BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Mikroorganisme ada dimana-mana. Mereka dapat ditemukan di tanah, udara, air, makanan, limbah, bahkan di permukaan tubuh. Singkatnya, setiap area dari lingkungan kita penuh dengan mikroba. Ilmu mikrobiologi memisahkan populasi yang beraneka ragam tersebut menjadi spesies induvidu yang dapat dipelajari (Cappucino, 1983). Sebagaimana yang telah kita ketahui alam memiliki banyak sekali jenis mikroba. setiap kegiatan yang kita lakukan seperti bersentuhan tangan, buang air besar, bersin, dan semuanya mengandung banyak sekali mikroba didalamnya. Populasi mikroba di alam

sekitar kita sangat besar dan kompleks. Menurut Pelczar (1986) Satu tinja dapat mengandung jutaan bakteri. Pertumbuhan mikroorganisme di alam dapat diketahui dengan pengambilan mikroorganisme tersebut di alam yang kemudian ditumbuhkan di dalam suatu medium buatan yang disebut dengan isolasi. Untuk melakukan hal ini, haruslah dimengerti jenis-jenis nutrien yang disyaratkan bakteri dan juga macam ligkungan fisik yang menyediakan kondisi optimum bagi pertumbuhan bakteri tersebut (Pelczar, 1986). Dalam percobaan ini akan dibahas secara lebih lanjut mengenai bagaimana cara perhitungan jumlah sel yang ada di dalam suatu medium yang mana umumnya digunakan untuk uji mikrobiologi bahan pangan yaitu metode hitung cawan (Total Plate Counts ) dan metode hitung MPN (Most Probable Number). Praktikum ini dilakukan untuk mengembangbiakkan mikroba murni atau mikroba homogen yaitu bakteri yang terkandung adalah sama atau sejenis. Mikroorganisme mampu tumbuh dengan baik bila tersedia media atau makanan sebagai substratnya (Utami, 2004: 6). Pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru harus dilakukan secara teliti. Terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alat-alat yang ada sangkut pautnya dengan medium dan pekerjaan inokulasi harus benar-benar steril. Hal ini dilakukan untuk menghindari kontaminasi, yaitu masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan. Pemurnian mikroba dikenal dengan istilah isolasi mikroba dan kultur murni. Isolasi merupakan cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal (Pelczar, 1986). Kegiatan ini membutuhkan pemahaman yang baik dan menyeluruh, oleh karena itu, pentingnya praktikum pada kegiatan kali ini dimaksudkan agar dapat memahami dan mentrampilkan pemurnian mikroba dalam kehidupan yang lebih kompleks. Ketika melakukan

praktikum tidak lupa juga diharapkan ketelitian dan kestrerilan praktikan, karena semua berpengaruh pada individu praktikan. B. Rumusan Masalah Rumusan masalah yang didapat berdasarkan latar belakang yang telah dibuat antara lain : 1. Bagaimana teknik dan prosedur isolasi mikroorganisme untuk mengetahui karakteristik dan menentukan jumlah mikroorganisme? 2. 3. C. Tujuan Tujuan dari praktikum kali ini yang didapat dari rumusan masalah adalah : 1. 2. 3. Mengetahui prosedur isolasi mikroorganisme dari lingkungan Mengetahui karakteristik morfologi koloni mikroorganisme Melatih mahasiswa untuk menentukan jumlah mikroorganisme dalam suatu sampel D. Manfaat Berdasarkan uraian latar belakang, rumusan masalah, dan tujuan yang ditetapkan, diharapkan praktikum ini dapat memberi manfaat bagi mahasiswa, yaitu : 1. 2. 3. Mahasiswa dapat mengetahui prosedur isolasi mikroorganisme dari lingkungan Mahasiswa dapat mengetahui karakteristik morfologi koloni mikroorganisme Untuk melatih mahasiswa untuk menentukan jumlah mikroorganisme dalam suatu sampel Bagaimana karakteristik morfologi koloni mikroorganisme? Bagaimana menentukan jumlah mikroorganisme dalam suatu sampel?

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

Penangkapan

suatu

mikroorganisme

adalah

suatu

proses

pemindahan

mikroorganisme atau suatu proses pengembangbiakan mikroorganisme pada medium yang belum ditumbuhi mikroorganisme. Penangkapan mikroorganisme ini merupakan

penangkapan bakteri. Proses ini dilakukan secara aseptik. Sebelum melakukan penanaman, baik tempat maupun alat-alatnya harus disterilkan terlebih dahulu dengan alkohol yang bertujuan untuk menghindari kontaminasi. (Volk, 1993) Isolasi adalah suatu cara untuk mendapatkan biakan murni dari suatu mikroba. Mikroba dapat diisolasi dari alam, misalnya sayuran busuk, buah busuk, lumpur danau atau sungai, limbah dan sebagainya. Isolasi mikroba dapat dilakukan dengan cawan gores atau cawan tuang. Sumber mikroba diberi perlakuan yang dapat merangsang pertumbuhan mikroba khususnya untuk mikroba yang diinginkan dan sekaligus menghambat pertumbuhan mikroba yang tidak diinginkan. Mikroba yang berhasil diisolasi harus dimurnikan berulang kali, sehingga koloni yang tumbuh dapat dipastikan berasal dari satu sel karena tidak semua mikroba mampu membentuk mikrokoloni yang terpisah secara sempurna. Biakan murni yang didapatkan selanjutnya dipindahkan secara steril pada biakan baru dan disebut sebagai isolat. (Yulneriwarni, 2008) Isolasi dilakukan dengan menggunakan taoge agar dan dilakukan pemurnian untuk mendapatkan koloni tunggal dengan metode gores (Streak Plate) yaitu quadrant streak (Method B) kemudian dilakukan pengamatan morfologi masing-masing koloni tunggal yang tumbuh pada media agar tersebut. Jumlah mikroba yang tumbuh pada media tertentu ditunjukkan oleh Colony Forming Units (CFU) atau satuan bentuk koloni. Jumlah normal koloni pada biakan adalah 30-300 koloni. (Herbert, 1978; Hastuti, 2007) Isolat yang telah dipindahkan kemudian diinkubasi selama 24 jam (temperatur 37oC) kemudian dilakukan enumerasi. Enumerasi adalah suatu teknik penghitungan jumlah mikroba dalam suatu media tanpa mengidentifikasikan jenis mikroba (bakteri, jamur, yeast) yang bertujuan untuk menentukan jumlah sel dari suatu kultur bakteri secara kuantitatif. Ada beberapa macam cara untuk mengukur jumlah sel, antara lain dengan hitungan cawan (plate count), hitungan mikroskopik langsung (direct microscopic count) atau MPN (Most Probable Number) (Fardiaz, 1992). Penetapan jumlah bakteri dapat dilakukan dengan menghitung jumlah sel bakteri yang mampu membentuk koloni di dalam media biakan atau membentuk suspensi dalam larutan biak (Schlegel dan Schmidt, 1994). Mikroba penyebab makanan busuk dapat ditemukan di tanah, air dan udara. Tumbuhnya mikroba di dalam bahan pangan dapat mengubah komposisi bahan pangan, dengan beberapa cara yakni: menghidrolisis pati dan selulosa menjadi fraksi yang lebih

kecil, menyebabkan fermentasi gula, menghidrolisis lemak dan menyebabkan ketengikan, serta mencerna protein dan menghasilkan bau busuk dan amoniak. Beberapa mikroba dapat membentuk lendir, gas, busa, warna, asam, toksin, dan lainnya. Mikroba menyukai kondisi yang hangat dan lembab (Susiwi, 2009).

BAB III METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilakukan pada tanggal 28 Februari sampai dengan 1 Maret 2013 di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Surabaya. 3.2 Bahan dan Alat Penelitian 3.2.1 Bahan : - akuades steril - media Taoge Agar (TA) steril - air selokan 3.2.2. Alat : - Spet (1 ml) - Bunsen +spiritus - kertas label - Korek api - tabung reaksi + rak - cawan petri steril - labu erlenmeyer - kertas bekas + tali kasur 3.3 Langkah Kerja 3.3.1. Penanaman Sampel Mikroorganisme a. menanam sampel uji (air selokan) sebanyak 1 ml, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml akuades steril. Suspensi ini merupakan pengenceran 10-1. Setiap langkah tersebut dilakukan secara aseptis. Kemudian dihomogenasi dengan divorteks b. mengambil 1 ml dari suspensi pengenceran 10-1 dan memasukkan kedalam tabung reaksi berisi 9 ml akuades steril. Suspensi ini merupakan pengenceran 10-2. Mengulangi langkah-langkah tersebut sampai mendapatkan suspensi dengan faktor pengenceran 10-7 c. secara aseptis mengambil 1 ml dari pengenceran 10-5, 10-6, dan 10-7, kemudian dimasukkan ke dalam cawan petri steril secara terpisah. Melakukan penuangan ini secara duplo (satu sampel dari setiap pengenceran ditanam pada dua cawan petri masing-masing sebanyak 1 ml) 6 pasang 1 buah secukupnya 7 buah 1 buah secukupnya 1 buah 7 tabung reaksi (masing-masing berisi 9 ml) secukupnya 1 ml

d. menuang media taoge agar yang telah dicairkan terlebih dahulu dan suhu media kurang lebih 450C ke setiap cawan petri yang telah berisi sampel e. mensuspensikan secara homogen campuran sampel dengan media tersebut f. menginkubasi biakan tersebut dengan posisi cawan petri terbalik, pada suhu antara 28-300C selama 24 jam g. mengamati dan mencatat karakteristik koloni-koloni dalam tabel.

3.3.2 Enumerasi Jumlah Mikroorganisme yang terdapat pada Suatu Sampel a. mengamati koloni yang terbentuk pada setiap cawan yang telah diinkubasi b. menghitung jumlah koloni yang terbentuk pada setiap cawan c.menentukan jumlah mikroorganisme yang terdapat pada sampel uji berdasarkan Standart Plate Count

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Tabel 1. Hasil Pengamatan Morfologi Koloni Sampel Air Selokan Depan Gedung C3 Koloni keKarakteristik optik Karakteristi k permukaan Putih Mengkilap tulang Bening Putih Mengkilap tulang Bening Putih Mengkilap tulang Bening Putih Mengkilap tulang Bening Putih Mengkilap tulang Bening 0,1 cm Spindle Flat Entire 0,2 cm Filamentous Flat Filame -ntous 0,3 cm Iregular Raised Lobate 0,1 cm Punctiform Raised Entire 0,4 cm Circular Raised Entire Pigmentasi Ukuran diamet er Bentuk Elevasi Bentuk tepian

Sampel

Translucent Opaque Translucent Opaque Translucent Opaque Translucent Opaque Translucent Opaque

2 Air seloka n depan gedung C3 4 3

Tabel 2. Standart Plate Count Sampel Air Selokan Depan Gedung C3 Jumlah koloni per- pengenceran 10-5 35 115 10-6 6 3 10-7 3 6 Standart Plate Count 7,5 x 106

Tabel 3. Standart Plate Count Sampel Air Kelas Pendidikan Biologi B 2010 No. 1 2 3 Susu sapi Limbah rumah tangga daerah PTT Air selokan depan Gedung C3 Sampel Cair Standart Plate Count 3,0 x 108 5,5 x 108 7,5 x 106

4 5 6 7 8 9

Air habitat cacing sutra Kuah bakso basi Air danau Ranunesa Air limbah rumah sakit Limbah sayur asam Limbah air pasar

5,2 x 106 2,1 x 106 4,8 x 107 3,7 x 106 8,7 x 108 5 x 108

4.3 Pembahasan Isolasi Pengisolasian merupakan suatu cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungan, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal. Manfaat dilakukannya kultur murni adalah untuk menelaah atau mengidentifikasi mikroba, termasuk penelaahan ciri-ciri kultural,

morfologis, fisiologis, maupun serologis, yang memerlukan suatu populasi yang terdiri dari satu macam mikroorganisme saja. Ada beberapa metode atau teknik yang digunakan pada isolasi mikroorganisme, yaitu metode tuang ( pour plate), metode sebar (spread plate), metode goresan (streak plate), pengenceran (dilution method), serta micromanipulator (teh micromanipulator method). Ukuran : Ukuran koloni bervariasi antara 0,1 - 0,4 cm, pada beberapa cawan petri pertumbuhan koloni tampak bercampur dan sulit dibedakan bentuknya. Karakteristik optik : Berdasarkan jumlah cahaya yang melewati koloni, tampak bahwa karakteristik optiknya yaitu translucent dan opaque. Karakteristik permukaan : Karakteristik permukaan yang tampak pada koloni yaitu permukaan halus mengkilap. Pigmentasi : Warna yang terlihat pada semua cawan petri yaitu ada yang putih tulang dan ada yang bening. Bentuk : Bentuk koloni yang terlihat bervariasi, antara lain circular, punctiform, iregular, filamentous dan spindle. Bentuk tepian : Bentuk tepian koloni menunjukan entire, lobate, dan filamentous Bentuk permukaan atas elevasi :

Permukaan ada yang membentuk elevasi raised dan ada juga yang flat

Pembahasan Enumerasi Media yang kami gunakan adalah media universal, yaitu media taoge agar. Hal ini dikarenakan media ini tidak selektif sehingga dapat menumbuhkan berbagai macam jenis bakteri. Media taoge agar digunakan untuk media penghitungan cawan karena media tersebut berbentuk cair ketika panas dan akan memadat setelah dingin, hal ini sangat membantu metode pour plate yang membutuhkan media cair agar sampel kultur dapat tercampur dengan merata dan memadat setelah didinginkan, sehingga diperoleh sel-sel microbial yang membentuk koloni yang terpisah dengan medium padat tersebut dan dapat dihitung jumlah koloninya dengan colony counter. Di samping itu, media ini harganya relatif murah sehingga sangat terjangkau. Pada media taoge agar juga mengandung berbagai macam nutrisi untuk pertumbuhan bakteri, yaitu karbon, nitrogen, dan garam-garam anorganik. Pada proses enumerasi, kami menggunakan metode cawan tuang (pour plate method) dan diinkubasi selama 24 jam. Prinsip metode ini adalah bila sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat dan dihitung langsung dengan colony counter tanpa menggunakan mikroskop. Pada penghitungan ini dilakukan pengenceran 10-1 sampai 10-7, dan diperoleh hasil seperti tabel 2 di atas. Berdasarkan tabel 2 di atas dengan menggunakan sampel air selokan depan Gedung C3 terlihat adanya kecenderungan penurunan jumlah mikroba setelah dilakukan pengenceran. Hal ini sudah sesuai dengan teori Gobel yang menyatakan bahwa semakin besar angka pengenceran maka akan semakin kecil jumlah mikroorganisme yang dapat dihitung. Pada saat pengenceran juga diperoleh koloni-koloni yang berbeda sesuai dengan tabel 1. Koloni yang didapatkan berbeda karena bakteri yang tumbuh belum murni selain itu juga disebabkan karena media yang digunakan yaitu taoge agar tidak selektif sehingga didapatkan berbagai jenis koloni bakteri. Di samping itu, terjadinya perbedaan pembentukan koloni yang muncul tersebut dikarenakan terdapat perbedaan

pengenceran yang dilakukan pada cawan-cawan tersebut, sehingga semakin encer kultur yang dibuat maka kemungkinan koloni bakteri yang terbentuk juga semakin sedikit. Metode pour plate mempunyai kelebihan dan kekurangan. Kelebihan metode pour plate adalah prosesnya lebih cepat karena tidak perlu menunggu media memadat terlebih dahulu dan juga tidak perlu melakukan pengenceran yang terlalu tinggi, karena kultur dapat segera bercampur dengan media yang masih cair, sehingga koloni yang terbentuk tidak saling bergabung antar koloni. Sedangkan kelemahan pada metode pour

plate yang pertama adalah kemungkinan kontaminasi pada media tidak diketahui secara pasti karena media dituangkan sesaat setelah sampel dituangkan, sehingga ada kemungkinan jumlah mikroba yang akan dihitung bertambah banyak, karena kehadiran mikroba kontamin yang ikut terhitung, sehingga terjadi spreader pada penghitungan jumlah koloni. Kelemahan yang kedua yaitu kemungkinan mikroba sampel mati lebih besar karena media dituangkan dalam keadaan cair (atau media masih agak panas), jika tidak dituangkan pada suhu yang dingin sekitar 40-45C. Hal ini sesuai dengan pernyataan Fardiaz (1992), bahwa penggunaan lebih dari 45C mengakibatkan kematian atau kerusakan sel mikroba yang tidak tahan suhu tinggi dan menyebabkan kondensasi yang berlebihan pada cawan Petri setelah agar memadat. Pada penghitungan ini dilakukan pengenceran dari 10-1 sampai 10-7 dan diperoleh hasil seperti di atas. Berdasarkan teori, semakin banyak dilakukan pengenceran maka semakin sedikit jumlah bakteri maupun koloni di dalamnya. Namun dalam percobaan kami, pada pengenceran 10-6 dan 10-7 terdapat peningkatan jumlah koloni. Hal ini dapat terjadi karena berbagai faktor diantaranya kurang telitinya kami dalam menghitung jumlah koloni. Pembahasan Enumerasi data kelas Enumerasi adalah teknik perhitungan jumlah mikroba dalam suatu media tanpa mengidentifikasikan jenis mikroba (bakteri, jamur, yeast), yang bertujuan untuk menentukan jumlah sel dari suatu kultur bakteri secara kuantitatif (Cappucino & Sherman, 1983). Penetapan jumlah bakteri dilakukan dengan menghitung jumlah sel bakteri yang mampu membentuk koloni di dalam media biakan atau membentuk suspensi dalam larutan biak (Schlegel & Schmidt, 1994). Dalam kegiatan praktikum kali ini, kami melakukan enumerasi dengan cara hitungan cawan. Enumerasi ini dilakukan dengan mengencerkan sampel yang berisi mikroorganisme hingga

konsentrasi tertentu, yang selanjutnya mengambil volume tertentu dari setiap seri pengenceran (dalam praktikum yang kami gunakan adalah sampel pengenceran 10-5, 10-6 dan 10-7) untuk ditanam pada media pertumbuhan yang telah dibuat sebelumnya. Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh pada cawan petri tersebut diamati morfologinya, kemudian dilakukan perhitungan dengan menggunakan alat bantu perhitungan yaitu colony counter. Syarat cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang memiliki jumlah antara 30 sampai 300 koloni. Dari hasil kegiatan praktikum enumerasi yang telah dilakukan, dapat diketahui bahwa jumlah mikroorganisme dalam setiap cawan bervariasi, hal ini dipengaruhi oleh komposisi bahan dan juga faktor lingkungan. Pada sampel air limbah sayur asam didapatkan Standart Plate Count sebesar 8,7 x 108. Hal ini menunjukkan bahwa pada

sampel limbah tersebut mengandung banyak mikroorganisme. Umumnya suasana asam mempunyai pengaruh yang buruk terhadap pertumbuhan mikroorganisme. Namun terdapat beberapa mikroorganisme dapat tumbuh dalam suasana sangat asam. Dengan demikian pada sampel limbah sayur asam didapatkan koloni mikroorganisme yang banyak. Sedangkan pada sampel kuah bakso basi didapatkan Standart Plate Count sebesar 2,1 x 106. Hal ini menunjukkan bahwa pada sampel limbah tersebut mengandung sedikit mikroorganisme. Pada kuah bakso basi mengandung bahan-bahan dengan konsentrasi garam dan gula yang tinggi sehingga mikroorganisme yang terdapat di dalamnya hanya sedikit. Hal ini dikarenakan pada konsentrasi tinggi mikroorganisme tidak dapat bergerak dengan bebas atau pergerakannya kurang bebas sehingga pertumbuhannya kurang maksimal.

DAFTAR PUSTAKA

James G. Cappucino. 1983. Microbiology : a Laboratory Manual. Sydney : Addison Wesley Pub. Co.
Fardiaz, S. (1992). Mikrobiologi Pangan I. Jakarta: PT. Gramedia Pustaka Utama

Hastuti, Ratih Dewi dan Ginting, Rohani Cinta Badia. 2007. Enumerasi bakteri, cendawan, dan aktinomisetes. 2.2 in Rasti Saraswati, Edi Husen, R.D.M Simanungkalit. Metode Analisis Biologi Tanah. Bogor : Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Sumberdaya Lahan Pertanian.

Herbert, S.D., dan Cox, D.J., 1978, An Anaerobic Glove Box for the Isolation and Cultivation of Methanogenic Bacteria, Journal of Applied Bacteriology, 45:411-415

James G. Cappucino. 1983. Microbiology : a Laboratory Manual. Sydney : Addison Wesley Pub. Co.

Pelczar, M.J dan E.C.S Chan. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Terjemahan R.S. Hadioetomo dkk. Jakarta : UI Press: Jakarta.
Susiwi. 2009. Kerusakan Pangan. Web publication http://file.upi.edu/Direktori/FPMIPA/JUR._PEND._KIMIA/195109191980032SUSIWI/SUSIWI-28%29._Kerusakan_Pangan.pdf. Diunduh tanggal 5 Maret 2013.

Schlegel,H. G. & K. Schmidt. (1994). Mikrobiologi Umum Edisi Keenam. Yogyakarta : Gajah Mada University Press

Utami, Ulfa. 2004. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Malang: Universitas Islam Negeri Malang. Malang.
Yulneriwarni. 2008. Mikroba, dari habitat ke industri. Makalah. Disampaikan dalam Simposium Biologi Industri, Fakultas Biologi Universitas Nasional, Jakarta 11 November 2008.

Volk dan Wheeler. 1993, Dasar- Dasar Mikrobiologi, Erlangga, Jakarta.