikasi) menjadi galaktosa dan pre-chromophore 5-bromo-4-chloro3-hydroxyindole, yang selanjutnya dioksidasi menjadi 5,5-dibromo-4,4-dichloro-indigo yang berwarna biru (Gambar 8).

Gambar 8. Mekanisme degradasi X-gal oleh -galaktosidase (Sumber. http://biochem.arizona.edu, diakses pada 29 September 2012, pukul 00.07)

Jika gen LacZ masih utuh, maka koloni bakteri E.coli BL21(DE3) akan berwarna biru akibat pengaruh zat warna indigo yang dihasilkan. Tetapi jika insert berhasil disisipkan (diligasikan) dengan vektor, otomatis gen lacZ-nya akan terdisrupsi alias rusak dan ujung-ujungnya tidak mampu menghasilkan indigo yang berwarna biru, sehingga koloni akan berwarna putih. Jadi hanya koloni putih yang timbuh pada media yang mengandung antibiotik dan X-Gal saja yang kemungkinan mengandung gen apoptin yang ditransformasikan. Inilah mengapa proses ini dinamakan blue-white screening (Gambar 9).

20

Gambar 9. Proses ligasi insert-plasmid (Sumber. http://biochem.arizona.edu, diakses pada 29 September 2012, pukul 00.12)

Menurut Mangunwardoyo (2002) transforman yang dihasilkan ada yang berwarna biru dan putih atau putih berubah menjadi biru, adanya warna biru karena senyawa X-gal dalam medium. Hal ini terjadi karena adanya -komplementasi di mana vektor plasmid pUC 19 pada bagian polilingkernya masing-masing mengkode 146 asam amino dari galaktosidase (-gal), sedangkan inangnya mengkode bagian C-terminal dan merupakan komplemen dari -gal. Jika gen penyandi amino terminal -gal dari vektor plasmid dirusak dengan adanya fragmen DNA, maka protein gal tidak terbentuk, hal ini menyebabkan koloni berwarna putih pada medium yang mengandung Xgal, sedangkan koloni yang melakukan komplementasi berwarna biru. Davis et al. (1994) menyebutkan terjadinya perubahan koloni yang berwarna putih menjadi biru kembali, kemungkinan disebabkan adanya pergeseran kerangka baca (frameshift) dari protein, atau mungkin disebabkan adanya aktivitas eksonuklease yang memotong fragmen tersebut. Selain metode blue-white screening terdapat pula metode hibridisasi untuk menseleksi klon rekombinan yang kita inginkan. Pada dasarnya metode ini menggunakan probe DNA berlabel untuk menandai klon yang memiliki DNA target (Lampiran 8). Probe ini sebelumnya dibuat melalui teknik PCR untuk menghasilkan sebuh potongan DNA berantai tunggal yang tersusun atas sekuens yang komplementer dengan sebagian gen yang dinginkan. Karena metode ini cenderung memakan waktu lebih lama karena harus melalui teknik PCR terlebih dahulu, maka kelompok kami menggunakan teknik blue-white screening sebagai strategi pen-seleksian.

2.5. Strategi Panen (Harvest) dan Pemurnian Gen Apoptin Hasil Kloning

Seteleh berhasil menseleksi E.coli BL21(DE3) yang mengandung plasmid rekombinan, maka dilakukanlah proses harvesting, dimana hasil dari blue-white screening disentrifugasi. Dari
21

hasil sentrigugasi ini, kemudian diambil supernatannya untuk kemudian dimurnikan. Teknik pemurnian yang digunkan adalah IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography). Teknik ini cocok dengan strategi kloning yang sebelumnya digunakan karena teknik ini menggunakan senyawaa pengkelat yang terikat secara kovalen pada zat padat pendukung kromatografi dan zat padat ini mengikat ion logam. Prinsip IMAC yaitu interaksi reversible anatara beberapa ranatai samping asam amino dan immobilized ion metal. Gen apoptin yang direkayasa sebelumnya mengandung histidin pada ujung N-terminalnya. Kehadiran His-Tag ini mengafilitasi proses pemurnian protein berdasarkan afinitas selektif protein dengan polihistinin tersebut terhadap adsorben yang dilengkapi pengkelat metal seperti Ni2+ atau Co2+. Interaksi anatra residu histidin dengan ion logam ini bersifat reversibel dan protein yang terikat dapat dielusi dengan imidazole atau dengan merendahkan nilai pH. Karena imidazole indentik dengan rantai samping histidin, maka pada saat konsentrasi imidazole ditingkatkan, imidazole akan menggantikan posisi pilihistidin pada resin, dan polihistidin akan terleusi keluar. Sehingga diperolehlah protein gen apoptin murni.

Gambar 10. Mekanisme permurnian protein dengan IMAC (Sumber. http://www.rsc.org/ej/AN/2008/b802355g/b802355g-s1.gif, diakses pada 30 September 2012, pukul 22.22)

Sebagai pembanding, teknik lain yang dapat digunakan dalam proses pemurnian adalah ionexchange chromatography dengan prinsip ikatan ionik antara asam amino dengan cation/anion exchange atau gel filtration chromatography dengan prinsip trapping molekul protein di dalam sebuah gel sebagai fase stasioner dari kolom kromatografi.

22

BAB III KELEBIHAN DAN KELEMAHAN STRATEGI YANG DIGUNAKAN

3.1. Metode Isolasi Dalam melakukan isolasi apoptin, kami memilih menggunakan metode pemisahan ekstraksi fenol kloroform. Umumnya fenol-kloroform disiapkan dalam bentuk campuran fenol-kloroformisoamil alkohol dengan perbandingan volume 25:24:1. Campuran fenol-kloroform adalah campuran yang homogen. Fenol-kloroform dan air tidak dapat bersatu sehingga akan terbentuk dua fase yakni fase air (fase aqueous) dan fase fenol-kloroform. Air adalah pelarut yang sangat polar, sedangkan fenol bersifat kurang polar dibandingkan dengan air. DNA adalah molekul polar yang disebabkan oleh adanya gugus-gugus fosfat dalam kerangkanya. Hal ini membuat DNA sangat larut dalam air dan kurang larut dalam fenol. Ketika isolat DNA yang larut dalam air dicampurkan dengan fenol, DNA tidak akan larut dalam fenol, namun tetap berada dalam fase air. Protein memiliki sifat yang berbeda dari DNA. Protein adalah polimer rantai panjang polipeptida yang tersusun atas berbagai macam asam amino. Asam amino ada yang bersifat polar (seperti glutamat, lisin dan histidin) karena memiliki residu yang bermuatan, dan ada juga asam amino yang non polar (seperti fenilalanin, leusin dan triptofan) akibat residunya yang tak bermuatan. Dalam lingkungan berpelarut air, rantai polipeptida melipat sedemikian rupa sehingga residu-residu asam amino yang kurang polar daripada air akan berada di sisi dalam protein (jauh dari air), sedangkan rantai samping asam amino yang polar akan tertata pada sisi luar protein, berikatan dengan air. Dengan kata lain residu-residu asam amino yang polar bersifat hidrofilik (suka air), dan yang non polar bersifat hidrofobik (takut air). Maka, ketika dicampurkan dengan fenol, protein terekspos dengan pelarut yang kurang polar, sehingga pola pelipatannya protein berubah. Pada dasarnya dalam kondisi tersebut residu-residu asam amino dari protein akan bertukar tempat. Residu yang kurang polar yang tadinya tersembunyi di sisi dalam protein ketika berada dalam pelarut air, kini mendesak menuju ke sisi luar untuk berinteraksi dengan pelarut fenol. Sebaliknya, residu-residu asam amino yang polar akan terselip ke sisi dalam protein, berlindung dari fenol. Dalam waktu singkat, protein mengalami denaturasi akibat perubahan pola pelipatannya. Residu non polar yang kini berada di sisi luar protein yang terdenaturasi membuat protein tersebut lebih larut di dalam fenol daripada di dalam air. Hal inilah yang mendasari proses pemisahan DNA dari protein dalam metode ekstraksi fenol. Protein akan terpisah di fase fenol, sedangkan molekul DNA yang polar tetap berada pada fase air. Kelebihan dan kekurangan yang ditawarkan bila dibandingkan dengan metode pemisahan dengan kolom adsorpsi adalah :
23

Metode Phenol - chloroform

Kelebihan DNA yang didapatkan lebih murni

Kekurangan Waktu yang dibutuhkan lebih lama. ada kemungkinan hasil isolasi DNA masih terkontaminasi (polisakarida dan protein).

Waktu yang dibutuhkan Kolom adsorpsi lebih cepat

3.2. Metode Sekuensing DNA Dalam melakukan sekuensing atau pemetaan DNA, digunakan metode sanger atau Sekuensing dengan dideoksi. Metode Sanger pada dasarnya memanfaatkan dua sifat salah satu subunit enzim DNA polimerase yang disebut fragmen klenow. Kedua sifat tersebut adalah kemampuannya untuk menyintesis DNA dengan adanya dNTP dan ketidakmampuannya untuk membedakan dNTP dengan ddNTP. Jika molekul dNTP hanya kehilangan gugus hidroksil (OH) pada atom C nomor 2 gula pentosa, molekul ddNTP atau dideoksi nukleotida juga mengalami kehilangan gugus OH pada atom C nomor 3 sehingga tidak dapat membentuk ikatan fosfodiester. Artinya, jika ddNTP disambungkan oleh fragmen klenow dengan suatu molekul DNA, maka polimerisasi lebih lanjut tidak akan terjadi atau terhenti. Basa yang terdapat pada ujung molekul DNA ini dengan sendirinya adalah basa yang dibawa oleh molekul ddNTP. Selain metode Sanger, dikenal juga metode Maxim Gilbert. Pada metode ini fragmenfragmen DNA yang akan disekuens harus dilabeli pada salah satu ujungnya, biasanya menggunakan fosfat radioaktif atau suatu nukleotida pada ujung 3. Metode Maxam-Gilbert dapat diterapkan baik untuk DNA untai ganda maupun DNA untai tunggal dan melibatkan pemotongan basa spesifik yang dilakukan dalam dua tahap. Kelebihan metode Sanger bila dibandingkan dengan teknik sekuensing DNA Maxim Gilbert adalah : Metode Kelebihan Mudah dilakukan Metode Sanger Tidak menggunakan Kekurangan hanya efektif diterapkan pada DNA bahan rantai tunggal.

yang mudah merusak sampel Metode Maxim Gilbert Dapat rantai ganda. diterapkan tunggal pada DNA Menggunakan reagen kimia dalam rantai menentukan pembelah spesifik DNA.

maupun

24

3.3. Metode Isolasi Plasmid Untuk mengisolasi plasmid, digunakan metode denaturasi dengan alkali. Secara singkatnya, sel yang akan diambil bagian plasmidnya diambil dengan mengguanakan sentrifugasi, diinkubasi dengan menggunakan yang lysosim buffer, dan dan diperlakukan dengan menggunakan alcaline dengan menggunakan

detergent. Protein

terlarut

membran

dipresipitasi

presipitate lysat dibersihkan dengan filtrasi dari presipitat melalui cheesecloth dan kemudian disentrifugasi. Dengan menggunakan metode denaturasi alkali, bakteri akan melisis sehingga dapat diambil plasmidnya, dan tidak diperlukannya pemurnian lanjutan.

3.4. Transformasi Unit Untuk transformasi unit, digunakan metode heat shock. Transformasi unit adalah ekspresi materi genetik asing yang masuk melalui dinding sel. Pada dasarnya dinding sel berfungsi melindungi sel dari masuknya benda-benda asing termasuk DNA, tapi dalam kondisi tertentu, dinding sel ini bisa memiliki semacam celah atau lubang yang bisa dimasuki DNA. Sebetulnya ada lebih dari 1% spesies bakteri mampu melakukan transformasi secara alami. Dimana mereka memproduksi protein-protein tertentu yang dapat membawa DNA menyeberangi dinding sel. Dengan melakukan teknik heat-shock mendinginkan, memanaskan dan mendinginkan kembali bakteri, maka DNA dapat masuk ke dalam sel. Melakukan metode dikejutpanaskan (heat shock) pada suhu 42C selama 45 detik akan membuat membran sel akan tertutup kembali karena terjadi perubahan suhu yang mendadak dari suhu rendah ke suhu tinggi. Dengan metode ini, kesterilan kerja dan kontaminasi sel akan terminimalisir.

3.5. Seleksi Klon Rekombinan Untuk seleksi klon rekombinan, digunakan metode blue white screening. Blue white screening adalah teknik untuk mendeteksi ligasi yang sukses dilakukan dalam vektor gen kloning. Vektor tersebut nantinya ditransformasi dalam sel kompeten, pada kasus ini yaitu bakteri. Sel yang kompeten tadi nantinya ditempatkan pada X - gal. bila ligasi yang dihasilkan sukses, koloni bakteri akan berwarna putih dan bila tidak berhasil akan berwarna biru. Kelebihan yang ditawarkan oleh teknik ini adalah metodenya mudah dilakukan dan cepat. Dalam kasus ini digunakan metode blue white screening karena plasmid pUC 19 yang memiliki gen lacZ.

25

DAFTAR PUSTAKA

Anam, Khairul. 2009. Laporan Praktikum Genetika Molekular: DNA Rekombinasi. Pascasarjana Bioteknologi, Institut Pertanian Bogor.

Sekolah

Anonim.pUC 18 dan pUC 19.http://www.fermentas.com/en/products/all/molecular-cloning/vectorsphage/sd005-puc18-puc19-dna. diakses pada tanggal 29 September 2012 pukul 10.00 WIB Anonim.CMV Expression Plasmid with the pUC19 MCS pSF-CMV-pUC19 pada

MCS.http://www.oxfordgenetics.co.uk/polylinkers/psf-cmv-puc19mcs-detail.diakses tanggal 29 September 2012 pukul 17.00 WIB

Anonim. Plasmid DNA purification.http://www.taq-dna.com/plasmid-dna-purification-_400.html. diakses pada tanggal 29 September 2012 pukul 17.00 WIB Anonim. DNA purification. http://www.promega.com/~/media/files/resources/paguide/letter/

chap9.pdf?la=en. Diakses pada tanggal 29 september pukul 10.00 WIB. Anonim. Section G Gene Manipulation. Southwest University. Gaffar S. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molekul. Bandung : Universitas Padjajaran. Jusuf M. 2001. Genetika I Struktur dan Ekspresi Gen. Bogor : Sagung Seto. Meng-Shiou Lee, F.-C. S.-H.-Y.-H.-H.-S.-J.-Y. (2012). Efficient Production of an Engineered Apoptin from Chicken Anemia Virus in a Recombinant E. coli for Tumor Therapeutic Applications. BMC Biotecnology, 1472-1486. Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor : Pustaka Wirausaha Muda. 123 pp. Muslih. Laporan praktikum Biologi Molekuler. http://muslih.edublogs.org/files/2010/03/praktikum -biomol_muslih.pdf NextGen Sciences. (2005). Guide to hight efficiency transformation. http://wolfson.huji.ac.il /expression/procedures/bacterial/competent_cells%20_guide_v3.pdf. September 2012, pukul 23.22. Schaum. 2010. Genetika, Edisi Keempat. Jakarta : Erlangga. Stansfield WD, Colome JS, Cano RJ. 2003. Theory and Problems of Molecular and Cell Biology. New York: McGraw-Hill Companies. Yalun. (2008). Mengenal bakteri Escherichia coli. http://yalun.wordpress/2008/10/07/_mengenalbakteri-escherichia-coli/. Diakses pada 20 September 2012, pukul 22.01. http://silfiadahnia.blogspot.com/2011/12/enzim-ligase.html http://www.neb.com/nebecomm/products/productb0202.asp http://sciencebiotech.net/te-buffer-vs-ddh2o/ http://www.neb.com/nebecomm/products_intl/protocol658.asp Diakses pada 20

26

LAMPIRAN

Lampiran 1. Kapsid Chicken Anemia Virus (Sumber. ictvdb.bio-mirror.cn)

Lampiran 2. Metode Sanger (Sumber. scq.ubc.ca)

27

Lampiran 3. Perbedaan MCS pUC 18 dan pUC 19 (Sumber. http://www.fermentas.com/en/products/all/molecular-cloning/vectors-phage/sd005-puc18-puc19-dna)

Lampiran 4. Penggunaan alkaline phosphatase untuk menghindari religasi pada molekul vektor (Sumber. Anonim. Section G Gene Manipulation. Southwest University)

28

Lampiran 5. Perbedaan dinding sel bakteri Gram negatif dan Gram positif (Sumber. http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Escherichia_coli, diakses pada 28 September 2012, pukul 23.02)

Lampiran 6. Kurva yang menggambarkan fasefase pertumbuhan bakteri; lag phase, log phase, stationary phase dan death phase (Sumber. Anam, Khairul. 2010. http://khairulanam.files.wordpress.com/2010/08/laporan-3-rekgen. pdf diakses pada 28 September 2012, pukul 23.17)

29

Lampiran 7. Skema proses transformasi dengan menggunakan metode elektroforasi (Sumber. Anonim. 2010. Transformasi, Ekspresi Gen Asing dalam Sel Bakteri. http://sciencebio- tech.net/transformasiekspresi-gen-asing-dalam-sel-bakteri/ diakses pada 28 September 2012, pukul 23.44)

Lampiran 8. Teknik hibridisasi kloni (Sumber. Schaum. 2010. Genetika, Edisi Keempat. Jakarta : Erlangga.)

30