Anda di halaman 1dari 26

LAPORAN PRAKTIKUM TEKNIK LABORATORIUM Penetapan Profil Protein Cry Dan Tipe Gen Penyandinya Galur Galur Bakteri

i Bacillus thuringiensis

KELOMPOK 1 FITRI RAHMAWATI IRFAN FACHRUROZY JESSYCA SHELA R. MUTHIA RIZKITA NINDA FIRSTRI O. QORIMEIFEBRIA R. SANDI ACHMAD TIAS LIKA SARI YOGI SETIAWAN ZULIANI ABIDIN 109095000032 109095000029 109095000004 1090950000 1090950000 1090950000 1090950000 109095000030 109095000038 109095000043

PROGRAM STUDI BIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA 2011M/2133H

BAB I PENDAHULUAN A. Maksud dan Tujuan Bakteri Bacillus thuringiensis merupakan bakteri garam positif yang berbentuk batang. Bakteri ini tersebar secara luas di berbagai Negara. Bakteri ini termasuk pathogen fakultatif yang dapat hidup di daun tanaman conifer maupun pada tanah. Apabila kondisi tidak memungkinkan atau tidak menguntungkan maka bakteri ini akan membentuk fase sporulasi. Saat sporulasi terjadi tubuhnya akan terdiri dari protein Cry yang termasuk ke dalam protein kristal kelas endotoksin delta. Apabila serangga memakan toksin tersebut maka serangga tersebut dapat mati. Oleh karena itu, protein atau toksin Cry dapat dimanfaatkan sebagai pestisida alami. Untuk memperoleh bakteri Bacillus thuringiensis yang potensial sebagai biopestisida, maka perlu dilakukan isolasi bakteri tersebut yang salah satunya dengan mengisolasinya dari sampel tanah yang berasal dari berbagai tempat. Setelah proses isolasi, untuk mengidentifikasi keberadaan protein Cry maka perlu dilakukan tahapan-tahapan berikutnya. Beberapa metode yang dapat dilakukan untuk mengidentifikasi keberadaan protein Cry tersebut adalah dengan metode elektroforsis agarose (SDS PAGE), dilanjutkan dengan metode lowry dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis dan dengan HPLC. Oleh karena itu dilakukan praktikum teknik laboratorium inimengenai bakteri Bacillus thuringiensis yang bertujuan untuk : 1. Mampu menggunakan alat instrumen laboratorium dan mengetahui teknik laboratorium 2. Mengetahui cara pembuatan medium 3. Untuk mendapatkan isolat bakteri Bacillus thuringiensis beserta protein kristalnya (protein Cry). 4. Dapat melakukan analisis protein kristal yang dihasilkan oleh Bacillus thuringiensis, serta melakukan profiling proteinnya. 5. Dapat mengerti dan memahami proses elektroforesis.

B. Landasan Teori Bacillus thuringiensis adalah bakteri gram-positif, berbentuk batang, aerobik, dan membentuk spora yang tersebar secara luas di berbagai negara. B. thuringiensis menghasilkan berbagai macam toksin. Toksin-toksin tersebut adalah -eksositosin, -eksositosin, dan -endotoksin (protein kristal) (Dubois dan Lewis, 1981). Bakteri ini termasuk patogen fakultatif dan dapat hidup di daun tanaman konifer maupun pada tanah. Apabila kondisi lingkungan tidak menguntungkan maka bakteri ini akan membentuk fase sporulasi. Saat sporulasi terjadi, tubuhnya akan terdiri dari protein Cry yang termasuk ke dalam protein kristal kelas endotoksin delta. Apabila serangga memakan toksin tersebut maka serangga tersebut dapat mati. Oleh karena itu, protein atau toksin Cry dapat dimanfaatkan sebagai pestisida alami. B. thuringiensis ditemukan pertama kali pada tahun 1911 sebagai patogen pada ngengat (flour moth) dari Provinsi Thuringia, Jerman. Bakteri ini digunakan sebagai produk insektisida komersial pertama kali pada tahun 1938 di Perancis dan kemudian di Amerika Serikat (1950). Pada tahun 1960an, produk tersebut telah digantikan dengan galur bakteri yang lebih patogen dan efektif melawan berbagai jenis insekta. Keberadaan inklusi paraspora dalam B. thuringiensis telah ditemukan sejak tahun 1915, namun komposisi protein penyusunnya baru diketahui pada tahun 1915. Pada tahun 1953, Hannay, mendeteksi struktur kristal pada inklusi paraspora yang mengandung lebih dari satu macam protein kristal insektisida (insecticidal crystal protein, ICP) atau disebut juga delta endotoksin. Berdasarkan komposisi ICP penyusunnya, kristal tersebut dapat membentuk bipimiramida, kuboid, romdoid datar, atau campuran dari beberapa tipe kristal. Berbagai macam spesies B. thuringiensis telah diisolasi dari serangga golongan koleoptera, diptera, dan lepidoptera, baik yang sudah mati ataupun dalam kondisi sekarat. Bangkai serangga sering mengandung spora dan ICP B. thuringiensis dalam jumlah besar. Sebagian subspesies juga didapatkan dari tanah, permukaan daun, dan habitat lainnya. Pada lingkungan dengan kondisi yang baik dan nutrisi yang cukup, spora bakteri ini dapat terus hidup dan melanjutkan pertumbuhan vegetatifnya. B. thuringiensis dapat ditemukan pada

berbagai jenis tanaman, termasuk sayuran, kapas, tembakau, dan tanaman hutan. B. thuringiensis dibagi menjadi 67 subspesies (hingga tahun 1998) berdasarkan serotipe dari flagela (H). Ciri khas dari bakteri ini yang membedakannya dengan spesies Bacillus lainnya adalah kemampuan membentuk kristal paraspora yang berdekatan dengan endospora selama fase sporulasi III dan IV. Sebagian besar ICP disandikan oleh DNA plasmid yang dapat ditransfer melalui konjugasi antargalur B. thuringiensis , maupun dengan bakteri lain yang berhubungan. Selama pertumbuhan vegetatif terjadi, berbagai galur B. thuringiensis menghasilkan bermacam-macam antibiotik, enzim, metabolit, dan toksin, yang dapat merugikan organisme lain. Selain endotoksin (ICP), sebagian subspesies B. thuringiensis dapat membentuk betaeksotoksi yang toksik terhadap sebagian besar makhluk hidup, termasuk manusia dan insekta. Protein atau toksin Cry tersebut akan dilepas bersamaan dengan spora ketika terjadi pemecahan dinding sel. Apabila termakan oleh larva insekta, maka larva akan menjadi inaktif, makan terhenti, muntah, atau kotorannya menjadi berair. Bagian kepala serangga akan tampak terlalu besar dibandingkan ukuran tubuhnya. Selanjutnya, larva menjadi lembek dan mati dalam hitungan hari atau satu minggu. Bakteri tersebut akan menyebabkan isi tubuh insekta menjadi berwarna hitam kecoklatan, merah, atau kuning, ketika membusuk. Toksin Cry sebenarnya merupakan protoksin, yang harus diaktifkan terlebih dahulu sebelum memberikan efek negatif. Aktivasi toksin Cry dilakukan oleh protease usus sehingga terbentuk toksin aktif dengan bobot 60 kDA yang disebut delta-endotoksin. Delta-endotoksin ini diketahui terdiri dari tiga domain. Toksin tersebut tidak larut pada kondisi normal sehingga tidak membahayakan manusia, hewan tingkat tinggi, dan sebagian insekta. Namun. pada kondisi pH tinggi (basa) seperti yang ditemui di dalam usus lepidoptera, yaitu di atas 9.5, toksin tersebut akan aktif. Selanjutnya, toksin Cry akan menyebabkan lisis (pemecahan) usus lepidoptera.

B. thuringiensis dapat memproduksi dua jenis toksin, yaitu toksin kristal (Crystal, Cry) dan toksin sitolitik (cytolytic, Cyt). Toksin Cyt dapat memperkuat toksin Cry sehingga banyak digunakan untuk meningkatkan efektivitas dalam mengontrol insekta. Lebih dari 50 gen penyandi toksin Cry telah disekuens dan digunakan sebagai dasar untuk pengelompokkan gen berdasarkan kesamaan sekuens penyusunnya. Tabel di bawah ini merupakan klasifikasi toksin Bt pada tahun 1995. Gen Bentuk Kristal Bobot Protein (kDa) 130-138 Insekta yang dipengaruhi

cry I [several subgrup:A(a), A(b), A(c), B, C, D, E, F, G] cry II [subgrup A, B, C]

bipiramida

larva lepidoptera lepidoptera and diptera koleoptera diptera berbagai macam

kuboid Datar/tidak teratur bipiramida berbagai macam

69-71

cry III [subgrup A, B, C] cry IV [subgrup A, B, C, D] cry V-IX

73-74 73-134 35-129

Cara isolasi Bacillus thuringiensis.


Isolat Bt dapat diisolasi dari tanah, bagian tumbuhan, kotoran hewan, serangga dan bangkainya dan sumber lain. Salah satu cara isolasi yang cukup efektif adalah dengan seleksi asetat. Beberapa gram sumber isolat disuspensikan ke dalam media pertumbuhan bakteri (misal LB (Luria Bertani Agar)) yang mengandung natrium asetat kemudian dikocok. Media asetat tersebut menghambat pertumbuhan spora Bt menjadi sel vegetatif. Setelah beberapa jam media tersebut di-panaskan pada suhu 80C selama beberapa menit. Pemanasan ini akan membunuh sel-sel bakteri atau mikroorganisme yang sedang tumbuh termasuk spora-spora bakteri lain yang tumbuh. Kemudian sebagian kecil dari suspensi yang telah dipanaskan diratakan pada media padat. Koloni-koloni yang tumbuh kemudian dipindahkan ke media sporulasi Bt.

Koloni yang tumbuh pada media ini dicek keberadaan spora atau protein kristalnya untuk menentukan apakah koloni tersebut termasuk isolat Bt. (Imam, 2009).

Mekanisme Patogenisitas Mekanisme kerja racun yang dihasilkan oleh Bacillus thuringiensis adalah
sebagai berikut. Setelah Bacillus thuringiensis masuk ke dalam perut larva, maka kristalnya akan masuk ke dalam usus larva. Kemudian enzim dalam usus akan memecah kristal dan mengaktifkan komponen insktisida Bt yang disebut endotoksin. Delta endotoksin berikatan dengan sel yang menempel pada dinding membran usus dan membentuk lubang pada membran, dan mengganggu keseimbangan ion dalam usus. Insekta akan berhenti makan dan kelaparan, kemudian mati. Jika insekta tidak terpengaruh secara langsung oleh kerja -endotoksin, kematian pada insekta terjadi setelah pertumbuhan vegetatif Bt di dalam usus insekta. Spora tumbuh setelah dinding usus hancur, dan kemudian memproduksi semakin banyak spora. Infeksi yang semakin meluas pada tubuh insekta menyebabkan kematian pada insekta tersebut.

Potensi sebagai Bioinsektisida Untuk bahan dasar bioinsektisida biasanya digunakan sel-sel spora atau protein kristal Bt dalam bentuk kering atau padatan. Padatan ini dapat diperoleh dari hasil fermentasi sel-sel Bt yang telah disaring atau diendapkan dan dikeringkan. Padatan spora dan protein kristal yang diperoleh dapat dicampur dengan bahan-bahan pembawa, pengemulsi, perekat, perata, dan lain-lain dalam formulasi bioinsektisida.

Elektroforesis SDSPAGE Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks

penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat bemigrasinya molekul-mulekul biologi. Media penyangganya bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan yang akan dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai dalam elektroforesis antara lain yaitu kertas, selulose, asetat dan gel. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein yakni: (Sudarmadji, 1996) 1. Ukuran molekul protein Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil. 2. Konsentrasi gel Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi. 3. Bufer (penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium

pendukung dan dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa protein yang bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik menjadi maksimal. Hal ini dapat

mempercepat gerakan molekul protein. Kekuatan ion rendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi molekul protein sangat lambat. 4. Medium penyangga Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai migrasi elektron atau penyaringan berdasarkan ukuran molekul seperti gel poliakrilamid (Sudarmadji, 1996).

1. Jika ukuran pori dari medium kira-kira sama dengan molekul, maka molekul yang lebih kecil akan berpindah lebih bebas di dalam medan listrik, sedangkan molekul yang lebih besar akan dibatasi dalam migrasinya. Besarnya pori-pori dapat diatur dengan mengubah konsentrasi penyusun gel poliakrilamidnya yaitu akrilamid dan bisakrilamid. 5. Kekuatan voltase 1. Voltase yang dipakai rendah (100-500) V, kecepatan migrasi molekul sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan. 2. Voltase yang dipakai tinggi (500-10000) V, mobolitas molekul meningkat secara lebih tajam dan digunakan untuk memisahkan senyawa dengan BM rendah serta jenis arus yang dipakai selalu harus searah (bukan bolak balik). 6. Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung. Jika temperatur tinggi akan mempercepat proses bermigrasinya protein dan sebaliknya jika temperatur rendah akan mengurangi kekuatan bermigrasinya protein. Salah satu metode PAGE yang umumnya digunakan untuk analisa campuran protein secara kualitatif adalah SDSPAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electroforesis). Prinsip penggunaan metode ini adalah migrasi komponen akril amida dengan N.N` bisakrilamida. Kisi kisi tersebut berfungsi sebagai saringan molekul sehingga konsentrasi atau rasio akrilamid dengan bisakrilamid dapat diatur untuk mengoptimalkan kondisi migrasi komponen protein. Metode ini sering digunakan untuk menentukan berat molekul suatu protein disamping untk memonitor pemurnian protein (Wilson dan Walker, 2000). SDSPAGE dilakukan terhadap protein tak larut dengan kekuatan ion rendah dan dapat menentukan apakah suatu protein termasuk monomerik atau oligomerik, menetapkan berat molekul dan jumlah rantai polipeptida sebagai subunit atau monomer. Penggunaan SDS-PAGE bertujuan untuk memberikan muatan negatif pada protein yang akan dianalisa. Protein yang terdenaturasi sempurna akan mengikat SDS dalam jumlah yang setara dengan berat molekul protein tersebut

(Dunn, 1989). Denaturasi protein dilakukan dengan merebus sampel dalam buffer yang mengandung merkaptoetanol (berfungsi untuk mereduksi ikatan disulfide), gliserol dan SDS (Wilson dan Walker, 2000). Muatan asli protein akan digantikan oleh muatan negatif dari anion yang terikat sehingga kompleks protein-SDS memiliki rasio muatan per berat molekul yang konstan (Hames, 1987). Sampelsampel enzim yang diinjeksikan ke dalam sumur gel diberi warna dengan bromphenol biru yang dapat terionisasi. Fungsi pewarna adalah untuk membantu memonitor jalannya elektroforesis. Berat molekul protein dapat diketahui dengan membandingkan Rf protein dengan protein standar yang berat molekulnya telah diketahui (Wilson dan Walker, 2000).

BAB II EKSPERIMEN

A. Alat dan Bahan Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah laminar air flow, timbangan analitik, beaker glass, autoklaf, bunsen, erlenmeyer, cawan petri, tabung reaksi, spatula, ose, hotplate, vortex, magnetic stirrer, mikrotube, mikro pipet, gelas ukur, tusuk gigi, aluminium foil, refrigerator, tip, kaca objek, mikroskop, pipet, kaca penutup dan spektrofotometer. Bahan yang digunakan adalah sampel tanah, larutan buffer, trypton, yeast extract, bacto agar, tryptose, Na3PO4, MnCl2, stock nutrient, metal salt solution, larutan Na2CO3, NaOH ,1 N, larutan CuSO4, larutan folin, HCl, Aquades, MgSO4, Glukosa, CaNO3, Casein hydrosilat, ZnCl3, FeCL3, Aquabides, degassed acrylamid, larutan tris, HCl, SDS, APS, TEMED.

B. Diagram Alir 1. Pembuatan Buffer

2. Pembuatan Medium T3

3. Pembuatan Medium LB Cawan dan LB Miring

4. Isolasi Bakteri Dari Sampel Tanah

5. Inokulasi Sampel Tanah

6. Pembuatan NaCl

7. Pemindahan B. thuringiensis dari Media T3 ke mikrotube

8. Pembuatan Larutan Solubasi

9. Lisis Sel

10. Uji Lowry a. Pembuatan Sampel

b. Penentuan Kadar Protein

11. Elektroforesis 11.1Preparasi Sampel

11. 2 Preparasi Gel Elektroforesis a. Resolving Gel (6%)

b. Stacking Gel (2%)

11.3 Pembuatan Kolom Gel

11.4 Preparasi Sampel

11.5 Pewarnaan dan Pencucian Gel

C. Rekaman Hasil Pengamatan

Gambar 1. Isolasi Bakteri pada medium T3

Gambar 2. Hasil Pengamatan Mikroskop

Gambar 3. Bakteri BT pada Medium LB

Gambar 4. Hasil Elektroforesis setelah Pewarnaan

BAB III ANALISIS DATA Rumus Molaritas Molaritas =

Pengenceran Larutan BSA M1V1 = M2V2

Persamaan Linear Uji Lowry Y = 5,032e-03 + 1,613225e-03*X

BAB IV HASIl DAN PEMBAHASAN 4.1 Isolasi Bakteri 4.2 Isolasi Protein 4.3 Kuantifikasi Protein dengan Lowry 4.4 Karakterisasi Protein dengan Elektorforesis SDS-PAGE

Pada kegiatan pertama dilakukan isolasi bakteri ini dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya keberadaan bakteri Bacillus thuringiensis dari sampel tanah yang di ambil. Isolat bakteri yang di dapat kemudian diamati dan di analisis keberadaan protein Cry yang dihasilkan oleh bakteri tersebut. Hasil Isolasi Bakteri Bacillus thuringiensis menunjukan dari 32 cawan bakteri yang ditumbuhkan, kemudian dibandingkan dengan kesamaan morfologi, warna, aroma dengan B. thuringiensis pembanding. Dari hasil perbandingan dipilih 24 koloni yang benar-benar mirip dengan B. thuringiensis pembanding untuk ditumbuhkan kembali di media T3 hingga sporulasi. Setelah sporulasi, ke 24 koloni di observasi dengan menggunakan mikroskkop cahaya untuk memastikan adanya bentuk protein kristal.

Menurut.. bakteri B.thuringiensis adalah bakteri yang mengandung protein kristal(dicari lagi sumbernya yang jelas).
Jawabannya: Bacillus thuringiensis adalah bakteri gram-positif, berbentuk batang, aerobik, dan membentuk spora yang tersebar secara luas di berbagai negara. B. thuringiensis menghasilkan berbagai macam toksin. Toksin-toksin tersebut adalah -eksositosin, -eksositosin, dan -endotoksin (protein kristal) (Dubois dan Lewis, 1981). Dari hasil observasi menggunkan mikroskop didapatkan 16nkoloni yang mengandung protein kristal (Lihat tabel 1). Tabel 1. Sampel 1 hasil Isolasi Bakteri Bacillus Thuringiensis No 1 2 3 4 5 6 7 8 Pengenceran 20 x 20 x 20 x 20 x 20 x 20 x 20 x 20 x Kelompok 2 2 3 3 3 1 3 3 Positif Bt 4 Bt 2 Bt 3 Bt Bt 8 Bt 3 Bt Bt 4

9 10 11 12 13 14 15 16

20 x 20 x 20 x 20 x 20 x 20 x 20 x 20 x

3 2 4 2 2 3 1 1

Bt Bt Bt Bt Bt Bt Bt Bt

5 3 1 1 5 1 7 6

Hasil diatas menunjukkan dari 16 sampel yang terdapat protein kristal. Dari ke 16 sampel ini kelompok 1 (tanah berasal dari.) terdapat 3 sampel,kelompok 2 terdapat 5 sampel,kelompok 3 terdapat 7 sampel,dan kelompok 4 terdapat 1

(Bahas Knp ????). Hal ini mungkin karena pada tanah tersebut hanya sedikit mengandung Bt, atau adanya kesalahan prosedur pada saat isolasi bakteri dari tanah,dan atau bakteri tersebut tidak mampu tumbuh dengan nutrisi yang diberikan.(((((Dicek lagi berdasarkan referensi yang valid)))))))
sampel. Setelah didapatkan Bt, Kemudian dilakukan isolasi protein untuk mengeluarkan protein dari bt. Selanjutnya dilakukan uji Lowry untuk kuantitifikasi protein.Hasilnya sebagai berikut Table 2
Hasil Uji lowry 1

Berdasarkan table diatas,terdapat 9 sampel yang positif mengandung proteindan 7 sampel tidak mengandung protein. konsentrasi protein yang paling tinggi adalah pada sampel 9,yakni 25,717 ug/ml.Dan paling rendah 9,87(((MENGAPA???). Mengapa nilainya sampai minus seian,hal inni karena kurangnya kalibrasi pada alat,sehingga angka yang ditunjukan jauh dari keakuratan.seharusnya angka 0 pun sudah menunjukan tidak ada protein yang terkandung. Dikarenakan tidak semua sampel mengandung protein,maka dilakukan pengulangan isolasi protein dan uji lowry yang bertujuan mendapatkan data yang lebih spesifik.

Sampel yang digunakan ada 12 sampel. (Lihat table 2) Tabel 3.Sampel 2 hasil Isolasi Bakteri Bacillus Thuringiensis No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Pengenceran 20 x 5x 20 x 5x 20 x 5x 20 x 20 x 5x 5x 5x 5x Kelompok 3 3 3 3 2 1 4 2 3 4 4 Positif Bt 4 Bt 6 Bt 7 Bt 8 Bt 1 Bt 6 Bt 8 Bt 3 Bt 7 Bt 4 Bt 2 Bt

Ke 12 sampel diatas merupakan isolat bakteri yang diambil dari isolat bakteri awal yang disimpan di LB miring. Selanjutnya dilakukan isolasi protein dan uji lowry kembali. Tabel 4
Hasil Uji lowry 2

Berdasarkan hasil uji lowry,semua sampel positif mengandung protein. Sampel yang mengandung protei terbesar terdapat pada sampl C,dengan konsentrasi 1122,98 ug/ml. Hal ini menunjukan.((((Mengapa

???? dibahas))))

Setelah diuji lowry,kemudian dilakukan karakterisasiprotein dengan menggunakan elektroforesis SDS Page menggunakan 12% Sparatin gel dan 14% Stacking gel. Kemudian diwarnai dengan menggunakan 0,1 % Coomassie Brilliant Blue,methanol dan 10% asam asetat. Hasilnya tidak terlihat adanya pita pita protein,yang ada hanya marker. Hal ini karena

(((((Mengapa ???????))))))

Tidak terbentuknya pita-pita protein pada saat pewarnaan hal ini dimungkinkan pada bakteri Bt sangat sedikit jumlah proteinnya sehingga tidak terbentuk pita-pita atau kemungkinan yang kedua adanya kesalahan dalam pengerjaan elektroforesis.

Gambar 1. Hasil Elektroforesis setelah pewarnaan

Pada saat elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda negatif menuju elektroda positif sampai pada jarak tertentu pada gel poliakrilamid tergantung pada berat molekulnya. Semakin rendah berat molekulnya maka semakin jauh pula protein bergerak atau mobilitasnya tinggi. Sebaliknya protein dengan berat molekul lebih besar akan bergerak pada jarak yang lebih pendek atau mobilitasnya rendah (Sumitro et al., 1996). Hasil elektroforesis akan didapatkan pita-pita protein yang terpisahkan berdasarkan berat molekulnya. Tebal tipisnya pita yang terbentuk dari pita protein menunjukkan kandungan atau banyaknya protein yang mempunyai berat molekul yang sama yang berada pada posisi pita yang sama. Hal ini sejalan dengan prinsip pergerakan molekul bermuatan, yakni molekul bermuatan dapat bergerak bebas di bawah pengaruh medan listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada zona atau pita yang sama atau berdekatan (Sudarmadji, 1996).

Pembahasan tambahan: Pertemuan 1 1. Media T3 dimasukkan ke lamari es pada suhu 4 derajat celcius untuk menonaktifkan kerja enzim agar tidak ada bakteri yang tumbuh dan nutrisinya tetap terjaga dan tidak hilang. 2. Dipilihnya buffer fosfat dengan pH 6,8 karena Bt hidup optimal pada pH 6,8. (dicari lagi sumber yang valid). Alasan menggunakan buffer fosfat untuk mempertahankan pH dengan formulasi basa lemah dan asam kuat atau sebaliknya. 3. adanya APS dalam pembuatan stacking gel sebagai penginisiasi. Pertemuan 2 1. bakteri yg sudah dipilih menggunakan mikroskop, ditaruh di lb miring karena lb miring merupakan tempat penyimpanan yang sangat baik. Lb miring itu bagaikan kasur, dia adalah tempat peristirahatan bagi si bakteri. Jika bakteri ingin diaktifkan lagi agar bersporulasi, maka bisa dipindahkan di medium T3. Pertemuan 3 1. Fungsi beta-merchaptoetanol untuk mereduksi semua ikatan disulgfida pada protein selain itu beta-merchaptoetanol termasuk zat yang mampu melisiskan dinding sel. 2. Pada saat uji lowry, sebelum di sentrifuse microtube didihkan untuk membantu pelisisan dinding sel. 3. Fungsi dari NaCl adalah untuk melisiskan sel, dan membersihkan dari media yang masih terbawa oleh bakteri. 4. fungsi dari sentrifuge pada suhu dingin untuk mencegah bereaksinya enzim protease yang ada pada bakteri tersebut. Tujuan yang lebih penting adalah untuk memisahkan pelet dengan supernatan dan mempercepat lisis sel. Lalu pada suhu dingin unutk mencegah kerusakan struktur protein karena pengaruh perubahan suhu.

DAFTAR PUSTAKA Dubois, N.R and F.B Lewis. 1981. What is Bacillus thuringiensis. J. Arboricul. 7(9):233-240 biogen.litbang.deptan.go.id. Dunn, m.J. 1989. Determination of total Protein Concentration. di dalam : Protein Purification Methods. Harris, E.L.V. dan S. Angal (eds.). IRL Press, Oxford, England. Hames BD, Hooper NM. 2000. Biochemistry: The Instant Notess. 2nd edition. Hongkong: SpringgerVerag. Imam. 2009. Bacillus thuringiensis, bio insectisida alternatif.

http://thelilacleaf.multiply.com/journal/item/3/Bacillus_thuringiensis_bi o_insectisida_alternatif?&show_intersitial=1&u=%2Fjournal%2Fitem. Diakses pada 26 Desember 2011 pukul 17:00 WIB Sudarmadji, S., 1996. Teknik Analisa Biokimiawi. Edisi Pertama.Liberty. Yogyakarta. Sumitro, S. B, Fatchiyah, Rahayu, Widyarti, dan Arumningtyas. 1996. Kursus Teknik-Teknik Dasar Analisis Protein dan DNA. Jurusan Biologi FMIPA Universitas Brawijaya. Malang. Wilson K. 1994. Protein and enzyme techniques In Practical Biochemistry, (ed. Wilson K and Walker JM), Cambridge University Press. p.161226.