RT-PCR PROTOCOL

1. Di dalam 1,5 mL tabung microcentrifuge yang mengandung badan nyamuk, di tambahkan RNA extraction buffer 250 L dan dihancurkan dengan menggunakan grinder. 2. Tambahkan Proteinase Digestion buffer 250 L dan proteinase-K 200 g/mL sebanyak 10 L. 3. Diinkubasi pada 38o C selama 2 jam. 4. Kemudian diinkubasi lagi pada 95o C selama 10 menit. 5. Disentrifuge pada 2500 rpm selama 1 menit (22o C). 6. Supernatan dipindahkan ke tabung baru ( 300 L). 7. Pipette 140 L sample (No. 6) dan tambahkan ke 1,5 mL tabung microcentrifuge yang mengandung 560 L buffer AVL (QIAGEN). 8. Vortex selama 16 detik dan diinkubasi selama 10 menit (RT). 9. Sentrifuge pada 2500 rpm selama 1 menit (22o C). 10. Tambahkan 560 L Ethanol absolut dan vortex selama 16 detik. 11. Sentrifuge pada 2500 rpm selama 1 menit (22o C). 12. Transfer 630 L dari step 11 ke QIAamp spin colom (dalam sebuah 2 mL tabung koleksi) dan sentrifuge pada 8000 rpm selama 1 menit (22o C). Tempatkan QIAamp spin colom ke 2 mL tabung koleksi yang bersih dan tabung yang sudah penuh dengan filtrat dibuang. 13. Ulangi step 12 2X. 14. Tambahkan 500 L buffer AW1 dan spin 8000 rpm selama 1 menit. 15. Tambahkan 500 L buffer AW2 dan spin 14000 rpm selama 3 menit. 16. Ulangi spin 14000 rpm selama 1 menit. 17. Tempatkan QIAamp spin colom ke tabung 1,5 mL microcentrifuge bersih dan tambahkan 60 L buffer AVE. Didiamkan selama 1 menit (RT). 18. Sentrifuge pada 8000 rpm selama 1 menit (22o C).

Amplifikasi PCR dari RNA virus dengue : RNA diamplifikasi dalam 50 L mengandung : VOLUME (uL) 4 10 3 1 5 5 1 1 20 50

ddH2O 5X AMV buffer 25 mM MgSO4 10 mM dNTP mix Primer (10 pmol/L) : - D1 - D2 5 U/L AMV-RT 5 U/L Tfl-DNA polymerase RNA TOTAL

PCR Cycle : 48o C selama 45 menit 94o C selama 2 menit 40 cycle : - denaturasi (94o C, 30 detik), annealing (60o C, 1 menit) extension (68o C, 2 menit).

68o C selama 7 menit

Nested PCR : Ambil 1 uL PCR product I dan dilarutkan dengan 49 uL ddH2O (1:50). Dilanjutkan dengan amplifikasi ke II.

ddH2O 10X PCR buffer 25 mM MgCl2 10 mM dNTP Primer (10 pmol/L) : - D1 - TS1 - TS2 - TS3 - TS4 Taq Polymerase 5 U/L DNA (1:50) TOTAL

VOLUME (uL) 23,25 5 3 1 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 0,25 5 50

Cycle PCR II : 94o C selama 2 menit , dilanjutkan dengan : 20 cycle : - denaturasi (94o C, 1 menit) - annealing (55o C, 1 menit) - extension (72o C, 2 menit). 72o C selama 10 menit

10 L nested product dielektroforesis dengan menggunakan 2 % agarose gel + 1x TBE buffer.

Proteinase Digestion buffer Untuk 50 mL : - 10 mL 1 M Tris HCL pH 8 - 2,5 mL 0,5 M EDTA - 3 mL 5 M NaCl - 10 mL 10 % SDS - 24,5 mL ddH2O

RNA extraction buffer Untuk 50 mL : - 1,4 mL 5 M NaCl - 75 uL 1 M MgCl2 - 500 uL 1 M Tris HCl pH 8,6 - 250 uL NP-40 - 100 uL 0,5 M DTT - 1 mL RNase inhibitor 40 U/uL - + ddH2O sampai 50 mL

YANG HARUS DIBAWA :

Grinder Pestle Tabung 1.5 ml PCR tube PCR tip (blue, yellow) RNA extraction Pinset Lancett Loading buff 100 bp marker Kuitansi RNA positif

buffer Proteinase Digestion buffer proteinase-K

Pippetor 4 Buku report, notebook , marker pen ACCESS RNA ( ddH2O, 5X AMV buffer, 25 mM MgSO4, 10 mM dNTP mix, 10 pmol/L primer (D1, D2) , 5 U/L AMVRT, 5 U/L TflDNA polymerase

QIAGEN (AVL, AW1, AW2, AVE buff, spin colom)

PCR CORE (ddH2O 10X PCR buffer, 25 mM MgCl2, 10 mM dNTP, 10 pmol/L primer (D1, TS1, TS2,TS3 TS4),Taq Polymerase 5 U/L

Etanol 75 %, Etanol absolute? TBE, Ethidium Bromide, Agarose gel?

Isolasi RNA dan DNA dari sel hewan atau jaringan : Sampel dihancurkan dalam buffer mengandung GITC (buffer untuk mengekstraksi sitoplasma dan menginaktivasi RNase da merusak RNA protein complex) dan di homogenkan. Protein di pisahkan oleh presipitasi garam. Total RNA dan DNA dikumpulkan dengan presipitasi isopropanol . RNA dan DNA kemudian dilarutkan dengan buffer tertentu. NP-40 merupakan non-ionik detergen yang digunakan untuk melisis membrane sel plasma. Nucleus akan tetap utuh selama proses lisis dan sentrifugasi. Buffer AVL mengandung guanidine thiocyanate. Buffer AW1 mengandung guanidine hydrochloride

The Access RT-PCR System is designed for the reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR) amplification of a specific target RNA from either total RNA or mRNA. This one-tube, two-enzyme system provides sensitive, quick, and reproducible analysis of even rare RNAs. The system uses AMV Reverse Transcriptase (AMV RT) from Avian Myeloblastosis Virus for first-strand DNA synthesis and the thermostable Tfl DNA Polymerase from Thermus flavus for second-strand cDNA synthesis and DNA amplification. The Access RT-PCR System includes an optimized single-buffer system that permits extremely sensitive detection of RNA transcripts, without a requirement for buffer additions between the reverse transcription and PCR amplification steps. This simplifies the procedure and reduces the potential for contaminating the samples. In addition, the improved performance of AMV Reverse Transcriptase at elevated temperatures in the AMV/Tfl 5X Reaction Buffer minimizes problems encountered with secondary structures in RNA.

RNAm, dicetak dari DNA, sebagai template untuk sintesis protein. Sintesis protein dilakukan oleh ribosom yang mengandung RNAr dan protein. Asam amino yang dihasilkan dari sintesis protein di transfer ke ribosom oleh RNAt