METODE POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Oleh : Hary Krettiawan C15109201

I.1Latar Belakang Penyakit merupakan faktor pembatas dalam kegiatan budidaya perikanan. Kerugian yang ditimbulkan kerapkali sangat besar. Penyakit dapat menyebabkan kematian, kekerdilan, periode pemeliharaan lebih lama, tingginya konversi pakan, padat penebaran rendah dan turunnya tingkat produksi. Penyakit dapat disebabkan oleh organisme patogen seperti protozoa, bakteri, jamur dan virus. Adanya hama di dalam tambak sangat merugikan bagi para pembudi daya dan spesies itu sendiri. Untuk itu para pembudi daya juga perlu memahami lebih dalam jenis jenis hama yang dapat mengganggu, merusak bahkan memangsa spesies yang di budi dayakan. Dengan di ketahuinya jenis jenis hama tersebut maka pembudi daya dapat mencegahnya atau memberantasnya dengan memberi obat sesuai dengan jenis hama yang di ketahui. Begitu pula dengan penyakit, yang sangat merugikan sekali bagi pembudi daya karena adanya suatu penyakit dapat menyebabkan ikan / udang mati secara mendadak dalam jangka waktu yang singkat. penyebab penyakit bakterial di dalam industri udang, didominasi oleh bakteri golongan Vibrio. Penyakit udang berpendar atau lebih dikenal vibriosis merupakan penyakit yang umumnya menyerang hewan laut seperti ikan, udang, dan kerang-kerangan. Pada udang bakteri Vibrio menyerang secara sekunder yaitu pada saat dalam keadaan stress dan lemah, oleh karena itu sering dikatakan bahwa bakteri ini termasuk jenis opportunistic patogen. Pengujian keberadaan bakteri patogen sangat diperlukan sebelum mewabah dan menyebabkan kerugian yang makin besar. Metoda pendeteksian bakteri patogen biasanya menggunakan metode penumbuhan mikroba yang kemudian

diamati keberadaan bakteri penyebab penyakitnya. Namun lamanya waktu pengerjaan menjadi masalah tersendiri, sehingga perlu penggunaan metode deteksi yang lebih cepat dan akurat. Metode pendektesian cepat dengan menggunakan teknik PCR mampu menghasilkan analisa keberadaan bakteri patogen lebih cepat dibandingkan dengan metode cawan . Hasil yang diperoleh pun lebih akurat karena level deteksinya adalah DNA spesifik dari bakteri patogen tersebut. PCR merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, orang dapat menghasilkan DNA dalam jumlah besar dalam waktu singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut. II. METODOLOGI

II.1 Alat dan Bahan Peralatan yang digunakan adalah sentrifuse, mesin thermo cycle, elektroforesis set, mikro pipet ukuran 1000, 200 dan 10 beserta tipnya, effendrof, . Sedangkan bahan uji yang digunakan adalah udang stadia PL3, uropoda, insang, hepatopankreas, kaki renang dan genom bakteri vibrio asal Sulawesi. Bahan-bahan yang digunakan adalah regent-reagent yang digunakan untuk proses ekstraksi DNA antara lain EDTA, SDS, Proteinase-K, NaCl 5 M, CTAB, phenol-chlorofom-isoamilalkohol, chloroform-isosmilslkohol dan isopropanol. Sedangkan bahan yang digunakan pada proses PCR adalah master mix, primer, kontrol positif, kontrol negatif dan mix kontrol. II.2 Prosedur Kerja Tahapan yang dilakukan untuk mendeteksi penyakit vibriosis dengan metode PCR terdiri dari tiga tahapan. Tahapan pertama yaitu ekstraksi DNA, perbanyakan

genom yang telah diekstraksi dengan mesin thermo cycle. Selanjutnya tahapan terakhir yaitu pembacaan hasil dari ekspresi genom yang telah teramplifikasi dengan metode elektroforesis dan difoto secara digital. Tahapan tersebut dijelaskan sebagai berikut. II.2.1Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA diambil dari sampel dengan berat 50-150 mg yang direndam dengan 250l Buffer TE. Selnjutnya sampel diinkubasi selama 1-3 jam dengan suhu 55C pada larutan yang terdiri dari 500l Buffer lysis, 20l proteinase-K dan 40l SDS 10%. Setelah inkubasi ditambahkan 12.5l RNAase dan selanjutnya diinkubasi pada suhu ruang selama 15-30 menit. Setelah diinkubasi ditambahkan PCIA dengan perbandingan larutan 25:24:1 kemudian divorteks secara manual sampai homogen dan dinkubasikan kembali pada suhu ruang selama 10 menit. Selanjutnya disentrifuse pada kecepatan13.000 rpm selama 8 menit. Supernatant yang terbentuk kemudian diambil dan dipindahkan ke tabung effendrof yang baru kemudian dicampur dengan 300l larutan CIA dengan perbandingan 24:1 kemudian disentrifuse lagi pada kecepatan 13.000 rpm selama 4 menit. Supernatant teratas diambil dan dipindahkan ke effendrof baru sebanyak 200l kemudian dicampur dengan 400l ethanol absolute dingin dan dihomogenkan. Selanjutnya disentrifuse dengan kecepatan 6000 rpm selama 30 menit. Supernatant yang terbentuk dibuang dan pellet dibilas dengan 1ml etanol 70% kemudian disentrifuse kembali pada kecepatan 6000 rpm selama 15 menit. Pellet yang terbentuk dikeringanginkan selanjutnya disimpan pada suhu -20C setelah dilarutkan dengan 100l Buffer TE. II.2.2Amplifikasi Genom Persiapan awal sebelum mengamplifikasi genom adalah pembuatan master mix (MM). Volume MM yang dibuat disesuaikan dengan jumlah sampel ditambah dengan kontrol. Karena jumlah sampel dan kontrol ada 9 maka tiap-tiap bahan penyusun MM dikalikan 9. Akan tetapi pada praktikum ini jumlah total MM merupakan hasil kali dari 9 sampel + 1 cadangan sehingga faktor pengkali MM adalah 10. Hal ini bertujuan untuk menghindari kekurangan MM pada saat

proses pipetting. Setelah MM siap, masukkan template sebanyak 0,5l ke dalam tabung PCR yang telah diberi kode dan diisi dengan MM masing-masing 24,3 l/tabung. Setelah semuanya siap, masing-masing tabung dimasukkan pada mesin PCR yang telah diatur suhunya sesuai dengan primer yang digunakan. II.2.3 Pembacaan Hasil PCR dengan Elektroforesis Gel Agarosa Setelah proses PCR selesai selanjutnya dilakukan pembacaan hasil dengan eletroforesis gel agarosa. Sebelum melakukan elektroforesis tahapan awal yang dilakukan adalah membuat gel agarosa itu sendiri. Pembuatannya dilakukan dengan cara melarutkan agarosa dalam larutan TBE (Tris base, Boric acid, EDTA) atau TAE (Tris base, Glacial acetic acid, EDTA) yang dipanaskan sampai mendidih selama 1.5 menit dan larutan hasil menjadi bening. Setelah suhu agar turun (50-60C) kemudian dicetak dengan cetakan khusus yang dilengkapi sisir sebagai cetakan sumur elektroforesis. Selanjutnya gel dibiarkan beku, kemudian dimasukkan ke dalam bak elektroforesis yang telah berisi larutan buffer elektroforesis. Tahapan kedua pada persiapan awal elektroforesis adalah membuat pemberat atau loading dye (LD). Bahan pemberat ini terdiri dari bahan pemberat DNA dan pewarna (bromphenol blue, xylene cyanol, gliserol dan EDTA). Selanjutnya sampel DNA uji dicampur dengan 2-5l LD kemudian dihomogenkan dan dimasukkan pada sumur elektroforesis. Setelah sumur terisi dengan sampel dan kontrol, marker DNA disisipkan pada sumur pertama. Kemudian bak elektroforesis dialirkan dengan listrik yang bertegangan 250 volt dengan kuat arus antara 80-100 mA. Proses elektroforesis dihentikan apabila bagian dari panjang gel DNA bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif. Setelah itu gel diangkat dan diamati dengan menggunakan ultraviolet transluminator dengan panjang gelombang pendek yaitu 280nm. Dokumentasi dilakukan dengan kamera yang telah terhubung komputer.

Menurut Chainulfiffah. A, D. S. Retnoningrum. (2003), Teknik sintesis dan amplifikasi fragmen DNA secara in vitro yang dikenal dengan Polymerase chain reaction (PCR) merupakan salah satu metode untuk mengidentifikasi penyakit infeksi yang baru-baru ini banyak dikembangkan. Metode ini digunakan untuk mengatasi kelemahan metode diagnosis konvensional seperti imunologi dan mikrobiologi. Teknik PCR didasarkan pada amplifikasi fragmen DNA spesifik dimana terjadi penggandaan jumlah molekul DNA pada setiap siklusnya secara eksponensial dalam waktu yang relatif singkat. Teknik ini sangat ideal untuk mengidentifikasi patogen dengan cepat dan akurat. Secara umum proses ini dapat dikelompokkan dalam tiga tahap yang berurutan yaitu denaturasi templat, annealing (penempelan) pasangan primer pada untai tunggal DNA target dan extension (pemanjangan atau polimerisasi), sehingga diperoleh amplifikasi DNA antara 106-109 kali (Retnoningrum 1997). PCR terdiri atas beberapa siklus yang berulang-ulang, biasanya 20 sampai 40 siklus. Pada setiap siklus DNA polymerase akan menggandakan DNA sebanyak 2 kali, maka secara matematis salinan utas ganda DNA yang akan dihasilkan setelah 30 siklus adalah 2 pangkat 30 yaitu 1.073.741.824 kali, seperti terlihat pada gambar 2.

Gambar 2. Siklus berulang pada proses PCR (Sumber: http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrcopies.gif)

Setiap siklus terdiri dari tiga tahap seperti tersaji pada gambar 3, yaitu : Pertama, tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Berlangsung pada suhu tinggi, 9496C yang menyebabkan ikatan hidrogen DNA terputus atau denaturasi dan DNA menjadi berberkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi templat ("patokan") bagi primer. Durasi tahap ini 12 menit. Tahap Kedua, penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA templat yang komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 4560C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di sembarang tempat. Sedangkan tahap ketiga yaitu tahap pemanjangan atau elongasi. Enzim yang berperan adalah Taq-polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76C selama 1 menit. Setelah tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1.

Gambar 3. Proses denaturasi, anneling dan ekstensi atau elongasi

Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkahlangkah kerja analisis DNA sequencing. Metode ekstraksi yang digunakan adalah metode fenol/khloroform/isoamilalkohol. Metode tersebut mampu menghasilkan lapisan air yang mengandung asam nukleat dan lapisan antara fenol sedangkan air yang berisi protein penghambat dan polimer (termasuk karbohidrat), dan lapisan khloroform-isoamilalkohol yang mengikat lemak. mengalami presipitasi Kemungkinan-kemungkinan yang menyebabkan hasil tidak memuaskan adalah : 1. Penempelan primer pada temperatur rendah. Penempelan primer yang terjadi pada temperature rendah tidak spesifik sehingga akan menghasilkan amplifikasi dengan spesifisitas rendah. Spesifisitas rendah juga menurunkan sensitifitas karena adanya kompetisi antara produk spesifik dan nonspesifik (Retnoningrum 1997). 2. Konsentrasi primer yang terlalu tinggi dapat terjadi mispriming yang mengakibatkan meningkatnya jumlah produk non spesifik. Jika konsentrasi primer terlalu rendah, hasil dari produk PCR akan rendah. 3. DNA templat yang dipersiapkan pada percobaan mengandung SDS yang mampu menghambat kinerja enzim Taq DNA polimerase sehingga dapat menurunkan efisiensi PCR. Untuk itu perlu presipitasi dengan etanol sekaligus untuk pemekatan kromosom perlu dilakukan dengan seksama baik waktu maupun konsentrasinya.. Menurut Arheim dan Erlich (1992), Analisis molekuler merupakan analisis yang dilakukan pada tingkat gen maupun ekspresinya yang bertujuan untuk mengkonfirmasi keberadaan gen melalui metode molekuler seperti PCR Teknik PCR memiliki kelebihan diantaranya sangat praktis, akan tetapi dapat terjadi positif semu jika reaksi yang dipergunakan mengandung kontaminan. Analisis PCR perlu menggunakan beberapa kontrol untuk menghindari terjadinya positif maupun negatif semu.